Summary
この研究は、腎臓GFPトランスジェニックゼブラフィッシュを用いた分節型腎障害の新しいインビボモデルを提示する。このモデルは、腎上皮細胞の標的アブレーションの誘導を可能にし、ネフロン傷害および修復の細胞機構を示す。
Abstract
急性腎臓傷害（AKI）は、高い死亡率を有する一般的な病状である。腎臓の修復能力により、支持療法後に適切な腎機能を回復させることが可能である。しかし、細胞死を最小限に抑え、再生プロセスを強化するためには、細胞レベルでネフロン細胞の死滅および修復がどのように起こるかをより良く理解することが必要である。 zebrafish pronephrosは、哺乳動物ネフロンに類似した解剖学的セグメントを含むため、この目標を達成するための良いモデルシステムです。以前は、魚の腎障害を研究するために使用された最も一般的なモデルは、薬理学的ゲンタマイシンモデルであった。しかしながら、このモデルは、損傷の正確な時空間制御を可能にせず、したがって、腎臓修復に関与する細胞プロセスおよび分子プロセスを研究することは困難である。この制限を克服するために、この研究は、ゲンタマイシンアプローチとは対照的に、特定の緑色蛍光タンパク質（GFP）-ex青色レーザ光（405nm）を用いてネフロンセグメントをプレスすることができる。このAKIの新規モデルは、上皮損傷の他の方法が欠けている多くの利点を提供する。その主な利点は、強いインビボ動物モデルにおいて、損傷レベルと正確な時空間制御を「ダイヤル」する能力である。この新しい方法は、腎障害および修復機構の理解のレベルを有意に高める可能性を有する。
Introduction
急性腎不全とも呼ばれる急性腎障害（AKI） 1,2 は、腎機能の突然の障害として広く定義されている3 。この状態の理解のレベルは長年にわたって著しく向上しているが、罹患率と死亡率は高いままである 1,2 。この状態の現在の治療法は、薬物治療の複数の臨床試験の結果が陰性であったため、ほとんど支持的である4,5 。腎臓は、それ自身を修復する能力を有する点で独特である。したがって、AKIの早期診断後の支持療法は、罹患率を制限する最良の方法である6 。しかし、早期にAKIを検出することは困難であり、死亡率は透析が必要な患者では50-80％。腎臓が自分自身を修復する能力およびこの状態の治療選択肢の欠如により、このネフロン再生プロセスを強化する方法を開発することが重要である。
傷害や動物モデルのさまざまなエージェントを含むAKIの研究に使用される多くの異なるモデルがありました。腎臓障害の薬剤に関して、アミノグリコシド抗生物質ゲンタマイシンは、AKI7,8に至る腎毒性剤として使用されている。しかし、いくつかのグループは、ゲンタマイシン処理がゼブラフィッシュ胚9に対して致命的であることを見出した。それは、胚の回復にはあまりにも深刻な管状の損傷を引き起こし、何らかのタイプの介入なしに再生の研究を困難にする。マウスやラットのような哺乳類のモデルも貴重だと考えられていますが、AKIの研究では多くの制限があります。おそらく、げっ歯類モデルの主な欠点は、視覚障害げっ歯類の腎臓を結紮し、上皮の死および修復に至る正確な時空間的過程を決定する。
Johnson ら胚および幼生のゼブラフィッシュにおいて急性腎障害を誘発するためのレーザーアブレーションベースの技術を報告している9 。彼らは、デキストラン結合体を筋肉内注射した後、腎臓に損傷を与えるためにパルスレーザーアブレーションを使用した。デキストラン結合体からの蛍光は、細管上皮9の損傷および再生の可視化を可能にする。このモデルは、上記の2つの制限を克服するが、傷害の段階的なレベルを許容せず、大きな、任意の細胞群で実施することは困難である。
ここに記載されているAKIの新しいレーザーアブレーションベースのゼブラフィッシュモデルは、上記のすべての制限に対応しています。幼虫ゼブラフィッシュの前腎臓腎臓は成熟した機能的器官であり、哺乳類のne糸球体、近位および遠位尿細管、および収集ダクト10を含む 。ゼブラフィッシュの幼虫もまた光学的に透明であり、蛍光技術によって腎臓を観察することが可能になる。したがって、ゼブラフィッシュは、AKIの貴重なインビボモデルであり、幼生期腎臓（受精後5〜12日）は、腎臓傷害および修復に関与する細胞および分子プロセスを研究するために使用することができる。
