Summary
Diese Arbeit präsentiert ein neues in vivo Modell der segmentalen Nierenverletzung mit Nieren GFP transgenen Zebrafisch. Das Modell ermöglicht die Induktion der gezielten Ablation von Nierenepithelzellen, um die zellulären Mechanismen der Nephronverletzung und Reparatur zu zeigen.
Abstract
Akute Nierenverletzung (AKI) ist eine häufige Erkrankung mit einer hohen Sterblichkeitsrate. Mit den Reparaturfähigkeiten der Niere ist es möglich, eine adäquate Nierenfunktion nach einer unterstützenden Behandlung wiederherzustellen. Jedoch ist ein besseres Verständnis davon, wie Nephron-Zelltod und -reparatur auf zellulärer Ebene stattfinden, erforderlich, um den Zelltod zu minimieren und den regenerativen Prozess zu verbessern. Der Zebrafisch pronephros ist ein gutes Modellsystem, um dieses Ziel zu erreichen, weil es anatomische Segmente enthält, die dem Säugetier-Nephron ähnlich sind. Bisher war das häufigste Modell, das verwendet wurde, um Nierenverletzungen bei Fischen zu untersuchen, das pharmakologische Gentamicin-Modell. Allerdings erlaubt dieses Modell keine präzise räumlich-zeitliche Kontrolle der Verletzung, und daher ist es schwierig, zelluläre und molekulare Prozesse zu untersuchen, die an der Nierenreparatur beteiligt sind. Um diese Einschränkung zu überwinden, stellt diese Arbeit eine Methode dar, durch die im Gegensatz zum Gentamicin-Ansatz ein spezifisches Green Fuorescent Protein (GFP) -exPress-Nephron-Segment kann mit einem violetten Laserlicht (405 nm) fotografiert werden. Dieses neuartige Modell von AKI bietet viele Vorteile, die andere Methoden der Epithelverletzung fehlen. Seine Hauptvorteile sind die Fähigkeit, das Verletzungsniveau und die präzise räumlich-zeitliche Kontrolle im robusten In-vivo- Tiermodell zu "wählen". Diese neue Methode hat das Potenzial, das Niveau des Verständnisses von Nierenverletzungen und Reparaturmechanismen deutlich zu verbessern.
Introduction
Akute Nierenverletzung (AKI) 1 , 2 , die auch als akutes Nierenversagen bezeichnet werden kann, ist weitgehend als plötzliche Beeinträchtigung der Nierenfunktion definiert 3 . Während das Niveau des Verständnisses dieser Bedingung im Laufe der Jahre bemerkenswert verbessert wurde, blieben die Morbiditäts- und Sterblichkeitsraten hoch 1 , 2 . Die derzeitige Behandlung für diese Bedingung ist meist unterstützend, da die Ergebnisse aus mehreren klinischen Studien der medikamentösen Therapie negativ waren 4 , 5 . Die Niere ist einzigartig darin, dass sie die Fähigkeit hat, sich selbst zu reparieren. Daher ist die unterstützende Therapie nach einer frühen Diagnose von AKI der beste Weg, um die Morbidität zu begrenzen 6 . Allerdings ist es schwierig, AKI frühzeitig zu erkennen, und die Sterblichkeit ist eine Staffelung von 50-80% für diejenigen, die Dialyse benötigen 5. Mit der Fähigkeit der Nieren, sich selbst zu reparieren und die Mangel an Behandlungsmöglichkeiten für diese Bedingung, ist es wichtig, Methoden zu entwickeln, um diese Nephron-Regeneration zu verbessern.
Es gab viele verschiedene Modelle für AKI-Forschung, die verschiedene Agenten der Verletzung und Tier-Modelle enthält verwendet. In Bezug auf Agenten der Nierenschädigung wurde das Aminoglykosid-Antibiotikum Gentamicin als nephrotoxisches Mittel verwendet, das zu AKI 7 , 8 führt . Allerdings haben mehrere Gruppen festgestellt, dass Gentamicin Behandlung ist tödlich für die Zebrafisch Embryo 9 . Es verursacht Schlauchschäden, die für die Embryo-Erholung zu ernst sind, was das Studium der Regeneration ohne irgendeine Art von Intervention schwierig macht. Säugetiermodelle, wie die Maus und die Ratte, werden auch als wertvoll angesehen, aber sie stehen vor vielen Einschränkungen während des Studiums von AKI. Vielleicht ist der Hauptnachteil von Nagetiermodellen die Schwierigkeit in VisuaDie Nagetierniere zu verteilen und so die präzisen räumlich-zeitlichen Prozesse zu bestimmen, die zu epithelialem Tod und Reparatur führen.
