Summary
Dette arbejde præsenterer en ny in vivo model af segmental nyreskade ved brug af nyre GFP transgene zebrafisk. Modellen tillader induktion af målrettet ablation af nyrepitelceller for at vise de cellulære mekanismer for nephronskader og reparation.
Abstract
Akut nyreskade (AKI) er en almindelig medicinsk tilstand med høj dødelighed. Med nyrenes reparationsevner er det muligt at genoprette tilstrækkelig nyrefunktion efter understøttende behandling. En bedre forståelse af hvordan nephroncelledød og reparation forekommer på mobilniveau er imidlertid nødvendig for at minimere celledød og for at forbedre den regenerative proces. Zebrafish pronephros er et godt model system til at nå dette mål, fordi det indeholder anatomiske segmenter, der ligner pattedyrnefronen. Tidligere var den mest almindelige model, der blev brugt til at studere nyreskade i fisk, den farmakologiske gentamicin-model. Imidlertid tillader denne model ikke en præcis spatiotemporal kontrol af skade, og derfor er det svært at studere cellulære og molekylære processer involveret i nyrereparation. For at overvinde denne begrænsning præsenterer dette værk en metode, hvorigennem i modsætning til gentamicin tilgangen et specifikt Green Fuorescent Protein (GFP) -exempelPressende nefron-segment kan fotograferes ved hjælp af et violet laserlys (405 nm). Denne nye model af AKI giver mange fordele, som andre metoder til epitelskader mangler. Dens vigtigste fordele er evnen til at "ringe" niveauet for skade og den præcise spatiotemporale kontrol i den robuste in vivo dyremodel. Denne nye metode har potentiale til betydeligt at fremme niveauet for forståelse af nyre skader og reparationsmekanismer.
Introduction
Akut nyreskade (AKI) 1 , 2 , som også kan betegnes som akut nyresvigt, defineres bredt som en pludselig nedsat nyrefunktion 3 . Selv om forståelsesniveauet for denne tilstand er blevet forbedret bemærkelsesværdigt gennem årene, har morbiditet og dødelighed været høj 1 , 2 . Den nuværende behandling for denne tilstand er for det meste støttende, da resultater fra flere kliniske forsøg med lægemiddelbehandling har været negative 4 , 5 . Nyren er unik, fordi den har evnen til at reparere sig selv. Derfor er støttetapi efter en tidlig diagnose af AKI den bedste måde at begrænse morbiditet 6 på . Det er imidlertid vanskeligt at opdage AKI tidligt, og dødeligheden er en svimlende 50-80% for dem, der kræver dialyse 5. Med nyrernes evne til at reparere sig selv og mangel på behandlingsmuligheder for denne tilstand er det vigtigt at udvikle metoder til at forbedre denne nephronregenerationsproces.
Der har været mange forskellige modeller, der anvendes til AKI-forskning, der omfatter forskellige agenser for skade- og dyremodeller. Med hensyn til midler til nyreskader er aminoglycosidantibiotisk gentamicin blevet anvendt som et nefrotoksisk middel, der fører til AKI 7 , 8 . Imidlertid har flere grupper fundet, at gentamicinbehandling er dødelig for zebrafiskembryoen 9 . Det forårsager rørformet skade, der er for alvorligt for embryogenvinding, hvilket gør undersøgelsen af regenerering vanskelig uden nogen form for intervention. Pattedyrsmodeller, som mus og rotte, betragtes også som værdifulde, men de står over for mange begrænsninger under undersøgelsen af AKI. Måske er den største ulempe ved gnavermodeller vanskeligheden i visuaLizing gnaverne nyre og dermed bestemmelse af de præcise spatiotemporal processer, der fører til epithelial død og reparation.
Johnson et al. Har rapporteret en laserablation-baseret teknik til at fremkalde akut nyreskade i embryonale og larvezebrafisk 9 . De brugte pulserende laserablation for at beskadige nyrerne efter en intramuskulær injektion med dextrankonjugater. Fluorescensen fra dextran-konjugater muliggør visualisering af skade og regenerering i tubuleepitelet 9 . Denne model overvinder de ovennævnte to begrænsninger, men det tillader ikke graderede skadesniveauer og er vanskeligt at udføre på store, vilkårlig cellegrupper.
