Summary
Detta manuskript beskriver den effektiva, icke-viral avgivning av miR till endotelceller genom en PEI / MNP vektor och deras magnetisering. Sålunda, förutom att genetisk modifiering, tillåter detta tillvägagångssätt för magnetisk cell vägledning och MRI detekterbarhet. Tekniken kan användas för att förbättra egenskaperna hos terapeutiska cellprodukter.
Abstract
Hittills tillgängliga kirurgiska och farmakologiska behandlingar för hjärt- och kärlsjukdomar (CVD) är begränsade och ofta palliativ. På samma gång, gen- och cellterapi är mycket lovande alternativa tillvägagångssätt för CVD-behandling. Emellertid är bred klinisk tillämpning av genterapi kraftigt begränsad av bristen på lämpliga gen leveranssystem. Utveckling av lämpliga gentillförselvektorer kan ge en lösning på aktuella utmaningar i cellterapi. I synnerhet befintliga nackdelar, såsom begränsad effektivitet och låg retention cell i den skadade organet, kan övervinnas genom lämplig cellteknik (dvs genetiska) före transplantation. Den presenterade protokoll beskriver effektiv och säker övergående modifiering av endotelceller med användning av en polyetylenimin superparamagnetisk nanopartikel (PEI / MNP) -baserad leveransvektor. Dessutom är algoritmen och metoder för cellkarakterisering definierats. Den framgångsrika intracellular leverans av mikroRNA (MIR) i humana navelvenendotelceller (HUVEC) har uppnåtts utan att påverka cellviabilitet, funktionalitet, eller intercellulär kommunikation. Dessutom var detta tillvägagångssätt visat sig orsaka en stark funktionell effekt introducerade exogena miR. Viktigare, tillämpningen av denna MNP-baserad vektor säkerställer cell magnetisering, med åtföljande möjligheter till magnetisk inriktning och icke-invasiv MRI spårning. Detta kan utgöra en grund för magnetiskt styrda, genetiskt manipulerade cell terapeutika som kan övervakas icke-invasivt med MRI.
Introduction
Gen- och cellterapi är kraftfulla verktyg som har potential att lösa dagens utmaningar i CVD-behandling. Trots att båda dessa metoder för närvarande testas i kliniska prövningar, är de ännu inte redo för bred klinisk tillämpning 1. Noterbart är ett vanligt tillvägagångssätt för att ta itu med de utmaningar som gen- och cellterapi för att utveckla multifunktionella genlevererande vektorer som är lämpliga för klinisk tillämpning. Bristen på säkra och effektiva gentillförselsystem är det största problemet för genterapi. På samma gång, den genteknik av cellulära produkter före transplantation skulle kunna övervinna de allvarliga utmaningar som cellterapi, såsom låg effektivitet (t ex i hjärtområdet, uppnås endast ~ 5% av funktionell förbättring efter stamcellstransplantation 1 ) och dålig retention / engraftment vid stället för skada (dvs droppar cellkvarhållning under 5 - 10% inom några minuter till timmar post-tillämpning, oberoende av administrationsvägen 2, 3, 4).
Hittills, virala vektorer kraftigt överskrider de icke-virala system i termer av effektivitet, vilket har resulterat i en bredare tillämpning i kliniska prövningar (~ 67%) 5. Emellertid, virus fordon medför allvarliga risker, såsom immunogenicitet (och den efterföljande inflammatoriskt svar, med allvarliga komplikationer), onkogenicitet, och begränsningar i storleken på den burna genetiska materialet 6. På grund av dessa säkerhetsproblem och de höga kostnaderna för virusvektorproduktion, är att föredra i vissa fall 7, 8 användningen av icke-virala system. Det är särskilt lämplig för sjukdomar som kräver transient genetisk korrigering, såsom uttrycket av tillväxtfaktorer som kontrollerar angiogenes (t ex för CVD behandling) eller delivery av vacciner.
I vår grupp, var ett tillförselsystem utformad genom att kombinera grenpolyetylenimin 25-kDa (PEI) och superparamagnetiska järnoxidnanopartiklar (MNP) sammanbundna av biotin-streptavidin samspel 9. Denna vektor är ett potentiellt verktyg för genetisk manipulering av celler, vilket möjliggör deras samtidiga magnetisering före transplantation. Den senare ger en grund för magnetisk vägledning / retention, vilket är särskilt lovande nuförtiden, som avancerade magnetiska inriktningstekniker håller på att framgångsrikt utvecklat 10. Dessutom, de resulterande magnetiskt påverkbara celler har potentialen att vara icke-invasivt övervakas av magnetisk resonanstomografi (MRI) eller magnetisk partikel avbildning 11, 12.
I fallet med PEI / MNP-vektor, säkerställer polyamin nukleinsyra kondensation och därmed skydd mot nedbrytande faktor s, vektor internalisering i celler och endosomala fly 5. Den MNP komplettera egenskaperna hos PEI, inte bara i termer av magnetisk vägledning, men också genom att minska den kända PEI toxicitet 7, 13, 14. Tidigare var PEI / MNP vektor egenskaper justeras i termer av leveranseffektivitet (dvs., pDNA och miRNA) och säkerhet genom att använda fibroblaster och humana mesenkymala stamceller 15, 16.
I detta manuskript, är ett detaljerat protokoll om tillämpningen av PEI / MNP för alstringen av miRNA-modifierade celler beskrivna 17. För detta ändamål är HUVECs används och representerar en etablerad modell för in vitro-angiogenes. De är svårt att transfektera och är känsliga för giftiga påverkan 18, 19,ass = "xref"> 20. Dessutom tillhandahåller vi en algoritm för att utvärdera sådana celler in vitro, inklusive deras inriktning, intercellulär kommunikation, och MRI-detektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Humana navelsträngar för cellisolering erhölls postpartum från informerade, friska kvinnor som gav sitt skriftliga medgivande till användning av detta material för forskning i enlighet med Helsingforsdeklarationen. Den etiska kommittén vid University of Rostock har godkänt den presenterade studien (reg. Nr A 2011 06, långvarig 23 September, 2013).
1. Framställning av Transfektion Anläggningar
- Biotinylering av polyetylenimin (PEI).
- Lös grenad PEI i ultrarent vatten under magnetisk omrörning vid 300 - 400 rpm under 24 h vid rumstemperatur (RT) och skyddas från ljus för att erhålla en 0,18-mM lösning. Lagra lösningen vid 4 ° C.
- Mäta koncentrationen av primära aminogrupper i den erhållna lösningen 21, 22.
- Använda 2% ninhydrin reagenslösning som amindetektionsreagens 23 genom att blanda 100 mikroliter av prediluted prov (1: 200 med ultrarent vatten) och 75 mikroliter av ninhydrinreagens. Inkubera i 30 min vid 80 ° C. Svalna den och tillsätt 100 | il av 50% etanol för stabilisering. Mät absorbansen vid 550 nm på absorptionen spektrofotometer.
- Skapa en standardkurva med användning av glycin.
- Förbereda 0,1 M amino-N-stamlösning (0,75 g glycin i 100 ml avjoniserat vatten) och dess utspädningar 1: 1, 1: 5, 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1: 100, 1: 200, och 1: 400, 1: 600. Mäta dessa lösningar såsom i steg 1.1.2.1 och skapa ett tomt med koncentrationen och absorbansen på axlarna.
- Baserat på den erhållna tomt och den uppmätta absorbansen för PEI-lösning, definierar koncentrationen av a-aminogrupperna i PEI.
OBS: Varning. Ninhydrinreagens lösningen måste uteslutande användas under huven och bör förvaras under en kväveatmosfär. Det är inte användbar när lösningens färg ändras på grund av oxidation.
- Upplös 100 mg biotin linker i ultrarent vatten omedelbart före användning för att erhålla en 0,01-mM lösning. Beräkna den erforderliga mängden av biotin för att lägga till PEI genom att multiplicera koncentrationen av a-aminogrupper i PEI (mätt i steg 1.1.2) genom 20 för att erhålla den nödvändiga mängden (i mol) biotinylerande reagens.
- Lägga biotin lösning på PEI-lösning vid pH 8-9 och inkubera i 16 h under magnetisk omröring vid RT.
