Summary
خلايا انسجة النخاع (مسس) مع وجود إمكانات عصبية داخل نخاع العظم. بروتوكول لدينا يثري هذه المجموعة من الخلايا عن طريق مسبق نقص الأكسجين، وبعد ذلك يوجه لهم لتصبح خلايا شوان ناضجة.
Abstract
تصف هذه المخطوطة وسيلة لإثراء الأسلاف العصبية من الخلايا اللحمية نخاعي (مسك) السكان وبعد ذلك لتوجيهها إلى مصير شوان الخلية ناضجة. لقد أخضعنا مسس الفئران والانسان لظروف نقص الأكسجين العابرة (1٪ من الأكسجين لمدة 16 ساعة)، يليه التوسع كالعصب العصبية على الطبقة المنخفضة المرفق مع عامل نمو البشرة (إغف) / عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (بفغف). تم تربيط الأعصاب على البلاستيك زراعة الأنسجة بولي-D- يسين / لامينين المغلفة والمثقفة في كوكتيل غليوجين يحتوي على β- هيريغولين، بفغف، وعامل النمو المشتقة من الصفيحات (بدغف) لتوليد شوان خلايا تشبه الخلايا (سكلس). تم توجيه سكلس إلى مصير الالتزام عبر كوكولتشر لمدة 2 أسابيع مع العصبية الجذر الظهرية المنقى (درغ) الخلايا العصبية الحصول عليها من E14-15 الحوامل سبراغ داولي الفئران. الخلايا الناضجة شوان تثبت استمرار في التعبير S100β / p75 ويمكن أن تشكل قطاعات المايلين. الخلايا التي تم إنشاؤها بهذه الطريقة لها إمكانات أببلتيونس في زرع الخلايا الذاتية بعد إصابة الحبل الشوكي، وكذلك في النمذجة المرض.
Introduction
زرع الأسلاف العصبية ومشتقاتها يدل على الوعد كاستراتيجية علاج التالية إصابة العصب الصدمة 1 ، 2 والتنكس العصبي 3 ، 4 . قبل التطبيق السريري، فمن الضروري ضمان: ط) وسيلة للوصول والتوسع على مصدر ذاتي من الخلايا الجذعية / السلف و 2) وسيلة لتوجيهها إلى ذات الصلة، وأنواع الخلايا الناضجة 3 . اهتمامنا في العلاج بالخلايا لإصابة الحبل الشوكي أدى بنا إلى السعي قوية، مصدر خلية ذاتي من الأسلاف العصبية من أنسجة الكبار.
وهناك مجموعة فرعية من اللجان الدائمة تنشأ من قمة العصبية ويمكن الوصول إليها بسهولة من تجويف نخاع. هذه الخلايا هي الأسلاف العصبية التي يمكن أن تولد الخلايا العصبية والدبقية 5 . نماذج حيوانية من نقص التروية الدماغية تثبت أن نقص الأكسجين يعزز برول إفيراتيون و مولتيبوتنسي من الأسلاف العصبية داخل الدماغ 6 . وكان هذا هو الأساس لاستخدام شرط مسبق الأكسجين كوسيلة للتوسع على الأسلاف العصبية المستمدة من نخاع.
زرع خلايا شوان في الحبل الشوكي المصاب يعزز التجديد 2 . يمكن إنشاء سكلس من اللجان الدائمة عن طريق المكملات مع العوامل الهليوجين ( أي، هيريغولين،، بفغف، و بدغف-آ) ولكنها تظهر عدم الاستقرار الظاهري. على سحب عوامل النمو، فإنها تعود إلى النمط الظاهري مثل الليفية 7 . عدم الاستقرار المظهري غير مرغوب فيه في زرع الخلايا بسبب خطر التمايز الشاذة والسرطنة. كما ترتبط السلائف الخلية شوان مع حزم محور عصبي داخل العصب الطرفية الجنينية 8 ، كنا قاد إلى سكلكتور كوكولتشر مع الخلايا العصبية درغ الجنينية المنقى 7 ،أس = "كريف"> 9. الناتجة ناضجة خلايا شوان هي مصير ملتزمة وتظهر وظيفة في المختبر 7 ، 9 وفي الجسم الحي 10 .
بروتوكول لدينا لتخصيب الأسلاف العصبية من اللجان الدائمة هو بسيط وفعال ويؤدي إلى زيادة في عدد الخلايا لفحوصات لاحقة. اشتقاق الخلايا شوان الملتزمة مصير عبر منصة كوكولتشر يسمح لدراسة التمايز الدبقية ولتوليد خلايا شوان مستقرة وظيفية للتطبيق السريري المحتمل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على الحيوانات وفقا صارم مع دليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية والتي وافقت عليها لجنة استخدام الحيوانات الحية للتعليم والبحث، لي كا شينغ كلية الطب، وجامعة هونغ كونغ. تم الحصول على عينات من نخاع العظم البشري من العرف الحرقفي للمتبرعين الصحيين بعد الحصول على الموافقة المستنيرة. تمت الموافقة على البروتوكولات من قبل مجلس المراجعة المؤسسية، جامعة هونغ كونغ.
1. إعداد الثقافات مسك الجرذ
- حصاد مسس من عظم الفخذ
- الأوتوكلاف جميع أدوات تشريح ( أي مقص تشريح غرامة، حادة يميل مقص القطع، وملقط مسننة) في 180 درجة مئوية لمدة 2 ساعة على الأقل قبل الاستخدام.
