Summary
يعرض هذا العمل الجديد في نموذج الجسم الحي من إصابة الكلى القطعي باستخدام الكلى غفب المعدلة وراثيا الزرد. نموذج يسمح لتحريض الاجتثاث المستهدفة من الخلايا الظهارية الكلى لإظهار الآليات الخلوية للإصابة نيفرون وإصلاح.
Abstract
إصابة الكلى الحاد (أكي) هو حالة طبية شائعة مع ارتفاع معدل الوفيات. مع قدرات إصلاح الكلى، فمن الممكن لاستعادة وظائف الكلى الكافية بعد العلاج الداعم. ومع ذلك، هناك حاجة إلى فهم أفضل لكيفية موت الخلايا نيفرون وإصلاح على المستوى الخلوي للحد من موت الخلايا وتعزيز عملية التجدد. و برونيفروس الزرد هو نظام نموذج جيد لتحقيق هذا الهدف لأنه يحتوي على شرائح التشريحية التي تشبه نفرون الثدييات. في السابق، كان النموذج الأكثر شيوعا لدراسة إصابة الكلى في الأسماك نموذج جنتاميسين الدوائية. ومع ذلك، فإن هذا النموذج لا يسمح للسيطرة الزمانية الزمانية دقيقة من الإصابة، وبالتالي فمن الصعب دراسة العمليات الخلوية والجزيئية المعنية في إصلاح الكلى. للتغلب على هذا القيد، يعرض هذا العمل طريقة يمكن من خلالها، على النقيض من النهج جنتاميسين، بروتين أخضر فوريسنت محددة (غفب) -exوالضغط على جزء نيفرون يمكن تصويرها باستخدام ضوء الليزر البنفسجي (405 نانومتر). هذا النموذج الرواية من أكي يوفر العديد من المزايا التي أساليب أخرى من الإصابة الظهارية تفتقر. مزاياه الرئيسية هي القدرة على "الاتصال الهاتفي" مستوى الإصابة والتحكم الزماني الزماني الدقيق في قوية في نموذج الحيوان الحي . هذه الطريقة الجديدة لديها القدرة على تحقيق تقدم كبير في مستوى فهم إصابات الكلى وآليات إصلاح.
Introduction
إصابة الكلى الحادة (أكي) 1 ، 2 ، والتي يمكن أيضا أن يشار إليها بالفشل الكلوي الحاد، يتم تعريفها على نطاق واسع بأنها ضعف مفاجئ في وظائف الكلى 3 . في حين أن مستوى فهم هذا الشرط قد تعزز بشكل ملحوظ على مر السنين، ظلت معدلات الاعتلال والوفيات مرتفعة 1 ، 2 . العلاج الحالي لهذه الحالة هو في الغالب داعمة، كما كانت نتيجة التجارب السريرية متعددة من العلاج بالعقاقير السلبية 4 ، 5 . الكلى هي فريدة من نوعها في أن لديها القدرة على إصلاح نفسها. لذلك، العلاج الداعم بعد التشخيص المبكر لل أكي هو أفضل وسيلة للحد من الاعتلال 6 . ومع ذلك، فإنه من الصعب الكشف عن أكي في وقت مبكر، ومعدل الوفيات هو مذهل 50-80٪ لأولئك الذين يحتاجون إلى غسيل الكلى 5. مع قدرة الكلى على إصلاح أنفسهم وعدم وجود خيارات العلاج لهذا الشرط، فمن المهم لتطوير أساليب لتعزيز هذه العملية تجديد نيفرون.
كانت هناك العديد من النماذج المختلفة المستخدمة لأبحاث أكي التي تشمل عوامل مختلفة للإصابة والنماذج الحيوانية. من حيث وكلاء تلف الكلى، وقد استخدم جينتاميسين المضادات الحيوية أمينوغليكوزيد كعامل كلوي يؤدي إلى أكي 7 ، 8 . ومع ذلك، وجدت عدة مجموعات أن العلاج الجنتاميسين هو قاتلة إلى الجنين الزرد 9 . أنه يسبب الضرر أنبوبي الذي هو خطير جدا لاستعادة الجنين، مما يجعل دراسة تجديد صعبة من دون نوع من التدخل. وتعتبر نماذج الثدييات، مثل الفئران والفئران، قيمة أيضا، ولكنها تواجه العديد من القيود أثناء دراسة أكي. ولعل العيب الرئيسي لنماذج القوارض هو صعوبة فيسواليزينغ الكلى القوارض وبالتالي تحديد العمليات المكانية الزمانية دقيقة مما يؤدي إلى الموت الظهاري وإصلاح.
جونسون وآخرون. قد ذكرت تقنية القائم على التذرية الليزر للحث على إصابة الكلى الحادة في الزرد الجنينية واليرقات 9 . واستخدموا التذرية الليزر نابض لتلف الكلى بعد الحقن العضلي مع تقارن ديكستران. مضان من يقارن ديكستران يسمح لتصور الضرر وتجديد في ظهارة نبيب 9 . هذا النموذج يتغلب على اثنين من القيود المذكورة أعلاه، لكنه لا يسمح لمستويات متدرجة من الاصابة ويصعب القيام بها على مجموعات الخلايا التعسفية الكبيرة.