この論文では、特定の緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するネフロンセグメントを、低エネルギー（パルスレーザシステムと比較して）紫色レーザ光（405nm）を用いて光結合させる方法を提示する。 GFP蛍光は、細胞のグループの標的化を可能にし、GFP光退色の観察によって可視化される変化を生じさせる。さらに、GFP（紫色光を吸収することによって）は、GFP発現腎細胞における損傷を増強するエネルギーシンクとして働く。時差マイクロコピーを使用して修復処理を調べることができます。研究により、細胞増殖、細胞移動、および細胞化生11,12,13がすべて腎臓修復において重要な役割を果たす可能性のあるプロセスであることが判明している。しかし、これらのプロセスの相対的重要性とその相互作用の詳細は、AKIの既存モデルの限界のために明らかにすることは困難でした。この新規アプローチを用いて、急性損傷後の腎臓修復において細胞移動が中心的役割を果たすことを示すことが可能であった14 。
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Protocol
この研究は、国立衛生研究所の実験動物のケアおよび使用のためのガイドの勧告に従って実施された。このプロトコルは、NYITCOMのOsteopathic Medicine Institutional Animal Care and Use Committee（NYITCOM IACUC）によって承認されました。全ての手術および生体内実験は、トリカイン麻酔下で実施され、苦痛を最小限に抑えるためにすべての努力がなされた。
1.胚の入手と維持
- 腎臓のGFP蛍光ゼブラフィッシュを横切って胚を得る。
注：蛍光標識ゼブラフィッシュトランスジェニック系の例を表1に示す 。 - 受精後24時間にE3溶液に28.5℃で胚を保つ。
- 24時間後、培地を0.003％1-フェニル-2-チオ尿素（PTU）を含有するE3溶液と交換する。
注：メラニン形成におけるチロシナーゼ依存性のステップをブロックするため、PTUを使用する色素沈着を防止する。ここでは、この解決策をE3-PTUと呼ぶ。 - 受精した胚を28.5°Cで6 dpf以上になるまで上げます。その時点で腎臓は成熟しています。
注：7-9 dpfウィンドウでは幼虫を使用することをお勧めします。 - 40倍の倍率および緑色蛍光発光フィルターで蛍光解剖顕微鏡を使用して、明るい腎臓GFP蛍光を有する幼虫を選択する。
2.ライブイメージングのためのZebrafishのマウント
- 3 dpfの前に胚を光化する場合、画像化のためにゼブラフィッシュをマウントする前に、孵化していないゼブラフィッシュから絨毛膜を除去する。
- 手動で鉗子で脱着（推奨）するか、プロテアーゼ混合物で化学的処理をしてください。
注記：デコレーションにより、最良のイメージング結果が得られます。
- 手動で鉗子で脱着（推奨）するか、プロテアーゼ混合物で化学的処理をしてください。
- E3-PTU溶液を用いてペトリ皿中の絨毛の破片を洗い流し、E3-PTUで皿を補充する。
- プレパ0.2 mg / mLのトリカイン溶液を含む1-2％低融点（LMP）アガロースでゼブラフィッシュを腎臓光切除およびライブイメージングにマウントします。
- 予めLMPアガロースが調製されている場合は、マイクロ波で再加熱して溶解します。
- LMPアガロースが調製されたら、解剖顕微鏡上に35mmのプラスチックシャーレを置く。麻酔した幼虫を適切に方向付けるために、引っ張ったガラスプローブを近くに置く。
注：アガロースが約1〜3分で凝固する前に胚を配向させなければならないので、適時にこのステップを行い、すべてを整えることが重要です。 - 胚をアガロースに移す前に、アガロースが冷えていることを確認してください（体温付近）。プラスチックまたはガラス転移ピペットを使用して、冷却した溶かしたアガロース - トリカイン溶液に胚を入れる。
注：これは、あまりにも高温のアガロースが胚に有害であり、心停止を引き起こす可能性があるために行われますまたは死 - トランスファーピペットを使用して、アガロース溶液中の胚を再描画し、胚/幼虫を35mmディッシュの中央に配置する。
- 胚/幼虫を含むアガロースを迅速に広げ、35mmの皿の底を均一に覆う。使用するアガロースの最善の量は~1.1mLである。
- ガラスプローブを使用して、胚を光切除および画像化のための最良の位置に向ける。