- Avlägsna den oreagerade biotin genom storleksuteslutningskromatografi 23. Använda kommersiellt tillgängliga kolonner innehållande ett gelfiltreringsmedium lämpligt för rening av den 25-kDA PEI och följa tillverkarens instruktioner. Ta alikvoter efter rening för att mäta aminkoncentrationen med användning av ett amindetektionsreagens (steg 1.1.2) och för att bestämma biotin konjugering effektiviteten (steg 1.2.2). Lagra det erhållna biotinylerade PEI vid 4 ° C.
- Karaktärsering av biotinylerad PEI.
- Bestämma koncentrationen av a-aminogrupper i PEI efter biotinylering, såsom beskrivs i steg 1.1.2.
- Bestämma graden av PEI biotinylering att verifiera konjugering förfarandet. För kvantifiering, använda ett kommersiellt tillgängligt kit, som är baserat på tillämpningen av HABA färgämne (4'-hydroxiazobensen-2-karboxylsyra), för att säkerställa en korrekt kolorimetrisk bestämning av biotinyleringsbetingelsema nivåerna 24, 25. Följ instruktionerna från tillverkaren.
- Filtrering av MNP och deras karakterisering.
- Filtrera kommersiellt tillgängligt streptavidin-belagd MNP genom ett 0,45-pm sprutdriven filter 16 för att utesluta större toxiska aggregat. Mäta den slutliga järnkoncentrationen med användning av en standard-fotometrisk analys 26.
- Undersök kvaliteten på de filtrerade MNP efter inspelningmagnetiseringskurvan och med TEM avbildning i enlighet med standardprotokoll 27, 28.
- Utspäda MNP suspensionen med destillerat vatten och placera tre mikroliter av den erhållna suspensionen på en 300-mesh Formvar kolbelagda koppargaller för TEM-analys. Därefter placera detta nät på ett objektglas på en värmeplatta och låt den torka.
- Analysera provet med ett transmissionselektronmikroskop vid 120 kV och kontrollera det elementära innehållet med användning av en röntgendetektor 27.
- 3-färg märkning av transfektion komplex för superupplösning mikroskopi.
- Märka 0,5% av de uppmätta primära aminogrupperna i PEI med NHS-Ester Atto 488 färgämne följande tillverkarens instruktioner. Avlägsna överskottet obundet färgämne genom size-exclusion-kromatografi, såsom beskrivits ovan (steg 1.1.4). Mäta den resulterande koncentrationen av aminogrupper med användning av en ninhydrin assay (steg 1.1.2).
- Märka kommersiellt tillgänglig oordning miR (scr-miR) med Cyanine5 färgämnet med användning av en lämplig märkningssats 15 (indikeras i Materials List). Mäta den resulterande fluorofor-miR koncentration spektrofotometriskt.
- Färsk märka MNP varje gång med biotinkonjugerad färgämne (t.ex., atto 565-biotin) vid en 1: 1000 vikt / vikt-förhållande. Direkt tillämpa färgämnet efter tillsats av MNP till miR / PEI under bildningen av transfektionsexperimenten komplexen, per detaljerna i Delyangina et al. 16.
2. Cellberedning
- HUVEC isolering.
- Isolera celler från navelsträngen direkt efter erhållande linorna med hjälp av kollagenasdigerering från det inre av linan ven; följa en tidigare utvecklad protokoll 29.
- Inkubera varje sladd med ~ 60 enheter / ml kollagenas typ IV-lösning i buffert - laddas i than navelven - vid 37 ° C under 13 min.
- För alla experiment, sammanställa HUVEC: er från ett minimum av 5 patienter.
OBS: Odling bör inte överstiga 4-5 passager. Använd inte celler kontaminerade med mykoplasma, eftersom detta orsakar en minskning i transfektionseffektiviteten. mykoplasmkontaminering bör testas för innan protokollet genom användning av ett PCR-kit för den synnerligen känsliga detektionen av mykoplasma.- Test för mykoplasma närvaro.
- Centrifug 1 ml cellodlingssupernatant för 10 min (13 tusen xg). Suspendera pelleten i 17 yl dH 2 O och koka (93 ° C) under 3 min. Använda två mikroliter av suspensionen för att amplifiera DNA-regionen som kodar för mycket konserverade ribosomala RNA (16S-rRNA) av olika mykoplasmaarter.
- Genomförande av PCR med användning av 10 pmol av varje primer (framåtriktad primer: 5'-CTGACGACAACCATGCACCATCTGTC-3 ', omvänd primer: 5'-GAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAG-3') i kamröjande med en kommersiell PCR-kit under följande betingelser: 94 ° C under 3 min; 45 cykler av 94 ° C under 30 s, 50 ° C under 30 s, och 72 ° C under 30 s; och en slutlig förlängning vid 72 ° C under 10 min.
- Analysera PCR-produkten (292 bp) med användning av agarosgelelektrofores.
- Test för mykoplasma närvaro.
- Antingen lagra de erhållna cellerna långsiktigt i flytande kväve eller kultur dem i den endoteliala tillväxtmedium kompletterat med 100 U / ml penicillin och 100 | ig / ml streptomycin vid 37 ° C i en humidi fi erad atmosfär innehållande 5% CO2.
- Isolera celler från navelsträngen direkt efter erhållande linorna med hjälp av kollagenasdigerering från det inre av linan ven; följa en tidigare utvecklad protokoll 29.
- HUVEC karakterisering.
- Karakterisera isolerade HUVEC i termer av deras funktionella kapacitet att bygga rören i basalmembranmatrisen (t ex Matrigel) och deras uttryck av den endotel markör CD31 (trombocyt endotelial celladhesionsmolekyl, PECAM-1) genom att följa standardprotokoll 30, 31.
3. Transfektion
- Trypsinize aktie HUVEC kultur (se steg 4.1.2.) Och manuellt räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer. Frö HUVEC på plastcellkultur brunnars plattor av lämplig storlek, med en startcelldensitet av ca 13 tusen celler / cm 2 av tillväxtytan, 48 h före transfektion tills 70-80% konfluens uppnåtts.
- Bered en färsk miR / PEI / MNP komplex varje gång.
OBS: det första bör miR / PEI-komplex erhållas (steg 3.2.1 - 3.2.3); därefter, bör MNP sättas till miR / PEI-lösning (steg 3.2.4) för att få den slutliga miR / PEI / MNP formulering användes för transfektion (steg 3,3).- Beräkna mängden av lämplig kommersiellt tillgänglig miR (oordning, märkta eller funktionella, se steg 4) med användning av koncentrationen av det lager som tillhandahålls av tillverkaren. Använda 2,5 pmol av miR / cm 2 av celltillväxt yta. Utspäda miR i 5% glukoslösning till obtain en slutlig koncentration av 0,125 pmol av miR / uL.
- Baserad på miR mängden från steg 3.2.1 och den optimala NP förhållande av 25 32, beräkna den erforderliga mängden av PEI med hjälp av dess uppmätta koncentration (steg 1.1.2). Späd PEI (per den beräknade erforderliga volymen) i en lika stor volym av 5% glukoslösning. Lägga den erhållna för-utspädd PEI till miR lösningen (från steg 3.2.1) och vortexblanda den erhållna blandningen under 30 s.
- Inkubera det erhållna miR / PEI blandningen under 30 min vid RT.
- Sonikera MNP vid 35 kHz för minst 20 min i sonikering vattenbad (se Materials List) vid RT, tillsätt lämplig mängd MNP lösning på miR / PEI (5 - 25 ^ g av järn / ml framställd miR / PEI / MNP blandning 16), virvel under 30 s, och inkubera under 30 min vid RT tills redo.
- Tillsätt framställd miR / PEI / MNP blandningen droppvis direkt till odlingsmediet på cellerna. Använda den resulterande blandningen av cell culture medium med miR / PEI / MNP utspädd i glukos som transfektion lösning. Ersätta denna blandning med färskt odlingsmedium 6 h efter transfektion.
4. Analys av vektor Säkerhet
- Undersökning av cellviabilitet.