Den nye laserablationbaserede zebrafiskmodel af AKI, der beskrives her, omhandler alle ovennævnte begrænsninger. Den pronephric nyre i zebrafisk larver er et modent, fungerende organ, der indeholder segmenter svarende til pattedyret nePhron, herunder en glomerulus, proksimal og distal tubuli og en opsamlingskanal 10 . Zebrafish larver er også optisk gennemsigtige, hvilket gør det muligt at observere nyrerne gennem fluorescens teknikker. Således er zebrafisk en værdifuld in vivo model af AKI, og den larvepræfektriske nyre (5-12 dage efter befrugtning) kan bruges til at studere de cellulære og molekylære processer involveret i nyreskade og reparation.
Dette papir præsenterer en metode, hvorigennem specifikke grønne fluorescerende proteiner (GFP) -expressende nefron-segmenter kan fotograferes ved anvendelse af et lavt energiforbrug (sammenlignet med et pulserende lasersystem) violet laserlampe (405 nm). GFP-fluorescensen gør det muligt at målrette en gruppe af celler, hvilket gør de ændringer, der forekommer synlige gennem observation af GFP-fotobleaching. Derudover tjener GFP (ved absorption af violet lys) som en energislag til at forstærke skaden i GFP-udtrykkende nyreceller. Time-lapse-mikroberKopi kan derefter bruges til at studere reparationsprocessen. Undersøgelser har fundet celleproliferation, cellemigration og cellemetaplasi 11 , 12 , 13 til alle potentielle processer, der kan spille en vigtig rolle i nyrereparation. Imidlertid har den relative betydning af disse processer og detaljerne i deres samspil været vanskeligt at afdække på grund af begrænsningerne af eksisterende modeller af AKI. Ved hjælp af denne nye tilgang var det muligt at vise, at cellemigration spiller en central rolle i nyrereparation efter akut skade 14 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne undersøgelse blev udført i overensstemmelse med anbefalingerne i vejledningen til pleje og brug af laboratoriedyr ved de nationale sundhedsinstitutter. Protokollen blev godkendt af NYIT College of Osteopathic Medicine Institutional Animal Care and Use Committee (NYITCOM IACUC). Alle operationer og in vivo eksperimenter blev udført under tricin anæstesi, og alle bestræbelser blev gjort for at minimere lidelsen.
1. Opnåelse og vedligeholdelse af embryoner
- Få embryoner ved at krydse nyren GFP fluorescerende zebrafisk.
BEMÆRK: Eksempler på fluorescensmærkede zebrafisk-transgene linier er anført i tabel 1 . - Hold embryonerne ved 28,5 ° C i E3-opløsning i løbet af 24 h efter befrugtning.
- Efter 24 timer udskiftes mediet med en E3-opløsning, der indeholder 0,003% 1-phenyl-2-thiourinstof (PTU).
BEMÆRK: PTU anvendes, fordi det blokerer de tyrosinaseafhængige trin i melanogeneseOg forhindrer dermed pigmentering. Her henvises denne løsning til som E3-PTU. - Hæv de befrugtede embryoner ved 28,5 ° C, indtil de er> 6 dpf, hvorefter nyrerne er modnet.
BEMÆRK: Det er bedst at bruge larver i vinduet 7-9 dpf. - Ved hjælp af et fluorescerende dissekeringsmikroskop ved 40x forstørrelse og grønt fluorescensemissionsfiltre, skal du vælge larverne med lys nyreflekse fluorescens.
2. Montering af Zebrafish til Live-billeddannelse
- Hvis du fotograferer embryoerne forud for 3 dpf, skal du fjerne chorionen fra uhærdet zebrafisk, før du monterer zebrafisken til billeddannelse.
- Manuelt dekarinat med tang (foretrukket) eller brug en kemisk behandling med en protease blanding.
BEMÆRK: Dekkerinering giver mulighed for de bedste billeddannelsesresultater.
- Manuelt dekarinat med tang (foretrukket) eller brug en kemisk behandling med en protease blanding.
- Skyl chorionsaffaldet i petriskålen ved hjælp af E3-PTU-opløsning og genopfyld fadet med E3-PTU.
- PrepaRe 1-2% lavmeltningspunkt (LMP) agarose med 0,2 mg / ml tricinopløsning til montering af zebrafisken for nyrefotoablation og levende billeddannelse.
- Hvis LMP-agarose allerede var forberedt på forhånd, genopvar det i mikrobølgeovnen for at smelte den.
- Når LMP-agarosen er tilberedt, skal du placere en 35 mm plast petriskål på et dissekeringsmikroskop. Placer en trækglasprobe i nærheden for korrekt orientering af de bedøvede larver.
