Summary
עבודה זו מציגה מודל חדש של vivo של פגיעה בכליות קטועי באמצעות דג הזברה הכליה GFP כליה. המודל מאפשר אינדוקציה של אבלציה ממוקד של תאים כלית אפיתל להראות את המנגנונים הסלולר של פגיעה נפרון ותיקון.
Abstract
פגיעה חריפה בכליות (AKI) היא מצב רפואי נפוץ עם שיעור תמותה גבוה. עם יכולות התיקון של הכליה, ניתן לשחזר תפקוד כליות נאות לאחר טיפול תומך. עם זאת, הבנה טובה יותר של איך המוות נפרון התא והתיקון מתרחשים ברמה התאית נדרש כדי למזער את המוות התא כדי לשפר את תהליך התחדשות. דג הזברה pronephros היא מערכת מודל טוב כדי להשיג מטרה זו משום שהיא מכילה קטעים אנטומיים הדומים נפרון יונקים. בעבר, המודל הנפוץ ביותר המשמש לחקר פגיעה בכליות בדגים היה מודל גנטמיצין פרמקולוגי. עם זאת, מודל זה אינו מאפשר שליטה מדויקת spatiotemporal של פגיעה, ולכן קשה ללמוד תהליכים תאיים ומולקולריים המעורבים תיקון כליות. כדי להתגבר על מגבלה זו, עבודה זו מציגה שיטה שבאמצעותה, בניגוד לגישה של ג'נטמיצין, חלבונים מסוימים של פרוטאינים ירוקים (GFP)לחיצה על קטע נפרון יכול להיות photablated באמצעות אור לייזר סגול (405 ננומטר). זה מודל חדשני של AKI מספק יתרונות רבים כי שיטות אחרות של פציעה אפיתל חסר. היתרונות העיקריים שלו הם היכולת "לחייג" את רמת הפציעה ואת השליטה המדויקת spatiotemporal חזקים מודל חיות vivo . שיטה חדשה זו יש פוטנציאל לקדם באופן משמעותי את רמת ההבנה של פגיעה בכליות מנגנוני תיקון.
Introduction
פגיעה חריפה בכליות (AKI) , 1 , 2 , אשר גם יכול להיקרא אי ספיקת כליות חריפה, מוגדר באופן כללי כמו ליקוי פתאומי בתפקוד הכליות 3 . בעוד שרמת ההבנה של מצב זה שופרה במידה ניכרת לאורך השנים, שיעורי התחלואה והתמותה נותרו גבוהים , 1 , 2 . הטיפול הנוכחי במצב זה הוא בעיקר תומך, כמו תוצאות של ניסויים קליניים מרובים של טיפול תרופתי כבר שלילי 4 , 5 . הכליה היא ייחודית בכך שיש לה את היכולת לתקן את עצמה. לכן, טיפול תומך לאחר אבחון מוקדם של AKI הוא הדרך הטובה ביותר להגביל את התחלואה 6 . עם זאת, קשה לזהות AKI מוקדם, ושיעור התמותה הוא מדהים 50-80% עבור אלה הזקוקים לדיאליזה 5. עם היכולת של הכליות לתקן את עצמם ואת חוסר אפשרויות הטיפול עבור מצב זה, חשוב לפתח שיטות כדי לשפר את תהליך התחדשות נפרון.
היו הרבה מודלים שונים המשמשים במחקר AKI הכולל סוכנים שונים של פגיעה ומודלים של בעלי חיים. במונחים של סוכנים של נזק לכליות, aminoglycoside גנטמיצין אנטיביוטי שימש כסוכן nephrotoxic שמוביל AKI 7 , 8 . עם זאת, מספר קבוצות מצאו כי טיפול גנטמיצין הוא קטלני העובר דג הזברה 9 . זה גורם נזק צינורי כי הוא רציני מדי עבור התאוששות העובר, מה שהופך את המחקר של התחדשות קשה ללא סוג כלשהו של התערבות. מודלים יונקים, כמו העכבר חולדה, נחשבים גם בעלי ערך, אבל הם עומדים בפני מגבלות רבות במהלך המחקר של AKI. אולי החיסרון העיקרי של מודלים מכרסמים הוא הקושי visuaLizing את הכליה מכרסם ובכך לקבוע את התהליכים spatiotemporal מדויק המוביל מוות ותיקון אפיתל.
Johnson et al. דיווחו לייזר לייזר טכניקה מבוססת כדי לגרום פגיעה בכליות חריפה של דג הזברה עובריים 9 הזחל. הם השתמשו אבלציה לייזר פעמו לפגוע בכליה לאחר הזרקת שריר עם הצמד דקסטרן. הקרינה מן מצמידים dextran מאפשר הדמיה של נזק התחדשות אפיתל 9 אבובית. מודל זה מתגבר על שתי המגבלות שהוזכרו לעיל, אך הוא אינו מאפשר רמות מוגדרות של פגיעה וקשה לבצע על קבוצות תאים שרירותיות גדולות.
