Summary
Existen células del estroma de la médula (MSC) con potencial neural dentro de la médula ósea. Nuestro protocolo enriquece esta población de células a través de un preacondicionamiento hipóxico y luego las dirige a convertirse en células maduras de Schwann.
Abstract
Este manuscrito describe un medio para enriquecer a progenitores neurales de la población de células estromales de médula (MSC) y posteriormente dirigirlos al destino maduro de células de Schwann. Se sometieron las MSC de rata y humana a condiciones hipoxicas transitorias (1% de oxıgeno durante 16 h), seguido de expansión como neurosferas sobre su- plemento de unión baja con factor de crecimiento epidérmico (EGF) / suplemento de factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF). Las neurosferas se sembraron en un plástico de cultivo de tejidos recubierto con poli-D-lisina / laminina y se cultivaron en un cóctel gliogénico que contenía β-Heregulina, bFGF y factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) para generar células similares a células de Schwann (SCLC). Los SCLC se dirigieron al compromiso de destino a través del cocultivo durante 2 semanas con neuronas purificadas de ganglios de la raíz dorsal (DRG) obtenidas de ratas Sprague Dawley gestantes E14-15. Las células maduras de Schwann demuestran persistencia en la expresión de S100β / p75 y pueden formar segmentos de mielina. Las células generadas de esta manera tienen potencialEn el trasplante de células autólogas después de la lesión de la médula espinal, así como en el modelado de la enfermedad.
Introduction
El trasplante de progenitores neurales y sus derivados demuestra la promesa como una estrategia de tratamiento después de la lesión nerviosa traumática 1 , 2 y la neurodegeneración [ 3 , 4] . Antes de la aplicación clínica, es esencial asegurar: i) un método para acceder y expandir sobre una fuente autóloga de células madre / progenitoras y ii) un medio para dirigirlos a tipos de células maduras relevantes 3 . Nuestro interés en la terapia celular para la lesión de la médula espinal nos llevó a buscar una robusta, autóloga célula fuente de progenitores neurales de tejidos adultos.
Una subpoblación de MSC se origina en la cresta neural y es fácilmente accesible desde la cavidad de la médula. Estas células son progenitores neurales que pueden generar neuronas y glia [ 5] . Modelos animales de isquemia cerebral demuestran que la hipoxia promueve el prol Iferation y multipotencia de progenitores neurales dentro del cerebro 6 . Ésta fue la base para utilizar el preacondicionamiento hipóxico como un medio de expansión sobre los progenitores neurales derivados de la médula.
El trasplante de células de Schwann en la médula espinal lesionada promueve la regeneración 2 . Los SCLC pueden generarse a partir de MSC mediante la suplementación con factores gliogénicos ( es decir, β-Heregulin, bFGF y PDGF-AA), pero muestran inestabilidad fenotípica. Tras la retirada de factores de crecimiento, que volver a un fenotipo fibroblasto- 7 . La inestabilidad fenotípica es indeseable en el trasplante de células debido al riesgo de diferenciación aberrante y carcinogénesis. Como los precursores de células de Schwann se asocian con haces axónicos dentro del nervio periférico embrionario 8 , se nos llevó a SCLC cocultivo con neuronas DRG embrionarias purificadas 7 ,Asno = "xref"> 9. Las células de Schwann maduras resultantes están comprometidas con el destino y demuestran su función in vitro 7 , 9 e in vivo 10 .
Nuestro protocolo para el enriquecimiento de progenitores neurales de MSCs es simple y eficiente y resulta en un aumento en el número de células para los ensayos posteriores. La derivación de células de Schwann comprometidas con el destino a través de la plataforma de cocultivo permite el estudio de la diferenciación glial y la generación de células estables y funcionales de Schwann para su posible aplicación clínica.
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Protocol
Todos los procedimientos relacionados con animales se realizaron en estricta conformidad con la Guía del NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y aprobado por el Comité sobre el Uso de Animales Vivos para la Enseñanza y la Investigación, Li Ka Shing Facultad de Medicina de la Universidad de Hong Kong. Se obtuvieron muestras de médula ósea humana de la cresta ilíaca de donantes sanos después de obtener el consentimiento informado. Los protocolos fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional, la Universidad de Hong Kong.