BEMÆRK: Det er vigtigt at gøre dette skridt i tide og at have alt på plads, fordi embryoerne skal orienteres, inden agarosen størkner i ca. 1-3 minutter. - Før du overfører embryoet til agarosen, skal du sørge for, at agarosen er kølig ( dvs. ved ca. kropstemperatur). Brug en plast- eller glasoverføringspipette til at placere embryoet i den nedkølede smeltede agarose-tricaine-opløsning.
BEMÆRK: Dette gøres, fordi agarose, der er for varmt, kan være skadeligt for embryoet, hvilket fører til hjertestopEller døden - Ved hjælp af en overførselspipette genbruges embryoet i agaroseopløsningen og placer embryoet / larven midt i en 35 mm skål.
- Spred agarosen med embryoet / larven hurtigt for at dække bunden af 35 mm fadet jævnt; Det bedste volumen af agarose til brug er ~ 1-1,1 ml.
- Brug glasproben til at orientere embryoen i den bedst mulige position til fotoablation og billeddannelse.
BEMÆRK: Film 1 viser embryo / larvens bedste orientering til ensidig fotoablation. Dette trin er den mest tidsfølsomme og bør udføres hurtigt, inden agarosen begynder at gelé, da ethvert forsøg på at omorientere fisken efter, at gelningen begynder, er skadelig.- Orienter larven således, at nyresegmentet af interesse er vinkelret på strålebanen, mens det kontralaterale segment er væk fra laserstrålen (se film 1 ).
BEMÆRK: Dette kan opnås ved at dreje larven som vist i Movie 1 . - Tillad ca. 15 minutter for agarosen at størkne. Dæk petriskålen for at minimere fordampningen. Når agarosen har størknet, er embryoet eller larven klar til fotoablation.
3. Laserablation
- Betjen det konfokale billeddannelsessystem.
BEMÆRK: Ved brug af den refererede billeddannelsesplatform (se materialebordet) indeholder de anbefalede indstillinger 40X forstørrelse, en 0,8 NA vanddypningslins og det første dikroiske spejlsæt, der tillader både 488 og 405 nm belysning af prøven. Detektionen skal udføres på den grønne kanal. - Placer opskålen indeholdende den immobiliserede zebrafisk på et konfokalt stadium.
BEMÆRK: Denne procedure er optimeret til opretstående konfiguration ved hjælp af en 40-60X vanddypefilse. Det bør dog være muligt at ændre proceduren for et inverteret mikroskop. - I opretstående konfiguration placeres petriskålen, der indeholder embryoet oven på en mikroskopOpe slide og hold den på plads ved hjælp af modellering ler ( fx plasticine). Placer glasskinnen med petriskålen på scenen af det konfokale mikroskop.
- Tilsæt 3 ml af billedopløsningen E3-PTU (se trin 1.3) med 0,2 mg / ml tricain.
BEMÆRK: Billedbehandlingsløsningen kan også tilføjes umiddelbart inden du sætter billedet på scenen. Tilsætningen af billeddannelsesopløsningen skal udføres meget omhyggeligt for at forhindre agarosen i at flyde ud af bunden af fadet. - Skift til vanddypningslinsen (40 eller 60X). Løft langsomt scenen, og sørg for, at linsen er let vinklet for at forhindre luft i at blive fanget i strålebanen. Når linsen rører løsningen i en vinkel, centrer den så, at den ligger inden for embryonernes synsfelt.
- Find segmentet af interesse ved hjælp af fluorescens lyskilden. Overfladisk placere filialen målrettet mod skade for at minimere lysfordeling (se film 1 ).
BEMÆRK: Den efterfølgendeT trin gør brug af refereret software (se Materialetabellen), men proceduren kan let tilpasses til andre platforme. - Åbn softwaren. Naviger til "Vis" | "Acquisition Control" | "C2plus Compact GUI" og indstil "pixel dwell time" til "1.9 μs," "frame size" til "512 x 512 pixels" og "pinhole size" til "90 μm." Indstil "405 nm (eller 408 nm i nogle systemer) laserintensitet" til nul og "488 laserintensitet" til "lav" (fortrinsvis <1%). Juster "gain" for at opnå et godt dynamisk område, men ikke at mætte signalet.
BEMÆRK: Disse værdier er ikke kritiske og bruges til konsistens. Når en 405 nm laser anvendes, vil det resultere i stigninger i GFP fluorescens. For at undgå mætning af signalet under fotobelægning (trin 3.11), skal signalværdierne skaleres ned på den grønne kanal. Den blå kanalforstærkning kan efterlades ved nul, da den ikke anvendes til sampling. - Klik på "Scan" i software interface for at scanne nyren ved hjælp af en 488 nm laser. Find det interessesegment, der er vinkelret på strålebanen, og det er godt visualiseret med god GFP-fluorescens. Når først regionen er blevet identificeret, tegne en region af interesse ved hjælp af en elliptisk region-of-interest (ROI).