החדש לייזר אבלציה מבוסס מודל דג הזברה של AKI המתואר כאן כתובות כל המגבלות לעיל. הכליה pronephric בזברה דג הזחל הוא איבר מבוגר, מתפקד המכיל קטעים דומים יונקים nePhron, כולל גלומרולוס, tubules פרוקסימלי ודיסטלי, וכן צינור איסוף 10 . הזחלים דג הזברה הם גם שקופים אופטית, מה שהופך אותו ריאלי לצפות בכליות באמצעות טכניקות הקרינה. לכן, דג הזברה הם בעלי ערך במודל vivo של AKI, ואת הכליה pronephric הזחל (5-12 ימים לאחר הפריה (dpf)) ניתן להשתמש כדי ללמוד את התהליכים הסלולר המולקולרי מעורב פגיעה בכליות ותיקון.
מאמר זה מציג שיטה שבאמצעותה חלבונים ספציפיים של חלבונים ירוקים (GFP) של נפרון יכולים להיות מצולמים באמצעות מערכת אנרגיית אור נמוכה (בהשוואה למערכת לייזר פולס), אור לייזר סגול (405 ננומטר). הקרינה GFP מאפשר מיקוד של קבוצה של תאים, מה שהופך את השינויים המתרחשים גלוי דרך תצפית של photobleaching GFP. בנוסף, GFP (על ידי קליטת אור סגול) משמש כיור אנרגיה כדי potentiate הפציעה GFP- להביע תאים כליות. זמן לשגות microsעותק ואז ניתן להשתמש כדי ללמוד את תהליך התיקון. מחקרים מצאו התפשטות תאים, הגירה תא, metaplasia התא 11 , 12 , 13 להיות כל התהליכים הפוטנציאליים שעשויים לשחק תפקיד חשוב לתיקון הכליות. עם זאת, את החשיבות היחסית של תהליכים אלה ואת הפרטים של גומלין שלהם היה קשה לחשוף בשל מגבלות של מודלים קיימים של AKI. באמצעות גישה חדשה זו, ניתן היה להראות כי הגירה תא ממלא תפקיד מרכזי לתיקון כליות לאחר פגיעה חריפה 14 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
מחקר זה בוצע בהתאם להמלצות במדריך לטיפול ולשימוש בחיות מעבדה של המכונים הלאומיים לבריאות. הפרוטוקול אושר על ידי המכללה NYIT של אוסטאופתיה רפואה מוסדית טיפול בבעלי חיים ועדת השתמש (NYITCOM IACUC). כל הניתוחים ובניסויים ב- vivo בוצעו תחת הרדמה טריקאין, וכל המאמצים נעשו כדי למזער את הסבל.
1. קבלה ושמירה על עוברים
- השגת עוברי ידי מעבר הכליה GFP ניאון דג הזברה.
הערה: דוגמאות של קווי דג הזברה שכותרתו fluorescently שכותרתו המפורטים בטבלה 1 . - שמור את העוברים ב 28.5 מעלות צלזיוס פתרון E3 במהלך 24 שעות לאחר ההפריה.
- לאחר 24 שעות, להחליף את המדיום עם פתרון E3 המכיל 0.003% 1-phenyl-2-thiourea (PTU).
הערה: PTU משמש מכיוון שהוא חוסם את השלבים התלויים בטירוזינאז במלנוגנזהולכן מונע פיגמנטציה. הנה, פתרון זה נקרא E3-PTU. - להעלות את עוברי מופרות ב 28.5 מעלות צלזיוס עד שהם> 6 dpf, באיזו נקודה הכליות התבגרו.
הערה: מומלץ להשתמש בזחלים בחלון 7-7 dpf. - באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי לנתח בהגדלה 40X ומסננים פליטת הקרינה הירוקה, בחר את הזחלים עם הקרינה GFP הקרינה בכליה.
2. הרכבה דג הזברה עבור הדמיה חיה
- אם photoablating העוברים לפני dpf 3, להסיר את הסיסית מכל דג הזברה שלא נגזר לפני הרכבה דג הזברה עבור הדמיה.
- באופן ידני dechorinate עם מלקחיים (המועדפת) או להשתמש בטיפול כימי עם תערובת פרוטאז.
הערה: Dechorination מאפשרת את תוצאות ההדמיה הטובות ביותר.
- באופן ידני dechorinate עם מלקחיים (המועדפת) או להשתמש בטיפול כימי עם תערובת פרוטאז.
- לשטוף את פסולת סיסית בצלחת פטרי באמצעות פתרון E3-PTU ולמלא את המנה עם E3-PTU.
- Prepaמחדש 1-2% נמוכה נקודת התכה (LMP) agarose עם 0.2 מ"ג / מ"ל פתרון tricaine לעלות את דג הזברה עבור photablation הכליות והדמיה חיה.
- אם agarose LMP כבר מוכן מראש, לחמם אותו במיקרוגל כדי להמיס אותו.
- לאחר agarose LMP מוכן, במקום צלחת פטרי 35 מ"מ פלסטיק על מיקרוסקופ לנתח. מניחים זכוכית משכו בדיקה בקרבת מקום כדי לכוון כראוי את הזחלים הרדים.