Johnson et al. Haben eine Laserablations-basierte Technik berichtet, um eine akute Nierenverletzung in embryonalen und larvalen Zebrafisch zu induzieren 9 . Sie verwendeten gepulste Laserablation, um die Niere nach einer intramuskulären Injektion mit Dextran-Konjugaten zu beschädigen. Die Fluoreszenz von Dextran-Konjugaten ermöglicht die Visualisierung von Schädigung und Regeneration im Tubulusepithel 9 . Dieses Modell überwindet die beiden oben erwähnten Einschränkungen, erlaubt aber keine abgestuften Verletzungsstörungen und ist bei großen, willkürlichen Zellgruppen schwer durchführbar.
Das hier beschriebene neue Laserablations-basierte Zebrafisch-Modell von AKI adressiert alle oben genannten Einschränkungen. Die pronephrische Niere im Larven-Zebrafisch ist ein reifes, funktionierendes Organ, das Segmente ähnlich dem Säugetier ne enthältPhron, einschließlich eines Glomerulus, proximalen und distalen Tubuli, und einem Sammelkanal 10 . Zebrafisch-Larven sind auch optisch transparent, so dass es möglich ist, die Niere durch Fluoreszenztechniken zu beobachten. So ist Zebrafisch ein wertvolles In-vivo- Modell von AKI, und die Larven-pronephrische Niere (5-12 Tage nach der Befruchtung (dpf)) kann verwendet werden, um die zellulären und molekularen Prozesse, die an Nierenverletzungen und Reparaturen beteiligt sind, zu untersuchen.
Dieses Papier stellt eine Methode dar, durch die spezifische Green Fluorescent Protein (GFP) -exprimierende Nephronsegmente unter Verwendung einer Niedrigenergie (im Vergleich zu einem gepulsten Lasersystem) violetten Laserlicht (405 nm) fotografiert werden können. Die GFP-Fluoreszenz ermöglicht das Targeting einer Gruppe von Zellen, wodurch die Veränderungen entstehen, die durch die Beobachtung von GFP-Photobleichen sichtbar werden. Darüber hinaus dient GFP (durch Absorption von violettem Licht) als Energiesenke, um die Verletzung in GFP-exprimierenden Nierenzellen zu verstärken. Zeitraffer-MikrosKopie kann dann verwendet werden, um den Reparaturprozess zu studieren. Studien haben Zellproliferation, Zellmigration und Zellmetaplasie 11 , 12 , 13 gefunden, um alle mögliche Prozesse, die eine wichtige Rolle bei der Nierenreparatur spielen können. Allerdings ist die relative Bedeutung dieser Prozesse und die Details ihres Zusammenspiels aufgrund der Einschränkungen bestehender AKI-Modelle schwer aufzudecken. Mit diesem neuartigen Ansatz konnte gezeigt werden, dass die Zellmigration eine zentrale Rolle bei der Nierenreparatur nach akuten Verletzungen spielt. 14
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Protocol
Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den Empfehlungen in der Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labor-Tiere der National Institutes of Health durchgeführt. Das Protokoll wurde von der NYIT College of Osteopathic Medicine Institutional Animal Care und Use Committee (NYITCOM IACUC) genehmigt. Alle Operationen und In-vivo- Experimente wurden unter Trikose Anästhesie durchgeführt, und alle Anstrengungen wurden gemacht, um Leiden zu minimieren.
1. Erhalt und Erhaltung von Embryonen
- Erhalten Sie Embryonen durch Überqueren der Niere GFP fluoreszierenden Zebrafisch.
HINWEIS: Beispiele für fluoreszenzmarkierte Zebrafisch-transgene Linien sind in Tabelle 1 aufgelistet. - Halten Sie die Embryonen bei 28,5 ° C in E3-Lösung während der 24-stündigen Nachdüngung.
- Nach 24 h ersetzen Sie das Medium durch eine E3-Lösung, die 0,003% 1-Phenyl-2-thioharnstoff (PTU) enthält.
HINWEIS: PTU wird verwendet, weil es die Tyrosinase-abhängigen Schritte in der Melanogenese blockiertUnd verhindert daher eine Pigmentierung. Hier wird diese Lösung als E3-PTU bezeichnet. - Heben Sie die befruchteten Embryonen bei 28,5 ° C an, bis sie> 6 dpf sind, an welcher Stelle die Nieren gereift sind.
HINWEIS: Es ist am besten, Larven im 7-9 dpf Fenster zu benutzen. - Mit einem fluoreszierenden Seziermikroskop bei 40facher Vergrößerung und grünen Fluoreszenzemissionsfiltern wählen Sie die Larven mit heller Nieren-GFP-Fluoreszenz aus.
2. Montage der Zebrafisch für Live-Imaging
- Wenn Sie die Embryonen vor 3 dpf fotografieren, entfernen Sie das Chorion aus irgendeinem ungehärteten Zebrafisch, bevor Sie den Zebrafisch für die Bildgebung anbringen.