- Naviger til "ROI" | "Tegn elliptisk afkast."
BEMÆRK: Dette vil blive brugt til løbende at måle gennemsnitlig GFP-intensitet, mens photobleaching finder sted, hvilket tillader administration af en præcis dosis laserbehandling.
- Naviger til "ROI" | "Tegn elliptisk afkast."
- Naviger til "Vis" | "Acquisition controls" | "C2plus Scan Area" og vælg "Band Scan Area." Den rektangulære maske vises inden for denne grænseflade. Definer manuelt et rektangulært scanningsvindue ved hjælp af markøren ( dvs. træk, resize og drej masken) for at dække segmentet, der er målrettet til laserablation. Højreklik iMaskeområde for at acceptere valget.
BEMÆRK: Kun det valgte område scannes. - Start tidsmålingen, mens du overvåger den grønne kanal ved hjælp af kun 488 nm laseren for at aktivere GFP. Sørg for, at intensiteten af 488-laseren er forholdsvis lav (~ 1%). Mål gennemsnitsintensiteten af GFP'en i interesseområdet ved at vælge "Mål" | "Tidsmåling". Brug fanerne "Graf" eller "Data" til at overvåge gennemsnitsintensitetsværdierne inden for afkastet.
BEMÆRK: Opkøbshastigheden defineres ved pixelopholdstid og størrelsen på det rektangulære vindue i trin 3.9, men det giver generelt mulighed for hurtig overvågning af signalet (~ 2-10 rammer / s). - Inducerer skader på nyrerne med den violette laser (405 nm) ved at øge intensiteten til 100% ved at skubbe "laser power" -kontrollen helt til højre. 488 nm laseren kan forblive aktiv, hvis intensiteten er lav.
- Overhold en linje gRaph ved hjælp af fanen "Graph" eller de numeriske værdier af GFP intensitet ved hjælp af fanen "Data" og vent til det falder til et ønsket niveau, for eksempel 50% af basislinjen (som vist i Figur 1 ).
BEMÆRK: En 20 mW laser er blevet brugt som en del af den refererede laser enhed (se Materialetabellen ); Maksimal intensitet kan variere mellem systemer. Den lavere intensitet kan kompenseres ved længere eksponering ( dvs. ved at bruge procent GFP-blegning som et mål for total eksponering).
- Overhold en linje gRaph ved hjælp af fanen "Graph" eller de numeriske værdier af GFP intensitet ved hjælp af fanen "Data" og vent til det falder til et ønsket niveau, for eksempel 50% af basislinjen (som vist i Figur 1 ).
- Når GFP-intensiteten inden for det elliptiske ROI (trin 3.8) er faldet til et ønsket niveau, skal du straks reducere intensiteten af den violette (405 nm) laser til "0" ved at flytte glideren "laser power" helt til venstre i Software kontrolpanelet.
- Få en ny baseline for GFP fluorescens. Bekræft ablationen ved at opnå et forhold på X / Y.
BEMÆRK: Se figur1B; Y = gennemsnitsintensitet før ablationen og X = gennemsnitsintensitet efter ablationen ved anvendelse af et gennemsnit på 4 konsekutive prøver inden for ROI. Det præcise målforhold (50%, 60% osv .) Afhænger af den mængde skade, der ønskes for et givet forsøg.
- Få en ny baseline for GFP fluorescens. Bekræft ablationen ved at opnå et forhold på X / Y.
4. Time-lapse-mikroskopi med propidiumjodidfarvning
- Anvende generelle tidsforløbsovervejelser (beskrevet i et tidligere studie 15 ) for at visualisere propidiumiodidfarvning som et korrelat mellem nyrecellskade efter fotoablation.
- Forinkubér larverne i 30 μM propidiumiodidopløsning (1% DMSO i E3-PTU) i 3 timer forud for indlejring og fotoablation som beskrevet i trin 2 og 3,7.
BEMÆRK: Der kræves ikke yderligere propidiumiodid i agarosen eller billeddannelsesopløsningen. - Fremkald segmental nyreskade som beskrevet i trin 3.1-3.12.