- إعداد وسط النمو مسك تتألف من الحد الأدنى الضروري المتوسطة - ألفا تعديل (αMEM) تستكمل مع 15٪ مصل بقري الجنين (فبس) والبنسلين / الستربتومايسين (P / S، 1٪ الخامس / الخامس).
- التضحية الشباب الذكور سبراغ داولي الفئران (200-250 غرام من وزن الجسم) من بينتوباربيتون جرعة زائدة (240 ملغ / كغ من وزن الجسم، داخل الصفاق).
ملاحظة: يجب معالجة عينات النخاع من الفئران المختلفة بشكل منفصل. - وضع الحيوانات التضحية في موقف ضعيف. تنظيف البطن والأطراف السفلية بدقة مع الايثانول 70٪.
- إزالة الجلد والأنسجة تحت الجلد على الفخذين وسطي باستخدام مقص تشريح غرامة والملقط. إزالة عضلات الفخذ كفافي حتى يتعرض عظم الفخذ. مواصلة هذا بشكل قريب وبعيدا حتى ينظر إلى الركبة والورك المفاصل. فصل عظم الفخذ من خلال مفصل مفصل الركبة والركبة باستخدام مقص قطع حادة يميل.
ملاحظة: لا تقاطع عظم الفخذ لفضح تجويف نخاع في هذه المرحلة. نقل فيمورس سليمة إلى تدفق الصفحي ثقافة الأنسجة غطاء محرك السيارة لمزيد من المعالجة. - استخدام مقص حادة يميل قطع لقطع النهايات البعيدة والدانية من عظم الفخذ من خلال الميتافيسيس.
- وضع مصفاة الخلية 70 ميكرون أكثر من أنبوب مخروطي 50 مل. إدراج حقنة 21 غرام، 10 مل تحتوي على المالحة الفوسفات مخزنة المالحة (بس، 10 ملي نا 2 هبو 4 ، ودرجة الحموضة 7.4) في القناة الفخذية يتعرض وتدفق محتوى النخاع في أنبوب مخروطي من قبل التنظيف المتكرر.
ملاحظة: يستخدم حوالي 20 مل من برنامج تلفزيوني لطرد كل عظم الفخذ. إذا كان لون المحتوى المسحوق يبقى ملطخة بالدم وعكر، يمكن استخدام حجم أكبر. - جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 480 x ج لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف. ريسوسبيند خلية بيليه في 10 مل من مسك النمو المتوسطة. لوحة الخلايا على طبق الثقافة الأنسجة 10 سم. وضع أطباق ثقافة الأنسجة في حاضنة الخلية (37 درجة مئوية، 5٪ كو 2 ). سجل اليوم الأولي من الطلاء كما اليوم 0.
ملاحظة: في جميع الخطوات التي تنطوي على الطرد المركزي، تعيين الفرامل لتباطؤ القصوى.
- إنشاء وتوسيع مستعمرات مسك
ملاحظة: هذا البروتوكول صالنحل على ثقافة الأنسجة الانضمام البلاستيك كوسيلة لتحديد ل مسس من داخل تجويف نخاع 11 . يسمح نخاع العظام المحتوى على الانضمام إلى البلاستيك زراعة الأنسجة لمدة 2 أيام.- في يوم 2، وشطف لوحات الثقافة ثلاث مرات مع 10 مل من برنامج تلفزيوني لإزالة الخلايا غير الملتصقة. استبدال برنامج تلفزيوني مع 10 مل من مسك النمو المتوسطة بعد الشطف. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني وتجديد مع المتوسطة النمو مسك كل 3 أيام.
ملاحظة: يجب أن تكون مستعمرات مسك مرئية حسب اليوم 6-7 ( الشكل 2A ). - مرور الخلايا قبل يوم 10 عن طريق إزالة المتوسطة النمو والشطف الخلايا مع برنامج تلفزيوني. إضافة 1.5 مل من المؤتلف الأنزيمية تفكك خلية كاشف واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. إضافة 3 مل من وسط النمو مسك لتحييد رد الفعل. جمع الخلايا منفصلة بواسطة الطرد المركزي في 250 x ج لمدة 5 دقائق.
- تحديد الخلايا داخل بيليه باستخدام عدادة الكريات بعد التخفيف المناسب في برنامج تلفزيوني.
- خلايا ممر البذور بكثافة 40،000 خلية / سم 2 في لوحة ثقافة 10 سم في وسط النمو مسك.
ملاحظة: مسس الجرذ ينبغي أن تصل إلى 80-90٪ التقاء في غضون 2 أيام من مرور ( الشكل 2B ). يمكن أن يتم تمرير الخلايا كما هو موضح في الخطوة 1.2.2 لمدة تصل إلى 8 الممرات. يمكن وصفها اللجان الدائمة عن طريق إمونوسيتوشيميستري وقدرتها على تريلينيج التمايز ( الشكل 3 ) 12 . فقط الثقافات مسك بين الممرات 3 و 8 تخضع ل المسبقة نقص الأكسجة اللاحقة والإثراء السلف العصبي. اللجان الدائمة من أكبر عدد مرور اعتماد مورفولوجيا بالارض ( الشكل 2C ) ولا تنتج أعداد كافية من الأسلاف العصبية. وينبغي التخلص من هذه الثقافات.
