Summary
Spiercellen (MSC's) met neurale potentieel bestaan in het beenmerg. Ons protocol verrijkt deze populatie van cellen via hypoxische preconditioning en wijst hen vervolgens op om volwassen Schwann cellen te worden.
Abstract
Dit manuscript beschrijft een middel om te verrijken voor neurale voorliefhebbers van de MSC-populatie en daarna te leiden naar het volwassen Schwann-cellot. Wij ondervonden ratten- en menselijke MSC's voor transiente hypoxische condities (1% zuurstof gedurende 16 uur), gevolgd door uitbreiding als neurospheren bij substratum met een lage bindingstijd, met supplementatie van de epidermale groeifactor (EGF) / basis fibroblastgroeifactor (bFGF). Neurospheren werden gepolijst op poly-D-lysine / laminine-beklede weefselkweekplastic en gekweekt in een gliogene cocktail die β-Heregulin, bFGF en bloedplaatjes afgeleide groeifactor (PDGF) bevat om Schwann-celachtige cellen te genereren (SCLC's). SCLC's werden gedurende 2 weken door middel van cocultuur door middel van cocultuur geregeld met gezuiverde Dorsal root Ganglia (DRG) neuronen verkregen uit E14-15 zwangere Sprague Dawley ratten. Volwassen Schwann cellen tonen aanhoudendheid in S100p / p75 expressie en kunnen myeline segmenten vormen. Cellen die op deze manier zijn gegenereerd hebben potentieel aPplicaties bij autologe celtransplantatie na ruggenmergletsel, evenals bij ziekte-modellering.
Introduction
De transplantatie van neurale progenitoren en hun derivaten toont belofte als een behandelingsstrategie na traumatische zenuwletsel 1 , 2 en neurodegeneratie 3 , 4 . Voorafgaand aan de klinische toepassing is het essentieel om te verzekeren: i) een methode om toegang te krijgen tot en uit te breiden op een autologe bron van stam- / stamcellen en ii) een middel om hen naar relevante volwassen cellen te brengen 3 . Onze interesse in celtherapie voor ruggenmergbesering heeft ons geleid tot het zoeken naar een robuuste, autologe celbron van neurale progenitoren uit volwassen weefsels.
Een subpopulatie van MSC's komt uit de neurale kam en is gemakkelijk toegankelijk vanuit de mergholte. Deze cellen zijn neurale voorvaders die neuronen en glia 5 kunnen genereren. Diermodellen van cerebrale ischemie tonen aan dat hypoxie de proliferatie bevordert Inferatie en multipotentie van neurale voorlopers in de hersenen 6 . Dit was de basis voor het gebruik van hypoxische pre-conditionering als middel om uit te breiden op merg-afgeleide neurale progenitoren.
De transplantatie van Schwann-cellen in het gewonde ruggenmerg bevordert regeneratie 2 . SCLC's kunnen worden gegenereerd door MSC's door middel van supplementatie met gliogene factoren ( dwz β-Heregulin, bFGF en PDGF-AA) maar tonen fenotypische instabiliteit. Bij de terugtrekking van groeifactoren keren ze terug naar een fibroblastachtig fenotype 7 . Fenotypische instabiliteit is ongewenst bij celtransplantatie vanwege het risico op afwijkende differentiatie en carcinogenese. Aangezien de Schwann-celprecursoren geassocieerd zijn met axonbundels binnen de embryonale perifere zenuw 8 , werden we geleid tot cocultuur-SCLC's met gezuiverde embryonale DRG-neuronen 7 ,Ass = "xref"> 9. Resultaat rijpe Schwanncellen zijn lotgevonden en tonen functie in vitro 7 , 9 en in vivo 10 .
Ons protocol voor de verrijking van neurale progenitoren van MSC's is eenvoudig en efficiënt en resulteert in een toename van het celnummer voor latere analyses. De afleiding van door Schotse cellen geformuleerde schadecellen via het coculture platform zorgt voor de studie van glialifferentiatie en voor het genereren van stabiele en functionele Schwann-cellen voor potentiële klinische toepassing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures met betrekking tot dieren werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de NIH Guide for Care and Use of Laboratory Animals en goedgekeurd door het Comité voor het gebruik van levende dieren voor onderwijs en onderzoek, Li Ka Shing Faculteit Geneeskunde, Universiteit van Hong Kong. Menselijke beenmergmonsters werden verkregen uit de iliac crest van gezonde donors na het verkrijgen van geïnformeerde toestemming. Protocollen werden goedgekeurd door de Institutional Review Board, De Universiteit van Hong Kong.
1. Bereiding van Rat MSC Cultures
- Oogst van MSC's van de femur
- Autoclaaf alle dissectie gereedschappen ( dwz fijne dissecteren van een schaar, stompe snijschaar en tandklemmen) bij minstens 180 ° C voor gebruik voorafgaand aan gebruik.