注：映画1は、片側光切除のための胚/幼虫の最良の向きを示す。このステップは、最も時間に敏感であり、ゲル化開始後に魚を再指向させる試みは有害であるため、アガロースがゲル化し始める前に迅速に実施されるべきである。- 関心のある腎臓セグメントが、対側の部分がレーザービームから離れている間に、ビーム経路に対して垂直になるように幼虫を向ける（ 映画1参照）。
注：これはムービー1のように幼虫を回すことで実現できます。 - アガロースが凝固するのに約15分を要する。ペトリ皿を覆って蒸発を最小限に抑えます。アガロースが凝固すると、胚または幼虫は光切除の準備が整う。
レーザーアブレーション
- 共焦点イメージングシステムを操作する。
注記：参照画像プラットフォーム（材料の表を参照）を使用する場合、40倍の倍率、0.8 NA水浸レンズ、およびサンプルの488および405 nm照明の両方を可能にする第1のダイクロイックミラーセットが推奨設定に含まれます。検出はグリーンチャネルで実行する必要があります。 - 固定化ゼブラフィッシュを含むディッシュを共焦点ステージ上に置く。
注：この手順は、40〜60倍の水浸レンズを使用した直立構成に最適です。しかしながら、倒立顕微鏡の手順を変更することは可能であるべきである。 - 直立構成では、胚を含むペトリ皿を顕微鏡の上に配置するモデリングクレイ（ 例えば、プラシーネ）を使用して、その場所にスライドさせて保持してください。ペトリ皿でガラススライドを共焦点顕微鏡のステージ上に置く。
- 0.2mg / mLのトリカインを用いて3mLのイメージング溶液E3-PTU（工程1.3参照）を加える。
注：スライドをステージ上に置く直前にイメージングソリューションを追加することもできます。イメージング溶液の添加は、アガロースが皿の底から浮かぶのを防ぐために非常に慎重に行わなければならない。 - 水浸レンズ（40または60X）に切り替えます。ゆっくりとステージを上げ、空気がビーム経路に閉じ込められないようにレンズがわずかに傾いていることを確認します。レンズがある角度で溶液に触れたら、それが胚の視野に入るように中心に置く。
- 蛍光光源を使用して目的のセグメントを見つけます。光散乱を最小限に抑えるために、怪我の対象となる支店を表面的に配置します（ 映画1を参照）。
注：サブシーケンサーtステップでは参照ソフトウェア（表の表を参照）を使用しますが、この手順は他のプラットフォームにも容易に適用できます。 - ソフトウェアを開きます。 「表示」| "獲得コントロール" | 「C2plus Compact GUI」に設定し、「ピクセル滞留時間」を「1.9μs」、「フレームサイズ」を「512x512ピクセル」、「ピンホールサイズ」を「90μm」に設定します。 「405nm（またはいくつかのシステムでは408nm）レーザー強度」をゼロに、「488レーザー強度」を「低」（好ましくは1％未満）に設定します。良好なダイナミックレンジを得るために「ゲイン」を調整しますが、信号を飽和させないように調整してください。
注：これらの値は重要ではなく、一貫性のために使用されます。 405 nmレーザーを使用すると、GFP蛍光が増加します。光退色（ステップ3.11）中の信号の飽和を避けるために、信号利得値は緑チャネル上で縮小されるべきである。青色チャネル利得は、saには使用されないので、ゼロのままにすることができますmpling。 - 488 nmレーザーを使用して腎臓をスキャンするには、ソフトウェアインターフェイスで[スキャン]をクリックします。ビーム経路に垂直で、良好なGFP蛍光を伴ってよく視覚化されている関心のあるセグメントを見つけます。その領域が特定されたら、楕円形のRegion-of-Interest（ROI）を使用して関心領域を描画します。
- "ROI"に移動| 「楕円ROIを描く」
注：これは、光退色が起こっている間に平均GFP強度を連続的に測定するために使用され、正確な線量のレーザー治療の投与を可能にする。
- "ROI"に移動| 「楕円ROIを描く」
- 「表示」| "獲得コントロール" | "C2plus Scan Area"を選択し、 "Band Scan Area"を選択します。長方形のマスクがそのインターフェイス内に表示されます。レーザーアブレーションの対象となるセグメントをカバーするために、カーソルを使用して長方形のスキャンウィンドウを手動で定義します（ つまり 、マスクのドラッグ、サイズ変更、回転）。右クリックしてマスク領域を使用して選択を受け入れます。