הערה: חשוב לעשות את זה צעד בזמן ו יש הכל במקום, כי העוברים חייבים להיות מכוונים לפני agarose מתקשה על 1-3 דקות. - לפני העברת העובר כדי agarose, ודא agarose הוא מגניב ( כלומר על טמפרטורת הגוף). השתמש פלסטיק או פיפטה העברת זכוכית למקם את העובר לתוך מתקתק מותך agarose-tricaine פתרון.
הערה: זה נעשה בגלל agarose כי הוא חם מדי יכול להיות מזיק לעובר, המוביל דום לבאו מוות - באמצעות פיפטה העברת, לצייר מחדש את העובר בפתרון agarose ומיקום העובר / זחל באמצע צלחת 35 מ"מ.
- להפיץ במהירות agarose המכיל את העובר / זחל כדי לכסות באופן שווה את החלק התחתון של צלחת 35 מ"מ; את עוצמת הקול הטובה ביותר של agarose להשתמש ~ ~ 1-1.1 מ"ל.
- השתמש בחלון זכוכית כדי לכוון את העובר במצב הטוב ביותר האפשרי עבור photablation והדמיה.
הערה: סרט 1 מציג את הכיוון הטוב ביותר של העובר / זחל עבור photablation חד צדדית. שלב זה הוא הזמן הרגיש ביותר צריך להתבצע במהירות לפני agarose מתחיל ג 'ל, כמו כל ניסיון reorient דגים לאחר gelling מתחיל מזיק.- אוריינט הזחל כך קטע כליה של עניין הוא בניצב לנתיב קרן בעוד קטע הנגדי הוא הרחק קרן הלייזר (ראה סרט 1 ).
הערה: זה יכול להיות מושגת על ידי הפיכת הזחל כפי שמוצג בסרט 1 .
- אוריינט הזחל כך קטע כליה של עניין הוא בניצב לנתיב קרן בעוד קטע הנגדי הוא הרחק קרן הלייזר (ראה סרט 1 ).
- אפשר כ 15 דקות עבור agarose כדי לחזק. מכסים את צלחת פטרי כדי למזער אידוי. לאחר agarose יש solidified, העובר או הזחל מוכן photablation.
3. לייזר אבלציה
- הפעל את מערכת הדמיה confocal.
הערה: בעת שימוש בפלטפורמת ההדמיה הפניה (ראה טבלת החומרים), ההגדרות המומלצות כוללות הגדלה של 40X, עדשה לטבילה במים של 0.8 NA, והמראה הדיכרואי הראשון מוגדר על מנת לאפשר הן 488 & 405 ננומטר תאורה של המדגם. האיתור צריך להתבצע על הערוץ הירוק. - מניחים את המנה המכילה את דג הזברה משותקת על הבמה confocal.
הערה: הליך זה מותאם במיוחד לתצורה זקופה באמצעות עדשת טבילה במים 40-60X. עם זאת, זה צריך להיות אפשרי לשנות את ההליך עבור מיקרוסקופ הפוך. - בתצורה זקוף, למקם את צלחת פטרי המכיל את העובר על גבי מיקרוסקופשקופית ope ולשמור אותו במקום באמצעות חימר דוגמנות ( למשל, plasticine). מקמו את שקופית הזכוכית עם צלחת פטרי על הבמה של המיקרוסקופ confocal.
- הוסף 3 מ"ל של פתרון הדמיה E3-PTU (ראה שלב 1.3) עם 0.2 מ"ג / מ"ל tricaine.
הערה: פתרון הדמיה יכול גם להוסיף מיד לפני הנחת השקופית על הבמה. תוספת של פתרון הדמיה צריך להיעשות בזהירות רבה כדי למנוע agarose מרחף את התחתית של המנה. - עבור לעדשת הטבילה במים (40 או 60X). לאט לאט להעלות את הבמה, ולוודא כי העדשה זווית מעט כדי למנוע את האוויר מלהיות לכודים בנתיב הקורה. כאשר העדשה נוגעת בפתרון בזווית, מרכז אותו כך שהוא נמצא בשדה הראייה של העוברים.
- מצא את הקטע של עניין באמצעות מקור אור פלואורסצנטי. מיקום שטחי של הענף המיועד לפגיעה כדי למזער את פיזור האור (ראה סרט 1 ).
הערה: לאחר מכןT לעשות שימוש בתוכנות הפניה (ראה טבלה של חומרים), אבל הנוהל יכול להיות מותאם בקלות פלטפורמות אחרות. - פתח את התוכנה. נווט אל "הצג" | "בקרת רכש" | "C2plus קומפקט GUI" ולהגדיר "לשכון זמן פיקסל" ל "1.9 μs", "גודל מסגרת" ל "512 x 512 פיקסלים", ו "גודל חריר" ל "90 מיקרומטר". הגדר "405 ננומטר (או 408 ננומטר במערכות מסוימות) עוצמת לייזר" לאפס ו "488 עוצמת לייזר" ל "נמוך" (רצוי <1%). להתאים את "רווח" כדי להשיג טווח דינמי טוב אבל לא להרוות את האות.