نموذج الزرد القائم على الاجتثاث الليزر الجديد من أكي وصفها هنا يتناول كل القيود المذكورة أعلاه. إن الكلى الليمونية في الزرد اليرقي هي ناضجة، وهي الجهاز الذي يحتوي على شرائح مشابهة للثدييات نفرون، بما في ذلك الكبيبات، والأنابيب القريبة والقاصية، وقناة تجميع 10 . اليرقات الزرد هي أيضا شفافة بصريا، مما يجعل من الممكن لمراقبة الكلى من خلال تقنيات مضان. وهكذا، الزرد هي قيمة في نموذج الجسم الحي من أكي، والكلى اليرقات الليمون (5-12 يوما بعد التسميد (دبف) يمكن استخدامها لدراسة العمليات الخلوية والجزيئية المعنية في إصابة الكلى وإصلاح.
تعرض هذه الورقة طريقة يمكن من خلالها تصوير بروتينات الفلورسنت الأخضر (غفب) محددة، بقطع نفرون باستخدام طاقة منخفضة (بالمقارنة مع نظام ليزر نابض) ضوء الليزر البنفسجي (405 نانومتر). و غفب مضان يسمح لاستهداف مجموعة من الخلايا، مما يجعل التغييرات التي تحدث مرئية من خلال مراقبة فوتوبلاشينغ غفب. وبالإضافة إلى ذلك، غفب (عن طريق امتصاص الضوء البنفسجي) بمثابة بالوعة الطاقة لتحفيز الإصابة في غفب معربا عن خلايا الكلى. الفاصل الزمني الفاصل بين الوقتثم يمكن استخدام نسخة لدراسة عملية الإصلاح. وقد وجدت الدراسات تكاثر الخلايا، وهجرة الخلايا، وحؤول الخلايا 11 ، 12 ، 13 إلى أن تكون العمليات المحتملة التي قد تلعب دورا هاما في إصلاح الكلى. ومع ذلك، فإن الأهمية النسبية لهذه العمليات وتفاصيل تفاعلها كان من الصعب كشف بسبب القيود المفروضة على النماذج الحالية من أكي. باستخدام هذا النهج الرواية، كان من الممكن أن تظهر أن الهجرة الخلية تلعب دورا رئيسيا في إصلاح الكلى بعد إصابة حادة 14 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد أجريت هذه الدراسة وفقا للتوصيات الواردة في دليل رعاية الحيوانات المختبرية واستخدامها في المعاهد الوطنية للصحة. تمت الموافقة على البروتوكول من قبل كلية نيت كلية الطب العظمي المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام اللجنة (نيتكوم إاكوك). وأجريت جميع العمليات الجراحية والتجريب في الجسم الحي تحت التخدير تريكين، وبذلت كل الجهود للحد من المعاناة.
1. الحصول على الأجنة والحفاظ عليها
- الحصول على الأجنة عن طريق عبور الكلى غفب الفلورسنت الزرد.
ملاحظة: وترد أمثلة من خطوط المعدلة وراثيا الزرد فلورزنتلي المسمى في الجدول 1 . - الحفاظ على الأجنة في 28.5 درجة مئوية في حل E3 خلال 24 ساعة بعد الإخصاب.
- بعد 24 ساعة، استبدل الوسط بمحلول E3 يحتوي على 0.003٪ 1-فينيل-2-ثيوريا (بتو).
ملاحظة: يستخدم بتو لأنه يمنع الخطوات التي تعتمد على التيروزيناز في الميلانوجينيسوبالتالي يمنع تصبغ. هنا، يشار إلى هذا الحل باسم E3-بتو. - رفع الأجنة المخصبة في 28.5 درجة مئوية حتى هم> 6 دبف، عند هذه النقطة قد نضجت الكلى.
ملاحظة: من الأفضل استخدام اليرقات في النافذة 7-9 دبف. - باستخدام المجهر تشريح الفلورسنت في 40X التكبير والمرشحات الانبعاثات مضان الخضراء، حدد اليرقات مع مشرق الكلى غفب مضان.
2. تركيب الزرد لايف التصوير
- إذا فوتوابلاتينغ الأجنة قبل 3 دبف، إزالة المشيماء من أي الزرد لم يسبق لها مثيل قبل تركيب الزرد للتصوير.
- يدويا ديكورينات مع ملقط (المفضل) أو استخدام العلاج الكيميائي مع خليط البروتياز.
ملاحظة: ديستوريناتيون يسمح لأفضل نتائج التصوير.
- يدويا ديكورينات مع ملقط (المفضل) أو استخدام العلاج الكيميائي مع خليط البروتياز.
- شطف الحطام المشيماء في طبق بتري باستخدام حل E3-بتو وإعادة ملء الطبق مع E3-بتو.
- استعداداتإعادة 1-2٪ نقطة انصهار منخفضة (لمب) الاغاروز مع 0.2 ملغ / مل حل تريكين لتركيب الزرد ل فوتوابلاتيون الكلى والتصوير الحي.
- إذا تم تحضير الاغاروز لمب مسبقا مسبقا، تسخينه في الميكروويف لإذابة عليه.
- مرة واحدة يتم إعداد الاغاروز لمب، وضع 35 ملم طبق بتري البلاستيك على المجهر تشريح. وضع مسبار الزجاج سحبت القريبة لتوجيه بشكل صحيح اليرقات تخدير.