- MSC groeimedium voorbereiden dat bestaat uit minimaal essentieel medium-alfa-modificatie (αMEM) aangevuld met 15% foetaal boviene serum (FBS) en penicilline / streptomycine (P / S, 1% v / v).
- Offer jonge mannelijke Sprague Dawley ratten (200-250 g lichaamsgewicht) door pentobarbiton overdosis (240 mg / kg lichaamsgewicht, intraperitoneale).
OPMERKING: Marrowmonsters van verschillende ratten moeten afzonderlijk worden verwerkt. - Plaats de opgeofferde dieren in de rugstand. Reinig hun buik en de onderste ledematen grondig met 70% ethanol.
- Verwijder de huid en het subcutane weefsel over de mediale dijen met behulp van fijne dissecterende scharen en pincetjes. Verwijder de dijspieren periferisch totdat de femur wordt blootgesteld. Ga dit proximaal en distaal door tot de knie- en heupgewrichten worden gezien. Ontwricht de femur door de heup en kniegewricht door middel van stompe snijscharen.
OPMERKING: Doe de femur niet om de murgholte op dit stadium bloot te leggen. Verplaats intacte femur naar een weefselkweekkap van laminair stroming voor verdere verwerking. - Gebruik stompe snijscharen om de distale en proximale uiteinden van de femur door middel van de metafyse te transverseren.
- Plaats een 70 μm celzeef over een 50 ml conische buis. Voeg een 21 G, 10 ml injectiespuit met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, 10 mM Na 2 HPO 4 , pH 7,4) in de blootgestelde female kanaal en spoel het merggehalte in de conische buis door herhaaldelijk spoelen.
OPMERKING: Ongeveer 20 ml PBS wordt gebruikt om elke femur te spoelen. Als de kleur van de gespoelde inhoud bloedbevlekte en troebel blijft, kan een groter volume worden gebruikt. - Verzamel de cellen door centrifugeren bij 480 xg gedurende 5 minuten. Gooi de supernatant weg. Resuspendeer de celpellet in 10 ml MSC groeimedium. Plaat de cellen op een weefselkweekschotel van 10 cm. Plaats de weefselkweekschotels in een cel incubator (37 ° C, 5% CO 2 ). Noteer de eerste dag van plating als dag 0.
OPMERKING: In alle stappen die centrifugeren, zet de rem voor maximale vertraging.
- Oprichting en uitbreiding van MSC-kolonies
OPMERKING: dit protocol rHet gaat hierbij om plastic adhesie van weefselkweek als middel om te kiezen voor MSC's van binnen de mergholte 11 . Het beenmerggehalte mag gedurende 2 dagen aan het weefselkweekplastic kleven.- Op dag 2, spoel de kweekplaten drie keer met 10 ml PBS af om niet-hechtende cellen te verwijderen. Vervang PBS met 10 ml MSC groeimedium na het spoelen. Was de cellen met PBS en vul elke 3 dagen met MSC groeimedium aan.
OPMERKING: MSC kolonies moeten zichtbaar zijn op dag 6-7 ( figuur 2A ). - Passeer de cellen op dag 10 door het groeimedium te verwijderen en de cellen te spoelen met PBS. Voeg 1,5 ml recombinante enzymatische celdissociatie-reagens toe en incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten. Voeg 3 ml MSC groeimedium toe om de reactie te neutraliseren. Verzamel de losstaande cellen door centrifugeren bij 250 xg gedurende 5 minuten.
- Kwantificeer de cellen in de pellet met behulp van een hemocytometer na een geschikte verdunning in PBS.
- Zaad doorgegeven cellen bij een dichtheid van 40.000 cellen / cm2 in een cultuurplaat van 10 cm in MSC groeimedium.
OPMERKING: Rat MSCs moeten 80-90% samenvloeiing bereiken binnen 2 dagen na het doorvoeren ( Figuur 2B ). Cellen kunnen passeren zoals beschreven in stap 1.2.2 voor maximaal 8 passages. MSC's kunnen worden gekenmerkt door immunocytochemie en hun capaciteit voor trilineage differentiatie ( Figuur 3 ) 12 . Alleen MSC culturen tussen passages 3 en 8 zijn onderworpen aan latere hypoxische preconditioning en neurale voorloper verrijking. MSC's met een groter doorgangsnummer nemen een afgeplatte morfologie aan ( Figuur 2C ) en produceren niet voldoende aantallen neurale voorvaders. Deze culturen moeten worden weggegooid.
- Op dag 2, spoel de kweekplaten drie keer met 10 ml PBS af om niet-hechtende cellen te verwijderen. Vervang PBS met 10 ml MSC groeimedium na het spoelen. Was de cellen met PBS en vul elke 3 dagen met MSC groeimedium aan.