- Transfektera den HUVEC ympades i en 24-brunnars odlingsplatta (steg 3,1 och 3,2); använda Cy3-miR som testsonder och oordning miR (scr-miR) som styrgrind prober för flödescytometri. Inkubera vid 37 ° C i en humidi fi erad atmosfär innehållande 5% CO2 under 24 timmar.
- Samla upp supernatanten och transfekterade celler genom trypsinering med användning 1x Trypsin-EDTA utspädd i PBS sattes till cellerna under 4 min vid 37 ° C. Centrifugera vid 300 xg under 10 min och använd för analysen.
- Undersöka cellernas livskraft och miR upptagseffektivitet 24 h efter transfektion med användning av flödescytometri genom att tillämpa en kommersiellt tillgänglig fläck att skilja mellan levande / döda celler; använda standardprotokoll 15
- Undersöka säkerheten för de miR / PEI / MNP-komplex för celler i funktionella analyser.
- Utvärdera proliferationsaktiviteten av transfekterade celler.
- Transfektera HUVEC ympades i en 12-brunnars odlingsplatta (steg 3,1 och 3,2) med funktionella antisens miR (t ex anti-miR92a för HUVEC 31) och inkubera vid 37 ° C i en humidi fi erad atmosfär innehållande 5% CO2 under 24 timmar.
- Använda ett kommersiellt tillgängligt kit för att definiera antalet prolifererande celler genom färgning med EDU (5-etynyl-2'-deoxiuridin) och skanning med laserbaserad konfokalmikroskopi. Använd följande mikroskopi inställningar: 40X mål med olja nedsänkning; 633-nm excitation laser (för en 647-nm färgämne); 5 slumpmässiga fält som skall spelas in i varje prov. Beräkna hastigheten för prolifererande celler genom att dividera antalet EDU-färgade kärnor med det totala kärnor numret (Hoechst-färgade).
- Utvärdera förmågan hos transfekterade celler att bilda rörliknande strukturer, som tidigare beskrivits 17, 31.
- Transfektera den HUVEC ympades i en 24-brunnars odlingsplatta (steg 3,1 och 3,2) med scr-miR och inkubera under 48 timmar vid 37 ° C i en humidi fi erad atmosfär innehållande 5% CO2. Samla de transfekterade cellerna (som i steg 4.1.1).
- Frö 3,5 x 10 4 av modifierade HUVEC i 24-brunnars plattor belagda med 140 mikroliter av basalmembranmatrisen. Inkubera i 18 h vid 37 ° C i en humidi fi erad atmosfär innehållande 5% CO2.
- Att spela in bilder av 10 slumpmässiga fält i varje brunn med användning av laserskanning konfokalmikroskopi (differentialinterferenskontrast) och analysera med ImageJ programvara med "Angiogenesis Analyzer" plugin. Inkluderar sådana parametrar som den totala längden av grenar, antalet grenar, och antalet junctions i utvärderingen. Jämför detta med den obehandlade kontrollen.
- Utvärdera proliferationsaktiviteten av transfekterade celler.
- Undersöka den eventuella toxiska inverkan av transfektion komplex på gap junction (GJ) -medierad intercellulär kommunikation (GJIC) genom att testa 3D fluorescens återhämtning efter fotoblekning (FRAP) 33 i 3D.
- Ympa cellerna på gelatinbelagda objektglas med ett tunt botten lämplig för live-cell imaging (oljeimmersion). Transfektera cellerna som beskrivits ovan i steg 3,2 med icke-märkt, icke-funktionell miR (scr-miR) och inkubera under 24 timmar.
- Förbered celler för avbildning genom att ladda dem med kalcein direkt före mikroskopi. I synnerhet ersätta odlingsmediet med färskt medium innehållande 5 uM kalcein, inkubera i 20 min, tvätta med PBS och tillsätt färskt odlingsmedium. Pre-värma inkubatorn av mikroskopet till 37 ° C och justera CO 2-koncentration till 5%.
OBS: Alla reagens bör vara varm för att undvika cell Contraction före mätning. - Använda ett 561-nm excitation laser för cell visualisering och FRAP experimentet. Först väljer celler för mätning som regioner av intresse (ROI) manuellt; testceller bör ha minst 3 angränsande celler. Definiera en referenscell med ljusa, stabil fluorescens som inte kommer att blekas. Definiera gränserna för en z-stack. Registrera fluorescens från toppen av cellerna till botten för att innefatta 10 - 15 skikt.
- Bleka testceller med användning 100% lasereffekten och registrera den efterföljande fluorescens återhämtning (på grund av GJ-specifik färgöverföring från angränsande celler) under följande 15 min. Spela in rådata i Z-stackar var 60 s. Totalt, utföra mätningarna FRAP med inte mindre än 5 - 10 testceller per experiment. Jämför resultaten till otransfekterade celler.
5. Provning av transfektionseffektiviteten
- Undersökning av miR upptag.
- Förbereda sondema som beskrivs i step 4,1 och använda dem samtidigt för att definiera miR upptag med flödescytometri.
- Bekräfta och beskriva den intracellulära lokaliseringen av transfektion komplex genom konfokal och Superresolution strukturerade belysning mikroskopi (SIM).
- Frö HUVEC på gelatinbelagda täckglas placerade i brunnarna på 24-brunnars odlingsplattor, såsom beskrivits tidigare (steg 3,1). Transfektera cellerna med 3-färg märkt miR / PEI / MNP (steg 1,4) och inkubera under 24 timmar vid 37 ° C i en humidi fi erad atmosfär innehållande 5% CO2.
- Tvätta täckglasen först med 2% bovint serumalbumin (BSA) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och sedan med bara PBS. Fixera cellerna genom inkubering i 4% paraformaldehyd (PFA) vid 37 ° C under 15 min och fläck kärnor med DAPI följande standardprotokoll 16. Tvätta 3 gånger i skakapparaten (15 min vardera) för att avlägsna överskott av färgämne.
OBS: PFA är cancerframkallande och måste hanteras varsamt. - Placera prepared täckglas på objektglas med användning av lämpligt monteringsmedium, låt dem torka åtminstone under 1 h, och använda dem för mikroskopi, såsom beskrivs nedan.
- Förvärva bilder med hjälp av en 63x oljeimmersion mål och följande SIM-inställningar: 405-, 488-, 561- och 633-nm-laserlinjer för excitering; z-stack-läge med en 32-bitars djup vid 5 vinklar, 5 faser, med utjämning av 4; G2 rutnät med en 405 laserlinje, G3 med en 488, G4 med en 561, och G5 med en 633.
- Utvärdera funktionaliteten av den levererade miR genom RT-qPCR i miR / PEI / MNP-HUVEC kontra obehandlade.
- Transfektera den HUVEC ympades i en 12-brunnars odlingsplatta stegen (3.1 och 3.2) med funktionell antisens miR (t ex anti-miR92a för HUVEC 31) och inkubera under 48 timmar vid 37 ° C i en humidi fi erad atmosfär innehållande 5% CO2.
- Utvärdera anti-miR92a leverans och bearbetning med RT-qPCR med användning av kommersiellt tillgängliga kit (se material); följ than tillverkarens instruktioner, som beskrivs på annat håll 17, 31. Parallellt, undersöka uttrycket av målgenen (t.ex. ITGA5 31).
OBS: AntagomiR leverans mot endogen miR är att föredra framför härmar eftersom det garanterar att mäta det faktiska utfallet av miR och inte bara dess intracellulär ackumulering.
6. Cell Targeting Utvärdering och Magnetic Cell Separation
- Cellmåls under statiska förhållanden in vitro.
- Transfektera den HUVEC i en 24-brunnsplatta (2,5 pmol / cm 2 scr-miR, NP 25, och 15-25 | ig / ml MNP), inkubera i 24 h, tvätta, och samla in såsom beskrivits ovan (steg 4).
- Blanda cellpelleten erhållen från en brunn med 1 ml av färskt odlingsmedium och placera den i brunnarna på en 12-brunnars platta. Fastställa en liten magnet lokalt (på sidan) vid botten av plattan med användning av tejp.
- Inkubera cellsuspensionen under 24 h och observera cellvidhäftning och tillväxt i området över magneten och i området utan en magnet. För en kvalitativ utvärdering, använda en konventionell inverterat mikroskop.