- Manuell mit Pinzette dehydrieren (bevorzugt) oder eine chemische Behandlung mit einer Protease-Mischung verwenden.
HINWEIS: Die Dechorierung ermöglicht die besten Bilderzeugung.
- Manuell mit Pinzette dehydrieren (bevorzugt) oder eine chemische Behandlung mit einer Protease-Mischung verwenden.
- Die Chorion-Trümmer in der Petrischale mit E3-PTU-Lösung ausspülen und die Schale mit E3-PTU nachfüllen.
- PrepaRe 1-2% Low-Melting Point (LMP) Agarose mit 0,2 mg / ml Tricain-Lösung zur Befestigung der Zebrafisch für Nieren-Photoablation und Live-Imaging.
- Wenn LMP-Agarose bereits vorher vorbereitet wurde, heizen Sie es in der Mikrowelle auf, um es zu schmelzen.
- Sobald die LMP-Agarose vorbereitet ist, legen Sie eine 35 mm Plastik-Petrischale auf ein Sektions-Mikroskop. Legen Sie eine gezogene Glassonde in die Nähe, um die anästhesierten Larven richtig auszurichten.
HINWEIS: Es ist wichtig, diesen Schritt rechtzeitig zu machen und alles zu haben, denn die Embryonen müssen sich orientieren, bevor die Agarose in ca. 1-3 min erstarrt. - Vor der Übertragung des Embryos auf die Agarose ist darauf zu achten, dass die Agarose kühl ist ( dh bei Körpertemperatur). Verwenden Sie eine Plastik- oder Glasübertragungspipette, um den Embryo in die abgekühlte geschmolzene Agarose-Tricain-Lösung zu legen.
HINWEIS: Dies geschieht, weil Agarose, die zu heiß ist, kann schädlich für den Embryo, was zu HerzstillstandOder Tod - Mit einer Transferpipette den Embryo in die Agarose-Lösung umreißen und den Embryo / Larve in der Mitte einer 35-mm-Schale positionieren.
- Die Agarose, die den Embryo / Larve enthält, schnell ausbreiten, um den Boden der 35 mm Schale gleichmäßig zu bedecken; Das beste Volumen der Agarose zu verwenden ist ~ 1-1.1 ml.
- Verwenden Sie die Glassonde, um den Embryo in der bestmöglichen Position für die Photoablation und die Bildgebung zu orientieren.
HINWEIS: Film 1 zeigt die beste Orientierung des Embryos / der Larve für die einseitige Photoablation. Dieser Schritt ist der zeitempfindlichste und sollte schnell durchgeführt werden, bevor die Agarose anfängt zu gelieren, da jeder Versuch, den Fisch nach dem Gelieren neu zu orientieren, schädlich ist.- Orientieren Sie die Larve so, dass das interessierende Nierensegment senkrecht zum Strahlengang ist, während das kontralaterale Segment vom Laserstrahl entfernt ist (siehe Film 1 ).
HINWEIS: Dies kann durch Drehen der Larve erreicht werden, wie in Film 1 gezeigt . - Erlauben Sie etwa 15 min für die Agarose zu verfestigen. Decken Sie die Petrischale ab, um die Verdunstung zu minimieren. Sobald die Agarose erstarrt ist, ist der Embryo oder die Larve bereit für die Photoablation.
3. Laserablation
- Betreiben Sie das konfokale Abbildungssystem.
HINWEIS: Bei Verwendung der referenzierten Imaging-Plattform (siehe Tabelle der Materialien) sind die empfohlenen Einstellungen 40-fache Vergrößerung, eine 0,8 NA-Wasser-Tauchlinse und der erste dichroitische Spiegelsatz, der sowohl eine 488- als auch eine 405-nm-Beleuchtung der Probe ermöglicht. Die Erkennung sollte auf dem grünen Kanal erfolgen. - Positioniere die Schale mit dem immobilisierten Zebrafisch auf einer konfokalen Bühne.
HINWEIS: Diese Vorgehensweise ist für die aufrechte Konfiguration mit einem 40-60X Wasser-Tauchobjektiv optimiert. Es sollte jedoch möglich sein, die Prozedur für ein invertiertes Mikroskop zu modifizieren. - In der aufrechten Konfiguration positionieren Sie die Petrischale, die den Embryo auf einer Mikroskopie enthältOpe schieben und halten sie mit dem Modellieren von Ton ( zB Plastilin). Positionieren Sie die Glasrutsche mit der Petrischale auf die Bühne des konfokalen Mikroskops.
- Füge 3 ml der Imaging-Lösung E3-PTU (siehe Schritt 1.3) mit 0,2 mg / ml Tricain hinzu.