הערה: ערכים אלה אינם קריטיים והם משמשים לעקביות. כאשר לייזר 405 ננומטר משמש, זה יגרום לעלייה הקרינה GFP. כדי למנוע את הרוויה של האות במהלך photobleaching (שלב 3.11), ערך רווח האות צריך להיות scaled למטה על הערוץ הירוק. הערוץ כחול הערוץ יכול להיות נשאר באפס, כפי שהוא אינו משמש עבור saדגימה. - לחץ על "סרוק" בממשק התוכנה כדי לסרוק את הכליה באמצעות לייזר 488 ננומטר. מצא את הקטע של עניין כי הוא מאונך לנתיב קרן וזה היטב visualized, עם הקרינה טוב GFP. לאחר אזור זה זוהה, לצייר אזור של עניין באמצעות אזור אליפטי של ריבית (ROI).
- נווט אל "החזר ROI" "צייר ROI אליפטית."
הערה: זה ישמש ברציפות למדוד את עוצמת ה- GFP הממוצע בזמן photobleaching מתרחש, המאפשר ניהול של מנה מדויקת של טיפול בלייזר.
- נווט אל "החזר ROI" "צייר ROI אליפטית."
- נווט אל "הצג" | "בקרות רכישה" | "C2plus Scan Area" ובחר "Band Scan Area". המסכה המלבנית תופיע בתוך ממשק זה. באופן ידני להגדיר חלון סריקה מלבני באמצעות הסמן ( כלומר גרור, לשנות גודל, ולהפוך את המסכה) כדי לכסות את הפלח ממוקד לייזר אבלציה. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני בתוךאזור המסכה כדי לקבל את הבחירה.
הערה: רק האזור הנבחר יסרוק. - התחל את המדידה בזמן ניטור הערוץ הירוק באמצעות רק 488 ננומטר לייזר להפעיל GFP. ודא כי עוצמת הלייזר 488 הוא נמוך יחסית (~ 1%). למדוד את עוצמת הממוצע של ה- GFP באזור של עניין על ידי בחירת "מדוד" | "מדידת זמן". השתמש בכרטיסיות "גרף" או "נתונים" כדי לעקוב אחר ערכי העוצמה הממוצעת בתוך החזר ה- ROI.
הערה: שיעור הרכישה מוגדר על ידי זמן לשכון פיקסל וגודל החלון המלבני שנקבע בשלב 3.9, אבל באופן כללי, זה מאפשר ניטור מהיר של האות (~ 2-10 מסגרות / ים). - לגרום נזק לתאי הכליה עם לייזר סגול (405 ננומטר) על ידי הגדלת עוצמת 100% על ידי הזזה של "כוח לייזר" שליטה כל הדרך ימינה. לייזר 488 ננומטר יכול להישאר פעיל אם עוצמת נמוכה.
- שים לב לקו gRaph באמצעות הכרטיסייה "גרף" או את הערכים המספריים של עוצמת ה- GFP באמצעות הכרטיסייה "נתונים" ולחכות עד טיפות לרמה הרצויה, למשל 50% של הבסיס (כפי שמוצג בתרשים 1 ).
הערה: נעשה שימוש בלייזר 20 מגה-וולט כחלק מיחידת הלייזר שאליה מתייחסת (ראה טבלת החומרים ); העוצמה המקסימלית עשויה להשתנות בין מערכות. בעצימות נמוכה ניתן לפצות על ידי חשיפה ארוכה יותר ( כלומר באמצעות הלבנת GFP אחוזים כאמצעי החשיפה הכוללת).
- שים לב לקו gRaph באמצעות הכרטיסייה "גרף" או את הערכים המספריים של עוצמת ה- GFP באמצעות הכרטיסייה "נתונים" ולחכות עד טיפות לרמה הרצויה, למשל 50% של הבסיס (כפי שמוצג בתרשים 1 ).
- לאחר עוצמת ה- GFP בתוך ההחזר על ההשקעה אליפטי (שלב 3.8) ירד לרמה הרצויה, מיד להפחית את עוצמת הסגול (405 ננומטר) לייזר ל "0" על ידי הזזת המחוון "לייזר כוח" כל הדרך שמאלה ב לוח הבקרה של התוכנה.
- השגת בסיס חדש של הקרינה GFP. לאשר את אבלציה על ידי קבלת יחס של X / Y.
הערה: ראה איור1B; Y = האינטנסיביות הממוצעת לפני האבלציה ו- X = האינטנסיביות הממוצעת לאחר האבלציה, תוך שימוש בממוצע של 4 דגימות עוקבות בתוך החזר ה- ROI. יחס היעד המדויק (50%, 60% וכו ' ) תלוי בכמות הפגיעה הרצויה לניסוי נתון.
- השגת בסיס חדש של הקרינה GFP. לאשר את אבלציה על ידי קבלת יחס של X / Y.
4. זמן לשגות מיקרוסקופית עם מכתים יודיד Propidium
- החל שיקולים כללי זמן לשגות (שתוארו במחקר קודם 15 ) כדי לדמיין מכתים propidium יודיד כקורלציה של פגיעה בתאי כליות לאחר photoablation.