2. Bereiding van humane BMSC-culturen
- Verdun 1 ml menselijk beenmerg aspiraat met 9 ml MSC groeimedium en plaat deCellen op een 10 cm weefselkweekschotel. Onderhou de culturen in een cel incubator (37 ° C, 5% CO2).
- Verwijder het medium na 2 dagen en schud de culturen drie keer zachtjes met 10 ml PBS om niet-aanhechtende cellen te verwijderen. Na de laatste spoeling verwijder de PBS en vervang deze met 10 ml MSC groeimedium. Vervang het groeimedium na elke 3 dagen van de cultuur na de PBS-spoel.
OPMERKING: MSC kolonies moeten zichtbaar zijn op dag 6-7. Het aantal kolonies kan variëren tussen proefpersonen. - Passage de cellen op dag 10, zoals beschreven in stap 1.2.2. Kwantificeer de cellen in de pellet met behulp van een hemocytometer na een geschikte verdunning in PBS. Zaad de passaged cellen op een dichtheid van 40.000 cellen / cm2 op een cultuurplaat van 10 cm in MSC groeimedium.
OPMERKING: Menselijke MSC's ( Figuur 2D ) tonen een soortgelijke morfologie aan rat MSCs en moeten ook 80 tot 90% samenvloeiing bereiken binnen 2 dagen na het passeren. Ze zouden chara moeten zijnGecertificeerde door middel van immunocytochemie en hun capaciteit voor trilineage differentiatie 12 . Zoals bij rat-MSC's, zijn menselijke MSC's die tussen passage 3 en 8 zijn onderworpen aan latere hypoxische preconditioning en neurale voorloperverrijking.
3. Hypoxische Voorbereiding
- Demonteer de hypoxiekamercomponenten ( bijv. Basis, deksel, bakken) nadat u de ringklem losgemaakt hebt en de afzonderlijke delen schoon maken met 70% ethanol. Plaats de kamercomponenten in een weefselkweekkap van laminair stromingsweefsel voor sterilisatie onder UV-licht gedurende 15 minuten.
- Vóór de hypoxische preconditioning, verwijder het medium en spoel de rat en de menselijke MSC culturen (secties 1 en 2) met 10 ml PBS af. Vervang de PBS met 10 ml MSC groeimedium aangevuld met 25 mM HEPES.
OPMERKING: De MSC's die op 10 cm gerechten zijn gekweekt, zouden 80-90% confluency moeten hebben bereikt voordat ze onderworpen zijn aan hypoxische preconditioning. - Plaats de culGerechten binnen de hypoxiekamer. Monteer de kamercomponenten en draai de ringklem aan. Spoel een gasmengsel van 99% N2 / 1% O2 in de kamer met een stromingssnelheid van 10 L / min gedurende 5 minuten.
- Verzegel de aansluitende einden van de hypoxiekamer om te voorkomen dat er gaslekkage ontstaat. Plaats de kamer in de cel-incubator (37 ° C, 5% CO 2 ) gedurende 16 uur.
- Na voltooiing van de hypoxische pre-conditionering, verwijder de culturen uit de kamer ter voorbereiding op de volgende neurale voorloperverrijkingskweek.
4. Neurale Progenitor Verrijking Cultuur
- Bereid neuraal progenitor medium op, dat bestaat uit Dulbecco's gemodificeerde arendmedium / Ham's voedermiddelmengsel F12 (DMEM / F12) aangevuld met B27 (2% v / v), basische fibroblastgroeifactor (bFGF, 20 ng / ml), epidermale groeifactor (EGF, 20 ng / ml) en P / S (1% v / v).
- Verwijder de hypoxische voorgeschreven rat / menselijke MSC's, zoals beschreven in stap 1.2.2.Verzamel de losstaande cellen door centrifugeren bij 250 xg gedurende 5 minuten. Kwantificeer de cellen in de pellet met behulp van een hemocytometer na de juiste verdunning in PBS.
- Resuspendeer de cellen in neuraal progenitor medium en zaad op laagbevestigende, 6-putjes platen met een dichtheid van 6.000 cellen / cm2. Plaats de cultuur gedurende 12 dagen in een cel-incubator (37 ° C, 5% CO2). Vervolgens 75% van het neurale progenitormedium elke 3 dagen.
OPMERKING: Grootte niet-aaneengesloten celclusters dienen op dag 6-7 te worden waargenomen. Op dag 10-12 kunnen neurospheren met een diameter ≥ 100 μm worden waargenomen ( figuur 4 ). Hypoxische voorgeschreven MSC's zouden meer neurosferen moeten opleveren in vergelijking met MSC's die onder normoxische omstandigheden zijn gekweekt 9 . - Verzamel neurospheren op dag 12 door ze in een pipet van 10 ml te zuiveren en ze over te brengen naar een 15 ml conische buis. Centrifugeer de neurospheren bij 250 xg gedurende 5 minuten.