- Cellmåls i simulerade dynamiska förhållanden in vitro.
- Transfektera den HUVEC i en 24-brunnars platta per steg 3.1 och 3,2 (2,5 pmol / cm 2 Cy3-miR, NP 25, och den 15 - 25 mikrogram / ml MNP), inkubera i 24 h, tvätta, och samla genom trypsinisering med användning 1x trypsin-EDTA utspädd i PBS sattes till cellerna under 4 min vid 37 ° C. Centrifugera vid 300 xg under 10 min.
- Blanda cellpelleten erhållen från en brunn med 1 ml av färskt odlingsmedium och placera den i brunnen på en 12-brunnars platta. Fastställa en liten magnet lokalt (på sidan av en brunn) med tejp. Placera odlingsplattan på skakapparaten och inkubera cellsuspensionen för 12 h vid 150 rpm för att simulera dynamiska förhållanden 34.
- Tvätta cellerna och fixeradem med hjälp av 4% PFA. Färga kärnorna med DAPI 16. Registrera cellvidhäftning med användning av laserskanning konfokalmikroskopi med en 514-nm excitation laser, z-stack-läge - till (5 12 skivor) erhålla rådata, och maximal intensitet projektion bildbehandling för att skapa bilder för analys.
- Kvantitativ analys av magnetiskt påverkbara och icke-svarande celler.
- Transfektera den HUVEC i en 24-brunnsplatta (2,5 pmol / cm 2 scr-miR, NP 25, och 15-25 | ig / ml MNP), inkubera i 24 h, tvätta, och samla såsom beskrivits tidigare (steg 6.2.1) . Pre-varm PBS och cellsorteringsbuffert (steriliserad genom filtrering, se Material List) till 37 ° C. Återsuspendera cellpelleten erhållen från varje brunn med 500 mikroliter av cellsortering buffert.
- Tillämpa denna cellsuspension till en magnetisk sorterings kolumner som fastställts av den medföljande magneten, tvätta kolonnerna på magneten 3 gånger med färskt cellsortering buffert, och samla genomströmning som Magnetitiskt unresponsive fraktion (mag-).
- Ta bort kolumner från magneten och omedelbart samla den magnetiskt mottaglig cellfraktionen (mag +) genom att trycka färsk cellsortering bufferten genom kolonnen med användning av en kolv.
- Centrifug både mag- och mag + vid 300 xg under 10 min. Återsuspendera cellpelleten i PBS, räkna cellerna, och utvärdera cellviabiliteten med en exklusion med trypanblått 35. Använda den erhållna cellpelleten antingen för långtidsanalys (dvs re-frö och utvärdera efter 24, 48, och 72 timmar i odling 17) eller direkt för flödescytometri (steg 4,1.).
- Definiera järn lastning av de transfekterade cellerna.
OBS: Under förberedelserna måste all kontakt av cellsonder med järnoxid material och instrument bör undvikas.- Samla de transfekterade HUVEC och otransfekterade kontroll (som i steg 4.1.1). Tvätta de uppsamlade cellerna två gånger i 2% BSA i PBS 36 b y omsorgsfull blandning av cellerna med 1 ml av denna tvättbuffert och därefter centrifugering vid 300 xg under 10 min. Återsuspendera den erhållna cellpelleten i 250 | il av PBS, tillsätt 100 | il av 4% PFA, och inkubera i 20 min för att fixera cellerna. Tvätta 3 gånger med PBS, som beskrivits ovan.
- Återsuspendera den resulterande fasta cellpelleten i 110 mikroliter av PBS och överföra den till 100-mikroliter PCR-rör.
- Ta 10-il alikvoter för cellräkning och använda den återstående provet för magnetisk partikelspektroskopi (MPS).
- Utför mätning på en kommersiellt tillgänglig MPS-enhet. Under mätningen, tillämpa följande inställningar: magnetfält B-enhet = 25 mT och frekvensen f 0 = 25 kHz. För järn kvantifiering av proverna, normalisera den tredje övertonen A 3 av MPS-spektrumet till motsvarande A 3, ref av en MNP referensprov med en känd järn mängd av 2,1 | igxref "> 37. Använd obehandlade celler som kontroller.
7. Definiera MRI Detektionsgräns
- förberedelse Cell.
- Utsädes HUVEC i en 6-brunnsplatta och transfektera (2,5 pmol / cm 2 scr-miR, NP 25, och den 15 - 25 mikrogram / ml MNP) i dubbletter eller triplikat i enlighet med den erforderliga mängden av celler (till fantom framställning). Inkubera cellerna under 24 h och tvätta, samla in och fixera dem med 4% PFA, såsom beskrivits tidigare (steg 4).
- Räkna de erhållna cellerna, förbereda alikvoter med lämpliga cellantal (t ex 10 3, 10 4, 10 5, etc), och justera deras volymen till 50 | il.
- Agaros fantom beredning
- Förbereda flera lager av 2% agaros i 50-ml rör med olika mängder av transfekterade celler inbäddade mellan skikten 38. Under beredning, sonikera och centrifugera den varma agaros 38 tillförstöra luftbubblor som orsakar artefakter.
OBS: Viktigt bör fantomer innehållande 5,5 x 10 5 HUVEC behandlade med omagnetiska miR / PEI-komplex framställas på samma sätt för att fungera som kontroller.
- Förbereda flera lager av 2% agaros i 50-ml rör med olika mängder av transfekterade celler inbäddade mellan skikten 38. Under beredning, sonikera och centrifugera den varma agaros 38 tillförstöra luftbubblor som orsakar artefakter.
- Scan den erhållna in vitro fantomer med en 7,1 T djur MRI-system efter placering av fantom centralt i spolen, parallell med z-axeln av det magnetiska fältet.
- Tillämpa följande sekvensparametrar för en gradient-ekosekvens förvärvet: TR = 66 ms; TE 1 / TE 2 / TE 3 / TE 4 / TE 5 / TE 6 = 1,44 / 2,88 / 4,51 / 6,11 / 7,60 / 9,01 ms; flip-vinkel = 3 °; matris = 128 x 128, interpoleras till 256 x 256; synfält = 42 mm; 100%; medelvärden = 1, eko tåglängd = 1; snittjocklek = 1,5 mm; och 16 skivor.
- Bedöma signalsönderfallet av alla fyra ekotider och beräkna kartor R2 * (R2 * = 1 / T2 *) med användning av lämplig mjukvara, såsom beskrivits på annat ställe 39.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det huvudsakliga syftet med det föreslagna protokollet är att producera magnetiskt påverkbara miR-modifierade celler och att föra sin noggrann karaktärisering (figur 1). Som ett resultat, effektivt transfekterade celler, som svarar på magnetisk selektion och vägledning och detekterbara med MRI, bör erhållas.
Först framställdes identiteterna av isolerade HUVEC bekräftades genom typisk färgning med den endoteliala markören CD31 (PECAM) (Figur 2A) och genom deras förmåga att bilda rören på lämpligt basalmembranmatrisen (figur 2B). De erhållna cellerna tog upp miR infördes genom PEI / MNP mycket effektivt; mikroskopi visade att alla celler var positiva för en signal av taggade miR (Cy3) 24 h efter transfektion (fig 3A). Viktigare, kunde ingen celldöd registrerades jämfört med obehandlade celler (Figur 3B), och normal utseende bibehölls (figur 3A). Såsom observerats med konfokal laserscanningsmikroskopi rades signalen från Cy3-miR främst belägna inuti cellerna. Dessutom var en mer detaljerad undersökning av den intracellulära lokaliseringen av alla delar av transfektion vektorn och miR utföras med högre upplösning med användning av 3-färgmärkta komplex. SIM, Mir, PEI, och MNP-signaler var alla detekteras i cytoplasman i den perinukleära regionen (figur 3C).