- Få timelapse-billedstabler, som beskrevetSeng i en tidligere undersøgelse 14 ved anvendelse af en 488 nm laser (GFP) og en 461 nm laser (Propidium Iodide, PI).
BEMÆRK: De to farver er overlejret i konfokale stakke for at korrelere forsvinden af GFP og udseendet af propidiumiodidfarvning. - Indstil parametrene for at opnå time-lapse-billedstablerne som følger: Virtuel skive tykkelse = 4 μm, z-stack interval = 2 μm, pixelopholdstid = 1,9 μs, billeddimensioner = 512 x 512 og middelværdi = 2.
BEMÆRK: Disse parametre giver mulighed for kontinuerlig, 10 til 15 minutters intervaloptagelse af op til 4 larver og sikrer, at der er minimal fotobildning af prøven. - Brug billedbehandling software kompatibel med optagelsesfilformatet til at visualisere og analysere dataene.
- Orienter larven således, at nyresegmentet af interesse er vinkelret på strålebanen, mens det kontralaterale segment er væk fra laserstrålen (se film 1 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bemærk venligst, at denne protokol blev brugt med en række transplantatiske GFP-transgene linjer, inklusive ET (krt8: EGFP) sqet11-9, ET (krt8: EGFP) sqet33-d10 og Tg (atp1a1a.4: GFP). Eksempelresultaterne vist her blev opnået ved anvendelse af ET (krt8: EGFP) sqet11-9-linjen.
Figur 1 viser eksemplet photoablation protokol. Den gennemsnitlige GFP-intensitet overvåges inden for området af interesse ( figur 1A og film 1 ). Et eksempel på gennemsnitlig intensitetssporing er vist i figur 1B .
Som vist i figur 2 , fortsætter GFP-fluorescens efter eksponering for 405 nm laserlys at forsvinde en celle ad gangen, indtil i løbet af 220 minutter taber hele det ablaterede segment 100% af dets GFP-positivitet. Dette tab af GFP fLuorescens skyldes faktisk celledød og ikke for eksempel nedreguleringen af GFP-ekspression. Dette fremgår af udseendet af røde fluorescerende propidiumiodid-positive kerner i cellerne, som taber GFP-positivitet.
Omfanget af celledød kan vurderes ved at måle gennemsnitlig GFP-fluorescens i det ablaterede segment og sammenligne det med den gennemsnitlige GFP-intensitet umiddelbart foran og bagved det ablaterede segment. Figur 3 viser forholdet mellem omfanget af lasereksponering (målt ved den indledende mængde af fotobleaching) og omfanget af celledød i det eksponerede segment. Det viser, at ved at variere den indledende eksponering er det muligt at "ringe" skaden og reaktionen af det skadede epitel. Med 10-20% af indledende GFP fotoblegning observeres næsten ingen reduktion af GFP-positivitet ved 5 timer efter skade. 50 og 60% fotobleaching fører til en fuldstændig forsømmelseArancen af GFP efter 5 timer, mens 30 og 40% blegning fører til mellemresultater, med 50% estimeret død observeret ved ca. 35% fotobelægning. Disse resultater understøttes af PI-farvning ( figur 3B ). 20% fotoblegning resulterer i næsten ingen PI-farvning ved 100 minutter efter ablation. 50% fotoblegning fører til kontinuerlig PI-positivitet i det ablaterede epitel efter 60 minutter, mens 30 og 40% fotobleaching fører til mellemliggende PI-inkorporering. Som det fremgår af disse data, tillader denne metodik induktionen af graderede mængder af epithelial skade og for undersøgelsen af epithelial responsen på dødelig og sublodal epithelial skade.