OPMERKING: Neurospheren kunnen zijnGekenmerkt op dag 12 voor neurale voorloper markers, zoals nestin en GFAP 7 .
5. Generatie van Schadecathène door de Schade via de Coca-Cola met DRG Neuronen
- Bereiding van gezuiverde rat DRG neuronen
- Autoclaaf alle dissectie gereedschappen ( dwz dissectieschaar, pincet, twee microdissectie tang en microdissecterende schaar) bij 180 ° C gedurende tenminste 2 uur voor gebruik.
- Coat 6-putjes weefselkweekplaten met poly-D-lysine (PDL, 10 μg / ml in PBS) bij 4 ° C overnacht. Verwijder de PDL en spoel met 1,5 ml PBS per putje.
- Ga door met de coating van de platen met laminine (10 μg / ml in PBS) bij 37 ° C gedurende 2 uur. Spoel de platen met 1,5 ml PBS per putje.
- Bereid DRG neuron onderhoudsmiddel op, bestaande uit neurobasaal medium aangevuld met B27 (2% v / v), L-glutamine (1% v / v), zenuwgroeifactor (NGF, 20 ng / ml) en P / S % V / v).
- Bereid DRG neuron zuiveringsmedium op, bestaande uit neurobasaal medium aangevuld met B27 (2% v / v), L-glutamine (1%), NGF (20 ng / ml), P / S (1%), fluorodeoxyuridine (FDU, 10 Μg / ml) en uridine (10 μg / ml).
- Zwangere ratten op zwangerschapsdag 14-15 bij overdosering van pentobarbital (240 mg / kg lichaamsgewicht, intraperitoneale) opleveren.
- Plaats de opgeofferde dieren in de rugstand. Reinig hun buik grondig met 70% ethanol.
- Snijd de onderbuikwand van het dier in de lengterichting met behulp van fijne dissecterende scharen en pincetjes. Identificeer en verwijder de baarmoeder met behulp van dissectieschaar. Knip de baarmoederwand om de embryo's bloot te stellen en te extraheren. Breng de embryo's over naar een steriele, 10 cm kweekschotel gevuld met PBS. Plaats de cultuurschotel op ijs.
- Breng het embryo voor dissectie over naar een steriele, 10 cm kweekschotel gevuld met PBS (kamertemperatuur) en plaats het onder een dissectiemicroscoop. Laat het embryo in slechte positie.
NIETE: Het witte wervelkolom en de bijgevoegde DRG's kunnen gezien worden via het dorsale aspect van het embryo, door middel van de doorschijnende huid. - Voeg microdissecterende tang in aan weerszijden van het ruggenmerg en gebruik stompe dissectie om het ruggenmerg van het omringende zachte weefsel te scheiden. Snijd het ruggenmerg vrij van het dier met behulp van microdissecterende tang langs de nekopening en staartstub. Voer verder stompe dissectie over het ventrale aspect van het koord om het te bevrijden van omringend zacht weefsel.
- Gebruik microdissecterende tang om resterend zacht weefsel over het dorsale aspect van het bevroren ruggenmerg te verwijderen.
OPMERKING: In dit stadium moet alleen het ruggenmerg, zenuwwortels en bijgevoegde DRG blijven. - Verwijder individuele DRG's van hun verbindende zenuwwortels met behulp van microdissecting tang. Gebruik een pipetpen die is bevestigd aan een 1 ml tip om de DRG's over te brengen naar een 1,5 ml, steriele centrifugebuis met PBS.
OPMERKING: Voor elke 1,5 ml buis mag maximaalEr kunnen 100 DRG's worden meegenomen. - Centrifugeer de DRG's bij 250 xg gedurende 5 minuten en zet ze opnieuw in recombinante enzymatische celdissociatie-reagens (200 μL per buis). Incubeer (37 ° C, 5% CO2) gedurende 10 minuten. Centrifugeer de DRG's bij 250 xg gedurende 5 minuten, verwijder de supernatant en resuspendeer in DRG neuron onderhoudsmiddel. Dissocieer de pellet door zachte trituratie met behulp van een 200 μL pipet tip. Kwantificeer de cellen in de pellet met behulp van een hemocytometer na een passende verdunning.
- Zaad de cellen bij een dichtheid van 5.000 cellen / cm2 in PDL / laminine beklede 6-putjes platen in 1,5 ml DRG neuron onderhoud medium per put. Na twee dagen cultuur verwijder het DRG neuron onderhoudsmiddel, spoel met PBS, en vervang met DRG neuron zuiveringsmedium.