- في يوم 2، وشطف لوحات الثقافة ثلاث مرات مع 10 مل من برنامج تلفزيوني لإزالة الخلايا غير الملتصقة. استبدال برنامج تلفزيوني مع 10 مل من مسك النمو المتوسطة بعد الشطف. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني وتجديد مع المتوسطة النمو مسك كل 3 أيام.
2. إعداد الثقافات بمسك الإنسان
- تمييع 1 مل من نخاع العظم البشري نضح مع 9 مل من نمو النمو مسك و لوحةالخلايا على طبق الثقافة الأنسجة 10 سم. الحفاظ على الثقافات في حاضنة الخلية (37 درجة مئوية، 5٪ كو 2 ).
- إزالة المتوسطة بعد 2 أيام وشطف بلطف الثقافات ثلاث مرات مع 10 مل من برنامج تلفزيوني لإزالة الخلايا غير الملتصقة. بعد شطف النهائي، وإزالة بس واستبدالها مع 10 مل من النمو المتوسط مسك. تجديد وسط النمو بعد كل 3 أيام من الثقافة بعد شطف برنامج تلفزيوني.
ملاحظة: يجب أن تكون مستعمرات مسك مرئية حسب اليوم 6-7. قد يختلف عدد المستعمرات بين المواضيع. - مرور الخلايا في يوم 10، كما هو موضح في الخطوة 1.2.2. تحديد الخلايا داخل بيليه باستخدام عدادة الكريات بعد التخفيف المناسب في برنامج تلفزيوني. البذور الخلايا الممهدة في كثافة 40،000 خلية / سم 2 على لوحة ثقافة 10 سم في وسط النمو مسك.
ملاحظة: مسس الإنسان ( الشكل 2D ) تثبت مورفولوجيا مماثلة لسكك الفئران وبالمثل يجب أن تصل إلى 80-90٪ التقاء في غضون 2 أيام من المرور. يجب أن تكون شارامتريسة عن طريق إمونوسيتوشيميستري وقدرتها على تريلينيج التمايز 12 . كما هو الحال مع اللجان الدائمة الفئران، مسس الإنسان التي هي بين مرور 3 و 8 تخضع ل مسبقة نقص الأكسجين المسبق والإثراء السلف العصبي.
3. هايبوكسيك شرط مسبق
- تفكيك مكونات غرفة نقص الأكسجين ( أي قاعدة، غطاء، والصواني) بعد الإفراج عن المشبك حلقة ومسح الأجزاء الفردية نظيفة مع الايثانول 70٪. وضع مكونات الغرفة داخل تدفق الصفحي هود ثقافة الأنسجة للتعقيم تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة.
- قبل المسبق نقص الأكسجين، وإزالة المتوسطة وشطف الفئران والثقافات مسك الإنسان (الأقسام 1 و 2) مع 10 مل من برنامج تلفزيوني. استبدال برنامج تلفزيوني مع 10 مل من مركز النمو مسك تستكمل مع 25 ملي هيبيس.
ملاحظة: و مسس مثقف على 10 سم أطباق يجب أن يكون 80-90٪ كونفلنسي قبل أن تكون عرضة ل مسبقة الأكسجين. - وضع طريق مسدودتلحم الأطباق داخل غرفة نقص الأكسجة. إعادة تجميع مكونات الغرفة وتشديد المشبك الدائري. تدفق خليط الغاز من 99٪ N 2 /1٪ O 2 في غرفة بمعدل تدفق 10 لتر / دقيقة لمدة 5 دقائق.
- ختم نهايات ربط غرفة نقص الأكسجين لضمان عدم وجود تسرب الغاز. وضع الغرفة داخل حاضنة الخلية (37 درجة مئوية، 5٪ كو 2 ) لمدة 16 ساعة.
- عند الانتهاء من الشروط المسبقة نقص الأكسجين، وإزالة الثقافات من الغرفة في التحضير للالثقافة التخصيب السلف العصبية اللاحقة.
4. العصبية السلف الإثراء الثقافة
- تم تحضير الوسط العصبي السلفي الذي يتكون من خليط غذائي متوسط النسق / خليط لحم الخنزير (F12) (دمم / F12) الذي يستكمل مع B27 (2٪ v / v)، عامل نمو الخلايا الليفية الأساسي (بفغف، 20 نغ / مل)، عامل نمو البشرة (إغف، 20 نغ / مل)، و P / S (1٪ v / V).
- فصل الفئران مسبقة الأكسجة مسبقة / الإنسان مسس، كما هو موضح في الخطوة 1.2.2.جمع الخلايا منفصلة بواسطة الطرد المركزي في 250 x ج لمدة 5 دقائق. تحديد الخلايا داخل بيليه باستخدام عدادة الكريات بعد التخفيف المناسب في برنامج تلفزيوني.
- ريسوسبيند الخلايا في المتوسطة السلف العصبية والبذور على منخفضة المرفقات، لوحات 6 جيدا في كثافة 6000 خلية / سم 2 . وضع الثقافة في حاضنة الخلية (37 درجة مئوية، 5٪ كو 2 ) لمدة 12 يوما. ريبلينيش 75٪ من المتوسطة السلف العصبي كل 3 أيام.