HINWEIS: Die bildgebende Lösung kann auch sofort vor dem Einlegen der Folie auf die Bühne aufgenommen werden. Der Zusatz von Imaging-Lösung sollte sehr sorgfältig durchgeführt werden, um zu verhindern, dass die Agarose aus dem Boden der Schale schwebt. - Umschalten auf die Wasser-Tauchlinse (40 oder 60X). Langsam heben Sie die Bühne an und stellen Sie sicher, dass das Objektiv leicht abgewinkelt ist, um zu verhindern, dass Luft im Strahlengang eingefangen wird. Sobald das Objektiv die Lösung in einem Winkel berührt, zentrieren Sie es so, dass es im Blickfeld der Embryonen ist.
- Finden Sie das Segment des Interesses mit der Fluoreszenz-Lichtquelle. Oberflächlich positionieren Sie den Zweig, der auf Verletzungen gerichtet ist, um die Lichtstreuung zu minimieren (siehe Film 1 ).
HINWEIS: Die UntersequenzT Schritte verwenden von referenzierten Software (siehe die Tabelle der Materialien), aber die Prozedur kann leicht an andere Plattformen angepasst werden. - Öffnen Sie die Software. Navigieren Sie zu "View" "Akquisitionssteuerung" "C2plus Compact GUI" und setzt die "Pixel-Verweilzeit" auf "1,9 μs", "Frame Size" auf "512 x 512 Pixel" und "Pinhole Size" auf "90 μm". Set "405 nm (oder 408 nm in einigen Systemen) Laserintensität" auf Null und "488 Laserintensität" bis "niedrig" (vorzugsweise <1%). Stellen Sie die "Verstärkung" ein, um einen guten Dynamikbereich zu erhalten, aber nicht das Signal zu sättigen.
HINWEIS: Diese Werte sind nicht kritisch und werden für Konsistenz verwendet. Wenn ein 405 nm Laser verwendet wird, führt dies zu einer Erhöhung der GFP-Fluoreszenz. Um die Sättigung des Signals während des Photobleichens zu vermeiden (Schritt 3.11), sollte der Signalverstärkungswert auf dem grünen Kanal verkleinert werden. Die blaue Kanalverstärkung kann bei Null bleiben, da sie nicht für sa verwendet wirdMischen - Klicken Sie auf "Scan" in der Software-Schnittstelle, um die Niere mit einem 488-nm-Laser zu scannen. Finden Sie das Segment des Interesses, das senkrecht zum Strahlengang ist und das ist gut visualisiert, mit guter GFP-Fluoreszenz. Sobald diese Region identifiziert wurde, ziehen Sie eine Region von Interesse mit einem elliptischen Region-of-Interest (ROI).
- Navigieren Sie zu "ROI" "Elliptischer ROI zeichnen".
HINWEIS: Dies wird verwendet, um die durchschnittliche GFP-Intensität kontinuierlich zu messen, während das Photobleichen stattfindet, was die Verabreichung einer genauen Dosis der Laserbehandlung ermöglicht.
- Navigieren Sie zu "ROI" "Elliptischer ROI zeichnen".
- Navigieren Sie zu "View" "Akquisitionskontrollen" "C2plus Scan Area" und wählen Sie "Band Scan Area". Die rechteckige Maske erscheint innerhalb dieser Schnittstelle. Manuelles Definieren eines rechteckigen Scanfensters mit dem Cursor ( z. B. Ziehen, Verkleinern und Drehen der Maske), um das für die Laserablation gezielte Segment zu decken. Klicken Sie mit der rechten Maustaste in dieMaskenbereich, um die Auswahl zu akzeptieren.
HINWEIS: Nur die ausgewählte Region wird gescannt. - Beginnen Sie die Zeitmessung bei der Überwachung des grünen Kanals mit nur dem 488 nm Laser, um GFP zu aktivieren. Stellen Sie sicher, dass die Intensität des 488-Lasers relativ niedrig ist (~ 1%). Messen Sie die durchschnittliche Intensität des GFP im interessierenden Bereich, indem Sie "Messen" wählen "Zeitmessung". Verwenden Sie die Registerkarten "Graph" oder "Data", um die durchschnittlichen Intensitätswerte im ROI zu überwachen.
HINWEIS: Die Erfassungsrate wird durch die Pixelverweilzeit und die Größe des in Schritt 3.9 eingestellten rechteckigen Fensters festgelegt, aber im allgemeinen ermöglicht es die schnelle Überwachung des Signals (~ 2-10 Frames / s). - Induzieren Schädigung der Nierenzellen mit dem violetten Laser (405 nm) durch Erhöhung der Intensität auf 100% durch Schieben der "Laser Power" Kontrolle ganz nach rechts. Der 488-nm-Laser kann aktiv bleiben, wenn die Intensität niedrig ist.