Vidare har en detaljerad undersökning av transfektion vektor säkerhet bevisat att miR / PEI / MNP-HUVEC kan bilda tuber på lämplig basalmembranmatrisen och att den resulterande nätverket är jämförbar med den för obehandlade celler som används som en positiv kontroll (figur 4A ). Dessutom transfekterade celler hållna GJIC, såsom 3D-FRAP experiment avslöjade. I synnerhet, när celler laddade med fluorescerande GJ-permeable färgämne och en av dem är blekt, återvinner dess fluorescens på grund av kommunikation med grannceller och den resulterande färgöverföring (Figur 4B).
Viktigare, på grund av närvaron av det superparamagnetiska föreningen 40 (figur 5A), tillåter PEI / MNP ansökan inte bara celltransfektion, utan även den samtidiga magnetisering. Den resulterande mängden av intracellulärt järn mättes med användning av MPS (figur 5B) för alla tillämpade MNP koncentrationer inom det optimala intervallet (2,5 pmol / cm 2 miR; NP 25 kompletteras med 5-25 | ig / ml MNP): 0,37 ± 0,079 till 0,7 ± 0,150 pg järn / cell 17. Eftersom användningen av magnetiska separationskolonner visat, för alla dessa MNP koncentrationer, är mängden av magnetiskt mottagliga celler i den totala volymen av transfekterade celler ~ 70% (figur 5C). Dessutom transfekterades HUVECs är synliga med MRI (Figur 5D) insidan av in vitro-agaros fantomer, mimicking musvävnad mottaglighet. Vidare har den magnetiska inriktningen av transfekterade HUVEC i dynamiska förhållanden simulerade in vitro visat sig vara effektiv (fig 6). I denna experimentuppställning, ens konstant kraftig rörelse odlingsmedium inte hindra rådande celltillväxt i området nära magnet ansökan.
Figur 1. Schematisk illustration av Produktion av Magnetized miR-modifierade HUVEC och deras analys. PEI / MNP (polyetylenimin / superparamagnetiska nanopartikel-baserad vektor) appliceras för att leverera microRNA (miR) till humana umbilikala venendotelceller (HUVEC). Den erhållna cellprodukten kännetecknas av följande parametrar: säkerhet (inklusive cellviabilitet, funktionelllighet, och kapacitet för intercellulär kommunikation); transfektionseffektivitet (dvs miR upptag effektiviteten och funktionaliteten efteråt); magnetisk inriktning in vitro i statiska och simulerade dynamiska förhållanden; magnetisk resonanstomografi (MRT) detektering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Karakterisering av isolerat HUVEC. A. Representativa bild av isolerade och odlade HUVEC färgade med endotelial CD31 markör. Kärnorna motfärgades med DAPI (blå). Skalstrecket är 20 um. B. Representativa resultat av rörbildning analys utförd på isolerad HUVEC; bilden registrerades med användning av en laserskanning konfokalmikroskop (differentiell interference kontrast) 18 h efter cellsådd på basalmembranmatrisen. Skalstrecket är 100 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. miR Leverans till HUVEC med hjälp av PEI / MNP. A. Upptaget av taggade miR (Cy3, röd) 24 h efter transfektion (2,5 pmol / cm 2 av Cy3-märkt miR, NP 25 och MNP 25 | ig / ml) och upprätthållandet av normal cell utseende illustreras. Bilder togs av konfokal laserscanningsmikroskopi med användning av ett 514-nm excitation laser (Cy3, röd) och differentiell interferenskontrast. Skalstrecket är 50 um. B. Cellviabilitet 24 h efter transfektion analyserades genom flödescytometri. Tomten representerar resultaten som erhölls för HUVECs behandlades med följande komplexa kompositioner: 2,5 pmol / cm 2 av Cy3-miR; NP-förhållande 25 kompletterad med 5 till 25 | j, g / ml MNP. Staplarna skildrar förhållandet mellan det genomsnittliga antalet viabla celler och hela cellpopulationen (n = 6; felstaplar: SEM). C. Strukturerad belysning mikroskopi (SIM) avbildning av tre-färg märkt miR / PEI / MNP-komplexen tas upp av HUVEC. Cellerna transfekterades såsom beskrivits ovan, inkuberades, och fixerades 24 timmar efter behandling; kärnorna motfärgades med DAPI. Rå SIM uppgifter har registrerats i z-stackar och behandlas; representativa bilder är resultatet av maximal intensitet projektion. Följande exciterings lasrar applicerades: 405 nm (DAPI, blå), 488 nm (Atto488-PEI, orange), 565 nm (Atto565-MNP, cyan), och 633 nm (Cy5-miR, röd). Skalstrecket är 5 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Safety of HUVEC Modifiering med miR / PEI / MNP. A. En rörbildning analys utfördes med transfekterade cellerna (2,5 pmol / cm 2 av scr-miR; NP 25 och MNP 25 | ig / ml) 48 h efter behandling. Bilder förvärvades med en laserskanning konfokalmikroskop (dvs differentialinterferenskontrast) 18 h efter cellsådd på basalmembranmatrisen. HUVEC transfekterade med miR / PEI användes som en kontroll toxicitet och obehandlade celler som en positiv kontroll. Skalstrecket är 100 um. Tomten återspeglar förhållandet mellan de transfekterade HUVEC och de obehandlade celler med användning av flera parametrar: rörlängd, antal förgreningar, och korsningar (n = 3, felstaplar: SEM). B. gap junction-förmedlad intercellulär kommunikation av miR / PEI / MNP-modifierad HUVEC utvärderades 24 h efter transfection. För detta ändamål, var cellerna laddade med GJ-permeabla färgämne kalcein (orange); fluorescens återhämtning efter fotoblekning (FRAP) undersöktes i 3D genom att skanna testceller i z-stackar. Representativa bilder av kalcein-laddade celler före blekningen, direkt efter blekning, och 15 min efter blekning (med återvunna fluorescens) är avbildade. Skalstrecket är 20 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Cell Magnetisering Resulterar från Transfektion med PEI / MNP och dess applikation. A. Representativa bild av filtrerat MNP, som tas med TEM, som illustrerar deras klustrade morfologi. En liten storlek (~ 5-15 nm) av enstaka järnoxidpartiklar (vilket resulterar i superparamagnetism) är därigenombekräftas. Skalstrecket är 100 nm. B. Den intracellulära lastning av transfekterade celler utvärderades genom magnetisk partikel spektroskopi (MPS) 24 h efter transfektion. Den representativa panelen visar MPS spektrum av undersökta proverna. I synnerhet, ren MNP-suspension (50 | il) tjänade som en referens (blå kvadrater); cirklarna är MPS-spektra av två transfekterade cellprover (röda cirklar: MNP 25 | ig / ml, gröna cirklar: MNP 5 ^ g / ml), medan de grå trianglarna visar den detekterade bakgrundsspektrum erhållet genom en mätning utan något prov. Notera den logaritmiska skalan av amplituden (A). C. Mängden magnetiskt modifierade cellen kvantifierades genom applicering av transfekterade HUVEC (2,5 pmol / cm 2 miR; NP 25 kompletteras med 5-25 | ig / ml MNP), uppsamlades genom trypsinering 24 h efter behandling, till en magnetisk cellseparationskolonn. Den resulterande magnetiskt positiva fraktionen (dvs., som fanns kvar i kolonnen)räknades, och dess procentuella ut av hela mängden av transfekterade celler återspeglas på tomten för varje MNP-koncentration (röda trianglar). Cellviabiliteten undersöktes sedan genom exklusion med trypanblått (grå romber). Data presenteras som medelvärde ± SEM (n = 3). D. En illustrativ MRI-bild av transfekterade HUVEC (300.000 celler; 2,5 pmol / cm 2 miR; NP 25 & 25 | ig / ml MNP) inbäddade i en agaros fantom registrerades med en 7,1 T djur MRI-system. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. In vitro Magnetisk Inriktning av miR / PEI / MNP-HUVEC i Simulerade dynamiska förhållanden. HUVEC samlades 24 timmar efter transfekterajon (2,5 pmol / cm 2 av Cy3-miR; NP 25 & MNP 25 | ig / ml) och re-ympades i färskt odlingsmedium i brunnarna, med en liten magnet lokalt ansluten till sidoväggen. I sin tur, var detta odlingsplatta fäst vid en skakapparat roterande med 150 varv per minut. Cellvidhäftning och tillväxt utvärderades 12 h senare genom att fixera cellerna med PFA, färgning deras kärnor med DAPI, och utförande av laserskanning konfokalmikroskopi (excitation lasrar: 405 nm, DAPI, blått; 514 nm, Cy3, orange). Bilderna visar celltillväxt i området med magnet ansökan; utan magnetapplikation; och i centrum av odlingsbrunn, där flödet av flytande koncentrerade cellerna. Skal staplarna är 50 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Produktion av genetiskt manipulerade celler laddade med superparamagnetiska nanopartiklar för deras ytterligare magnetiskt kontrollerad vägledning presenteras i det nuvarande protokollet. Framgångsrik tillämpning av denna strategi möjliggör upplösningen av vissa svårigheter av cellterapi, såsom låg retention och dålig engraftment i det skadade området 2, 3, 4, genom att tillhandahålla en inriktningsbar cellprodukt för transplantation. Dessutom skulle det samtidiga införandet av lämpligt valt genetiskt material främja cellegenskaper och kunde således öka funktionella fördelar 41.