ملاحظة: يجب أن نلاحظ مجموعات كبيرة غير ملتصقة الخلايا عن طريق اليوم 6-7. قبل يوم 10-12، نيوروسفيرز مع قطرها ≥ 100 ميكرون يمكن ملاحظتها ( الشكل 4 ). وينبغي أن تسفر مسس مسبقة الأكسجة مسبقة الأكسدة المزيد من نيوروسفيرز بالمقارنة مع اللجان الدائمة المستزرعة في ظل ظروف نورموكسيك 9 . - جمع نيوروسفيرز في يوم 12 من قبل الشفط لهم في ماصة 10 مل ونقلها إلى أنبوب مخروطي 15 مل. أجهزة الطرد المركزي في نيوروسفيرز في 250 x ج لمدة 5 دقائق.
ملاحظة: العصبية يمكن أن يكونتتميز في يوم 12 ل علامات السلف العصبية، مثل نستن و غفاب 7 .
5. جيل من خلايا شوان الملتزمة مصير عبر كوكولتشر مع الخلايا العصبية درغ
- إعداد الخلايا العصبية درغ الفئران النقي
- الأوتوكلاف جميع أدوات تشريح ( أي مقص تشريح، ملقط، اثنين ملقط تشريح مجهري، مقص ميكروديسكتينغ) في 180 درجة مئوية لمدة 2 ساعة على الأقل قبل الاستخدام.
- معطف 6-جيدا لوحات زراعة الأنسجة مع بولي- D- يسين (بدل، 10 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني) في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. إزالة بدل وشطف مع 1.5 مل من برنامج تلفزيوني لكل بئر.
- المضي قدما في طلاء لوحات مع لامينين (10 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني) في 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. شطف لوحات مع 1.5 مل من برنامج تلفزيوني لكل بئر.
- إعداد درغ صيانة الخلايا العصبية المتوسطة، وتتألف من المتوسطة العصبية تستكمل مع B27 (2٪ الخامس / الخامس)، L- الجلوتامين (1٪ الخامس / الخامس)، عامل نمو الأعصاب (نغف، 20 نانوغرام / مل)، و P / S (1 ٪ v / v).
- إعداد درغ المتوسطة تنقية الخلايا العصبية، وتتألف من المتوسطة العصبية تستكمل مع B27 (2٪ الخامس / الخامس)، L- الجلوتامين (1٪)، نغف (20 نانوغرام / مل)، P / S (1٪)، فلورودوكسيوريدين (فدو، 10 ميكروغرام / مل)، و أوريدين (10 ميكروغرام / مل).
- التضحية الفئران الحوامل في يوم الحمل 14-15 من بينتوباربيتال جرعة زائدة (240 ملغ / كغ من وزن الجسم، داخل الصفاق).
- وضع الحيوانات التضحية في موقف ضعيف. تنظيف البطن بشكل كامل مع الايثانول 70٪.
- قطع جدار البطن السفلي من الحيوان طوليا باستخدام مقص تشريح غرامة والملقط. تحديد وإزالة الرحم باستخدام مقص تشريح. قطع جدار الرحم لفضح واستخراج الأجنة. نقل الأجنة إلى العقيمة، 10 سم طبق الثقافة مليئة بس. وضع طبق الثقافة على الجليد.
- نقل الجنين المقصود لتشريح لطبق العقيمة 10 سم ثقافة مليئة بس (درجة حرارة الغرفة) ووضعه تحت مجهر تشريح. يكون الجنين في موقف عرضة.
ليسE: يمكن رؤية الحبل الشوكي الأبيض و درغس المرفقة على الجانب الظهري للجنين، من خلال الجلد شفافة. - إدراج ملقط ميكروديسكتينغ على جانبي الحبل الشوكي واستخدام تشريح حادة لبدء فصل الحبل الشوكي من الأنسجة اللينة المحيطة بها. قطع الحبل الشوكي مجانا من الحيوان باستخدام ملقط ميكروديسكتينغ على طول فتح الرقبة والذيل كعب. إجراء مزيد من تشريح حادة على الجانب البطني من الحبل لتحريره من الأنسجة اللينة المحيطة بها.
- استخدام ملقط ميكروديسكتينغ لإزالة الأنسجة اللينة المتبقية على الجانب الظهري من الحبل الشوكي المحرر.
ملاحظة: في هذه المرحلة، يجب أن تبقى فقط الحبل الشوكي، وجذور الأعصاب، و درغ المرفقة. - فصل درغس الفردية من جذور العصب ربطها باستخدام ملقط ميكروديسكتينغ. استخدام القلم ماصة تعلق على نصيحة 1 مل لنقل درغس إلى 1.5 مل، أنبوب الطرد المركزي العقيمة التي تحتوي على برنامج تلفزيوني.
ملاحظة: لكل أنبوب 1.5 مل، بحد أقصى100 درغس يمكن استيعابها. - أجهزة الطرد المركزي درغس في 250 x ج لمدة 5 دقائق و ريسوسبيند لهم في المؤتلف الأنزيمية تفكك خلية كاشف (200 ميكرولتر لكل أنبوب). احتضان (37 درجة مئوية، 5٪ كو 2 ) لمدة 10 دقيقة. أجهزة الطرد المركزي درغس في 250 x ج لمدة 5 دقائق، وإزالة طاف، و ريسوسبيند في درغ المتوسطة صيانة الخلايا العصبية. فصل بيليه بواسطة تريتوراتيون لطيف باستخدام 200 ميكرولتر ماصة طرف. تحديد الخلايا داخل بيليه باستخدام عدادة الكريات بعد التخفيف المناسب.