- Beobachtung einer Linie gRaph mit der Registerkarte "Graph" oder den numerischen Werten der GFP-Intensität über die Registerkarte "Data" und warten, bis sie auf ein gewünschtes Level fällt, zB 50% der Baseline (wie in Abbildung 1 gezeigt ).
HINWEIS: Ein 20-mW-Laser wurde als Teil der referenzierten Lasereinheit verwendet (siehe Tabelle der Materialien ); Die maximale Intensität kann zwischen den Systemen variieren. Eine geringere Intensität kann durch eine längere Exposition kompensiert werden ( dh mit prozentualer GFP-Bleiche als Maß für die Gesamtbelastung).
- Beobachtung einer Linie gRaph mit der Registerkarte "Graph" oder den numerischen Werten der GFP-Intensität über die Registerkarte "Data" und warten, bis sie auf ein gewünschtes Level fällt, zB 50% der Baseline (wie in Abbildung 1 gezeigt ).
- Sobald die GFP-Intensität innerhalb des elliptischen ROI (Schritt 3.8) auf ein gewünschtes Niveau gefallen ist, verringern Sie sofort die Intensität des violetten (405 nm) Lasers auf "0", indem Sie den Schieberegler "Laserleistung" ganz nach links bewegen Das Software-Bedienfeld.
- Erhalten Sie eine neue Grundlinie der GFP-Fluoreszenz. Bestätigen Sie die Ablation, indem Sie ein Verhältnis von X / Y erhalten.
HINWEIS: Siehe Abbildung1B; Y = mittlere Intensität vor der Ablation und X = mittlere Intensität nach der Ablation unter Verwendung von durchschnittlich 4 aufeinanderfolgenden Proben innerhalb des ROI. Das genaue Zielverhältnis (50%, 60%, etc. ) hängt von der Verletzungsmenge ab, die für ein gegebenes Experiment gewünscht wird.
- Erhalten Sie eine neue Grundlinie der GFP-Fluoreszenz. Bestätigen Sie die Ablation, indem Sie ein Verhältnis von X / Y erhalten.
4. Zeitraffer-Mikroskopie mit Propidium-Iodid-Färbung
- Bewerben Sie allgemeine Zeitrafferbetrachtungen (in einer früheren Studie 15 skizziert), um die Propidiumjodidfärbung als Korrelat der Nierenzellverletzung nach der Photoablation zu visualisieren.
- Vor der Inkubation der Larven in 30 μM Propidiumjodidlösung (1% DMSO in E3-PTU) für 3 h vor der Einbettung und Photoablation, wie in den Schritten 2 und 3,7 beschrieben.
HINWEIS: In der Agarose oder der Imaging-Lösung ist kein zusätzliches Propidiumjodid erforderlich. - Induzieren segmentale Nierenverletzung, wie in den Schritten 3.1-3.12 beschrieben.
- Erhalten Sie Zeitraffer-Bildstapel, als descriBett in einer früheren Studie 14 , unter Verwendung eines 488 nm Lasers (GFP) und eines 461 nm Laser (Propidium Iodid, PI).
HINWEIS: Die beiden Farben werden in konfokalen Stapeln überlagert, um das Verschwinden von GFP und das Auftreten von Propidiumjodidfärbung zu korrelieren. - Setzen Sie die Parameter für das Erhalten der Zeitraffer-Bildstapel wie folgt: virtuelle Scheibendicke = 4 μm, z-Stapelintervall = 2 μm, Pixelverweilzeit = 1,9 μs, Bildmaße = 512 x 512 und Mittelwertbildung = 2.
HINWEIS: Diese Parameter erlauben eine kontinuierliche, 10- bis 15-minütige Intervallaufnahme von bis zu 4 Larven und sorgen für eine minimale Photobleichung der Probe. - Verwenden Sie Imaging-Software, die mit dem Aufzeichnungsdateiformat kompatibel ist, um die Daten zu visualisieren und zu analysieren.
- Orientieren Sie die Larve so, dass das interessierende Nierensegment senkrecht zum Strahlengang ist, während das kontralaterale Segment vom Laserstrahl entfernt ist (siehe Film 1 ).
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Representative Results
Bitte beachten Sie, dass dieses Protokoll erfolgreich mit einer Anzahl von Nieren-GFP-transgenen Linien verwendet wurde, einschließlich ET (krt8: EGFP) sqet11-9, ET (krt8: EGFP) sqet33-d10 und Tg (atp1a1a.4: GFP). Die hier gezeigten Beispielergebnisse wurden unter Verwendung der ET (krt8: EGFP) sqet11-9 Linie erhalten.
Abbildung 1 zeigt das Beispiel-Photoablationsprotokoll. Die durchschnittliche GFP-Intensität wird innerhalb des interessierenden Bereichs überwacht (Abbildung 1A und Film 1 ). Eine beispielhafte durchschnittliche Intensitätsspur ist in 1B gezeigt .