注記：選択したリージョンのみがスキャンされます。 - 緑色チャンネルを監視しながら、488 nmレーザーを使用してGFPを起動しながら時間測定を開始します。 488レーザーの強度が比較的低い（〜1％）ことを確認します。 "Measure"を選択することにより、関心領域内のGFPの平均強度を測定する。 「時間測定」 [グラフ]タブまたは[データ]タブを使用して、ROI内の平均強度値を監視します。
注：取得速度は、ピクセルドウェル時間とステップ3.9で設定された長方形ウィンドウのサイズによって定義されますが、一般的に、信号の高速監視（約2〜10フレーム/秒）が可能です。 - 「レーザーパワー」コントロールを右端にずらして強度を100％に増やし、バイオレットレーザー（405nm）で腎臓細胞を損傷させます。強度が低い場合、488 nmレーザーはアクティブのままです。
- 線gを観察する「グラフ」タブを使用するか、「データ」タブを使用してGFP強度の数値を使用し、所望のレベル、例えばベースラインの50％（ 図1に示す ）まで低下するのを待ちます。
注記：20mWレーザーは、参照レーザーユニットの一部として使用されています（材料表を参照 ）。最大強度はシステムによって異なることがある。より低い強度は、より長時間の暴露（ すなわち 、総暴露の尺度としてのパーセントGFP漂白を用いる）によって補うことができる。
- 線gを観察する「グラフ」タブを使用するか、「データ」タブを使用してGFP強度の数値を使用し、所望のレベル、例えばベースラインの50％（ 図1に示す ）まで低下するのを待ちます。
- 楕円ROI内のGFP強度（ステップ3.8）が所望のレベルに低下したら、「レーザー出力」スライダを左にずっと移動させることによって、紫色（405nm）レーザの強度を直ちに「0」に減少させるソフトウェアコントロールパネル。
- GFP蛍光の新しいベースラインを得る。 X / Yの比を求めることによってアブレーションを確認する。
注： 図を参照してください図1Bに示す。 Y =アブレーション前の平均強度、X =アブレーション後の平均強度、ROI内の4つの連続サンプルの平均を用いる。正確な標的比率（50％、60％ など ）は、所与の実験に望まれる損傷の量に依存する。
- GFP蛍光の新しいベースラインを得る。 X / Yの比を求めることによってアブレーションを確認する。
4.ヨウ化プロピジウム染色による経時顕微鏡検査
- 光分解後の腎細胞傷害の相関として、ヨウ化プロピジウム染色を視覚化するための一般的な時間経過の検討（前の研究15で概説）を適用する。
- ステップ2および3.7にそれぞれ記載されているように、埋め込みおよび光切除の前に、30μMヨウ化プロピジウム溶液（E3-PTU中の1％DMSO）中の幼虫を3時間プレインキュベートする。
注：ヨウ化プロピジウムは、アガロースまたはイメージング溶液には必要ありません。 - 段階3.1~3.12に記載されているように、部分腎障害を誘発する。
- 時間経過イメージスタックを取得する488 nmレーザー（GFP）および461 nmレーザー（Propidium Iodide、PI）を使用して、前の研究14のベッドを使用した。
注：GFPの消失とヨウ化プロピジウム染色の出現を相関させるために、2色を共焦点スタックに重ねる。 - 仮想スライス厚さ=4μm、z-スタック間隔=2μm、画素滞留時間=1.9μs、画像寸法= 512x512、および平均= 2のように、タイムラプス画像スタックを得るためのパラメータを設定する。
注：これらのパラメータは、最大4匹の幼虫の連続的な10〜15分の間隔記録を可能にし、試料の光退色が最小限であることを保証する。 - 記録ファイル形式と互換性のあるイメージングソフトウェアを使用して、データを視覚化して分析します。
- 関心のある腎臓セグメントが、対側の部分がレーザービームから離れている間に、ビーム経路に対して垂直になるように幼虫を向ける（ 映画1参照）。
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Representative Results
このプロトコルはET（krt8：EGFP）sqet11-9、ET（krt8：EGFP）sqet33-d10、およびTg（atp1a1a.4：GFP）を含む多くの腎臓GFPトランスジェニック系統でうまく使用されたことに注意してください。ここに示されている例の結果は、ET（krt8：EGFP）sqet11-9系統を用いて得られた。
図1は、光切断プロトコルの例を示す。平均GFP強度は、関心領域内でモニターされる（ 図1Aおよび映画1 ）。例示的な平均強度トレースを図1Bに示す 。