ملاحظة: من المهم أن تفعل هذه الخطوة في الوقت المناسب وأن يكون كل شيء في مكان، لأن الأجنة يجب أن تكون موجهة قبل الاغاروز يتصاعد في حوالي 1-3 دقيقة. - قبل نقل الجنين إلى الاغاروز، تأكد من أن الاغاروز هو بارد ( أي في حوالي درجة حرارة الجسم). استخدام ماصة نقل البلاستيك أو الزجاج لوضع الجنين في تبريد أسفل ذاب حل الاغاروز تريكين.
ملاحظة: يتم ذلك لأن الاغاروز التي حار جدا يمكن أن تكون ضارة للجنين، مما يؤدي إلى السكتة القلبيةأو الوفاة - باستخدام ماصة نقل، إعادة رسم الجنين في حل الاغاروز وموقف الجنين / يرقة في منتصف طبق 35 ملم.
- انتشار بسرعة الاغاروز التي تحتوي على الجنين / يرقة لتغطية بالتساوي الجزء السفلي من طبق 35 مم. أفضل حجم من الاغاروز للاستخدام ~ 1-1.1 مل.
- استخدام مسبار الزجاج لتوجيه الجنين في أفضل موقف ممكن ل فوتوابلاتيون والتصوير.
ملاحظة: الفيلم 1 يظهر أفضل اتجاه الجنين / يرقات ل فوتوابلاتيون من جانب واحد. هذه الخطوة هي الأكثر حساسية للوقت ويجب أن يتم بسرعة قبل الاغاروز يبدأ هلام، كما أن أي محاولة لإعادة توجيه الأسماك بعد بدء التبلور هو ضار.- توجيه اليرقة بحيث قطاع الكلى من الفائدة هو عمودي على مسار شعاع في حين أن الجزء المقابل هو بعيدا عن شعاع الليزر (انظر الفيلم 1 ).
ملاحظة: يمكن تحقيق ذلك عن طريق تحويل اليرقة كما هو مبين في الفيلم 1 . - السماح حوالي 15 دقيقة لالأغاروز لتصلب. تغطية طبق بتري للحد من التبخر. مرة واحدة وقد عززت الاغاروز، الجنين أو اليرقة مستعدة ل فوتوابلاتيون.
3. الليزر الاجتثاث
- تشغيل نظام التصوير مبائر.
ملاحظة: عند استخدام منصة التصوير المشار إليها (انظر جدول المواد)، وتشمل الإعدادات الموصى بها 40X التكبير، 0.8 نا غمس عدسة المياه، والمرآة مزدوج اللون الأول مجموعة للسماح كل من 488 و 405 نانومتر إضاءة العينة. وينبغي إجراء الكشف على القناة الخضراء. - وضع طبق يحتوي على الزرد يجمد على مرحلة مبائر.
ملاحظة: هذا الإجراء هو الأمثل لتكوين تستقيم باستخدام 40-60X عدسة غمس المياه. ومع ذلك، ينبغي أن يكون من الممكن تعديل الإجراء للمجهر مقلوب. - في التكوين تستقيم، ووضع طبق بتري تحتوي على الجنين على رأس المجهرأوب، والحفاظ عليها في مكانها باستخدام الطين النمذجة (على سبيل المثال، البلاستيسين). وضع الشريحة الزجاجية مع طبق بتري على مرحلة المجهر متحد البؤر.
- إضافة 3 مل من حل التصوير E3-بتو (انظر الخطوة 1.3) مع 0.2 ملغ / مل تريكين.
ملاحظة: ويمكن أيضا أن يضاف حل التصوير على الفور قبل وضع الشريحة على خشبة المسرح. وينبغي أن يتم إضافة حل التصوير بعناية فائقة لمنع الاغاروز من العائمة قبالة الجزء السفلي من الطبق. - التبديل إلى عدسة غمس المياه (40 أو 60X). ببطء رفع المرحلة، والتأكد من أن العدسة زوايا قليلا لمنع الهواء من أن تصبح محاصرين في مسار شعاع. وبمجرد أن تلمس العدسة الحل في زاوية، مركز ذلك بحيث يكون في مجال الرؤية من الأجنة.
- العثور على شريحة من الفائدة باستخدام مصدر ضوء مضان. سوبيرفيسيالي موقف الفرع المستهدفة للإصابة لتقليل تشتت الضوء (انظر الفيلم 1 ).
ملاحظة: ذي سوبلوسنt استخدام الخطوات من البرمجيات المشار إليها (انظر جدول المواد)، ولكن الإجراء يمكن تكييفها بسهولة لمنصات أخرى. - افتح البرنامج. انتقل إلى "عرض" | "التحكم في الاستحواذ" | "C2plus واجهة المستخدم الرسومية المدمجة" وضبط "بكسل الوقت يسكن" إلى "1.9 μs،" "حجم الإطار" إلى "512 × 512 بكسل"، و "حجم الثقب" إلى "90 ميكرون". مجموعة "405 نانومتر (أو 408 نانومتر في بعض النظم) كثافة الليزر" إلى الصفر و "488 كثافة الليزر" إلى "منخفضة" (ويفضل <1٪). ضبط "كسب" للحصول على مجموعة ديناميكية جيدة ولكن ليس لتشبع إشارة.