1. Preparación de cultivos MSC de rata
- Cosecha de MSCs del fémur
- Autoclave todas las herramientas de disección ( es decir, tijeras de disección finas , tijeras de corte con punta romana y fórceps dentados) a 180 ° C durante al menos 2 horas antes de su uso.
- Preparar un medio de crecimiento MSC que incluya una modificación mínima del medio esencial alfa (αMEM) suplementado con suero bovino fetal al 15% (FBS) y penicilina / estreptomicina (P / S, 1% v / v).
- Sacrificar ratas Sprague Dawley machos jóvenes (200-250 g de peso corporal) por sobredosis de pentobarbitona (240 mg / kg de peso corporal, intraperitoneal).
NOTA: Las muestras de médula de diferentes ratas deben ser procesadas por separado. - Colocar los animales sacrificados en posición supina. Limpie el abdomen y los miembros inferiores a fondo con etanol al 70%.
- Remueva la piel y el tejido subcutáneo sobre los muslos medianos utilizando una fina tijera de disección y una pinza. Retire los músculos del muslo circunferencialmente hasta que el fémur esté expuesto. Continúe proximalmente y distalmente hasta que se vean las articulaciones de la rodilla y la cadera. Disarticular el fémur a través de la cadera y la articulación de la rodilla con las tijeras de corte con punta romana.
NOTA: No transecten el fémur para exponer la cavidad medular en esta etapa. Transferir los fémures intactos a una campana de cultivo de tejido de flujo laminar para su posterior procesamiento. - Use tijeras de corte con punta romana para transeccionar los extremos distal y proximal del fémur a través de la metáfisis.
- Coloque un colador de células de 70 μm sobre un tubo cónico de 50 ml. Insertar una jeringa de 21 G, de 10 ml que contenga solución salina tamponada con fosfato (PBS, Na2HPO4 10 mM, pH 7,4) en el canal femoral expuesto y enjuagar el contenido de médula en el tubo cónico por lavado repetido.
NOTA: Se usa aproximadamente 20 mL de PBS para lavar cada fémur. Si el color del contenido enjuagado permanece manchado de sangre y turbio, se puede usar un volumen mayor. - Recoger las células por centrifugación a 480 xg durante 5 min. Deseche el sobrenadante. Resuspender el sedimento celular en 10 ml de medio de crecimiento MSC. Colocar las células en un plato de cultivo de tejidos de 10 cm. Colocar las cápsulas de cultivo de tejidos en un incubador celular (37ºC, 5% CO 2 ). Anote el día inicial del chapado como el día 0.
NOTA: En todos los pasos de centrifugación, ajuste el freno para una desaceleración máxima.
- Establecimiento y expansión de las colonias MSC
NOTA: Este protocolo rElies en la adhesión de plástico de cultivo de tejidos como un medio para seleccionar MSCs de dentro de la cavidad de la médula 11 . El contenido de médula ósea se deja adherir al plástico de cultivo de tejidos durante 2 días.- El dıa 2, enjuagar las placas de cultivo tres veces con 10 ml de PBS para eliminar las células no adherentes. Sustituir el PBS con 10 ml de medio de crecimiento MSC después del enjuague. Lavar las células con PBS y reponer con MSC medio de crecimiento cada 3 días.
NOTA: Las colonias MSC deben ser visibles por el día 6-7 ( Figura 2A ). - Pasar las células al día 10 eliminando el medio de crecimiento y enjuagando las células con PBS. Añadir 1,5 ml de reactivo de disociación celular enzimático recombinante e incubar a 37 ° C durante 5 min. Añadir 3 ml de medio de crecimiento MSC para neutralizar la reacción. Recoger las células separadas por centrifugación a 250 xg durante 5 min.
- Cuantificar las células dentro del pellet utilizando un hemocitómetro después de una dilución adecuada en PBS.
- La semilla pasó células a una densidad de 40.000 células / cm2 en una placa de cultivo de 10 cm en medio de crecimiento MSC.