Wie in Abbildung 2 gezeigt, verschwindet die GFP-Fluoreszenz nach der Exposition gegenüber 405 nm Laserlicht zu einer Zeit, bis bei 220 min das gesamte ablatierte Segment 100% seiner GFP-Positivität verliert. Dieser Verlust von GFP fLuoreszenz ist in der Tat aufgrund des Zelltods und nicht z. B. der Abregulation der GFP-Expression. Dies wird durch das Auftreten von roten fluoreszierenden Propidiumjodid-positiven Kernen in den Zellen nachgewiesen, die die GFP-Positivität verlieren.
Das Ausmaß des Zelltods kann durch Messung der durchschnittlichen GFP-Fluoreszenz im ablatierten Segment beurteilt und mit der mittleren GFP-Intensität unmittelbar vorne und hinter dem ablatierten Segment verglichen werden. Fig. 3 zeigt die Beziehung zwischen dem Ausmaß der Laserbelichtung (gemessen durch die Anfangsmenge des Photobleichens) und dem Ausmaß des Zelltods im exponierten Segment. Es zeigt sich, dass durch Variation der anfänglichen Belichtung die Verletzung und die Reaktion des verletzten Epithels "gewählt" werden kann. Bei 10-20% des anfänglichen GFP-Photobleichens wird praktisch keine Reduktion der GFP-Positivität bei 5 h nach der Verletzung beobachtet. 50 und 60% photobleaching führt zu einem kompletten verschwindenArance von GFP um 5 h, während 30 und 40% Bleichen zu Zwischenergebnissen führen, mit 50% geschätztem Tod bei etwa 35% Photobleichung beobachtet. Diese Ergebnisse werden durch PI-Färbung unterstützt (Abbildung 3B ). 20% Photobleichung führt zu praktisch keiner PI-Färbung bei 100 min nach der Ablation. 50% Photobleichung führt nach 60 min zu einer kontinuierlichen PI-Positivität im ablatierten Epithel, während 30 und 40% Photobleichung zum Zwischen-PI-Einbau führt. Wie aus diesen Daten hervorgeht, erlaubt diese Methodik die Induktion von abgestuften Mengen an Epithelverletzungen und für die Untersuchung der epithelialen Reaktion auf tödliche und subtale Epithelschäden.
Abbildung 1: Photoablationsprozedur ( A ) Schematische Darstellung der Embryo / Larve-Orientierung, Laser-Exposition und der Region-of-Interest (Ellipse) MessungUrement der durchschnittlichen Fluoreszenz zur Überwachung der Menge an GFP-Photobleichung; Siehe Film 1. Die rechteckige Box zeigt das Scan-Fenster an. ( B ) Ein Beispiel für eine tatsächliche Region-of-Interest-durchschnittliche GFP-Intensitätsspur vor, während und nach 405 nm Laserbelichtung. Durchschnittliche GFP-Intensitäten auf vier aufeinanderfolgenden Messungen (gezeigt in grünen Kästchen) werden vor (Y) und nach (X) der Photoablation gezeigt. Das Verhältnis X / Y wird als Maß für die Gesamtlichtbelichtung verwendet und ist auf der X-Achse in Fig. 3 aufgetragen . Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Epithelzelltod nach 405 nm Laserbelichtung. Beispiel sequentielle Frames, die das Verschwinden von GFP an zeigenD das Aussehen der Propidiumjodidfärbung nach der Photoablation (40% initiales Photobleichen). Die Rahmen sind bei 0, 130, 170 und 220 min nach Violettlicht (405 nm) Belichtung. Das Verschwinden von GFP fällt mit dem Auftreten der roten fluoreszierenden PI-Kern-Positivität zusammen. Bitte beachten Sie, dass die PrI-Fluoreszenz mit dem roten Kanal erkannt wird. Die rote Fluoreszenz, die außerhalb der Niere gesehen wird, ist auf Chromophore und die Anwesenheit von PI im Darmlumen zurückzuführen. Maßstab = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Dosiswirkung der Epithelverletzung auf den Betrag der Photoablation. ( A ) Die Photoablation wird durch den Prozentsatz der anfänglichen Reduktion der GFP-Fluoreszenz im Exposure gemessenEd segment Dies verglichen mit dem Rückgang der durchschnittlichen GFP-Fluoreszenz im verletzten Segment bei 5 h nach der Verletzung. Diese Messung wird auf die durchschnittliche Fluoreszenzmenge stromaufwärts und stromabwärts des verletzten Segments normiert. Zieldosen waren 10, 20, 30, 40, 50 und 60% des anfänglichen Photobleichens. Die tatsächlichen Mengen sind etwas größer, was 14,8, 