- البذور الخلايا في كثافة 5000 خلية / سم 2 في بدل / لامينين المغلفة لوحات 6 جيدا في 1.5 مل من درغ المتوسطة صيانة الخلايا العصبية لكل بئر. بعد يومين من الثقافة، وإزالة درغ المتوسطة صيانة الخلايا العصبية، وشطف مع برنامج تلفزيوني، واستبدال مع درغ المتوسطة تنقية الخلايا العصبية.
ملاحظة: لكل دورة تنقية، وعلاج الثقافات درغ مع تنقية المتوسطة لمدة 2 يوما، تليها 1 يوم من الحضانة في وسط الصيانة. بعد 3-4 دورات تنقية، و ريمالبيضاوي من جميع الدبقية الذاتية ومن المتوقع 7 . يجب أن يستغرق ذلك حوالي 14 يوما. تنقش الثقافات اختبار إيجابي للعلامة العصبية TUJ1 وغائبة عن التعبير S100 (( الشكل 5 ).
- جيل شوان خلايا تشبه الخلايا
- إعداد وسط الحث الدبقية تتألف من αMEM تستكمل مع β- هيريغولين (100 نانوغرام / مل)، بفغف (10 نانوغرام / مل)، عامل النمو المشتقة من الصفائح الدموية (بدغف-آ، 5 نانوغرام / مل)، فبس (10٪)، و P / S (1٪ v / v).
- لوحة العصبية أعدت في القسم 4 في بدل / لامينين المغلفة 6 لوحات جيدا بكثافة من 5-10 المجالات لكل سم 2 في 1.5 مل من وسط الحث الدبقية في البئر. استبدال المتوسطة الحث الدبقية كل 2 أيام بعد الشطف الخلايا مع برنامج تلفزيوني.
ملاحظة: خلايا من العصبية المصنفة ينظر إلى الهجرة إلى الخارج بحلول اليوم 2. بحلول يوم 7، الخلايا المهاجرة لها مظهر مدبب ويجب أن تظهر إمونوبوسيتيفيتي للخلية شوانعلامات p75 مستقبلات نيوروتروفين (p75) و S100β 7 . ويشار إلى هذه الخلايا باسم سكلس.
- كوكولتشر من سكليسس مع الخلايا العصبية درغ
- إعداد المتوسطة كوكولتور تتألف من درغ صيانة الخلايا العصبية المتوسطة (الخطوة 5.1.4) وسطح الحث الدبقية (الخطوة 5.2.1) في نسبة 1: 1 حجم إلى حجم.
- إعداد وسط صيانة خلية شوان تتألف من دمم / F12 تستكمل مع فبس (5٪)، β-هيريغولين (10 نانوغرام / مل)، و P / S (1٪ الخامس / الخامس).
- إزالة المتوسطة الثقافة من يوم 7 سكلس، شطف لهم مع برنامج تلفزيوني، واحتضان لهم مع 0.5 مل / جيدا من المؤتلف الأنزيمية تفكك خلية كاشف عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. إعادة تعليق سكلس في المتوسطة كوكولتشر.
- تحديد الخلايا باستخدام عدادة الكريات بعد التخفيف المناسب.
- البذور سكلكس على تنقيته درغ الخلايا العصبية في كثافة 1000 خلية / سم 2 . الحفاظ على كوكولتورس لمدة 14 يوما، مع استبدال المتوسطة كل يومين.
ملاحظة: خلال كوكولتشر، سكلكس المكتسبة التشكل المغزل تشبه التي هي نموذجية من خلايا شوان ناضجة ( الشكل 6 ). تستمر هذه الخلايا في النمط الظاهري بعد انسحاب عوامل النمو وقادرة على محاور عصبية ميلينات في المختبر وفي الجسم الحي 7 ، 10 . وينبغي رصد الإيجابية من علامات الخلايا شوان ( أي p75 و S100β) بواسطة المناعي. - عند الانتهاء من كوكولتشر، وخلايا شوان المرور مصير مرور، كما هو موضح في الخطوة 1.2.2. استخدام 0.5 مل من كاشف التفكك لكل بئر. تحديد الخلايا باستخدام عدادة الكريات بعد التخفيف المناسب.
- ريسوسبيند مصير ارتكبت الخلايا شوان في شوان صيانة الخلية المتوسطة بكثافة 10،000 الخلايا / سم 2 . خلايا البذور في بدل / لامينين المغلفة لوحات 6-جيدا لمناعي.
ملاحظة: كوكولتوريس تحتوي حتما اللجان الدائمة التي اعتمدت الخلايا الليفيةمصير الخلية 7 . يتم تمرير هذه الخلايا جنبا إلى جنب مع خلايا شوان الملتزمة مصير عند الانتهاء من كوكولتشر. خلايا شوان الكذب على رأس هذه الخلايا الليفية فرعية يمكن فصلها بسهولة وتوسيعها بعد الشطف مع "الطائرات الباردة" من برنامج تلفزيوني (4 درجات مئوية)، كما تم وصفها في أماكن أخرى 13 . ويمكن توسيع خلايا شوان الملتزمة مصير في وسط الصيانة لمدة 1 شهر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويوضح الشكل 1 لمحة عامة عن المراحل الرئيسية في بروتوكول لدينا. وباختصار، يتم اختيار مسس الفئران والإنسان لاللتزام البلاستيك زراعة الأنسجة. يتم تحديد مسبق موسك الموسعة مع نقص الأكسجين ثم تخضع لظروف تشكيل نيوروسفهير. يتم طلاء الأعصاب والسماح للتفريق في سكلس. سكولتريدس مع الخلايا العصبية درغ المنقى لتوليد خلايا شوان الملتزمة مصير.