NOTA: Las MSC de la rata deben alcanzar una confluencia del 80-90% dentro de los 2 días de la pasada ( Figura 2B ). Las células se pueden pasar como se describe en el paso 1.2.2 para hasta 8 pasajes. MSC se puede caracterizar por medio de la inmunocitoquímica y su capacidad de trilineaje diferenciación ( Figura 3 ] [ 12] . Sólo los cultivos MSC entre los pasos 3 y 8 están sujetos a un posterior preacondicionamiento hipóxico y enriquecimiento progenitor neural. MSC de mayor número de paso adoptan una morfología aplanada ( Figura 2C ) y no producen un número suficiente de progenitores neurales. Estos cultivos deben ser descartados.
- El dıa 2, enjuagar las placas de cultivo tres veces con 10 ml de PBS para eliminar las células no adherentes. Sustituir el PBS con 10 ml de medio de crecimiento MSC después del enjuague. Lavar las células con PBS y reponer con MSC medio de crecimiento cada 3 días.
2. Preparación de cultivos BMSC humanos
- Diluir 1 ml de aspiración de médula ósea humana con 9 ml de medio de crecimiento MSC yEn un plato de cultivo de tejidos de 10 cm. Mantener los cultivos en una incubadora celular (37 ° C, 5% CO 2 ).
- Eliminar el medio después de 2 días y enjuagar suavemente los cultivos tres veces con 10 ml de PBS para eliminar las células no adherentes. Después del enjuague final, eliminar el PBS y reemplazarlo con 10 ml de MSC medio de crecimiento. Reponga el medio de crecimiento después de cada 3 días de cultivo después del enjuague con PBS.
NOTA: Las colonias MSC deben estar visibles por el día 6-7. El número de colonias puede variar entre sujetos. - Pasar las células al día 10, como se describe en el paso 1.2.2. Cuantificar las células dentro del pellet utilizando un hemocitómetro después de una dilución adecuada en PBS. Seed las células pasadas a una densidad de 40.000 células / cm2 sobre una placa de cultivo de 10 cm en medio de crecimiento MSC.
NOTA: Las MSC humanas ( Figura 2D ) demuestran una morfología similar a las MSCs de rata y asimismo deben alcanzar una confluencia del 80-90% dentro de los 2 días de la pasada. Deben ser charaCterized por medio de inmunocitoquímica y su capacidad para diferenciación trilineaje [ 12] . Al igual que con las MSC de rata, las MSC humanas que están entre el paso 3 y el 8 están sujetas a un posterior precondicionamiento hipóxico y enriquecimiento progenitor neural.
3. Precondicionamiento hipóxico
- Desmonte los componentes de la cámara de hipoxia ( es decir, base, tapa, bandejas) después de soltar la abrazadera de anillo y limpie las partes individuales con etanol al 70%. Coloque los componentes de la cámara dentro de una campana de cultivo de tejido de flujo laminar para esterilización bajo luz UV durante 15 min.
- Antes del preacondicionamiento hipóxico, eliminar el medio y enjuagar los cultivos MSC de rata y humanos (secciones 1 y 2) con 10 ml de PBS. Sustituir el PBS por 10 ml de medio de crecimiento MSC suplementado con HEPES 25 mM.
NOTA: Los MSCs cultivados con platos de 10 cm deben haber alcanzado una confluencia de 80-90% antes de ser sometidos a un preacondicionamiento hipóxico. - Coloque el culEn la cámara de hipoxia. Vuelva a montar los componentes de la cámara y apriete la abrazadera del anillo. Enjuagar una mezcla gaseosa de 99% de N2 / 1% de O2 en la cámara a una velocidad de flujo de 10 l / min durante 5 min.
- Sellar los extremos de conexión de la cámara de hipoxia para asegurarse de que no hay fugas de gas. Colocar la cámara dentro de la incubadora de células (37 ° C, 5% CO 2 ) durante 16 h.
- Una vez completado el preacondicionamiento hipóxico, se eliminan los cultivos de la cámara en preparación para el posterior cultivo de enriquecimiento progenitor neural.
4. Cultura de Enriquecimiento de Progenitor Neural
- Preparar el medio progenitor neural compuesto por medio de águila modificada de Dulbecco / mezcla de nutrientes de Ham F12 (DMEM / F12) suplementado con B27 (2% v / v), factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF, 20 ng / ml), factor de crecimiento epidérmico (EGF, 20 ng / ml) y P / S (1% v / v).
- Se separan las MSC ratas / humanos precondicionadas hipóxicas, como se describe en el paso 1.2.2.Recoger las células separadas por centrifugación a 250 xg durante 5 min. Cuantificar las células dentro de la pastilla utilizando un hemocitómetro después de la dilución adecuada en PBS.