Figur 1: Photoablation Procedure. ( A ) Skematisk viser embryo / larveorientering, laser eksponering og region-of-interest (ellipse) målingUrinering af den gennemsnitlige fluorescens for at overvåge mængden af GFP fotobleaching; Se film 1. Den rektangulære boks angiver scanningsvinduet. ( B ) Et eksempel på en egentlig region-af-interesse gennemsnitlig GFP intensitetssporing før, under og efter 405 nm laser eksponering. Gennemsnitlige GFP intensiteter på fire på hinanden følgende målinger (vist i grønne bokse) vises før (Y) og efter (X) photoablationen. Forholdet X / Y anvendes som et mål for den totale lyseksponering og er plottet på X-aksen i figur 3 . Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Epitelcelle død efter 405 nm laser eksponering. Eksempel sekventielle rammer, der viser forsvinden af GFP anD udseendet af propidiumiodidfarvning efter photoablation (40% initial photobleaching). Rammerne er på 0, 130, 170 og 220 min efter violet lys (405 nm) eksponering. GFP's forsvinden falder sammen med udseendet af rød fluorescerende PI-nukleare positivitet. Bemærk, at PrI-fluorescens registreres ved hjælp af den røde kanal. Den røde fluorescens set uden for nyren skyldes chromoforer og tilstedeværelsen af PI i tarmen lumen. Målestang = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Dosisrespons af epithelial skade til mængden af fotoablation. ( A ) Photoablation måles ved procentdelen af initial reduktion i GFP fluorescens i exposEd segment. Dette sammenlignes med faldet i gennemsnitlig GFP-fluorescens i det skadede segment ved 5 timer efter skaden. Denne måling normaliseres til den gennemsnitlige mængde fluorescens opstrøms og nedstrøms for det skadede segment. Måldoser var 10, 20, 30, 40, 50 og 60% af den oprindelige photobleaching. De faktiske mængder er lidt større, hvilket svarer til 14,8, 24,4, 33,8, 45,4, 56,5 og 62,1% fotobelægning, hvilket resulterer i 85,2, 75,6, 66,2, 54,6, 43,5 og 37,9% resterende fluorescens, n = 2 - 6 / mål gruppe. Fejlstængerne repræsenterer standardafvigelsen langs X (procent af resterende fluorescens umiddelbart efter fotoablation) og Y (procent af resterende fluorescens 5 timer efter fotoablation) akser. ( BE ) PI-farvning parallellerer den overordnede forsvinden af GFP-positivitet. Næsten ingen PI-farvning observeres ved 20% (80% resterende fluorescens) fotoblegning ved 100 minutter efter laser eksponering ( B , højre panel). ( C og
| Transgene | Ekspressionsmønster | Referencer |
| Tg (wt1b: GFP) | Glomerulus, nogle PT | [11] |
| Tg (atp1a1a.4: GFP) | Distal til glomerulus | [12] |
| Tg (cdh17: GFP) | Distal til glomerulus | [9,10] |
| Tg (ret1: GFP) | Sen DT, PD | [13] |
| Tg (enpep: GFP) | Distal til glomerulus | [14] |
| Tg (CD41: GFP) | Multicilierede celler | [15] |
| ET (KRT8: EGFP) sqet11-9 | Rett PT, tidligt DT | [16,17] |
| ET (KRT8: EGFP) sqet33-d10 | Konvolut PT | [16,17] |
| PT = Proximal Tubule | ||
| DT = Distal Tubule | ||
| PD - Pronephric Duct |
Film 1: Animationsoversigt af Photoablation Procedure. I den første del af filmen er der vist korrekt embryo / larveorientering. De to nyregrener er vist i grønt. En glasprobe bruges til at orientere fisken i agarose. Dette gøres hvis en kontrol, ikke-skadet gren er ønsket. Fiske fisk giver mulighed for laser eksponering på kun en gren af pronephric nyre. I anden del af filmen er laserablationen beskrevet. Ellipsen angiver det område af interesse inden for segmentet, der gennemgår ablation, der anvendes til at overvåge mængden af indledende photobleaching. Det rektangulære vindue giver mulighed for den præcise justering af størrelsen og placeringen af det ablated segment. Klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det skal bemærkes, at den samlede laserkraft varierer mellem systemer. Ved hjælp af procent GFP fotobleaching tillader det dog en udlæsning af den samlede energi, der leveres til fluorescerende nyre, uafhængig af variationen i laserkraft og kompenseret af længden af eksponeringen. Husk dog, at svaret fra forskellige væv til denne metode til fotoablation varierer. Selv under nyre-modning er det betydeligt vanskeligere at opnå en 50% reduktion i GFP-fluorescens hos yngre embryoner end i modne larver. Disse forskelle i vævsresponsivitet til fotoablation bør tages i betragtning ved modifikation og tilpasning af denne protokol til forskellige applikationer. Det er således kritisk at overvåge procentvis reduktion i GFP-fluorescens for korrekt måling af mængden af skade og det forventede respons af det skadede nyrepitel.
De vigtigste fordele ved denne metode sammenlignet med andre metoder for nyreskade iZebrafisk er det, der giver mulighed for den nøjagtige kontrol af skadens spatiotemporale placering. Det giver også forskere mulighed for at ringe op for skaden op og ned. Denne evne til at kontrollere mængden af skade bør muliggøre undersøgelse af epithelcellernes responser og bør hjælpe med beslutningstagning med hensyn til genopretning versus apoptose versus nekrose. For eksempel er det muligt at vise, at cellemigration er et første respons fra overlevende epitel til segmental ablation, og at celleproliferation er en sekundær proces, sandsynligvis drevet af mekaniske kræfter frembragt ved cellemigration 14 .