図2に示すように、405nmレーザー光に曝露した後、GFP蛍光は一度に1つの細胞を消滅し続け、220分で切除された全セグメントがそのGFP陽性の100％を失う。このGFPの損失ルーセントレッセンスは実際には細胞死に起因し、例えばGFP発現のダウンレギュレーションではない。これは、GFP陽性を失う細胞における赤色蛍光性ヨウ化物陽性核の出現によって証明される。
細胞死の程度は、アブレートされたセグメントの平均GFP蛍光を測定し、それをアブレーションされたセグメントの直前および後の平均GFP強度と比較することによって評価することができる。 図3は、レーザー照射の程度（光退色の初期量によって測定される）と露出した部分における細胞死の程度との間の関係を示す。それは、初期暴露を変化させることによって、損傷した上皮の損傷および応答を「ダイヤルする」ことが可能であることを示す。最初のGFP光退色の10〜20％では、損傷後5時間でGFP陽性の実質的な減少は観察されない。 50％および60％の光退色は完全に消失する30％および40％の漂白が中間結果をもたらし、50％の推定死亡が約35％の光漂白で観察された。これらの結果は、PI染色（ 図3B ）によって支持される。 20％の光退色は、アブレーション後100分で実質的にPI染色を生じない。 50％の光退色は、60分後に切除された上皮におけるPIの連続陽性をもたらし、30および40％の光退色はPIの中間取り込みを導く。このデータから分かるように、この方法論は、段階的な量の上皮傷害の誘発および致死的および準致死的な上皮損傷に対する上皮応答の研究を可能にする。
図1：光切断手順。 （ A ）胚/幼虫の配向、レーザー曝露、および関心領域（楕円）measを示す模式図GFP光退色の量をモニターする平均蛍光のurement;ムービー1を参照してください。長方形のボックスはスキャンウィンドウを示します。 （ B ）405nmレーザー曝露前、曝露中および曝露後の実際の関心領域平均GFP強度トレースの一例。 4回の連続した測定（緑色の枠内に示されている）上の平均GFP強度は、光切除の前（Y）および後（X）に示される。比X / Yは全露光量の尺度として用いられ、 図3の X軸にプロットされている。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2：405nmレーザー暴露後の上皮細胞死。 GFPの消失を示す例示的な連続フレームおよび光分解後のヨウ化プロピジウム染色の出現（40％初期光退色）。フレームは、紫色光（405nm）露光後、0,130,170,220分にある。 GFPの消失は、赤色蛍光PI核陽性の出現と一致する。 PrI蛍光は赤色チャネルを使用して検出されることに注意してください。腎臓の外側に見られる赤色の蛍光は、発色団および腸管腔内のPIの存在に起因する。スケールバー=100μm。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図3：光切除量に対する上皮損傷の用量応答。 （ A ）光切除は、露光におけるGFP蛍光の初期減少率edセグメント。これは、損傷後5時間での傷害セグメントにおける平均GFP蛍光の減少と比較される。この測定は、損傷したセグメントの上流および下流の蛍光の平均量に対して正規化される。標的線量は、最初の光退色の10,20,30,40,50、および60％であった。実際の量は、蛍光が残っている85.2,75.6,66.2,54.6,43.5、および37.9％の残存蛍光をもたらす14.8,24.4,33.8,45.4,56.5、および62.1％の光漂白に僅かに大きく、わずかに大きい.n = 2-6 /標的グループ。エラーバーは、X（光アブレーション直後の残りの蛍光のパーセント）およびY（光アブレーションの5時間後の蛍光のパーセント）軸に沿った標準偏差を表す。 （ BE ）PI染色は、GFP陽性の全体的な消失と平行している。ほとんどのPI染色は、レーザ照射後100分で20％（蛍光残存率80％）光退色で観察されなかった（ B 、右パネル）。 （ Cおよび
| トランスジェニック | 発現パターン | 参考文献 |
| Tg（wt1b：GFP） | 糸球体、一部のPT | [11] |
| Tg（atp1a1a.4：GFP） | 遠位の糸球体 | [12] |
| Tg（cdh17：GFP） | 遠位の糸球体 | [9,10] |