- Resuspender las células en el medio progenitor neural y la semilla en baja fijación, de 6 pocillos placas a una densidad de 6.000 células / cm 2 . Colocar el cultivo en un incubador de células (37 ° C, 5% de CO 2 ) durante 12 días. Reponga el 75% del medio progenitor neural cada 3 días.
NOTA: Se deben observar clusters de células no adherentes de tamaño considerable entre el día 6-7. Al día 10-12 se pueden observar neuroesferas con un diámetro ≥ 100 μm ( Figura 4 ). Los MSCs preacondicionados hipóxicos deberían producir más neuroesferas en comparación con las MSC cultivadas bajo condiciones normoxic 9 . - Recoja las neuroesferas el día 12 aspirándolas en una pipeta de 10 ml y transfiriéndolas a un tubo cónico de 15 ml. Centrifugar las neurosferas a 250 xg durante 5 min.
NOTA: Las neuroesferas pueden serCaracterizado el día 12 por los marcadores progenitor neurales, tales como nestina y GFAP 7 .
5. Generación de Células de Schwann comprometidas con el Destino a través del Cocultivo con Neuronas DRG
- Preparación de neuronas purificadas DRG de rata
- Autoclave todas las herramientas de disección ( es decir, tijeras de disección, fórceps, dos pinzas de microdissección y tijeras de microdisección) a 180 ° C durante al menos 2 horas antes de su uso.
- Se cubren placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos con poli-D-lisina (PDL, 10 μg / ml en PBS) a 4ºC durante una noche. Retire la PDL y enjuague con 1,5 mL de PBS por pocillo.
- Proceder con revestimiento de las placas con laminina (10 μg / ml en PBS) a 37 ° C durante 2 h. Enjuague las placas con 1,5 mL de PBS por pocillo.
- Preparar el medio de mantenimiento de neuronas DRG, compuesto por medio neurobasal suplementado con B27 (2% v / v), L-glutamina (1% v / v), factor de crecimiento nervioso (NGF, 20 ng / mL) y P / S % V / v).
- Preparar el medio de purificación de neuronas DRG, compuesto por medio neurobasal suplementado con B27 (2% v / v), L-glutamina (1%), NGF (20 ng / ml), P / S (1%), fluorodesoxiuridina (FDU, 10 Μg / ml) y uridina (10 μg / ml).
- Sacrificar a las ratas embarazadas al día 14-15 de gestational por sobredosis de pentobarbital (240 mg / kg de peso corporal, intraperitoneal).
- Colocar los animales sacrificados en posición supina. Limpie su abdomen completamente con etanol al 70%.
- Corte la pared abdominal inferior del animal longitudinalmente usando las tijeras y la pinza de disección finas. Identifique y retire el útero usando tijeras de disección. Corte la pared uterina para exponer y extraer los embriones. Transferir los embriones a un plato de cultivo estéril de 10 cm lleno de PBS. Coloque el plato de la cultura en el hielo.
- Transferir el embrión destinado a la disección a un plato estéril de cultivo de 10 cm lleno de PBS (temperatura ambiente) y colocarlo debajo de un microscopio de disección. Tener el embrión en posición prona.
NOE: La médula espinal blanquecina y los DRG adjuntos se pueden ver sobre el aspecto dorsal del embrión, a través de su piel translúcida. - Inserte la pinza de microdissección a lo largo de ambos lados de la médula espinal y utilice la disección romo para comenzar a separar la médula espinal de los tejidos blandos circundantes. Corte la médula espinal libre del animal usando una pinza de microdisección a lo largo de la abertura del cuello y el talón de la cola. Realizar una disección aún más brusca sobre el aspecto ventral del cordón para liberarlo del tejido blando circundante.
- Utilice pinzas de microdissección para eliminar el tejido blando residual sobre el aspecto dorsal de la médula espinal liberada.
NOTA: En esta etapa, solo la médula espinal, las raíces nerviosas y el DRG adjunto deben permanecer. - Separar los DRG individuales de sus raíces nerviosas conectadas usando pinzas microdissecantes. Utilice una pluma de pipeta unida a una punta de 1 ml para transferir los DRG a un tubo de centrífuga estéril de 1,5 ml que contiene PBS.