OPMERKING: Voor elke zuiveringscyclus, behandel de DRG culturen met zuiveringsmedium gedurende 2 dagen, gevolgd door 1 dag incubatie in onderhoudsmiddel. Na 3-4 zuiveringscycli wordt de remOvaal van alle endogene glia wordt verwacht 7 . Dit duurt ongeveer 14 dagen. Gezuiverde culturen testen positief voor de neuronale marker TUJ1 en zijn afwezig voor S100β expressie ( Figuur 5 ).
- Generatie van Schwann celachtige cellen
- Bereid glialinductiemedium dat bestaat uit aMEM aangevuld met P-Heregulin (100 ng / ml), bFGF (10 ng / ml), bloedplaatjes afgeleide groeifactor (PDGF-AA, 5 ng / ml), FBS (10%) en P / S (1% v / v).
- Plaat de neurospheren die bereid zijn in sectie 4 in PDL / laminine beklede 6-putjes platen bij een dichtheid van 5-10 bolletjes per cm2 in 1,5 ml glial inductie medium per put. Vervang glialinductiemedium elke 2 dagen na het spoelen van de cellen met PBS.
OPMERKING: Cellen uit gezaagde neurospheren worden gezien als dag 2 naar buiten migreren. Op dag 7 hebben migrerende cellen een taperende verschijning en moeten immunopositiviteit voor de Schwann-cel aantonenMarkers p75 neurotrofin receptor (p75) en S100β 7 . Deze cellen worden aangeduid als SCLCs.
- Coculture van SCLC's met DRG neuronen
- Bereid coculture-medium op, dat bestaat uit DRG-neuron onderhoudsmedium (stap 5.1.4) en glialinductiemedium (stap 5.2.1) bij een volumeverhouding van 1: 1.
- Bereid Schwann-cel onderhoudsmedium bestaande uit DMEM / F12 aangevuld met FBS (5%), P-Heregulin (10 ng / ml) en P / S (1% v / v).
- Verwijder het kweekmedium uit dag 7 SCLC's, spoel ze met PBS en incubeer ze 5 minuten met 5 ml / ml recombinante enzymatische celdissociatie-reagens bij 37 ° C. Resuspendeer de SCLC's in coculture medium.
- Kwantificeer de cellen met behulp van een hemocytometer na een passende verdunning.
- Zaai de SCLC's op gezuiverde DRG neuron culturen bij een dichtheid van 1000 cellen / cm2. Behou de coculturen gedurende 14 dagen, met een gemiddelde vervanging om de 2 dagen.
OPMERKING: Tijdens cocultuur verwierf SCLCs de spindelachtige morfologie die typisch is voor volwassen Schwann-cellen ( Figuur 6 ). Deze cellen volgen in hun fenotype na de terugtrekking van groeifactoren en kunnen axonen in vitro en in vivo 7 , 10 mengen. De positiviteit van Schwann celmarkers ( dwz p75 en S100β) moet worden gecontroleerd door immunofluorescentie. - Na voltooiing van de cocultuur, zijn doorgangskader-toegewijde Schwann-cellen, zoals beschreven in stap 1.2.2. Gebruik 0,5 ml dissociatie-reagens per putje. Kwantificeer de cellen met behulp van een hemocytometer na een passende verdunning.
- Resuspende schaduwcellen in Schwann-cel onderhoudsmedium bij een dichtheid van 10.000 cellen / cm2. Zaadcellen in PDL / laminine beklede 6-putjes platen voor immunofluorescentie.
OPMERKING: Cocultures bevatten onvermijdelijk MSC's die een fibroblast hebben aangenomenCel lot 7 . Deze cellen worden doorgevoerd samen met schaduwcellen op het gebied van de noodlot bij de voltooiing van de cocultuur. Schwanncellen die bovenop dit fibroblast substratum liggen, kunnen gemakkelijk worden losgemaakt en verder uitgebreid na het spoelen met "koude stralen" van PBS (4 ° C), zoals elders beschreven 13 is . Schadeconservaten kunnen gedurende 1 maand in onderhoudsmedium worden uitgebreid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een overzicht van de belangrijkste fasen in ons protocol is geïllustreerd in figuur 1 . Samenvattend worden rat- en menselijke MSC's geselecteerd door aanhechting aan weefselkweekplastic. Uitgebreide MSC's zijn voorgeschreven met hypoxie en zijn dan onderworpen aan neurosfeervormende condities. Neurospheren zijn geplateerd en mogen onderscheiden in SCLC's. SCLC's worden gecultiveerd met gezuiverde DRG-neuronen om schaduwcellen te genereren.