| Tg（ret1：GFP） | 遅延DT、PD | [13] |
| Tg（エンペプ：GFP） | 遠位の糸球体 | [14] |
| Tg（cd41：GFP） | 多相細胞 | [15] |
| ET（krt8：EGFP）sqet11-9 | ストレートPT、早期DT | [16,17] |
| ET（krt8：EGFP）sqet33-d10 | 畳み込まれたPT | [16,17] |
| PT =近位尿細管 | ||
| DT =遠位尿細管 | ||
| PD - 前根管 |
ムービー1：光切断手順のアニメーション要約。映画の最初の部分では、適切な胚/幼虫の向きが示されています。 2つの腎臓の枝は緑色で示されている。アガロース中で魚を配向させるためにガラスプローブを使用する。これは、制御された非損傷分岐が望まれる場合に行われる。魚を釣り上げると、腎腎臓の1つの枝にのみレーザーが曝露される。映画の第2部では、レーザーアブレーション手順の概要が説明されています。楕円は、アブレーションを受けているセグメント内の関心領域を示し、初期光退色の量をモニタするために使用されるヒンジ。長方形の窓は、アブレーションされたセグメントのサイズと位置を正確に調整することを可能にする。 このビデオを見るにはここをクリックしてください。 （右クリックしてダウンロードしてください）
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Discussion
全レーザ出力はシステムによって異なることに留意されたい。しかし、％GFP光退色を使用すると、レーザー出力の変動とは無関係に、蛍光腎臓に送達され、暴露の長さによって補償される総エネルギーの読み出しが可能になる。しかし、この光切除法に対する異なる組織の応答は様々であることに留意してください。腎臓の成熟中でさえ、成熟した幼虫よりも若い胚でGFP蛍光の50％の減少を得ることは、はるかに困難である。このプロトコルを変更し、異なるアプリケーションに適応させる場合、光分解に対する組織反応性のこれらの差異を考慮する必要があります。したがって、傷害の量および傷害された腎臓上皮の予測される応答を適切に測定するために、GFP蛍光の減少パーセントをモニターすることが重要である。
この方法の主な利点は、腎障害の他の方法とゼブラフィッシュはそれが損傷の時空間的位置の正確な制御を可能にするものである。また、研究者は怪我のレベルを上下させることができます。傷害の量を制御するこの能力は、上皮細胞の応答の検査を可能にするべきであり、回復対アポトーシス対壊死の意思決定を助けるべきである。例えば、細胞移動は、部分的切除に対する生存上皮の初期応答であり、細胞増殖は、おそらく細胞移動によって生成される機械的力によって駆動される二次的プロセスであることを示すことが可能である14 。
細胞レベルで修復プロセスを研究する能力に加えて、この方法論には他の利点がある。第1に、以前の光切除技術は、光損傷9の量に対する制御を制限していた。しかし、このモデルは怪我の量を段階的にコントロールできるため、将来の研究を行う。さらに、このアプローチでは、GFP蛍光細胞の任意のグループを標的とすることが可能であり、したがって、セグメント全体の容易なアブレーションが可能になる。これはパルスレーザー技術で達成することができますが、それはより困難であり、実験設計の可能性を制限します。非常に多くのGFPトランスジェニックゼブラフィッシュが利用可能であるため、上皮傷害を標的化して増強するためにGFPを使用することは、さらなる利点である（ 表1は部分的なリストに過ぎない）。トランスジェニック種によって発現される他の蛍光タンパク質、例えばキラーレッドタンパク質も研究されているが、これらの魚トランスジェニックは広く利用可能ではない16 。 GFPを使用することのさらなる利点は、異なるレーザー波長で、光分解（405nm）またはイメージング（488nm）のいずれかでGFP発現を使用できることである。しかし、Johnson らによって発表された方法は、 9は、非蛍光性このアプローチよりも広く使用することができます。
このレーザーアブレーションモデルのもう一つの限界は、それがヒトAKIにつながる可能性のある様々な要因のすべてを考慮に入れないかもしれないということです。人体の細胞壊死につながる一連の事象、ならびに腎障害の際に誘導される細胞アポトーシスがあるかもしれない。レーザーアブレーション中に生成される異なる環境が、ヒトにおけるAKIの病態生理学のすべての側面を模倣できるかどうかは不明である10 。それにもかかわらず、このレーザアブレーションモデルは、代替モデルに比べて多くの利点を有する。腎細胞死の研究とリアルタイムでの高分解能修復を可能にすることにより、この方法は腎臓修復機構のより良い理解につながり、AKI治療に対する新しいアプローチの基礎を築くはずである。