NOTA: Para cada tubo de 1,5 ml, un máximo de100 DRGs se pueden acomodar. - Centrifugar los DRGs a 250 xg durante 5 min y resuspendirlos en reactivo de disociación celular enzimático recombinante (200 mu l por tubo). Incubar (37ºC, 5% CO 2 ) durante 10 min. Centrifugar los DRGs a 250 xg durante 5 min, eliminar el sobrenadante y resuspender en el medio de mantenimiento de neuronas DRG. Disociar el gránulo por trituración suave usando una punta de pipeta de 200 mu l. Cuantificar las células dentro de la pelotilla utilizando un hemocitómetro después de una dilución adecuada.
- Sembrar las células a una densidad de 5.000 células / cm 2 en placas de 6 pocillos revestidas con PDL / laminina en 1,5 ml de medio de mantenimiento de neuronas DRG por pocillo. Después de dos días de cultivo, retira el medio de mantenimiento de neuronas DRG, enjuaga con PBS y reemplaza con el medio de purificación de neuronas DRG.
NOTA: Para cada ciclo de purificación, tratar los cultivos DRG con medio de purificación durante 2 días, seguido de 1 día de incubación en medio de mantenimiento. Después de 3-4 ciclos de purificación, el remOval de todos los glia endógena se espera 7 . Esto debe tomar aproximadamente 14 días. Los cultivos purificados son positivos para el marcador neuronal TUJ1 y están ausentes para la expresión de S100β ( Figura 5 ).
- Generación de células tipo Schwann
- Preparar el medio de inducción glial compuesto de αMEM suplementado con β-Heregulina (100 ng / ml), bFGF (10 ng / ml), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-AA, 5 ng / ml), FBS (10%) y P / S (1% v / v).
- Se planifican las neurosferas preparadas en la sección 4 en placas de 6 pocillos revestidas con PDL / laminina a una densidad de 5-10 esferas por cm2 en 1,5 ml de medio de inducción glial por pocillo. Reemplace el medio de inducción glial cada 2 días después de enjuagar las células con PBS.
NOTA: Se observa que las células de las neurosferas sembradas emigran hacia fuera en el día 2. Al día 7, las células migratorias tienen un aspecto ahusado y deben demostrar inmunopositividad para la célula de SchwannMarcadores p75 neurotrophin receptor (p75) y S100 β 7 . Estas células se denominan SCLC.
- Cocultivo de SCLCs con neuronas DRG
- Preparar el medio de cultivo compuesto por el medio de mantenimiento de neuronas DRG (paso 5.1.4) y el medio de inducción glial (paso 5.2.1) a una relación volumen-volumen de 1: 1.
- Preparar el medio de mantenimiento de células de Schwann compuesto por DMEM / F12 suplementado con FBS (5%), β-Heregulin (10 ng / ml) y P / S (1% v / v).
- Eliminar el medio de cultivo de los SCLC del día 7, enjuagarlos con PBS e incubarlos con 0,5 ml / pocillo de reactivo de disociación celular enzimático recombinante a 37 ° C durante 5 min. Resuspender los SCLC en medio de cocultivo.
- Cuantificar las células utilizando un hemocitómetro después de una dilución adecuada.
- Se sintetizan los SCLC sobre cultivos de neuronas DRG purificados a una densidad de 1.000 células / cm2. Mantener los cocultivos durante 14 días, con reemplazo medio cada 2 días.
NOTA: Durante el cocultivo, los SCLC adquirieron la morfología semejante a un huso que es típica de células de Schwann maduras ( Figura 6 ). Estas células persisten en su fenotipo después de la retirada de factores de crecimiento y son capaces de myelinate axones in vitro e in vivo [ 7 , 10] . La positividad de los marcadores celulares de Schwann ( es decir, p75 y S100β) debe ser monitoreada por inmunofluorescencia. - Una vez completado el cocultivo, pasan las células de Schwann comprometidas con el destino, como se describe en el paso 1.2.2. Utilizar 0,5 ml de reactivo de disociación por pocillo. Cuantificar las células utilizando un hemocitómetro después de una dilución adecuada.