24,4, 33,8, 45,4, 56,5 und 62,1% Photobleichung bedeutet, was zu 85,2, 75,6, 66,2, 54,6, 43,5 und 37,9% verbleibender Fluoreszenz führt, n = 2 - 6 / Ziel Gruppe. Die Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung entlang des X (Prozent der verbleibenden Fluoreszenz unmittelbar nach der Photoablation) und Y (Prozent der verbleibenden Fluoreszenz 5 h nach der Photoablation) Achsen. ( BE ) PI-Färbung parallel zum Gesamtverschwinden der GFP-Positivität. Nahezu keine PI-Färbung wird bei 20% (80% verbleibende Fluoreszenz) beobachtet. Photobleichung bei 100 min nach der Laserbelichtung ( B , rechte Platte). ( C und
| Transgenic | Ausdrucksmuster | Referenzen |
| Tg (wt1b: GFP) | Glomerulus, einige PT | [11] |
| Tg (atp1a1a.4: GFP) | Distal zum Glomerulus | [12] |
| Tg (cdh17: GFP) | Distal zum Glomerulus | [9,10] |
| Tg (ret1: GFP) | Late DT, PD | [13] |
| Tg (enpep: GFP) | Distal zum Glomerulus | [14] |
| Tg (cd41: GFP) | Multiciliated Zellen | [15] |
| ET (krt8: EGFP) sqet11-9 | Gerade PT, frühes DT | [16,17] |
| ET (krt8: EGFP) sqet33-d10 | Faltende PT | [16,17] |
| PT = Proximal Tubule | ||
| DT = Distale Tubule | ||
| PD - Pronephric Duct |
Film 1: Animation Zusammenfassung der Photoablation Prozedur. Im ersten Teil des Films wird eine richtige Embryo / Larve-Orientierung gezeigt. Die beiden Nierenäste sind grün dargestellt. Eine Glassonde wird verwendet, um den Fisch in Agarose zu orientieren. Dies geschieht, wenn ein kontrollierter, nicht verletzter Zweig gewünscht wird. Angeln der Fische erlaubt die Laserbelichtung auf nur einem Zweig der pronephrischen Niere. Im zweiten Teil des Films wird das Laserablationsverfahren skizziert. Die Ellipse zeigt den interessierenden Bereich innerhalb des Segments an, das einer Ablation unterzogen wird, die verwendet wird, um die Menge an initialem Photobleak zu überwachenHing. Das rechteckige Fenster ermöglicht die präzise Einstellung der Größe und Position des ablatierten Segments. Bitte klicken Sie hier um dieses Video anzusehen. (Klicken Sie mit der rechten Maustaste zum Herunterladen.)
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Discussion
Es ist zu beachten, dass die gesamte Laserleistung zwischen den Systemen variiert. Jedoch ermöglicht die Verwendung von Prozent-GFP-Photobleichen ein Auslesen der Gesamtenergie, die an die fluoreszierende Niere abgegeben wird, unabhängig von der Änderung der Laserleistung und kompensiert durch die Belichtungsdauer. Denken Sie jedoch daran, dass die Reaktion der verschiedenen Gewebe auf diese Methode der Photoablation variiert. Auch bei der Nierenreifung ist es wesentlich schwieriger, eine 50% ige Reduktion der GFP-Fluoreszenz bei jüngeren Embryonen zu erhalten als bei reifen Larven. Diese Unterschiede in der Empfindlichkeit des Gewebes gegenüber der Photoablation sollten bei der Modifikation und Anpassung dieses Protokolls an verschiedene Anwendungen berücksichtigt werden. Daher ist es entscheidend, die prozentuale Verringerung der GFP-Fluoreszenz zu überwachen, um die Menge der Verletzung und die vorhergesagte Reaktion des verletzten Nierepithels richtig zu messen.
Die wichtigsten Vorteile dieser Methode, wenn andere Methoden der Nierenverletzung inZebrafisch ist, dass die genaue Kontrolle der räumlich-zeitlichen Lage der Verletzung ermöglicht wird. Außerdem ermöglicht es Forschern, das Niveau der Verletzung auf und ab zu wählen. Diese Fähigkeit, die Menge der Verletzung zu kontrollieren, sollte die Untersuchung der Antworten von Epithelzellen ermöglichen und sollte bei der Entscheidungsfindung im Hinblick auf die Wiederherstellung gegenüber der Apoptose und der Nekrose helfen. Beispielsweise ist es möglich zu zeigen, dass die Zellmigration eine anfängliche Antwort des überlebenden Epithels auf die segmentale Ablation ist und dass die Zellproliferation ein sekundärer Prozess ist, der wahrscheinlich durch mechanische Kräfte, die durch die Zellmigration erzeugt werden, angetrieben wird.