Ud over muligheden for at studere reparationsprocessen på et cellulært niveau er der andre fordele ved denne metode. For det første havde tidligere fotoablationsteknikker begrænset kontrol over mængden af fotodamage 9 . Denne model tillader dog en gradvist kontrol over mængden af skade, hvilket gør det lettere atUdføre fremtidige undersøgelser. Derudover er det i denne tilgang muligt at målrette vilkårlig grupper af GFP fluorescerende celler, hvilket således muliggør nem ablation af hele segmenter. Mens dette kunne opnås med den pulserende laserteknik, er den mere besværlig, hvilket begrænser potentialet for eksperimentelt design. Brugen af GFP til at målrette og forøge epithelial skade er en yderligere fordel, fordi der er så mange GFP transgene zebrafisk til rådighed ( Tabel 1 er kun en delvis liste). Andre fluorescerende proteiner udtrykt af transgene arter er også undersøgt, såsom Killer-rødt protein, men disse transgene transplantater er ikke bredt tilgængelige 16 . En yderligere fordel ved at anvende GFP er, at GFP-ekspression med forskellige laserbølgelængder kan anvendes enten til fotoablation (405 nm) eller billeddannelse (488 nm). Det skal imidlertid bemærkes, at metoden udgivet af Johnson et al. 9 kan anvendes til ikke-fluorescerendeZebrafisk og dermed kan bruges mere bredt end denne tilgang.
En anden begrænsning af denne laserablationsmodel er, at den måske ikke tager højde for alle de forskellige faktorer, der kan føre til menneskelig AKI. Der kan være en kæde af hændelser, der fører til celle nekrose i den menneskelige krop, samt celle apoptose, der er induceret under nyreskade. Det er uklart, om det forskellige miljø produceret under laserablation kan efterligne alle aspekter af AKI's patofysiologi hos mennesker 10 . Ikke desto mindre har denne laserablationsmodel mange fordele i forhold til de alternative modeller. Ved at tillade undersøgelse af nyrecelledød og reparation i høj opløsning i realtid, bør denne metode føre til en bedre forståelse af nyrereparationsmekanismer og danne grundlag for nye tilgange til AKI-behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Dr. Iain Drummond og Dr. Vladimir Korzh for at dele nyre GFP transgene linjer. Vi vil også gerne takke NYITCOM for at give de nødvendige ressourcer til at udføre dette arbejde. Denne undersøgelse blev delvist støttet af tilskud: K08DK082782, R03DK097443 (NIH) og HSCI Pilot Grant (AV).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri Dishes, 35 x 10 mm | Genesee Scientific | 32-103 | Procedural Usage: Step 2.4, 2.7 |
| Petri Dishes, 100 x 15 mm | Midwest Scientific | 910 | Procedural Usage: Step 1 |
| Dechorination forceps - Electron Microscopy Sciences Dumont Tweezers 5 Dumostar | Fischer Scientific | 50-241-57 | Procedural Usage: Step 2.1.1 |
| Plastic Transfer Pipet | Globe Scientific | 135030 | Procedural Usage: Step 2.5, 3.6 |
| Tricaine | Sigma Aldrich | A5040-25G | Procedural Usage: Step 2.3, 3.4 |
| Agarose | Fischer Scientific | BP165-25 | Procedural Usage: Step 2.3 |
| Pulled glass probe (manufactured manually from glass capillary tubes) | Fischer Scientific | 21-1640-2C | Procedural Usage: Step 2.4 |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1270 | Procedural Usage: Step 1.5 |
| SOLA Light Engine | Lumencor | SOLA SM-5-LCR-SB | Procedural Usage: Step 1.5 |
| Eclipse C2 Plus Confocal Microscope System | Nikon | Procedural Usage: Step 3 | |
| 1x E3 Solution | Recipe used to generate: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2 , 0.33 mM MgSO4 Procedural Step Usage: 1.2, 1.3, 2.2, 2.3 | ||
| PTU | Sigma | P7629-10G | Procedural Step Usage: 1.3, 2.2, 3.4, 4.2 |
| NIS Elements Software | Nikon | C2+ | Procedural Usage: Step 3 |
| Laser Unit | Agilent | MLC 400 | Procedural Step 3.11 |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma Aldrich | P4170-100MG | Procedural Step Usage: 4.2 |
References
- Chertow, G. M. Acute Kidney Injury, Mortality, Length of Stay, And Costs In Hospitalized Patients. J Am Soc Nephrol. 16 (11), 3365-3370 (2005).