- Resuspender las células de Schwann comprometidas con el destino en medio de mantenimiento de células de Schwann a una densidad de 10.000 células / cm2. Seed células en PDL / laminin-coated 6-well placas de inmunofluorescencia.
NOTA: Cocultures inevitablemente contienen MSCs que han adoptado un fibroblastoDestino celular 7 . Estas células se pasan junto con las células de Schwann comprometidas con el destino después de la terminación del cocultivo. Las células de Schwann situadas en la parte superior de este sustrato de fibroblastos pueden separarse fácilmente y ampliarse después del enjuague con "chorros fríos" de PBS (4 ° C), como se ha descrito en otra parte 13 . Fate-comprometido células de Schwann se puede ampliar en el medio de mantenimiento de 1 mes.
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Representative Results
En la Figura 1 se ilustra una visión general de las etapas clave de nuestro protocolo. En resumen, las MSC de rata y humana se seleccionan por adhesión al plástico de cultivo de tejidos. Los MSC expandidos se precondicionan con hipoxia y luego se someten a condiciones de formación de neurosfera. Neurospheres se platean y permiten diferenciar en SCLCs. Los SCLC son cocultivados con neuronas DRG purificadas para generar células Schwann comprometidas por el destino.
La morfología de MSC de rata y humana cultivadas se ilustra en la Figura 2 . Su morfología afilada sana se muestra en contraste con la aparición cuadrangular de MSCs mantenidas para números de paso alto, que han perdido su multipotencia. Las colonias de ratas y humanos expandidas deben demostrar la expresión de marcadores MSC, ausencia de marcadores de células madre hematopoyéticas y la capacidad de trilineaje difLa ferenciación ( Figura 3 ). Los MSC sanos de entre los pasos 3 y 8 están sujetos a un preacondicionamiento hipóxico durante 16 h y posteriormente se pasan a placas de cultivo de baja adherencia con suplementación de EGF / bFGF. El preacondicionamiento hipóxico da como resultado un mayor número de neurosferas, así como tamaños de neurosferas medianos más grandes ( Figura 4 ).
Las neuroesferas se plaquean sobre placas de cultivo revestidas con PDL / laminina y se inducen a convertirse en SCLC por cultivo en medio de inducción glial que contiene β-Heregulina, bFGF y PDGF-AA. Los SCLC exhiben la morfología afilada característica de las células de Schwann y la expresión del marcador correspondiente, sin embargo, son fenotípicamente inestables y vuelven a un fenotipo de fibroblasto después de la interrupción de los factores de crecimiento
El cocultivo con neuronas sensoriales es un prerrequisito para producir una célula intrínseca swPrurito al destino compromiso. El establecimiento de redes DRG purificadas se consigue mediante el tratamiento pulsado con FDU y uridina para eliminar la glía endógena y debe confirmarse por la ausencia de inmunopositividad S100β ( Figura 5 ). El día 7, los SCLC son pasados y cocultivados con neuronas DRG purificadas durante 14 días ( Figura 6 ). Tras la finalización de la cocultura, Maduro, el destino-comprometido células de Schwann debe surgir.