De morfologie van gekweekte ratten en menselijke MSC's is geïllustreerd in figuur 2 . Hun gezonde tapse morfologie wordt getoond in tegenstelling tot de vierhoekige verschijning van MSC's die worden gehandhaafd voor hoge doorgangen, die hun multipotency hebben verloren. Uitgebreide rat- en menselijke kolonies zouden de expressie van MSC-merkers moeten aantonen, een afwezigheid van hematopoietische stamcelmarkers en de capaciteit voor trilineage difFerentiatie ( figuur 3 ). Gezonde MSC's van tussen de passages 3 en 8 zijn onderworpen aan hypoxische preconditionering gedurende 16 uur en worden vervolgens doorgegeven op laag-adhesieve kweekplaten met EGF / bFGF-aanvulling. Hypoxische preconditioning resulteert in grotere neurosferen, evenals grotere gemiddelde neurosfeergroottes ( Figuur 4 ).
Neurospheren worden op PDL / laminine gecoate kweekplaten geplateerd en geïnduceerd om SCLC's te worden door cultuur in glial inductiemedium dat β-Heregulin, bFGF en PDGF-AA bevat. SCLC's tonen de karakteristieke tapered morfologie van Schwann cellen en de bijbehorende marker expressie, maar ze zijn fenotypisch instabiel en keren terug naar een fibroblast fenotype bij de stopzetting van groeifactoren
Kokultuur met sensorische neuronen is een voorwaarde om een cel-intrinsieke sw teweeg te brengenJeuk aan het lot inzetten. De oprichting van gezuiverde DRG-netwerken wordt bereikt door middel van gepulseerde behandeling met FDU en uridine om endogene glia te verwijderen en moet worden bevestigd door de afwezigheid van S100β immunopositiviteit ( Figuur 5 ). Op dag 7 worden SCLC's doorgegeven en gecultureerd met gezuiverde DRG-neuronen gedurende 14 dagen ( Figuur 6 ). Na de voltooiing van de coculture zouden volwassen, schadelijke Schwann-cellen moeten ontstaan.
Figuur 1: Overzicht van het protocol. Beenmerg wordt verkregen uit ofwel rat femur of humane iliac kam aspiraten. MSC's van binnen het beenmerg kunnen bevestigen en uit te breiden op weefselkweek plastic. Om te verrijken voor MSC's met neurale potentieel, worden cellen gedurende 1 uur in 1% 02 geconditioneerd en worden ze vervolgens overgebracht op laag adherentie cultuur pAtes met bFGF / EGF supplementatie. Dit resulteert in de vorming van neurospheren, die op PDL / laminine gecoate weefselkweekplastic worden geplateerd en gekweekt in glial inductie medium om SCLC's te genereren. SCLC's worden doorgegeven en gecultiveerd met gezuiverde DRG-neuronen gedurende 2 weken om hen naar volwassenheid te leiden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Oprichting van MSC kolonies. Groote MSC kolonies zouden 6-7 dagen na het plateren van beenmergcellen zichtbaar zijn op weefselkweekplastic. Een representatief beeld van een rat MSC kolonie wordt getoond ( A ), terwijl menselijke kolonies een soortgelijke verschijning aantonen. Kolonies kunnen doorgegeven worden op dag 10. Bij hogere vergroting zien beide rat (B ) en menselijke ( D ) MSC's tonen een karakteristieke fibroblast-achtige morfologie na het doorgeven. MSC's die worden gehandhaafd voor hoge doorgangsnummers verwerven een platte, vierhoekige morfologie ( C ) en moeten worden weggegooid. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Karakterisering van MSC's. ( A - D ) Representatieve beelden van menselijke MSCs. MSC's kunnen worden gekenmerkt door de uitdrukking van passende markers, zoals CD90 ( A ), CD73 ( B ) en Stro-1 ( C ), en door afwezigheid van hematopoietische stamcelmarkers, zoals CD45 ( D ). ( E - G ) Rat MSC's geïsoleerde en uitgebreid zoals beschreven in het protocol tonen multipotentie in hun vermogen om adipocyten te vormen ( E ; vetdeposito's gekleurd met Soedan Red), osteoblasten ( F ; pericellulaire matrix gekleurd met Alizarin Red) en chondrocyten ( G ; proteoglycanen gekleurd met Safranin- O) onder geschikte kweekomstandigheden. Schaalstaven = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Verrijking van neurale progenitoren van MSC's. Zowel rat ( A ) en menselijke ( C ) MSCs vormen neurospheren wanneer ze worden gekweekt op laagweefselweefselkweekplastic in medium aangevuld met EGF / bFGF. De getallen en gemiddelde diameter van de rat (