ملاحظة: هذه القيم ليست حاسمة ويتم استخدامها للاتساق. عندما يتم استخدام ليزر 405 نانومتر، وسوف يؤدي إلى زيادات في مضان غفب. ولتجنب تشبع الإشارة أثناء فوتوبلاشينغ (الخطوة 3.11)، ينبغي خفض قيمة كسب الإشارة إلى القناة الخضراء. ويمكن ترك كسب القناة الزرقاء عند الصفر، حيث أنه لا يستخدم في ساmpling. - انقر فوق "مسح" في واجهة البرنامج لمسح الكلى باستخدام الليزر 488 نانومتر. العثور على شريحة من الفائدة التي عمودي على مسار شعاع وهذا هو تصور جيد، مع جيدة مضان غفب. وبمجرد تحديد هذه المنطقة، رسم منطقة ذات فائدة باستخدام منطقة بيضاوي الشكل من الفائدة (روي).
- انتقل إلى "عائد الاستثمار" | "رسم العائد على الاستثمار الإهليلجي".
ملاحظة: سيتم استخدام هذا لقياس مستمر كثافة غفب في حين أن فوتوبلاشينغ يحدث، مما يسمح لإدارة جرعة دقيقة من العلاج بالليزر.
- انتقل إلى "عائد الاستثمار" | "رسم العائد على الاستثمار الإهليلجي".
- انتقل إلى "عرض" | "عناصر التحكم في الاستحواذ" | "C2plus سكان أريا" واختر "باند سكان أريا". سوف يظهر قناع مستطيلة داخل تلك الواجهة. يدويا تحديد إطار مسح مستطيلة باستخدام المؤشر ( أي السحب، تغيير الحجم، وتحويل القناع) لتغطية الجزء المستهدف للتذرية الليزر. انقر بزر الماوس الأيمن داخلمنطقة قناع لقبول الاختيار.
ملاحظة: سيتم مسح المنطقة المحددة فقط. - بدء قياس الوقت أثناء مراقبة القناة الخضراء فقط باستخدام الليزر 488 نانومتر لتنشيط غفب. تأكد من أن شدة الليزر 488 منخفضة نسبيا (~ 1٪). قياس متوسط كثافة غفب في المنطقة ذات الاهتمام عن طريق اختيار "قياس" | "قياس الوقت". استخدم علامات التبويب "الرسم البياني" أو "البيانات" لمراقبة قيم الشدة المتوسطة ضمن عائد الاستثمار.
ملاحظة: يتم تعريف معدل الاستحواذ من قبل بكسل يسكن الوقت وحجم نافذة مستطيلة المنصوص عليها في الخطوة 3.9، ولكن بشكل عام، فإنه يسمح للرصد السريع للإشارة (~ 2-10 إطارات / ثانية). - يسبب الضرر إلى خلايا الكلى مع الليزر البنفسجي (405 نانومتر) عن طريق زيادة شدة إلى 100٪ عن طريق تحريك "قوة الليزر" السيطرة على طول الطريق إلى اليمين. الليزر 488 نانومتر يمكن أن تبقى نشطة إذا كانت شدة منخفضة.
- مراقبة خط gالجراف باستخدام علامة التبويب "الرسم البياني" أو القيم العددية لشدة غفب باستخدام علامة التبويب "البيانات" وانتظر حتى ينخفض إلى المستوى المطلوب، على سبيل المثال 50٪ من خط الأساس (كما هو مبين في الشكل 1 ).
ملاحظة: تم استخدام ليزر 20 ميغاواط كجزء من وحدة ليزر المشار إليها (انظر جدول المواد )؛ قد تختلف الشدة القصوى بين الأنظمة. يمكن تعويض كثافة أقل عن طريق التعرض لفترة أطول ( أي باستخدام نسبة مئوية تبييض غفب كمقياس للتعرض الكلي).
- مراقبة خط gالجراف باستخدام علامة التبويب "الرسم البياني" أو القيم العددية لشدة غفب باستخدام علامة التبويب "البيانات" وانتظر حتى ينخفض إلى المستوى المطلوب، على سبيل المثال 50٪ من خط الأساس (كما هو مبين في الشكل 1 ).
- وبمجرد أن انخفضت كثافة غفب داخل العائد على الاستثمار بيضاوي الشكل (الخطوة 3.8) إلى المستوى المطلوب، على الفور خفض شدة البنفسجي (405 نانومتر) ليزر إلى "0" عن طريق تحريك شريط "قوة الليزر" المنزلق على طول الطريق إلى اليسار في لوحة التحكم البرمجيات.
- الحصول على خط أساس جديد من مضان غفب. تأكيد الاجتثاث من خلال الحصول على نسبة من X / Y.
ملاحظة: انظر الشكل1B؛ Y = متوسط الكثافة قبل الاجتثاث و X = متوسط الكثافة بعد الاجتثاث، وذلك باستخدام متوسط 4 عينات متتالية داخل عائد الاستثمار. نسبة الهدف المحدد (50٪، 60٪، الخ ) يعتمد على مقدار الإصابة المرغوب فيها لتجربة معينة.
- الحصول على خط أساس جديد من مضان غفب. تأكيد الاجتثاث من خلال الحصول على نسبة من X / Y.
4. الوقت الفاصل بين المجهري مع بروبيديوم يوديد تلطيخ
- تطبيق اعتبارات الفاصل الزمني العامة (المبينة في دراسة سابقة 15 ) لتصور تلطيخ يوديد بروبيديوم كعلاقة من إصابة خلية الكلى بعد فوتوابلاتيون.