Figura 1: Visión general del protocolo. La médula ósea se obtiene de cualquiera de los fémures de rata o de los aspirados de la cresta ilíaca humana. Los MSCs de dentro de la médula ósea pueden unirse y expandirse sobre el plástico de cultivo de tejido. Con el fin de enriquecer para MSC con potencial neural, las células son preacondicionadas en 1% de O 2 durante 16 h y luego se pasan a baja adherencia cultivo plCon la suplementación de bFGF / EGF. Esto da lugar a la formación de neurosferas, que se plataban sobre plástico de cultivo de tejido revestido con PDL / laminina y se cultivaron en medio de inducción glial para generar SCLC. Los SCLC son pasados y cocultivados con neuronas DRG purificadas durante 2 semanas con el fin de dirigirlas a la madurez. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Establecimiento de colonias MSC. Las colonias MSC importantes deben ser visibles 6-7 días después de la galjanoplastia de las células de la médula ósea sobre el plástico de cultivo de tejido. Se muestra una imagen representativa de una colonia MSC de rata ( A ), mientras que las colonias humanas demuestran una apariencia similar. Las colonias pueden ser pasadas el día 10. Visto a mayor aumento, tanto la rata (B ) y las MSC humanas ( D ) presentan una morfología caracterıstica similar a los fibroblastos después del paso. Las MSCs que se mantienen para números de paso alto adquieren una morfología cuadrada aplastada ( C ) y deben ser descartadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Caracterización de MSCs. ( A - D ) Imágenes representativas de MSC humanas. Los MSC pueden caracterizarse por la expresión de marcadores apropiados, tales como CD90 ( A ), CD73 ( B ) y Stro-1 ( C ), y por la ausencia de marcadores de células madre hematopoyéticas, tales como CD45 ( D ). ( E - G ) Rat MLos SC aislados y expandidos como se describe en el protocolo demuestran una multipotencia en su capacidad para formar adipocitos ( E , depósitos de grasa teñidos con Sudan Red), osteoblastos ( F , matriz pericelular teñidos con Alizarin Red) y condrocitos ( G , proteoglicanos teñidos con Safranin- O) en condiciones apropiadas de cultivo. Barras de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Enriquecimiento de progenitores neurales de MSCs. Las MSC de rata ( A ) y humanas ( C ) forman neurosferas cuando se cultivan sobre plástico de cultivo tisular de baja adherencia en medio suplementado con EGF / bFGF. El número y el diámetro medio de la rata (
Figura 5: Establecimiento de redes DRG purificadas de ratas. Las redes DRG purificadas se establecen después del tratamiento pulsado con los agentes antimitóticos FDU y uridina (A). Las redes de Neurite que carecen de glia endógena que expresa S100β (B) están listas para el cocultivo con SCLC. Barras de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Generación de células de Schwann derivadas de médula ósea a través del cocultivo con neuronas DRG. Al completar 2 semanas de cocultivo con neuronas DRG purificadas y SCLCs humanas, las células de Schwann en forma de huso y con destino se originan tanto de grupos tratados con normoxia como tratados con hipoxia ( A y D ). Estas células expresan los marcadores de células de Schwann p75 (B y E) y S100β (C y F). La expresión del antígeno de los núcleos humanos (HuNeu) demuestra que las células positivas para S100β no estaban contaminando las células gliales originarias de DRG de rata. Barras de escala = 100 μm.
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Discussion
Es esencial para preservar el "stemness" de MSCs antes del enriquecimiento de progenitores neurales a través de precondicionamiento hipóxico y neurosphere cultura. A partir de nuestra experiencia, MSC multipotentes pueden ser identificados de forma fiable por su morfología de tipo fibroblastos alargada. Por el contrario, las MSC que han adoptado una morfología cuadrangular más aplanada, con fibras prominentes de estrés citoesquelético, no adoptan fácilmente los destinos celulares neuronales y deben ser descartadas. En general, no utilizamos MSC con números de pasaje mayores de ocho. Para preservar su stemness, es crítico pasar rápidamente MSCs antes de que alcancen la confluencia 100%. Por el contrario, el mantenimiento de MSC en una confluencia demasiado baja es indeseable. De nuestra experiencia, la siembra de CSM a una densidad de 40.000 células / cm 2 , o simplemente pasando células que son confluentes al 80% en una proporción de 1: 2, permite obtener los mejores resultados.
El establecimiento y mantenimiento adecuados de la red DRG es unUn determinante del éxito del cocultivo. El tiempo necesario para la recolección de DRG debe mantenerse al mínimo. Los ganglios individuales deben ser manejados de una manera atraumática, particularmente durante el desprendimiento de la médula espinal, cuando es mejor manejar las raíces nerviosas solamente. En general, apuntamos a un período de menos de 2 h entre el momento del sacrificio de los animales y la digestión enzimática de los DRG cosechados, ya que una cosecha prolongada da como resultado una maceración de los tejidos y la pérdida de viabilidad celular. El desprendimiento de neuronas DRG del sustrato durante el cultivo se encuentra a menudo. Para evitar que esto ocurra, el revestimiento debe estar recién preparado y realizado cerca del momento de la cosecha de tejidos. En general, los grandes grupos de DRG no digeridos se separan con mayor frecuencia y no producen el éxito del cocultivo. La duración de la digestión enzimática y la cantidad de trituración se pueden ajustar, con el objetivo de lograr una red con una apariencia similar a la de la Figura 5 .