Den nuvarande protokollet har utvecklats på HUVEC som modell. Dessa celler är kända för att vara svåra att transfektera och mottagliga för toxiska påverkan 18, 19, 20. DEMonstrated nivå av fluorofor-märkt miR upptag över 95% efter PEI / MNP transfektion erhålls typiskt med PEI-baserade vektorer och som vanligen används katjoniska lipidbaserade transfektionsreagens (t ex lipofektamin) 42. Dessutom kan den optimala NP förhållande av 25 motsvarar med tidigare publicerade värden på 20 - 40 för NP. Ändå har den högeffektiva upptag av testade fluorofor-märkta miR inte nödvändigtvis garanterar korrekt miR bearbetning och funktion efter leverans 43. Denna punkt är särskilt relevant när det gäller PEI, med dess snäva elektro kondensation av NA. Följaktligen får den resulterande funktionella kapaciteten hos levererad miR också testas. Här, en funktionell miR endogent uttryckta i HUVEC, var miR-92a 31, utvalt, och anti-miR mot det levererades med användning av PEI och PEI / MNP. Som ett resultat, en nästan fullständig knockdown av målet miR-92a bevisat effektiv frisättning av anti-miR from transfektionsexperimenten komplex.
Viktigare, i tidigare verk, var framgångsrik tillämpning av PEI / MNP-vektor visats för leverans av plasmid-DNA (pDNA) och miR till andra celltyper, både vidhäftande (t.ex. COS7, humana mesenkymala stamceller 15, 16) och i suspension (t ex benmärgshärledda CD133 + hematopoietiska stamceller 44). Alla dessa experiment har bekräftat det kända faktum att transfektionseffektiviteten och toxicitet är celltypsberoende 45. Sålunda, valet av den optimala vektorn kompositionen (dvs miR belopp, NP-förhållandet, och mängden av MNP järn) bör utföras för varje speciell celltyp, genom att använda tidigare fastställda optimala förhållanden som referenspunkter.
Dessutom bör övergående karaktär uppnått genetiska modifieringen redovisas. Å ena sidan, it är mycket lämplig för viss funktion, såsom den kortsiktiga leverans av tillväxtfaktorer. Å andra sidan kan varaktigheten av uttryck inte tillräckligt länge för olika ändamål som kräver långsiktig uttryck. Icke desto mindre, den beprövade säkerheten hos PEI / MNP vektor stöder dess möjliga upprepad administrering när villkoren är ytterligare optimeras.
PEI och dess derivat används ofta på grund av deras höga effektivitet jämfört med andra icke-virala vehiklar och deras flexibilitet för modifiering 7. Men trots PEI framgång in vitro och in vivo, dess tillämpning i kliniska prövningar är mycket begränsad (dvs. några fas ett och två prövningar eller cancerpatienter) 7, 14 på grund av PEI toxicitet 7, 13. Som tidigare verk i vår grupp 16, liksom detta protokoll, har visat, MNPhar möjlighet att minska PEI toxicitet avsevärt. I synnerhet, har miR / PEI transfektion skadade förmågan hos HUVEC att bilda rören på sin matris, därmed inte en huvud in vitro funktionellt test för dessa celler. I kontrast, rörbildning prestanda miR / PEI / MNP-HUVEC var jämförbar med obehandlade celler. Noterbart var denna minskning av PEI toxicitet uppnås genom införande av låga halter av komponenter, såsom järnoxid, som är biokompatibel och som rutinmässigt används som en kontrast reagens i humanpatienter 40.
Bortsett från att bibehålla funktionella egenskaper, är det viktigt att modifierade cellerna är kapabla att upprättandet intercellulär kommunikation, som den här funktionen är nödvändigt för en korrekt integrering av cell terapeutika efter transplantation 46. Dessutom kan modifierade celler utnyttjas som bärare för leverans av terapeutiska miR till skadade vävnader 47. I det här fallet, deras Capacity för att utbyta molekyler med angränsande celler definierar deras framgång som ett fordon. Eftersom PEI / MNP transfektion tillåter GJIC i modifierade HUVEC har de potential för integration in vivo och ge miR leverans till skadade områden.
Notably, har tidigare publicerade arbeten på cell magnetisering för efterföljande inriktning rapporterade cellbelastning av ~ 4 och 30 pg av järn / cell 48, 49, 50, 51. Dessa siffror avsevärt överskrida de värden ~ 0,16-0,7 pg / cell, som var tillräckliga för den målsökande in vitro av NA / PEI / MNP-HUVEC i statiska och simulerade dynamiska förhållanden. Sådana låga mängder järn är välgörande när det gäller säkerhet: en allmänt känd mekanism av järnoxid nanopartikel-associerad toxicitet (dvs. produktionen av reaktiva syrespecies (ROS)) är känd för att vara direkt förknippad med mängden av integrernalized nanopartiklar 40. Dessutom har flera studier visat att höga intracellulära nivåer av järnoxidnanopartiklar kan leda till dosberoende cytoskelettala desorganisation och skador 52, 53. Viktigt rapporterade de flesta fall av cell magnetisering för inriktning ändamål inkluderar inte genetisk cell manipulation. I kontrast tillhandahåller miR / PEI / MNP-vektorn en möjlighet att samtidigt modifiera celler och för att lägga till magnetiska egenskaper.
Dock kan låg MNP loading vara inte tillräckligt för magnetisk inriktning i en turbulent miljö med blodflödet. I syfte att komma närmare den utmanande situationen in vivo, var dynamiska förhållanden simuleras in vitro: odlingsplattor med magnetiserad miR / PEI / MNP-HUVEC i suspension placerades på roterande skakapparat 34. Detta experiment uppenbarligen inte kan täcka alla interaktioner som förekommer ivivo. Men ledde det till en bättre förståelse av den måls potential PEI / MNP-modifierade celler. Som ett resultat, var mycket effektiv cellinriktning demonstrerades när även aktiv skakning av odlingsmediet inte störde cellrörelse mot magneten 54. För detta ändamål, var miR-modifierade HUVEC laddad med åtminstone ~ 0,16 pg av järn / cell. Dessutom kan magnetiskt påverkbara celler för sortering. En magnet-baserad cellseparationsförfarande appliceras på den aktuella studien har inte äventyras viabilitet Mir / PEI / MNP-celler. Viktigare, applicering av ett statiskt magnetfält (dvs inriktning experiment som involverade applicering av ett magnetfält för 12-24 h) inte ha en skadlig effekt på målsökta celler. Därför, den demonstrerade produktion av magnetiserade genetiskt modifierade celler utgör grunden för ytterligare in vivo-undersökningar behandlar effektiviteten av cellkvarhållande säkerställs genom magnetisk kraft. Noterbart är the mest framgångsrika in vivo-studier med användning av målsökning av magnetiserade celler 51, 54, 55 begagnade cellkvarhållning efter lokal administrering i stället för cell vägledning efter intravenös injektion. Därför verkar magnetbaserade retention vid injektionsstället önskvärt för ytterligare in vivo-applikationer av miR / PEI / MNP-modifierade celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inga konkurrerande ekonomiska intressen att lämna ut.