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Disclosures
著者らは、競合する金銭的利益がないと宣言している。
Acknowledgments
腎臓のGFPトランスジェニック系統を共有してくださったIain Drummond博士とVladimir Korzh博士に感謝したいと思います。 NYITCOMにもこの作業を行うために必要なリソースを提供していただき、ありがとうございます。この研究の一部は、K08DK082782、R03DK097443（NIH）、およびHSCIパイロットグラント（AV）の助成金によって一部サポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri Dishes, 35 x 10 mm | Genesee Scientific | 32-103 | Procedural Usage: Step 2.4, 2.7 |
| Petri Dishes, 100 x 15 mm | Midwest Scientific | 910 | Procedural Usage: Step 1 |
| Dechorination forceps - Electron Microscopy Sciences Dumont Tweezers 5 Dumostar | Fischer Scientific | 50-241-57 | Procedural Usage: Step 2.1.1 |
| Plastic Transfer Pipet | Globe Scientific | 135030 | Procedural Usage: Step 2.5, 3.6 |
| Tricaine | Sigma Aldrich | A5040-25G | Procedural Usage: Step 2.3, 3.4 |
| Agarose | Fischer Scientific | BP165-25 | Procedural Usage: Step 2.3 |
| Pulled glass probe (manufactured manually from glass capillary tubes) | Fischer Scientific | 21-1640-2C | Procedural Usage: Step 2.4 |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1270 | Procedural Usage: Step 1.5 |
| SOLA Light Engine | Lumencor | SOLA SM-5-LCR-SB | Procedural Usage: Step 1.5 |
| Eclipse C2 Plus Confocal Microscope System | Nikon | Procedural Usage: Step 3 | |
| 1x E3 Solution | Recipe used to generate: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2 , 0.33 mM MgSO4 Procedural Step Usage: 1.2, 1.3, 2.2, 2.3 | ||
| PTU | Sigma | P7629-10G | Procedural Step Usage: 1.3, 2.2, 3.4, 4.2 |
| NIS Elements Software | Nikon | C2+ | Procedural Usage: Step 3 |
| Laser Unit | Agilent | MLC 400 | Procedural Step 3.11 |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma Aldrich | P4170-100MG | Procedural Step Usage: 4.2 |
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