Mientras nuestro cocuLture plataforma consistentemente induce el compromiso de destino, sólo el 20-30% de los cultivos realizados en paralelo producen el destino comprometido de células de Schwann [ 7 , 13] . Por lo tanto, preparar suficientes DRGs y SCLC para realizar concomitantemente cocultures en tres a cuatro placas de cultivo de 6 pocillos. Se plantea la hipótesis de que una combinación de factores relacionados con la red DRG subyacente, incluyendo su edad embrionaria, viabilidad celular, densidad y topografía, afectan el éxito del cocultivo. Estas variables subyacentes necesitan ser investigadas y estandarizadas más a fondo. Aparte de las limitaciones en el rendimiento de cocultivo, se debe buscar un medio para reemplazar el requisito de neuronas DRG derivadas de ratas y productos de origen animal. Además, debe acortarse la duración del protocolo. Como una modificación abreviada de nuestro protocolo, hemos tenido éxito en la obtención de células maduras Schwann a partir de día 10 neurospheres sembradas directamente sobre purificado DRG neuronas, sin la anterior generación de SCLC , 10 .
Neurospheres enriquecido a través de nuestro método sirven como una fuente robusta de células de linajes neuronales y glial. Nuestra plataforma para dirigir las células precursoras al compromiso del destino tiene la ventaja de evitar la manipulación genética, con sus riesgos inherentes, y las células resultantes son relevantes para el trasplante celular, el modelado de la enfermedad y el estudio de la diferenciación glial.
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Disclosures
Todos los autores de este manuscrito no tienen revelaciones que declarar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer al Dr. Nai-Sum Wong por proporcionar el aparato de cámara de hipoxia ya la Sra. Alice Lui por el apoyo técnico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| αMEM | Sigmaaldrich | M4526 | |
| DMEM/F12 | Thermofisher scientific | 12400-024 | |
| Neurobasal medium | Thermofisher scientific | 21103-049 | |
| FBS | Biosera | FB-1280/500 | |
| B27 | Thermofisher scientific | 17504-001 | |
| Epidermal growth factor (EGF) | Thermofisher scientific | PHG0313 | |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | 100-18B/100UG | |
| Nerve growth factor (NGF) | Millipore | NC011 | |
| Platelet-derived growth factor-AA (PDGF-AA) | Peprotech | 100-13A | |
| Heregulin beta-3, EGF domain (β-Her) | Millipore | 01-201 | |
| Uridine | Sigmaaldrich | U3003 | |
| 5-Fluro-2' - deoxyuridine (FDU) | Sigmaaldrich | F0503 | |
| Poly-D-lysine (PDL) | Sigmaaldrich | P7886-1G | |
| Laminin | Thermofisher scientific | 23017015 | |
| GlutaMAX | Thermofisher scientific | 35050061 | |
| Penicillin / streptomycin (P/S) | Thermofisher Scientific | 15140-122 | |
| TrypLE Express | Thermofisher Scientific | 12604-013 | |
| 10 cm plate for adherent culture | TPP | 93100 | Used for selection of MSCs by tissue culture adherence |
| 6-well plate for adherent culture | TPP | 92006 | Used for expansion of MSCs following passaging |
| UltraLow 6-well plate for non-adherent culture | Corning | 3471 | Used for neural progenitor enrichment |
| anti-human CD90(Thy-1) | BD Biosciences | 555593 | |
| anti-human CD73 | BD Biosciences | 550256 | |
| anti-human/rat STRO-1 | R&D Systems | MAB1038 | |
| anti-human nestin | R&D Systems | MAB1259 | |
| anti-human CD45 | BD Biosciences | 555480 | |
| anti-rat CD90(Thy-1) | BD Biosciences | 554895 | |
| anti-rat CD73 | BD Biosciences | 551123 | |
| anti-rat nestin | BD Biosciences | MAB1259 | |
| anti-rat CD45 | BD Biosciences | 554875 | |
| Anti-S100β | Dako | Z031101 | |
| Anti-p75 | Millipore | MAB5386 | |
| Anti-GFAP | Sigmaaldrich | G3893 | |
| Anti-Class III-beta tubulin (Tuj-1) | Covance | MMS-435P | |
| Anti-Human nuclei | Millipore | MAB1281 | |
| Hypoxia chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 | |
| HEPES buffer | Sigmaaldrich | H4034-100G |
References
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