- טרום לדגור את הזחלים ב 30 מיקרומטר propidium iodide פתרון (1% DMSO ב E3-PTU) במשך 3 שעות לפני הטבעה ו photoablation, כמתואר בשלבים 2 ו 3.7, בהתאמה.
הערה: אין propidium יודיד נוסף נדרש agarose או פתרון הדמיה. - לעורר פגיעה בכליות קטועי, כפי שמתואר בשלבים 3.1-3.12.
- השג זמן לשגות ערימות תמונה, כמו descriבמיטה במחקר קודם 14 , באמצעות לייזר 488 ננומטר (GFP) ו 461 ננומטר לייזר (Propidium יודיד, PI).
הערה: שני הצבעים הם על גבי ערימות confocal לקשר את היעלמותו של ה- GFP ואת המראה של מכתים יודיד propidium. - הגדרת הפרמטרים להשגת ערימת זמן לשגות התמונה כדלקמן: עובי פרוסה וירטואלית = 4 מיקרומטר, z- מחסנית מרווח = 2 מיקרומטר, פיקסל לשכון זמן = 1.9 μs, ממדי תמונה = 512 x 512, ו ממוצעים = 2.
הערה: פרמטרים אלה מאפשרים רציף, 10-15 דקות הקלטה של עד 4 הזחלים ולוודא שיש photobleaching מינימלי של המדגם. - השתמש בתוכנת הדמיה תואם עם פורמט קובץ ההקלטה כדי לדמיין ולנתח את הנתונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שים לב כי פרוטוקול זה שימש בהצלחה עם מספר קווי Ghen כליה מהונדסים, כולל ET (krt8: EGFP) sqet11-9, ET (krt8: EGFP) sqet33-d10, ו Tg (atp1a1a.4: GFP). תוצאות הדוגמה המוצגות כאן התקבלו באמצעות ET (krt8: EGFP) sqet11-9 שורה.
איור 1 מציג את פרוטוקול photoablation לדוגמה. עוצמת GFP הממוצע הוא פיקוח בתוך האזור של עניין ( איור 1 א , וסרט 1 ). דוגמה עקבות הממוצע עקבות מוצג באיור 1B .
כפי שמוצג בתרשים 2 , לאחר החשיפה לאור 405 ננומטר ננומטר, הקרינה GFP ממשיך להיעלם תא אחד בכל פעם, עד 220 דקות, קטע ablated כולו מאבד 100% של positivity GFP שלה. זה הפסד של GFP וזחילה היא אכן בשל מוות התא ולא, למשל, downregulation הביטוי GFP. עדות לכך הופעתו של גרעיני פלואורסיד אדום proidium יודיד חיובי בתאים המאבדים את החיוניות של ה- GFP.
היקף המוות התא ניתן להעריך על ידי מדידת הקרינה הממוצע GFP במגזר ablated ולהשוות אותו לעוצמה GFP מתכוון מיד קדמי ואחורי לפלח ablated. איור 3 מציג את הקשר בין היקף החשיפה בלייזר (הנמדד על ידי כמות ראשונית של photobleaching) ואת מידת המוות של התא בחלק חשוף. זה מראה כי, על ידי שינוי החשיפה הראשונית, ניתן "לחייג" את הפציעה ואת התגובה של אפיתל הפצוע. עם 10-20% של photobleaching GFP הראשונית, כמעט ללא הפחתה של רגישות GFP הוא ציין ב 5 שעות לאחר הפציעה. 50 ו 60% photobleaching מוביל deste מוחלטאנס של GFP ב 5 שעות, בעוד 30 ו 40% הלבנת מוביל לתוצאות ביניים, עם 50% מוערך המוות נצפתה על photobleaching כ 35%. תוצאות אלה נתמכות על ידי מכתים PI ( איור 3 ב ). 20% photobleaching תוצאות כמעט שום מכתים PI ב 100 דקות לאחר אבלציה. 50% photobleaching מוביל חיובי PI רציפה ב אפיתל ablated לאחר 60 דקות, בעוד 30 ו 40% photobleaching מוביל שילוב PI ביניים. כפי שניתן לראות ממידע זה, מתודולוגיה זו מאפשרת אינדוקציה של כמויות מדורגות של פגיעה באפיתל ועל חקר התגובה אפיתל לתאי אפיתל קטלני תת קטלני.