- قبل احتضان اليرقات في 30 ميكرومتر محلول يوديد بروبيديوم (1٪ دمسو في E3-بتو) لمدة 3 ساعات قبل التضمين و فوتوابلاتيون، كما هو موضح في الخطوات 2 و 3.7، على التوالي.
ملاحظة: لا يتطلب أي يوديد بروبيديوم إضافية في الاغاروز أو حل التصوير. - يسبب إصابة الكلى القطاعية، كما هو موضح في الخطوات 3.1-3.12.
- الحصول على مداخن صورة الفاصل الزمني، كما وصفسرير في دراسة سابقة 14 ، وذلك باستخدام ليزر 488 نانومتر (غفب) وليزر 461 نانومتر (بروبيديوم يوديد، بي).
ملاحظة: يتم فرضه لونين في مداخن مبائر لربط اختفاء غفب ومظهر تلطيخ يوديد بروبيديوم. - تعيين المعلمات للحصول على مداخن صورة الفاصل الزمني على النحو التالي: شريحة شريحة الظاهري = 4 ميكرون، z- الفاصل الزمني = 2 ميكرون، بكسل الوقت يسكن = 1.9 μs، أبعاد الصورة = 512 × 512، ومتوسط = 2.
ملاحظة: تسمح هذه المعلمات لمواصلة، 10-15 دقيقة تسجيل الفاصلة تصل إلى 4 اليرقات والتأكد من أن هناك فوتوبلاشينغ الحد الأدنى من العينة. - استخدام برامج التصوير متوافق مع تنسيق ملف التسجيل لتصور وتحليل البيانات.
- توجيه اليرقة بحيث قطاع الكلى من الفائدة هو عمودي على مسار شعاع في حين أن الجزء المقابل هو بعيدا عن شعاع الليزر (انظر الفيلم 1 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يرجى ملاحظة أن هذا البروتوكول استخدمت بنجاح مع عدد من الخطوط المعدلة وراثيا غفب الكلى، بما في ذلك إت (krt8: إغف) sqet11-9، إت (krt8: إغف) sqet33-d10، و تغ (atp1a1a.4: غفب). تم الحصول على نتائج المثال الموضح هنا باستخدام خط إت (krt8: إغف) sqet11-9.
ويبين الشكل 1 بروتوكول فوتوابلاتيون سبيل المثال. يتم رصد كثافة غفب متوسط داخل المنطقة ذات الاهتمام ( الشكل 1A ، والفيلم 1 ). يظهر مثال متوسط كثافة تتبع في الشكل 1B .
كما هو مبين في الشكل 2 ، بعد التعرض ل 405 نانومتر ضوء الليزر، لا تزال مضان غفب لتختفي خلية واحدة في وقت واحد، في 220 دقيقة، وقطاع أبلاتد بأكمله يفقد 100٪ من الإيجابية غفب لها. هذه الخسارة من غفب fمضان هو في الواقع بسبب موت الخلايا وليس، على سبيل المثال، دونرغولاتيون التعبير غفب. ويتجلى هذا من خلال ظهور النوى الحمراء بروبيديوم يوديد إيجابي في الخلايا التي تفقد الإيجابية غفب.
يمكن تقييم مدى موت الخلايا عن طريق قياس متوسط مضان غفب في الجزء أبلات ومقارنتها مع متوسط كثافة غفب على الفور الأمامي والخلفي للجزء أبلاتد. ويبين الشكل 3 العلاقة بين مدى التعرض ليزر (يقاس بالمبلغ الأولي من فوتوبلاشينغ) ومدى موت الخلايا في الجزء المعرضة. فإنه يدل على أنه من خلال تغيير التعرض الأولي، فمن الممكن أن "طلب" الإصابة واستجابة الظهارة المصابة. مع 10-20٪ من فوتوبلاشينغ غفب الأولية، وتقريبا أي تخفيض من الإيجابية غفب لوحظ في 5 ساعة بعد الإصابة. 50 و 60٪ فوتوبلاشينغ يؤدي إلى خيب كاملأرانس من غفب في 5 ساعات، في حين أن 30 و 40٪ تبييض يؤدي إلى نتائج وسيطة، مع 50٪ من الوفيات المقدرة لوحظ في حوالي 35٪ فوتوبلاشينغ. ويدعم هذه النتائج بي تلطيخ ( الشكل 3B ). 20٪ النتائج فوتوبلاشينغ في عمليا لا تلطيخ بي في 100 دقيقة بعد الاجتثاث. 50٪ فوتوبلاشينغ يؤدي إلى الإيجابية بي الإيجابية في ظهارة أبلاتد بعد 60 دقيقة، في حين أن 30 و 40٪ فوتوبلاشينغ يؤدي إلى دمج بي المتوسطة. كما يمكن أن يرى من هذه البيانات، وهذه المنهجية يسمح لتحريض كميات متدرج من إصابة الظهارية ودراسة الاستجابة الظهارية إلى الأضرار الظهارية القاتلة وشبه القاتلة الظهارية.