Figuur 5: Oprichting van gezuiverde rat DRG-netwerken. Gezuiverde DRG-netwerken worden opgesteld na gepulseerde behandeling met de antimitotische middelen FDU en uridine (A). Neuritaire netwerken die geen S100β-expressieve endogene glia (B) hebben, zijn klaar voor cocultuur met SCLC's. Schaalstaven = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Generatie van bone marrow afgeleide Schwann cellen via coculture met DRG neuronen. Na het voltooien van 2 weken cocultuur met gezuiverde DRG-neuronen en humane SCLC's, komen spindelvormige, schotse Schwann-cellen voort uit zowel normoxia- als hypoxiebehandelde groepen ( A en D ). Deze cellen duiden de Schwann-celmarkers p75 (B en E) en S100β (C en F) uit. De expressie van menselijk nucleair antigeen (HuNeu) demonstreert dat de S100p-positieve cellen geen glialcellen vervagen die afkomstig zijn van rat DRG's. Schaalstaven = 100 μm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het is essentieel om de "stevigheid" van MSC's te behouden voorafgaand aan de verrijking van neurale voorvaders via hypoxische preconditioning en neurosfeercultuur. Uit onze ervaring kunnen multipotente MSC's betrouwbaar worden geïdentificeerd door hun langwerpige fibroblastachtige morfologie. In tegenstelling hiermee, MSCs die een meer platgemaakte, vierhoekige morfologie, met prominente cytoskeletale stressvezels hebben aangenomen, nemen niet gemakkelijk neurale celpartijen vast en dienen weggegooid te worden. In het algemeen gebruiken we geen MSC's met passagiersnummers groter dan acht. Om hun stilheid te behouden is het van cruciaal belang om snel MSCs te doorlopen voordat ze 100% samenloop bereiken. Omgekeerd is het behoud van MSC's bij een te lage samenvloeiing ongewenst. Uit onze ervaring, zaaien MSC's met een dichtheid van 40.000 cellen / cm2, of gewoon doorgaan met cellen die 80% samenvloeien bij een verhouding van 1: 2, voor de beste resultaten mogelijk zijn.
De juiste vestiging en onderhoud van het DRG-netwerk is kritischAl bepalend voor coculture succes. De benodigde tijd voor DRG oogst moet minimaal gehouden worden. Individuele ganglia moeten op atraumatische wijze worden behandeld, met name tijdens het losmaken van het ruggenmerg, wanneer het het beste is om alleen de zenuwwortels te behandelen. Over het algemeen streven we naar een periode van minder dan 2 uur tussen het tijdstip van het offeren van dieren en de enzymatische vertering van geoogste DRG's, aangezien een langdurige oogst resulteert in weefselmaceratie en het verlies van cellevendabiliteit. De ontlasting van DRG-neuronen uit het substraat tijdens de cultuur wordt vaak aangetroffen. Om te voorkomen dat dit optreedt, moet de coating vers voorbereid en uitgevoerd worden in de buurt van de weefseloogst. In het algemeen losmaken grote, onaantastbare DRG-clusters vaker en leveren ze geen succes op coculture. De duur van enzymatische vertering en de hoeveelheid trituratie kan worden aangepast, met als doel het bereiken van een netwerk met een verschijning die lijkt op figuur 5 .
Terwijl onze cocuDit platform zorgt voortdurend voor de toewijding van het lot, maar slechts 20-30% van de culturen die worden uitgevoerd in parallelle opbrengstgerelateerde Schwann-cellen 7 , 13 . Daarom bereiden we genoeg DRG's en SCLC's voor om tegelijkertijd coculturen in drie tot vier cultuurplaten met 6 putjes uit te voeren. Wij veronderstellen dat een combinatie van factoren die verband houden met het onderliggende DRG-netwerk, met inbegrip van hun embryonale leeftijd, cellevendigheid, dichtheid en topografie, het succes van cocultuur beïnvloeden. Deze onderliggende variabelen moeten verder worden onderzocht en gestandaardiseerd. Afgezien van beperkingen in de culturele opbrengst, moet er een middel worden gevonden om de eis te vervangen voor rat-afgeleide DRG neuronen en dierlijke producten. Bovendien moet de duur van het protocol verkort worden. Als een verkorte modificatie van ons protocol hebben we succes gehad bij het afleiden van volwassen Schwann-cellen uit dag 10 neurospheren die direct op gezuiverde DRG-neuronen werden geplant, zonder de voorafgaande generatie van SCLC's , 10 .
Neurospheres verrijkt via onze methode dienen als een robuuste bron van cellen van neuronale en gliale lijn. Ons platform voor het voorlichten van precursorcellen naar de verplichting tot het lot heeft het voordeel om genetische manipulatie te vermijden, met zijn inherente risico's, en de resulterende cellen zijn van belang voor celtransplantatie, ziekte-modellering en de studie van glialifferentiatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle auteurs van dit manuscript hebben geen onthullingen om te verklaren.