איור 1: נוהל צילום. ( א ) סכמטי מראה העובר / אורווה אוריינטציה, חשיפה לייזר, ואת האזור של ריבית (אליפסה) מדידההרכש של הקרינה הממוצע לפקח על כמות של photobleaching GFP; ראה סרט .1 התיבה המלבנית מציינת את חלון הסריקה. ( ב ) דוגמה של אזור בפועל של הריבית הממוצע GFP עוצמת מעקב לפני, במהלך, ואחרי 405 ננומטר חשיפה לייזר. ממוצע עוצמות ה- GFP על ארבע מדידות רצופות (מוצג בתוך תיבות ירוקות) מוצגים לפני (Y) ואחרי (X) photablation. היחס בין X / Y משמש כמדד של החשיפה לאור הכולל, והוא מתוות על ציר X בתרשים 3 . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: תא אפיתל מוות לאחר 405 ננומטר חשיפה לייזר. דוגמה מסגרות רציף מראה את היעלמותו של GFP אד המראה של מכתים יודיד propidium לאחר photoablation (40% photobleaching הראשונית). המסגרות נמצאות בחשיפה של 0, 130, 170 ו- 220 דקות לאחר חשיפה לאור השמש (405 ננומטר). היעלמותו של ה- GFP חופפת עם המראה של פלואורסצנטי אדום PI חיובי posi. שים לב כי הקרינה PrI מזוהה באמצעות ערוץ אדום. הקרינה האדומה שנראית מחוץ לכליה נובעת מהכרומופורים ומהנוכחות של PI בלום המעיים. סולם בר = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: תגובה מינון של פגיעה אפיתל לסכום של Photoablation. ( א ) Photoablation נמדדת על ידי אחוז הירידה הראשונית GFP הקרינה של exposקטע. זאת בהשוואה לירידה הקרינה הממוצע GFP במגזר נפגע ב 5 שעות לאחר הפציעה. מדידה זו מנורמל לכמות הממוצעת של פלואורסצנטי במעלה ומורד במורד של פצוע קטע. מינוני היעד היו 10, 20, 30, 40, 50, ו 60% של photobleaching הראשונית. הכמויות הממוצעות הן מעט גבוהות יותר, והן מגיעות ל - 14.8, 24.4, 33.8, 45.4, 56.5 ו - 62.1% photobleaching, וכתוצאה מכך 85.2, 75.6, 66.2, 54.6, 43.5 ו - 37.9% שנותרו פלואורסצנציה, n = 2 - 6 / היעד קְבוּצָה. ברים שגיאה מייצגים את סטיית תקן לאורך X (אחוז הקרינה שנותרו מיד לאחר photoablation) ו- Y (אחוז הנותרים הקרינה 5 שעות לאחר photablation) צירים. ( BE ) מכתים PI מקביל היעלמות הכללית של positivity GFP. כמעט שום מכתים PI הוא ציין ב 20% (80% הנותרים פלואורסצנטי) photobleaching ב 100 דקות לאחר חשיפה לייזר ( B , הפאנל הימני). ( ג
| טרנסגני | דפוס הביטוי | הפניות |
| Tg (wt1b: GFP) | Glomerulus, כמה PT | [11] |
| Tg (atp1a1a.4: GFP) | דיסטלי לגלומרולוס | [12] |
| Tg (cdh17: GFP) | דיסטלי לגלומרולוס | [9,10] |
| Tg (ret1: GFP) | DT מאוחר, PD | [13] |
| Tg (enpep: GFP) | דיסטלי לגלומרולוס | [14] |
| Tg (cd41: GFP) | תאים מרוכזים | [15] |
| ET (krt8: EGFP) sqet11-9 | סטרייט PT, מוקדם DT | [16,17] |
| ET (krt8: EGFP) sqet33-d10 | PT מעוות | [16,17] |
| PT = צינורית הפרוקסימלי | ||
| DT = צינורית דיסטלית | ||
| PD - צינור פרהנפרי |
סרט 1: אנימציה סיכום של נוהל Photoablation. בחלקו הראשון של הסרט, העובר תקין / זווית אוריינטציה הוא הפגינו. שני ענפי הכליה מוצגים בירוק. זכוכית בדיקה משמש כדי לכוון את הדג agarose. הדבר נעשה אם יש צורך בסניף בקרה שאינו פצוע. זווית הדג מאפשרת חשיפה בלייזר על ענף אחד בלבד של הכליה הקדמית. בחלקו השני של הסרט, הלייזר אבלציה לייזר מתואר. האליפסה מציינת את האזור של עניין בתוך קטע שעובר אבלציה המשמש לפקח על כמות photobleac הראשוניתHing. החלון מלבני מאפשר התאמה מדויקת של גודל ומיקום של קטע ablated. לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה. (לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי להוריד).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
יש לציין כי כוח הלייזר הכולל משתנה בין מערכות. עם זאת, באמצעות אחוזים gob photobleaching מאפשר readout של האנרגיה הכוללת נמסר כליה ניאון, עצמאית של וריאציה לייזר כוח פיצוי על ידי אורך החשיפה. יש לזכור, עם זאת, כי התגובה של רקמות שונות בשיטה זו של photoablation משתנה. גם במהלך התבגרות הכליה, זה הרבה יותר קשה להשיג ירידה של 50% GFP הקרינה בעוברים צעירים יותר מאשר בזחלים בוגרים. הבדלים אלה בתגובה רקמות כדי photoablation צריך להילקח בחשבון בעת שינוי והתאמה של פרוטוקול זה ליישומים שונים. לכן, זה קריטי כדי לפקח על הפחתת אחוז GFP הקרינה כדי לאמוד כראוי את כמות הפציעה ואת התגובה החזוי של אפיתל כליה נפגע.