Acknowledgments
Vi vill tacka G. Fulda (Electron Microscopy Centre, Rostock universitet, Tyskland) för teknisk support förvärva TEM-bilder av filtrerad supernanopartiklar och att utföra sina röntgenanalys. Det arbete som utförs på RTC Rostock stöddes av förbundsministeriet för utbildning och forskning Tyskland (FKZ 0312138A, FKZ 316.159 och VIP + 03VP00241) och staten Mecklenburg-Vorpommern med EU: s strukturfonder (ESF / IV-WM-B34- 0030/10 och ESF / IV-BM-B35-0010 / 12) och av DFG (DA 1296-1), Damp-Foundation, och den tyska Heart Foundation (F / 01/12). Frank Wiekhorst stöddes av EU FP7 forskningsprogrammet "NanoMag" FP7-NMP-2013-LARGE-7.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PEI 25 kDa | Sigma Aldrich | 408727 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | |
| PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17085101 | Containing Sephadex G-25 Medium |
| Ninhydrin Reagent solution 2% | Sigma Aldrich | 7285 | |
| Glycine | Sigma Aldrich | 410225 | |
| Pierce Biotin Quantitation Kit | Thermo Scientific | 28005 | |
| Microplate reader Model 680 | Bio-Rad | ||
| Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles | Promega | Z5481 | |
| Millex-HV PVDF Filter | Merck | SLHV013SL | 0.45 µm |
| Libra 120 transmission electron microscope | Zeiss | Acceleration Voltage 120 kV | |
| Sapphire X-ray detector | EDAX-Amatek | ||
| Cell culture plastic | TPP | ||
| NHS-Esther Atto 565 | ATTO-TEC GmbH | AD 565-31 | |
| NHS-Esther Atto 488 | ATTO-TEC GmbH | AD 488-31 | |
| Cy5 miRNA Label IT kit | Mirus Bio | MIR 9650 | |
| Biotin Atto 565 | ATTO-TEC GmbH | AD 565-71 | |
| Collagense Type IV Gibco | Thermo Scientific | 17104019 | |
| Endothelial growth medium, EGM-2 | Lonza | CC-3156 & CC-4176 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | 15140122 | 100 U/mL, 100 µg/mL |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| anti-PECAM-1 antibody | Santa Cruz | sc-1506 | |
| MS MACS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit | Thermo Scientific | L10119 | |
| Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control | Thermo Scientific | AM17120 | "Cy3-miR" or "Cyanine-miR3" in the manuscript |
| Pre-miR miRNA Precursor Molecules - Negative Control | Thermo Scientific | AM17110 | "scr-miR" in the manuscript |
| Anti-hsa-miR92a-3p synthetic Inhibitor | Thermo Scientific | AM10916 | |
| LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 158127 | 4% solution in PBS |
| DAPI nuclear stain | Thermo Scientific | D1306 | |
| NucleoSpin RNA isolation Kit | Machery-Nagel | 740955 | |
| mirVana miRNA Isolation Kit | Thermo Scientific | AM1560 | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Thermo Scientific | 4366596 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystems | ||
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Scientific | 4368814 | |
| hsa-miR-92a TaqMan assay | Thermo Scientific | 000431 | Mature miRNA Sequence: UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU |
| FastGene Taq Ready Mix | Nippon Genetics | LS27 | |
| ITGA5 TaqMan assay | Thermo Scientific | Hs01547673_m1 | |
| RNU6B TaqMan assay | Thermo Scientific | 001093 | |
| 18S rRNA Endogenous Control | Thermo Scientific | 4333760F | |
| Gelatin | Sigma Aldrich | G7041 | |
| CellTrace Calcein Red-Orange | Thermo Scientific | C34851 | |
| PBS | Pan Biotech | P04-53500 | |
| BSA | Sigma Aldrich | ||
| MACS buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
| 7.1 Tesla animal MRI system | Bruker Corporation | A7906 | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | upgraded with an AngiogenesisAnalyzer (NIH) | |
| MPS device | Bruker Biospin | ||
| Matlab software | Mathworks | ||
| Ring Neodym Magnet | magnets4you GmbH | RM-10x04x05-G | ø 10 mm; remanescence is ~ 1.3 T, coercivity ≥ 955 kA/m |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit | Thermo Scientific | C10340 | |
| FluorSave Reagent | Merck | 345789 | |
| Ultrasonic bath | Bandelin electronic | Type: RK 100 SH |
References
- Behfar, A., Crespo-Diaz, R., Terzic, A., Gersh, B. J. Cell therapy for cardiac repair-lessons from clinical trials. Nat Rev Cardiol. 11 (4), 232-246 (2014).
- Zeng, L., Hu, Q., et al. Bioenergetic and functional consequences of bone marrow-derived multipotent progenitor cell transplantation in hearts with postinfarction left ventricular remodeling. Circulation. 115 (14), 1866-1875 (2007).
- Dib, N., Khawaja, H., Varner, S., McCarthy, M., Campbell, A. Cell therapy for cardiovascular disease: a comparison of methods of delivery. J Cardiovasc Transl Res. 4 (2), 177-181 (2011).
- Terrovitis, J., Lautamäki, R., et al. Noninvasive Quantification and Optimization of Acute Cell Retention by In Vivo Positron Emission Tomography After Intramyocardial Cardiac-Derived Stem Cell Delivery. J Am Coll Cardiol. 54 (17), 1619-1626 (2009).
- Villate-Beitia, I., Puras, G., Zarate, J., Agirre, M., Ojeda, E., Pedraz, J. L. First Insights into Non-invasive Administration Routes for Non-viral Gene Therapy. Gene Therapy - Principles and Challenges. , (2015).
- Nayerossadat, N., Maedeh, T., Ali, P. A. Viral and nonviral delivery systems for gene delivery. Adv Biomed Res. 1, 27 (2012).
- Yin, H., Kanasty, R. L., Eltoukhy, A. A., Vegas, A. J., Dorkin, J. R., Anderson, D. G. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nat Rev Genet. 15 (8), 541-555 (2014).
- Chira, S., Jackson, C. S., et al. Progresses towards safe and efficient gene therapy vectors. Oncotarget. 6 (31), 30675-30703 (2015).
- Li, W., Ma, N., et al. Enhanced thoracic gene delivery by magnetic nanobead-mediated vector. J Gene Med. 10 (8), 897-909 (2008).
- Muthana, M., Kennerley, A. J., et al. Use of magnetic resonance targeting to direct cell therapy to target sites in vivo. Nat Commun. 6, 1-11 (2013).
- Zheng, B., von See, M. P., et al. Quantitative Magnetic Particle Imaging Monitors the Transplantation, Biodistribution, and Clearance of Stem Cells In Vivo. Theranostics. 6 (3), 291-301 (2016).
- Almstätter, I., Mykhaylyk, O., et al. Characterization of magnetic viral complexes for targeted delivery in oncology. Theranostics. 5 (7), 667-685 (2015).
- Juliano, R. L. The delivery of therapeutic oligonucleotides. Nucleic Acids Res. , (2016).
- Chen, J., Guo, Z., Tian, H., Chen, X. Production and clinical development of nanoparticles for gene delivery. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16023 (2016).
- Schade, A., Delyagina, E., et al. Innovative strategy for microRNA delivery in human mesenchymal stem cells via magnetic nanoparticles. Int J Mol Sci. 14 (6), 10710-10726 (2013).
- Delyagina, E., Schade, A., et al. Improved transfection in human mesenchymal stem cells: effective intracellular release of pDNA by magnetic polyplexes. Nanomedicine. 9 (7), 999-1017 (2014).
- Voronina, N., Lemcke, H., et al. Non-viral magnetic engineering of endothelial cells with microRNA and plasmid-DNA-An optimized targeting approach. Nanomedicine. 12 (8), 2353-2364 (2016).
- Hunt, M. A., Currie, M. J., Robinson, B. A., Dachs, G. U. Optimizing transfection of primary human umbilical vein endothelial cells using commercially available chemical transfection reagents. J Biomol Tech. 21 (2), 66-72 (2010).