ويوضح الشكل 2 مورفولوجيا الفئران مثقف و مسس الإنسان. ويظهر مورفولوجيا صحية مدبب على النقيض من ظهور رباعي المراكز من اللجان الدائمة التي تم الاحتفاظ بها لأرقام مرور عالية، والتي فقدت تعددها. وينبغي أن تظهر المستعمرات الفئران والبشرية الموسعة التعبير عن علامات مسك، وغياب علامات الخلايا الجذعية المكونة للدم، والقدرة على تريلينيج ديففرنتياتيون ( الشكل 3 ). مراكز صحية متوسطة من بين الممرات 3 و 8 تخضع لشرط مسبق الأكسجين لمدة 16 ساعة ويتم تمريرها بعد ذلك على لوحات ثقافة الالتزام المنخفض مع إغف / بفغف مكملات. نتائج مسبقة نقص الأكسجين المسبق في أعداد أكبر من نيوروسفيرز، فضلا عن أحجام أكبر نيوروسفير متوسط ( الشكل 4 ).
يتم طلاء الأعصاب على لوحات ثقافة بدل / لامينين المغلفة والتي يسببها لتصبح سكلس عن طريق الثقافة في وسط الحث الدبقية التي تحتوي على β- هيريغولين، بفغف، و بدغف-آ. سكلس المعرض التشكل مدبب مميزة من خلايا شوان والتعبير علامة المقابلة، ومع ذلك فهي ظاهريا غير مستقرة والعودة إلى النمط الظاهري الليفية على وقف عوامل النمو
كوكولتشر مع الخلايا العصبية الحسية هو شرط أساسي لتحقيق خلية جوهرية سوحكة مصير الالتزام. ويتحقق إنشاء شبكات درغ المنقى عن طريق العلاج نابض مع فدو و أوريدين لإزالة الدبقية الذاتية ويجب تأكيده من قبل عدم وجود إمونوبوسيتيفيتي S100 (( الشكل 5 ). في يوم 7، يتم تمرير سكلس و كوكولتوريد مع الخلايا العصبية درغ المنقى لمدة 14 يوما ( الشكل 6 ). عند الانتهاء من كوكولتشر، ناضجة، يجب أن تظهر الخلايا شوان الملتزمة مصير.
الشكل 1: نظرة عامة على البروتوكول. يتم الحصول على نخاع العظام من فامورس الفئران أو أسبريتس الحرقفي الإنسان. مسس من داخل نخاع العظام يمكن إرفاق وتوسيع على الأنسجة زراعة البلاستيك. من أجل إثراء ل مسس مع الإمكانات العصبية، والخلايا هي شرط مسبق في 1٪ O 2 لمدة 16 ساعة ثم يتم تمريرها على الثقافة المنخفضة الالتزام بلمع مكملات بفغف / إغف. هذا يؤدي إلى تشكيل نيوروسفيرز، والتي هي مطلي على بدل / لامينين المغلفة الأنسجة زراعة البلاستيك ومثقف في وسط الحث الدبقية لتوليد سكلس. يتم تمرير سكلس و كوكولتوريد مع الخلايا العصبية درغ المنقى لمدة 2 أسابيع من أجل توجيهها إلى مرحلة النضج. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: إنشاء مستعمرات مسك. يجب أن تكون مستعمرات مسك كبيرة مرئية 6-7 أيام بعد الطلاء من خلايا نخاع العظام على البلاستيك زراعة الأنسجة. وتظهر صورة ممثلة لمستعمرة مسك الفئران ( A )، في حين أن المستعمرات البشرية تظهر مظهر مماثل. المستعمرات يمكن أن يمر في يوم 10. ينظر في التكبير العالي، كل من الفئران (B ) والإنسانية ( D ) مسس تظهر مورفولوجيا تشبه الليفية مميزة بعد مرور. اللجان الدائمة التي يتم الاحتفاظ بها لأرقام مرور عالية تكتسب مورفولوجيا المسطح، رباعي الأضلاع ( C ) ويجب التخلص منها. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: توصيف اللجان الدائمة. ( A - D ) صور ممثل من اللجان الدائمة الإنسان. يمكن وصفها اللجان الدائمة عن طريق التعبير عن العلامات المناسبة، مثل CD90 ( A )، CD73 ( B )، و سترو-1 ( C )، وغياب علامات الخلايا الجذعية المكونة للدم، مثل CD45 ( D ). ( E - G ) الجرذ Mسس معزولة وموسعة كما هو موضح في البروتوكول تبين تعدد القدرات في قدرتها على تشكيل الخلايا الشحمية ( E ؛ رواسب الدهون الملون السودان الأحمر)، أوستيوبلاستس ( F ؛ مصفوفة محيطية ملطخة بالأليزارين الأحمر)، غضروفية ( G ؛ بروتيوغليكان ملطخة سافرانين - O) في ظل ظروف الثقافة المناسبة. مقياس الحانات = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: إثراء الأسلاف العصبية من اللجان الدائمة. كلا الفئران ( A ) والإنسانية ( C ) اللجان الدائمة شكل العصبية عندما المستزرعة على انخفاض الالتزام الأنسجة زراعة البلاستيك في المتوسطة تستكمل مع إغف / بفغف. الأرقام ومتوسط قطر الفئران (