היתרונות העיקריים של שיטה זו בהשוואה שיטות אחרות של פגיעה בכליותדג הזברה הוא המאפשר שליטה מדויקת של המיקום spatiotemporal של הפציעה. כמו כן, הוא מאפשר לחוקרים לחייג את רמת הפציעה מעלה ומטה. יכולת זו לשלוט בכמות הפציעה צריכה לאפשר בדיקה של תגובות תאי אפיתל ועזרה בקבלת החלטות במונחים של התאוששות לעומת אפופטוזיס לעומת נמק. לדוגמה, ניתן להראות כי נדידת תאים היא תגובה ראשונית של אפיתל שורד כדי אבלציה סקטורלית כי התפשטות תאים הוא תהליך משני, סביר מונע על ידי כוחות מכניים שנוצר על ידי הגירה תאים 14 .
מלבד היכולת ללמוד את תהליך התיקון ברמה התאית, יש יתרונות נוספים למתודולוגיה זו. ראשית, טכניקות photablation הקודם היה מוגבל שליטה על כמות photodamage 9 . עם זאת, מודל זה מאפשר שליטה מדורגת על כמות הפציעה, מה שהופך אותו קל יותרלנהל מחקרים עתידיים. בנוסף, בגישה זו, ניתן לכוון קבוצות שרירותיות של תאים GFP ניאון, ובכך לאפשר אבלציה קלה של מגזרים שלמים. אמנם זה יכול להיות מושגת עם טכניקה לייזר פעמו, זה יותר מייגע, להגביל את הפוטנציאל של עיצוב ניסיוני. השימוש של ה- GFP לכוון פציעה אפיתל פוטנציאלי הוא יתרון נוסף, כי יש כל כך הרבה דג הזברה מהונדס GFP זמין ( טבלה 1 היא רק רשימה חלקית). חלבונים ניאון אחרים לידי ביטוי על ידי מינים מהונדס נחקרו גם, כגון חלבון אדום Killer, אבל אלה מהונדס דגים אינם זמינים באופן נרחב 16 . יתרון נוסף של שימוש ב- GFP הוא, עם אורכי גל לייזר שונים, הביטוי GFP יכול לשמש גם עבור photoablation (405 ננומטר) או הדמיה (488 ננומטר). עם זאת, יש לציין כי השיטה שפורסמה על ידי Johnson et al. 9 ניתן ליישם שאינם פלורסנטדג הזברה ולכן ניתן להשתמש בו באופן נרחב יותר מאשר גישה זו.
הגבלה נוספת של מודל זה אבלציה לייזר היא שזה לא יכול לקחת בחשבון את כל הגורמים השונים שיכולים להוביל AKI האדם. אולי יש שרשרת של אירועים המוליכים נמק תא בגוף האדם, כמו גם אפופטוזיס התא כי הוא המושרה במהלך פגיעה בכליות. לא ברור אם הסביבה שונה המיוצר במהלך אבלציה לייזר יכול לחקות את כל ההיבטים של הפתופיזיולוגיה של AKI בבני אדם 10 . עם זאת, מודל זה לייזר אבלציה יש יתרונות רבים על פני מודלים חלופיים. על ידי מתן האפשרות למחקר של מוות בכליות ותיקון ברזולוציה גבוהה בזמן אמת, שיטה זו אמורה להוביל להבנה טובה יותר של מנגנוני תיקון הכליות ולהניח בסיס לגישות חדשות לטיפול ב- AKI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.
Acknowledgments
ברצוננו להודות ד"ר איין Drummond וד"ר ולדימיר Korzh לשיתוף כליה GFP כליה מהונדס. כמו כן, ברצוננו להודות ל- NYITCOM על אספקת המשאבים הדרושים לביצוע עבודה זו. מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מענקים: K08DK082782, R03DK097443 (NIH), ומענק פיילוט HSCI (AV).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri Dishes, 35 x 10 mm | Genesee Scientific | 32-103 | Procedural Usage: Step 2.4, 2.7 |
| Petri Dishes, 100 x 15 mm | Midwest Scientific | 910 | Procedural Usage: Step 1 |
| Dechorination forceps - Electron Microscopy Sciences Dumont Tweezers 5 Dumostar | Fischer Scientific | 50-241-57 | Procedural Usage: Step 2.1.1 |
| Plastic Transfer Pipet | Globe Scientific | 135030 | Procedural Usage: Step 2.5, 3.6 |
| Tricaine | Sigma Aldrich | A5040-25G | Procedural Usage: Step 2.3, 3.4 |
| Agarose | Fischer Scientific | BP165-25 | Procedural Usage: Step 2.3 |
| Pulled glass probe (manufactured manually from glass capillary tubes) | Fischer Scientific | 21-1640-2C | Procedural Usage: Step 2.4 |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1270 | Procedural Usage: Step 1.5 |
| SOLA Light Engine | Lumencor | SOLA SM-5-LCR-SB | Procedural Usage: Step 1.5 |
| Eclipse C2 Plus Confocal Microscope System | Nikon | Procedural Usage: Step 3 | |
| 1x E3 Solution | Recipe used to generate: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2 , 0.33 mM MgSO4 Procedural Step Usage: 1.2, 1.3, 2.2, 2.3 | ||
| PTU | Sigma | P7629-10G | Procedural Step Usage: 1.3, 2.2, 3.4, 4.2 |
| NIS Elements Software | Nikon | C2+ | Procedural Usage: Step 3 |
| Laser Unit | Agilent | MLC 400 | Procedural Step 3.11 |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma Aldrich | P4170-100MG | Procedural Step Usage: 4.2 |
References
- Chertow, G. M. Acute Kidney Injury, Mortality, Length of Stay, And Costs In Hospitalized Patients. J Am Soc Nephrol. 16 (11), 3365-3370 (2005).