الشكل 1: إجراءات فوتوابلاتيون. ( A ) تخطيطي يظهر التوجه الجنين / اليرقة، والتعرض ليزر، والمنطقة من الفائدة (القطع الناقص) قياسأوريوم من مضان متوسط لرصد كمية من فوتوبلاشينغ غفب؛ انظر الفيلم 1. يشير المربع المستطيل إلى نافذة المسح الضوئي. ( B ) مثال على المنطقة الفعلية من الفائدة متوسط غفب كثافة تتبع قبل وأثناء وبعد 405 نانومتر التعرض ليزر. متوسط كثافة غفب على أربعة قياسات متتالية (يظهر داخل صناديق خضراء) تظهر قبل (Y) وبعد (X) فوتوابلاتيون. وتستخدم النسبة X / Y كمقياس للتعرض الكلي للضوء ويتم رسمها على المحور X في الشكل 3 . الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الموت الخلايا الظهارية بعد 405 نانومتر التعرض ليزر. مثال إطارات متتابعة تظهر اختفاء غفبد ظهور تلطيخ يوديد بروبيديوم بعد فوتوابلاتيون (40٪ فوتوبلاشينغ الأولي). الإطارات هي في 0، 130، 170، و 220 دقيقة بعد البنفسجي ضوء (405 نانومتر) التعرض. اختفاء غفب يتزامن مع ظهور الأحمر الفلورسنت بي الإيجابية النووية. يرجى ملاحظة أنه تم الكشف عن مضان بري باستخدام القناة الحمراء. ويرجع مضان أحمر ينظر خارج الكلى إلى كروموفوريس وجود بي في تجويف الأمعاء. شريط مقياس = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: استجابة الجرعة من إصابات الظهارية إلى مقدار فوتوابلاتيون. ( A ) يقاس فوتوابلاتيون بنسبة مئوية من التخفيض الأولي في مضان غفب في المعارضإد. ويقارن هذا مع انخفاض متوسط مضان غفب في الجزء المصاب في 5 ساعة بعد الإصابة. يتم تطبيع هذا القياس إلى متوسط كمية مضان المنبع والمصب من الجزء المصاب. وكانت الجرعات المستهدفة 10، 20، 30، 40، 50، و 60٪ من فوتوبلاشينغ الأولي. والمبالغ الفعلية أكبر قليلا، حيث تصل إلى 14.8 و 24.4 و 33.8 و 45.4 و 56.5 و 62.1٪ فوتوبلاشينغ مما يؤدي إلى 85.2 و 75.6 و 66.2 و 54.6 و 43.5 و 37.9٪ مضان متبقي، ن = 2 - 6 / الهدف مجموعة. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري على طول X (في المئة من مضان المتبقية على الفور بعد فوتوابلاتيون) و Y (نسبة المتبقية مضان 5 ساعة بعد فوتوابلاتيون) محاور. ( بي ) بي تلطيخ يوازي الاختفاء العام للإيجابية غفب. تقريبا لا تلطيخ بي لوحظ في 20٪ (80٪ المتبقية مضان) فوتوبلاشينغ في 100 دقيقة التعرض بعد الليزر ( B ، اللوحة اليمنى). ( جيم و
| المعدلة وراثيا | نمط التعبير | المراجع |
| TG (wt1b: GFP) | غلوميرولوس، بعض بت | [11] |
| TG (atp1a1a.4: GFP) | القاصي للكبيبات | [12] |
| TG (cdh17: GFP) | القاصي للكبيبات | [9،10] |
| TG (ret1: GFP) | أواخر دت، بد | [13] |
| TG (ENPEP: GFP) | القاصي للكبيبات | [14] |
| TG (cd41: GFP) | الخلايا متعددة الأطراف | [15] |
| ET (krt8: EGFP) sqet11-9 | مستقيم بت، في وقت مبكر دت | [16،17] |
| ET (krt8: EGFP) sqet33-D10 | ملتوية بت | [16،17] |
| بت = توبولي القريبة | ||
| دت = توبولي القاصي | ||
| بد - قناة برونيفريك |
فيلم 1: ملخص الرسوم المتحركة من إجراء فوتوابلاتيون. في الجزء الأول من الفيلم، يتجلى الاتجاه الصحيح الجنين / يرقة. ويظهر فرعين الكلى باللون الأخضر. ويستخدم مسبار الزجاج لتوجيه الأسماك في الاغاروز. ويتم ذلك إذا كان المطلوب مراقبة فرع غير المصاب. سمكة السمك يسمح للتعرض الليزر على فرع واحد فقط من الكلى برونيفريك. في الجزء الثاني من الفيلم، يتم توضيح الإجراء التذرية الليزر. البيضاوي يشير إلى المنطقة ذات الأهمية داخل الجزء تمر الاجتثاث المستخدمة لرصد كمية فوتوبلاك الأوليةهينج. نافذة مستطيلة تسمح للتعديل الدقيق لحجم وموقف الجزء أبلاتد. الرجاء النقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وتجدر الإشارة إلى أن قوة الليزر الإجمالية تختلف بين النظم. ومع ذلك، باستخدام النسبة المئوية غفب فوتوبلاشينغ يسمح لقراءة من إجمالي الطاقة تسليمها إلى الكلى الفلورسنت، مستقلة عن الاختلاف في قوة الليزر وتعويض عن طول التعرض. نضع في اعتبارنا، ومع ذلك، أن استجابة الأنسجة المختلفة لهذه الطريقة من فوتوابلاتيون يختلف. حتى خلال نضج الكلى، فمن أكثر صعوبة بكثير للحصول على تخفيض 50٪ في مضان غفب في الأجنة الأصغر سنا مما كانت عليه في اليرقات الناضجة. وينبغي أن تؤخذ هذه الاختلافات في استجابة الأنسجة ل فوتوابلاتيون في الاعتبار عند تعديل وتكييف هذا البروتوكول لتطبيقات مختلفة. وبالتالي، فمن الأهمية بمكان لرصد انخفاض في المئة في مضان غفب لقياس بشكل صحيح مقدار الإصابة والاستجابة المتوقعة من ظهارة الكلى المصابة.