الشكل 5: إنشاء شبكات درغ الفئران المنقى. يتم إنشاء شبكات درغ تنقيته بعد العلاج نابض مع وكلاء مضاد للالتهابات فدو و أوريدين (A). شبكات نيوريت التي هي خالية من S100β معبرة عن الدبقية الذاتية (B) على استعداد ل كوكولتشر مع سكلكس. مقياس الحانات = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ether.within الصفحات = "1"> 
الشكل (6): توليد خلايا شوان المستمدة من نخاع العظم عن طريق الاستزراع مع الخلايا العصبية درغ. عند اكتمال 2 أسابيع من كوكولتشر مع الخلايا العصبية درغ المنقى و سكلسس الإنسان، على شكل المغزل، وخلايا شوان الملتزمة مصير تنبع من كل من النيماتوكسيا - ونقص الأكسجة المعاملة مجموعات ( A و D ). تعبر هذه الخلايا عن علامات الخلية شوان p75 (B و E) و S100β (C و F). التعبير عن مستضد النوى البشرية (هونيو) يدل على أن الخلايا إيجابية S100 were لم تلوث الخلايا الدبقية الناشئة من درغس الفئران. مقياس الحانات = 100 ميكرون.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
فمن الضروري للحفاظ على "الجذعية" من اللجان الدائمة قبل إثراء الأسلاف العصبية عن طريق مسبق الأكسجين الثقافة و نيوروسفهير. من تجربتنا، مسس مولتيبوتنت يمكن تحديدها بشكل موثوق بها من قبل ممدود تشبه الخلايا الليفية مورفولوجيا. في المقابل، مسس التي اعتمدت مورفولوجيا أكثر بالارض، رباعي الأضلاع، مع الألياف الإجهاد الهيكل الخلوي بارزة، لا تعتمد بسهولة مصير الخلايا العصبية ويجب التخلص منها. بشكل عام، ونحن لا تستخدم اللجان الدائمة مع أرقام مرور أكبر من ثمانية. للحفاظ على الجذعية، فمن الأهمية بمكان لتمرير بسرعة اللجان الدائمة قبل أن تصل إلى 100٪ التقاء. على العكس من ذلك، الحفاظ على اللجان الدائمة في التقاء منخفض جدا غير مرغوب فيه. من تجربتنا، البذر اللجان الدائمة بكثافة 40،000 خلية / سم 2 ، أو ببساطة مرور الخلايا التي هي 80٪ متموجة في نسبة 1: 2، يسمح لأفضل النتائج.
إن إنشاء وصيانة شبكة درغ هو ناقدالمحددات للنجاح كوكولتشر. وينبغي إبقاء الوقت المطلوب لمحصول درغ إلى أدنى حد ممكن. وينبغي التعامل مع العقد الفردية بطريقة أروماتيك، وخاصة أثناء انفصال من الحبل الشوكي، عندما يكون من الأفضل للتعامل مع جذور الأعصاب فقط. بشكل عام، ونحن نهدف لفترة أقل من 2 ساعة بين وقت التضحية الحيوانية والهضم الأنزيمي من درغس حصاد، كما يؤدي الحصاد لفترات طويلة في تطهير الأنسجة وفقدان بقاء الخلية. وكثيرا ما تواجه مفرزة الخلايا العصبية درغ من الطبقة التحتية أثناء الثقافة. ولمنع حدوث ذلك، يجب أن يتم تحضير الطلاء بشكل طازج ويتم تنفيذه بالقرب من وقت حصاد الأنسجة. بشكل عام، مجموعات درغ الكبيرة، غير المهضومة فصل أكثر في كثير من الأحيان ولا تسفر عن نجاح كوكولتشر. يمكن تعديل مدة الهضم الأنزيمي وكمية التسريب، بهدف تحقيق شبكة ذات مظهر يشبه الشكل 5 .
بينما لدينا كوكومنصة لتور يدفع باستمرار التزام مصير، فقط 20-30٪ من الثقافات يؤدي في موازية العائد مصير الملتزمة شوان خلايا 7 ، 13 . ولذلك نقوم بإعداد ما يكفي من درغس و سكلسز للقيام في وقت واحد كوكولتوريس في 3-4 لوحات الثقافة 6-جيدا. نحن نفترض أن مجموعة من العوامل المتعلقة بالشبكة درغ الكامنة، بما في ذلك سنهم الجنينية، وقابلية الخلية، والكثافة، والطوبوغرافيا، تؤثر على نجاح الاستزراع المائي. وتحتاج هذه المتغيرات الأساسية إلى مزيد من التحقيق والتوحيد. وبصرف النظر عن القيود في محصول كوكولتشر، ينبغي السعي للحصول على وسيلة لإلغاء متطلبات الخلايا العصبية درغ المستمدة من الفئران والمنتجات الحيوانية. وعلاوة على ذلك، ينبغي اختصار مدة البروتوكول. كما تعديل مختصر من بروتوكول لدينا، كان لدينا نجاح في اشتقاق خلايا شوان ناضجة من يوم 10 نيوروسفيرز المصنف مباشرة على الخلايا العصبية درغ المنقى، دون الجيل السابق من سكلسس ، 10 .
العصبية المخصب عبر طريقتنا بمثابة مصدر قوي للخلايا العصبية و الدبقية الأنساب. لدينا منصة لتوجيه الخلايا السلائف إلى مصير الالتزام لديه ميزة تجنب التلاعب الجيني، مع المخاطر الكامنة، والخلايا الناتجة هي ذات الصلة لزرع الخلايا، والنمذجة المرض، ودراسة التمايز الدبقية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى جميع مؤلفي هذه المخطوطة أية إفادات يعلن عنها.