- Yasuda, H., et al. Incidence And Clinical Outcomes of Acute Kidney Injury Requiring Renal Replacement Therapy In Japan. Ther Apher Dial. 14 (6), 541-546 (2010).
- Waikar, S. S., Liu, K. D., Chertow, G. M. Diagnosis, Epidemiology And Outcomes of Acute Kidney Injury. Clin J Am Soc Nephrol. 3 (3), 844-861 (2008).
- Lameire, N., Van Biesen, W., Vanholder, R. Acute Kidney Injury. The Lancet. 372 (9653), 1863-1865 (2008).
- Esson, M. L. Diagnosis And Treatment of Acute Tubular Necrosis. Ann Intern Med. 137 (9), 744 (2002).
- Vaidya, V. S., Ferguson, M. A., Bonventre, J. V. Biomarkers of Acute Kidney Injury. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 48 (1), 463-493 (2008).
- Hentschel, D. M. Acute Renal Failure In Zebrafish: A Novel System To Study A Complex Disease. Am J Physiol Renal Physiol. 288 (5), F923-F929 (2005).
- Cianciolo Cosentino, C., et al. Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae To Study Acute Kidney Injury. J Vis Exp. (42), (2010).
- Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser Ablation of The Zebrafish Pronephros To Study Renal Epithelial Regeneration. J Vis Exp. (54), (2011).
- Drummond, I. A., Davidson, A. J. Zebrafish Kidney Development. Methods Cell Biol. , 233-260 (2010).
- Toback, F. G. Regeneration After Acute Tubular Necrosis. Kidney Int. 41 (1), 226-246 (1992).
- Witzgall, R., et al. Localization of Proliferating Cell Nuclear Antigen, Vimentin, C-Fos, And Clusterin In The Postischemic Kidney. Evidence For A Heterogenous Genetic Response Among Nephron Segments, And A Large Pool of Mitotically Active And Dedifferentiated Cells. J Clin Invest. 93 (5), 2175-2188 (1994).
- Bonventre, J. V. Dedifferentiation And Proliferation of Surviving Epithelial Cells In Acute Renal Failure. J Am Soc Nephrol. 14 (90001), (2003).
- Palmyre, A., et al. Collective Epithelial Migration Drives Kidney Repair After Acute Injury. PLoS ONE. 9 (7), e101304 (2014).
- Vasilyev, A., Drummond, I. A. Live Imaging Kidney Development In Zebrafish. Methods Mol Biol. , 55-70 (2012).
- Korzh, V., et al. Visualizing Compound Transgenic Zebrafish In Development: A Tale of Green Fluorescent Protein And Killerred . Zebrafish. 8 (1), 23-29 (2011).
- Bollig, F., Mehringer, R., Perner, B., et al. Identification and comparative expression analysis of a second wt1 gene in zebrafish. Dev Dyn. 235 (2), 554-561 (2006).
- Liu, Y., Pathak, N., Kramer-Zucker, A., Drummond, I. A. Notch signaling controls the differentiation of transporting epithelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros. Development. 134 (6), 1111-1122 (2007).
- Diep, C. Q., Ma, D., Deo, R. C., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470 (7332), 95-100 (2011).
- Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebra fish. Am J Physiol. 299 (5), F1040-F1047 (2010).
- Fisher, S., Grice, E. A., Vinton, R. M., Bessling, S. L., McCallion, A. S. Conservation of RET regulatory function from human to zebrafish without sequence similarity. Science. 312 (5771), 276-279 (2006).
- Seiler, C., Pack, M. Transgenic labeling of the zebrafish pronephric duct and tubules using a promoter from the enpep gene. Gene Expr Patterns. 11 (0), 118-121 (2011).
- Lin, H. F., Traver, D., Zhu, H., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106 (12), 3803-3810 (2005).
- Choo, B. G., Kondrichin, I., Parinov, S., et al. Zebrafish transgenic Enhancer TRAP line database (ZETRAP). BMC Dev Biol. 6 (1), 5 (2006).
- Parinov, S., Kondrichin, I., Korzh, V., Emelyanov, A. Tol2 transposon-mediated enhancer trap to identify developmentally regulated zebrafish genes in vivo. Dev Dyn. 231 (2), 449-459 (2004).