المزايا الرئيسية لهذه الطريقة عند مقارنة طرق أخرى من إصابة الكلى فيالزرد هو أن يسمح للسيطرة الدقيقة من الموقع السباتي الصدغي للإصابة. أيضا، فإنه يسمح للباحثين لطلب مستوى الإصابة صعودا وهبوطا. هذه القدرة على السيطرة على مقدار الإصابة يجب أن تسمح لفحص ردود الخلايا الظهارية، وينبغي أن تساعد في صنع القرار من حيث الانتعاش مقابل موت الخلايا المبرمج مقابل نخر. على سبيل المثال، فمن الممكن أن تظهر أن الهجرة الخلية هو استجابة أولية من ظهارة البقاء على قيد الحياة إلى استئصال القطعي، وأن تكاثر الخلايا هو عملية ثانوية، من المرجح أن تكون مدفوعة من قبل القوى الميكانيكية الناتجة عن الهجرة الخلية 14 .
إلى جانب القدرة على دراسة عملية الإصلاح على مستوى الخلوية، وهناك مزايا أخرى لهذه المنهجية. أولا، كان تقنيات فوتوابلاتيون السابقة سيطرة محدودة على كمية فوتوداماج 9 . ومع ذلك، فإن هذا النموذج يسمح للرقابة متدرجة على مقدار الإصابة، مما يجعل من الاسهل لإجراء دراسات مستقبلية. وبالإضافة إلى ذلك، في هذا النهج، فمن الممكن استهداف مجموعات تعسفية من خلايا الفلورسنت غفب، مما يسمح الاجتثاث سهلة من قطاعات بأكملها. في حين أن هذا يمكن أن يتحقق مع تقنية الليزر نابض، فمن أكثر شاقة، مما يحد من إمكانات للتصميم التجريبي. استخدام غفب لاستهداف وتحفيز إصابة الظهارية هو ميزة أخرى، لأن هناك الكثير من الزرد المعدلة وراثيا غفب المتاحة ( الجدول 1 ليست سوى قائمة جزئية). كما تم دراسة بروتينات الفلورسنت الأخرى التي أعرب عنها الأنواع المعدلة وراثيا، مثل البروتين الأحمر القاتل، ولكن هذه الكائنات المعدلة وراثيا الأسماك ليست متاحة على نطاق واسع 16 . ميزة إضافية لاستخدام غفب هو أنه مع أطوال موجية ليزر مختلفة، ويمكن استخدام غفب التعبير إما ل فوتوابلاتيون (405 نانومتر) أو التصوير (488 نانومتر). ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن الطريقة التي نشرتها جونسون وآخرون. 9 يمكن تطبيقها على غير الفلورسنتالزرد، وبالتالي يمكن استخدامها على نطاق أوسع من هذا النهج.
قيود أخرى من هذا النموذج الاجتثاث الليزر هو أنه قد لا تأخذ في الاعتبار جميع العوامل المختلفة التي يمكن أن تؤدي إلى أكي الإنسان. قد تكون هناك سلسلة من الأحداث التي تؤدي إلى نخر الخلية في جسم الإنسان، فضلا عن موت الخلايا المبرمج الذي يسببه خلال إصابة الكلى. ومن غير الواضح ما إذا كانت البيئة المختلفة المنتجة خلال الاجتثاث الليزر يمكن تقليد جميع جوانب الفيزيولوجيا المرضية من أكي في البشر 10 . ومع ذلك، فإن هذا النموذج الاجتثاث الليزر لديه العديد من المزايا على نماذج بديلة. من خلال السماح لدراسة موت الخلايا الكلى وإصلاح في ارتفاع القرار في الوقت الحقيقي، وينبغي أن يؤدي هذا الأسلوب إلى فهم أفضل لآليات إصلاح الكلى ووضع الأساس لنهج جديدة لعلاج أكي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
نود أن نشكر الدكتور إيان دروموند والدكتور فلاديمير كورز لتقاسم خطوط غفب الكلى المعدلة وراثيا. ونود أيضا أن نشكر نيتكوم على توفير الموارد اللازمة للقيام بهذا العمل. تم دعم هذه الدراسة جزئيا من المنح: K08DK082782، R03DK097443 (نيه)، والمنحة التجريبية هسي (أف).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri Dishes, 35 x 10 mm | Genesee Scientific | 32-103 | Procedural Usage: Step 2.4, 2.7 |
| Petri Dishes, 100 x 15 mm | Midwest Scientific | 910 | Procedural Usage: Step 1 |
| Dechorination forceps - Electron Microscopy Sciences Dumont Tweezers 5 Dumostar | Fischer Scientific | 50-241-57 | Procedural Usage: Step 2.1.1 |
| Plastic Transfer Pipet | Globe Scientific | 135030 | Procedural Usage: Step 2.5, 3.6 |
| Tricaine | Sigma Aldrich | A5040-25G | Procedural Usage: Step 2.3, 3.4 |
| Agarose | Fischer Scientific | BP165-25 | Procedural Usage: Step 2.3 |
| Pulled glass probe (manufactured manually from glass capillary tubes) | Fischer Scientific | 21-1640-2C | Procedural Usage: Step 2.4 |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1270 | Procedural Usage: Step 1.5 |
| SOLA Light Engine | Lumencor | SOLA SM-5-LCR-SB | Procedural Usage: Step 1.5 |
| Eclipse C2 Plus Confocal Microscope System | Nikon | Procedural Usage: Step 3 | |
| 1x E3 Solution | Recipe used to generate: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2 , 0.33 mM MgSO4 Procedural Step Usage: 1.2, 1.3, 2.2, 2.3 | ||
| PTU | Sigma | P7629-10G | Procedural Step Usage: 1.3, 2.2, 3.4, 4.2 |
| NIS Elements Software | Nikon | C2+ | Procedural Usage: Step 3 |
| Laser Unit | Agilent | MLC 400 | Procedural Step 3.11 |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma Aldrich | P4170-100MG | Procedural Step Usage: 4.2 |
References
- Chertow, G. M. Acute Kidney Injury, Mortality, Length of Stay, And Costs In Hospitalized Patients. J Am Soc Nephrol. 16 (11), 3365-3370 (2005).