Acknowledgments
ويود المؤلفون أن يعترفوا بالدكتور ناي - سوم وونغ لتوفير جهاز غرفة نقص الأكسجين والسيدة أليس لوي للدعم التقني.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| αMEM | Sigmaaldrich | M4526 | |
| DMEM/F12 | Thermofisher scientific | 12400-024 | |
| Neurobasal medium | Thermofisher scientific | 21103-049 | |
| FBS | Biosera | FB-1280/500 | |
| B27 | Thermofisher scientific | 17504-001 | |
| Epidermal growth factor (EGF) | Thermofisher scientific | PHG0313 | |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | 100-18B/100UG | |
| Nerve growth factor (NGF) | Millipore | NC011 | |
| Platelet-derived growth factor-AA (PDGF-AA) | Peprotech | 100-13A | |
| Heregulin beta-3, EGF domain (β-Her) | Millipore | 01-201 | |
| Uridine | Sigmaaldrich | U3003 | |
| 5-Fluro-2' - deoxyuridine (FDU) | Sigmaaldrich | F0503 | |
| Poly-D-lysine (PDL) | Sigmaaldrich | P7886-1G | |
| Laminin | Thermofisher scientific | 23017015 | |
| GlutaMAX | Thermofisher scientific | 35050061 | |
| Penicillin / streptomycin (P/S) | Thermofisher Scientific | 15140-122 | |
| TrypLE Express | Thermofisher Scientific | 12604-013 | |
| 10 cm plate for adherent culture | TPP | 93100 | Used for selection of MSCs by tissue culture adherence |
| 6-well plate for adherent culture | TPP | 92006 | Used for expansion of MSCs following passaging |
| UltraLow 6-well plate for non-adherent culture | Corning | 3471 | Used for neural progenitor enrichment |
| anti-human CD90(Thy-1) | BD Biosciences | 555593 | |
| anti-human CD73 | BD Biosciences | 550256 | |
| anti-human/rat STRO-1 | R&D Systems | MAB1038 | |
| anti-human nestin | R&D Systems | MAB1259 | |
| anti-human CD45 | BD Biosciences | 555480 | |
| anti-rat CD90(Thy-1) | BD Biosciences | 554895 | |
| anti-rat CD73 | BD Biosciences | 551123 | |
| anti-rat nestin | BD Biosciences | MAB1259 | |
| anti-rat CD45 | BD Biosciences | 554875 | |
| Anti-S100β | Dako | Z031101 | |
| Anti-p75 | Millipore | MAB5386 | |
| Anti-GFAP | Sigmaaldrich | G3893 | |
| Anti-Class III-beta tubulin (Tuj-1) | Covance | MMS-435P | |
| Anti-Human nuclei | Millipore | MAB1281 | |
| Hypoxia chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 | |
| HEPES buffer | Sigmaaldrich | H4034-100G |
References
- Wiliams, R. R., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation: a repair strategy for spinal cord injury? Prog Brain Res. 201, 295-312 (2012).
- Kanno, H., Pearse, D. D., Ozawa, H., Itoi, E., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation for spinal cord injury repair: its significant therapeutic potential and prospectus. Rev Neurosci. 26 (2), 121-128 (2015).
- Lindvall, O., Kokaia, Z. Stem cells in human neurodegenerative disorders--time for clinical translation? J Clin Invest. 120 (1), 29-40 (2010).
- Terzic, D., et al. Directed Differentiation of Oligodendrocyte Progenitor Cells From Mouse Induced Pluripotent Stem Cells. Cell Transplant. 25 (2), 411-424 (2016).
- Takashima, Y., et al. Neuroepithelial cells supply an initial transient wave of MSC differentiation. Cell. 129 (7), 1377-1388 (2007).
- Felling, R. J., et al. Neural stem/progenitor cells participate in the regenerative response to perinatal hypoxia/ischemia. J Neurosci. 26 (16), 4359-4369 (2006).
- Shea, G. K., Tsui, A. Y., Chan, Y. S., Shum, D. K. Bone marrow-derived Schwann cells achieve fate commitment--a prerequisite for remyelination therapy. Exp Neurol. 224 (2), 448-458 (2010).
- Jessen, K. R., Mirsky, R. The origin and development of glial cells in peripheral nerves. Nat Rev Neurosci. 6 (9), 671-682 (2005).
- Mung, K. L., et al. Rapid and efficient generation of neural progenitors from adult bone marrow stromal cells by hypoxic preconditioning. Stem Cell Res Ther. 7 (1), 146 (2016).
- Ao, Q., et al. The regeneration of transected sciatic nerves of adult rats using chitosan nerve conduits seeded with bone marrow stromal cell-derived Schwann cells. Biomaterials. 32 (3), 787-796 (2011).
- Tondreau, T., et al. Isolation of BM mesenchymal stem cells by plastic adhesion or negative selection: phenotype, proliferation kinetics and differentiation potential. Cytotherapy. 6 (4), 372-379 (2004).
- Baksh, D., Song, L., Tuan, R. S. Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. J Cell Mol Med. 8 (3), 301-316 (2004).
- Jirsova, K., Sodaar, P., Mandys, V., Bar, P. R. Cold jet: a method to obtain pure Schwann cell cultures without the need for cytotoxic, apoptosis-inducing drug treatment. J. Neurosci. Methods. 78 (1-2), 133-137 (1997).