- Zhang, J., Wang, Z., Lin, W., Chen, S. Gene transfection in complex media using PCBMAEE-PCBMA copolymer with both hydrolytic and zwitterionic blocks. Biomaterials. 35 (27), 7909-7918 (2014).
- Lim, J., Dobson, J. Improved transfection of HUVEC and MEF cells using DNA complexes with magnetic nanoparticles in an oscillating field. J Genet. 91 (2), 223-227 (2012).
- Moore, S., Stein, W. H. A modified ninhydrin reagent for the photometric determination of amino acids and related compounds. J Biol Chem. 211 (2), 907-913 (1954).
- Jones, D. L., Owen, A. G., Farrar, J. F. Simple method to enable the high resolution determination of total free amino acids in soil solutions and soil extracts. Soil Biol Biochem. 34 (12), 1893-1902 (2002).
- Kircheis, R., Wightman, L., et al. Polyethylenimine/DNA complexes shielded by transferrin target gene expression to tumors after systemic application. Gene Ther. 8 (1), 28-40 (2001).
- Green, N. M. A SPECTROPHOTOMETRIC ASSAY FOR AVIDIN AND BIOTIN BASED ON BINDING OF DYES BY AVIDIN. Biochem J. 94, 23 (1965).
- Haugland, R. P., You, W. W. Coupling of Antibodies with Biotin. Methods Mol Biol. 418, 13-23 (2008).
- Braunschweig, J., Bosch, J., Heister, K., Kuebeck, C., Meckenstock, R. U. Reevaluation of colorimetric iron determination methods commonly used in geomicrobiology. J Microbiol Methods. 89 (1), 41-48 (2012).
- Andrade, ÂL., Valente, M. A., Ferreira, J. M. F., Fabris, J. D. Preparation of size-controlled nanoparticles of magnetite. J Magn Magn Mater. 324 (10), 1753-1757 (2012).
- Barbaro, D., Di Bari, L., et al. Glucose-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles prepared by metal vapour synthesis are electively internalized in a pancreatic adenocarcinoma cell line expressing GLUT1 transporter. PLoS ONE. 10 (4), e0123159 (2015).
- Gaebel, R., Ma, N., et al. Patterning human stem cells and endothelial cells with laser printing for cardiac regeneration. Biomaterials. 32 (35), 9218-9230 (2011).
- Martín de Llano, J. J., Fuertes, G., Torró, I., García Vicent, C., Fayos, J. L., Lurbe, E. Birth weight and characteristics of endothelial and smooth muscle cell cultures from human umbilical cord vessels. J Transl Med. 7, 30 (2009).
- Bonauer, A., Carmona, G., et al. MicroRNA-92a controls angiogenesis and functional recovery of ischemic tissues in mice. Science. 324 (5935), 1710-1713 (2009).
- Wang, W., Li, W., et al. Polyethylenimine-mediated gene delivery into human bone marrow mesenchymal stem cells from patients. J Cell Mol Med. 15 (9), 1989-1998 (2011).
- Lemcke, H., Peukert, J., Voronina, N., Skorska, A., Steinhoff, G., David, R. Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes. J Mol Cell Cardiol. 98, 117-127 (2016).
- Cheng, K., Li, T. -S., Malliaras, K., Davis, D. R., Zhang, Y., Marbán, E. Magnetic targeting enhances engraftment and functional benefit of iron-labeled cardiosphere-derived cells in myocardial infarction. Circ Res. 106 (10), 1570-1581 (2010).
- Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Curr Protoc Immunol. , A.3B.1-A.3B.2 (2001).
- Chorny, M., Alferiev, I. S., et al. Formulation and in vitro characterization of composite biodegradable magnetic nanoparticles for magnetically guided cell delivery. Pharm Res. 29 (5), 1232-1241 (2012).
- Poller, W., Löwa, N., et al. Magnetic Particle Spectroscopy Reveals Dynamic Changes in the Magnetic Behavior of Very Small Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles During Cellular Uptake and Enables Determination of Cell-Labeling Efficacy. J Biomed Nanotechnol. 12 (2), 337-346 (2016).
- Lobsien, D., Dreyer, A. Y., Stroh, A., Boltze, J., Hoffmann, K. T. Imaging of VSOP Labeled Stem Cells in Agarose Phantoms with Susceptibility Weighted and T2* Weighted MR Imaging at 3T: Determination of the Detection Limit. PLoS ONE. 8 (5), 1-10 (2013).
- Hernando, D., Kühn, J. -P., et al. R2* estimation using "in-phase" echoes in the presence of fat: the effects of complex spectrum of fat. J Magn Reson Imaging. 37 (3), 717-726 (2013).
- Soenen, S. J., Rivera-Gil, P., Montenegro, J. -M., Parak, W. J., De Smedt, S. C., Braeckmans, K. Cellular toxicity of inorganic nanoparticles: Common aspects and guidelines for improved nanotoxicity evaluation. Nano Today. 6 (5), 446-465 (2011).
- Robert, D., Kirkton, N. B. Genetic Engineering and Stem Cells: Combinatorial Approaches for Cardiac Cell Therapy. IEEE Eng Med Biol Mag. 27 (3), 85 (2008).
- Chen, Y., Wang, W., et al. Development of an MRI-visible nonviral vector for siRNA delivery targeting gastric cancer. Int J Nanomedicine. 7, 359-368 (2012).
- Diener, Y., Jurk, M., et al. RNA-based, transient modulation of gene expression in human haematopoietic stem and progenitor cells. Sci Rep. 5, 17184 (2015).
- Müller, P., Voronina, N., et al. Magnet-Bead Based MicroRNA Delivery System to Modify CD133+ Stem Cells. Stem Cells Int. 2016, 1-16 (2016).
- Yang, H., Vonk, L. A., et al. Cell type and transfection reagent-dependent effects on viability, cell content, cell cycle and inflammation of RNAi in human primary mesenchymal cells. Eur J Pharm Sci. 53, 35-44 (2014).
- Chen, C. -H., Sereti, K. -I., Wu, B. M., Ardehali, R. Translational aspects of cardiac cell therapy. J Cell Mol Med. 19 (8), 1757-1772 (2015).
- Alaiti, M. A., Ishikawa, M., et al. Up-regulation of miR-210 by vascular endothelial growth factor in ex vivo expanded CD34+ cells enhances cell-mediated angiogenesis. J Cell Mol Med. 16 (10), 2413-2421 (2012).
- Landázuri, N., Tong, S., et al. Magnetic targeting of human mesenchymal stem cells with internalized superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Small. 9 (23), 4017-4026 (2013).
- Carenza, E., Barceló, V., et al. In vitro angiogenic performance and in vivo brain targeting of magnetized endothelial progenitor cells for neurorepair therapies. Nanomedicine. 10 (1), 225-234 (2014).
- Kyrtatos, P. G., Lehtolainen, P., et al. Magnetic Tagging Increases Delivery of Circulating Progenitors in Vascular Injury. JACC Cardiovasc Interv. 2 (8), 794-802 (2009).
- Huang, Z., Shen, Y., et al. Magnetic targeting enhances retrograde cell retention in a rat model of myocardial infarction. Stem Cell Res Ther. 4 (6), 149 (2013).
- Wu, X., Tan, Y., Mao, H., Zhang, M. Toxic effects of iron oxide nanoparticles on human umbilical vein endothelial cells. Int J Nanomedicine. 5, 385-399 (2010).
- Soenen, S. J. H., Nuytten, N., De Meyer, S. F., De Smedt, S. C., De Cuyper, M. High Intracellular Iron Oxide Nanoparticle Concentrations Affect Cellular Cytoskeleton and Focal Adhesion Kinase-Mediated Signaling. Small. 6 (7), 832-842 (2010).
- Cheng, K., Malliaras, K., et al. Magnetic enhancement of cell retention, engraftment, and functional benefit after intracoronary delivery of cardiac-derived stem cells in a rat model of ischemia/reperfusion. Cell Transplant. 21 (6), 1121-1135 (2012).
- Vandergriff, A. C., Hensley, T. M., et al. Magnetic targeting of cardiosphere-derived stem cells with ferumoxytol nanoparticles for treating rats with myocardial infarction. Biomaterials. 35 (30), 8528-8539 (2014).