Neben der Fähigkeit, den Reparaturprozess auf zellulärer Ebene zu studieren, gibt es andere Vorteile dieser Methodik. Zuerst hatten vorherige Photoablationstechniken eine begrenzte Kontrolle über die Menge an Photodamage 9 . Allerdings ermöglicht dieses Modell eine abgestufte Kontrolle über die Höhe der Verletzung, so dass es einfacher zu machenKünftige Studien durchführen Darüber hinaus ist es bei diesem Ansatz möglich, beliebige Gruppen von GFP-Fluoreszenzzellen zu zielen, wodurch die einfache Ablation ganzer Segmente ermöglicht wird. Während dies mit der gepulsten Lasertechnik erreicht werden konnte, ist es mühsamer, das Potential für experimentelles Design zu begrenzen. Die Verwendung von GFP zur Ziel- und Potenzierung von Epithelverletzungen ist ein weiterer Vorteil, da es so viele GFP-transgene Zebrafisch gibt ( Tabelle 1 ist nur eine Teilliste). Andere fluoreszierende Proteine, die durch transgene Spezies exprimiert wurden, wurden ebenfalls untersucht, wie das Killer-rote Protein, aber diese Fisch-Transgenika sind nicht weit verfügbar 16 . Ein zusätzlicher Vorteil der Verwendung von GFP besteht darin, dass bei verschiedenen Laserwellenlängen die GFP-Expression entweder für die Photoablation (405 nm) oder die Bildgebung (488 nm) verwendet werden kann. Es ist jedoch zu beachten, dass die von Johnson et al. 9 kann auf nicht-fluoreszierende angewendet werdenZebrafisch und kann daher weit verbreitet als dieser Ansatz verwendet werden.
Eine weitere Einschränkung dieses Laserablationsmodells ist, dass es nicht alle anderen Faktoren berücksichtigen kann, die zu menschlichem AKI führen können. Es kann eine Kette von Ereignissen geben, die zu Zellnekrose im menschlichen Körper führen, sowie Zell-Apoptose, die bei Nierenverletzungen induziert wird. Es ist unklar, ob die während der Laserablation erzeugte Umgebung alle Aspekte der Pathophysiologie von AKI beim Menschen imitieren kann 10 . Dennoch hat dieses Laserablationsmodell viele Vorteile gegenüber den alternativen Modellen. Indem man das Studium des Nierenzelltods und der Reparatur mit einer hohen Auflösung in Echtzeit erlaubt, sollte diese Methode zu einem besseren Verständnis von Nierenreparaturmechanismen führen und eine Grundlage für neue Ansätze zur AKI-Behandlung legen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Iain Drummond und Dr. Vladimir Korzh für den Austausch von Nieren-GFP-transgenen Linien. Wir danken auch NYITCOM für die Bereitstellung notwendiger Ressourcen für diese Arbeit. Diese Studie wurde teilweise durch Stipendien unterstützt: K08DK082782, R03DK097443 (NIH) und der HSCI Pilot Grant (AV).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri Dishes, 35 x 10 mm | Genesee Scientific | 32-103 | Procedural Usage: Step 2.4, 2.7 |
| Petri Dishes, 100 x 15 mm | Midwest Scientific | 910 | Procedural Usage: Step 1 |
| Dechorination forceps - Electron Microscopy Sciences Dumont Tweezers 5 Dumostar | Fischer Scientific | 50-241-57 | Procedural Usage: Step 2.1.1 |
| Plastic Transfer Pipet | Globe Scientific | 135030 | Procedural Usage: Step 2.5, 3.6 |
| Tricaine | Sigma Aldrich | A5040-25G | Procedural Usage: Step 2.3, 3.4 |
| Agarose | Fischer Scientific | BP165-25 | Procedural Usage: Step 2.3 |
| Pulled glass probe (manufactured manually from glass capillary tubes) | Fischer Scientific | 21-1640-2C | Procedural Usage: Step 2.4 |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1270 | Procedural Usage: Step 1.5 |
| SOLA Light Engine | Lumencor | SOLA SM-5-LCR-SB | Procedural Usage: Step 1.5 |
| Eclipse C2 Plus Confocal Microscope System | Nikon | Procedural Usage: Step 3 | |
| 1x E3 Solution | Recipe used to generate: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2 , 0.33 mM MgSO4 Procedural Step Usage: 1.2, 1.3, 2.2, 2.3 | ||
| PTU | Sigma | P7629-10G | Procedural Step Usage: 1.3, 2.2, 3.4, 4.2 |
| NIS Elements Software | Nikon | C2+ | Procedural Usage: Step 3 |
| Laser Unit | Agilent | MLC 400 | Procedural Step 3.11 |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma Aldrich | P4170-100MG | Procedural Step Usage: 4.2 |
References
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