- Yasuda, H., et al. Incidence And Clinical Outcomes of Acute Kidney Injury Requiring Renal Replacement Therapy In Japan. Ther Apher Dial. 14 (6), 541-546 (2010).
- Waikar, S. S., Liu, K. D., Chertow, G. M. Diagnosis, Epidemiology And Outcomes of Acute Kidney Injury. Clin J Am Soc Nephrol. 3 (3), 844-861 (2008).
- Lameire, N., Van Biesen, W., Vanholder, R. Acute Kidney Injury. The Lancet. 372 (9653), 1863-1865 (2008).
- Esson, M. L. Diagnosis And Treatment of Acute Tubular Necrosis. Ann Intern Med. 137 (9), 744 (2002).
- Vaidya, V. S., Ferguson, M. A., Bonventre, J. V. Biomarkers of Acute Kidney Injury. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 48 (1), 463-493 (2008).
- Hentschel, D. M. Acute Renal Failure In Zebrafish: A Novel System To Study A Complex Disease. Am J Physiol Renal Physiol. 288 (5), F923-F929 (2005).
- Cianciolo Cosentino, C., et al. Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae To Study Acute Kidney Injury. J Vis Exp. (42), (2010).
- Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser Ablation of The Zebrafish Pronephros To Study Renal Epithelial Regeneration. J Vis Exp. (54), (2011).
- Drummond, I. A., Davidson, A. J. Zebrafish Kidney Development. Methods Cell Biol. , 233-260 (2010).
- Toback, F. G. Regeneration After Acute Tubular Necrosis. Kidney Int. 41 (1), 226-246 (1992).
- Witzgall, R., et al. Localization of Proliferating Cell Nuclear Antigen, Vimentin, C-Fos, And Clusterin In The Postischemic Kidney. Evidence For A Heterogenous Genetic Response Among Nephron Segments, And A Large Pool of Mitotically Active And Dedifferentiated Cells. J Clin Invest. 93 (5), 2175-2188 (1994).
- Bonventre, J. V. Dedifferentiation And Proliferation of Surviving Epithelial Cells In Acute Renal Failure. J Am Soc Nephrol. 14 (90001), (2003).
- Palmyre, A., et al. Collective Epithelial Migration Drives Kidney Repair After Acute Injury. PLoS ONE. 9 (7), e101304 (2014).
- Vasilyev, A., Drummond, I. A. Live Imaging Kidney Development In Zebrafish. Methods Mol Biol. , 55-70 (2012).
- Korzh, V., et al. Visualizing Compound Transgenic Zebrafish In Development: A Tale of Green Fluorescent Protein And Killerred . Zebrafish. 8 (1), 23-29 (2011).
- Bollig, F., Mehringer, R., Perner, B., et al. Identification and comparative expression analysis of a second wt1 gene in zebrafish. Dev Dyn. 235 (2), 554-561 (2006).
- Liu, Y., Pathak, N., Kramer-Zucker, A., Drummond, I. A. Notch signaling controls the differentiation of transporting epithelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros. Development. 134 (6), 1111-1122 (2007).
- Diep, C. Q., Ma, D., Deo, R. C., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470 (7332), 95-100 (2011).
- Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebra fish. Am J Physiol. 299 (5), F1040-F1047 (2010).
- Fisher, S., Grice, E. A., Vinton, R. M., Bessling, S. L., McCallion, A. S. Conservation of RET regulatory function from human to zebrafish without sequence similarity. Science. 312 (5771), 276-279 (2006).
- Seiler, C., Pack, M. Transgenic labeling of the zebrafish pronephric duct and tubules using a promoter from the enpep gene. Gene Expr Patterns. 11 (0), 118-121 (2011).
- Lin, H. F., Traver, D., Zhu, H., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106 (12), 3803-3810 (2005).
- Choo, B. G., Kondrichin, I., Parinov, S., et al. Zebrafish transgenic Enhancer TRAP line database (ZETRAP). BMC Dev Biol. 6 (1), 5 (2006).
- Parinov, S., Kondrichin, I., Korzh, V., Emelyanov, A. Tol2 transposon-mediated enhancer trap to identify developmentally regulated zebrafish genes in vivo. Dev Dyn. 231 (2), 449-459 (2004).