- Yasuda, H., et al. Incidence And Clinical Outcomes of Acute Kidney Injury Requiring Renal Replacement Therapy In Japan. Ther Apher Dial. 14 (6), 541-546 (2010).
- Waikar, S. S., Liu, K. D., Chertow, G. M. Diagnosis, Epidemiology And Outcomes of Acute Kidney Injury. Clin J Am Soc Nephrol. 3 (3), 844-861 (2008).
- Lameire, N., Van Biesen, W., Vanholder, R. Acute Kidney Injury. The Lancet. 372 (9653), 1863-1865 (2008).
- Esson, M. L. Diagnosis And Treatment of Acute Tubular Necrosis. Ann Intern Med. 137 (9), 744 (2002).
- Vaidya, V. S., Ferguson, M. A., Bonventre, J. V. Biomarkers of Acute Kidney Injury. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 48 (1), 463-493 (2008).
- Hentschel, D. M. Acute Renal Failure In Zebrafish: A Novel System To Study A Complex Disease. Am J Physiol Renal Physiol. 288 (5), F923-F929 (2005).
- Cianciolo Cosentino, C., et al. Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae To Study Acute Kidney Injury. J Vis Exp. (42), (2010).
- Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser Ablation of The Zebrafish Pronephros To Study Renal Epithelial Regeneration. J Vis Exp. (54), (2011).
- Drummond, I. A., Davidson, A. J. Zebrafish Kidney Development. Methods Cell Biol. , 233-260 (2010).
- Toback, F. G. Regeneration After Acute Tubular Necrosis. Kidney Int. 41 (1), 226-246 (1992).
- Witzgall, R., et al. Localization of Proliferating Cell Nuclear Antigen, Vimentin, C-Fos, And Clusterin In The Postischemic Kidney. Evidence For A Heterogenous Genetic Response Among Nephron Segments, And A Large Pool of Mitotically Active And Dedifferentiated Cells. J Clin Invest. 93 (5), 2175-2188 (1994).
- Bonventre, J. V. Dedifferentiation And Proliferation of Surviving Epithelial Cells In Acute Renal Failure. J Am Soc Nephrol. 14 (90001), (2003).
- Palmyre, A., et al. Collective Epithelial Migration Drives Kidney Repair After Acute Injury. PLoS ONE. 9 (7), e101304 (2014).
- Vasilyev, A., Drummond, I. A. Live Imaging Kidney Development In Zebrafish. Methods Mol Biol. , 55-70 (2012).
- Korzh, V., et al. Visualizing Compound Transgenic Zebrafish In Development: A Tale of Green Fluorescent Protein And Killerred . Zebrafish. 8 (1), 23-29 (2011).
- Bollig, F., Mehringer, R., Perner, B., et al. Identification and comparative expression analysis of a second wt1 gene in zebrafish. Dev Dyn. 235 (2), 554-561 (2006).
- Liu, Y., Pathak, N., Kramer-Zucker, A., Drummond, I. A. Notch signaling controls the differentiation of transporting epithelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros. Development. 134 (6), 1111-1122 (2007).
- Diep, C. Q., Ma, D., Deo, R. C., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470 (7332), 95-100 (2011).
- Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebra fish. Am J Physiol. 299 (5), F1040-F1047 (2010).
- Fisher, S., Grice, E. A., Vinton, R. M., Bessling, S. L., McCallion, A. S. Conservation of RET regulatory function from human to zebrafish without sequence similarity. Science. 312 (5771), 276-279 (2006).
- Seiler, C., Pack, M. Transgenic labeling of the zebrafish pronephric duct and tubules using a promoter from the enpep gene. Gene Expr Patterns. 11 (0), 118-121 (2011).
- Lin, H. F., Traver, D., Zhu, H., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106 (12), 3803-3810 (2005).
- Choo, B. G., Kondrichin, I., Parinov, S., et al. Zebrafish transgenic Enhancer TRAP line database (ZETRAP). BMC Dev Biol. 6 (1), 5 (2006).
- Parinov, S., Kondrichin, I., Korzh, V., Emelyanov, A. Tol2 transposon-mediated enhancer trap to identify developmentally regulated zebrafish genes in vivo. Dev Dyn. 231 (2), 449-459 (2004).