Acknowledgments
De auteurs zouden graag Dr. Nai-Sum Wong willen erkennen voor het leveren van de hypoxie kamerapparatuur en mevrouw Alice Lui voor de technische ondersteuning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| αMEM | Sigmaaldrich | M4526 | |
| DMEM/F12 | Thermofisher scientific | 12400-024 | |
| Neurobasal medium | Thermofisher scientific | 21103-049 | |
| FBS | Biosera | FB-1280/500 | |
| B27 | Thermofisher scientific | 17504-001 | |
| Epidermal growth factor (EGF) | Thermofisher scientific | PHG0313 | |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | 100-18B/100UG | |
| Nerve growth factor (NGF) | Millipore | NC011 | |
| Platelet-derived growth factor-AA (PDGF-AA) | Peprotech | 100-13A | |
| Heregulin beta-3, EGF domain (β-Her) | Millipore | 01-201 | |
| Uridine | Sigmaaldrich | U3003 | |
| 5-Fluro-2' - deoxyuridine (FDU) | Sigmaaldrich | F0503 | |
| Poly-D-lysine (PDL) | Sigmaaldrich | P7886-1G | |
| Laminin | Thermofisher scientific | 23017015 | |
| GlutaMAX | Thermofisher scientific | 35050061 | |
| Penicillin / streptomycin (P/S) | Thermofisher Scientific | 15140-122 | |
| TrypLE Express | Thermofisher Scientific | 12604-013 | |
| 10 cm plate for adherent culture | TPP | 93100 | Used for selection of MSCs by tissue culture adherence |
| 6-well plate for adherent culture | TPP | 92006 | Used for expansion of MSCs following passaging |
| UltraLow 6-well plate for non-adherent culture | Corning | 3471 | Used for neural progenitor enrichment |
| anti-human CD90(Thy-1) | BD Biosciences | 555593 | |
| anti-human CD73 | BD Biosciences | 550256 | |
| anti-human/rat STRO-1 | R&D Systems | MAB1038 | |
| anti-human nestin | R&D Systems | MAB1259 | |
| anti-human CD45 | BD Biosciences | 555480 | |
| anti-rat CD90(Thy-1) | BD Biosciences | 554895 | |
| anti-rat CD73 | BD Biosciences | 551123 | |
| anti-rat nestin | BD Biosciences | MAB1259 | |
| anti-rat CD45 | BD Biosciences | 554875 | |
| Anti-S100β | Dako | Z031101 | |
| Anti-p75 | Millipore | MAB5386 | |
| Anti-GFAP | Sigmaaldrich | G3893 | |
| Anti-Class III-beta tubulin (Tuj-1) | Covance | MMS-435P | |
| Anti-Human nuclei | Millipore | MAB1281 | |
| Hypoxia chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 | |
| HEPES buffer | Sigmaaldrich | H4034-100G |
References
- Wiliams, R. R., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation: a repair strategy for spinal cord injury? Prog Brain Res. 201, 295-312 (2012).
- Kanno, H., Pearse, D. D., Ozawa, H., Itoi, E., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation for spinal cord injury repair: its significant therapeutic potential and prospectus. Rev Neurosci. 26 (2), 121-128 (2015).
- Lindvall, O., Kokaia, Z. Stem cells in human neurodegenerative disorders--time for clinical translation? J Clin Invest. 120 (1), 29-40 (2010).
- Terzic, D., et al. Directed Differentiation of Oligodendrocyte Progenitor Cells From Mouse Induced Pluripotent Stem Cells. Cell Transplant. 25 (2), 411-424 (2016).
- Takashima, Y., et al. Neuroepithelial cells supply an initial transient wave of MSC differentiation. Cell. 129 (7), 1377-1388 (2007).
- Felling, R. J., et al. Neural stem/progenitor cells participate in the regenerative response to perinatal hypoxia/ischemia. J Neurosci. 26 (16), 4359-4369 (2006).
- Shea, G. K., Tsui, A. Y., Chan, Y. S., Shum, D. K. Bone marrow-derived Schwann cells achieve fate commitment--a prerequisite for remyelination therapy. Exp Neurol. 224 (2), 448-458 (2010).
- Jessen, K. R., Mirsky, R. The origin and development of glial cells in peripheral nerves. Nat Rev Neurosci. 6 (9), 671-682 (2005).
- Mung, K. L., et al. Rapid and efficient generation of neural progenitors from adult bone marrow stromal cells by hypoxic preconditioning. Stem Cell Res Ther. 7 (1), 146 (2016).
- Ao, Q., et al. The regeneration of transected sciatic nerves of adult rats using chitosan nerve conduits seeded with bone marrow stromal cell-derived Schwann cells. Biomaterials. 32 (3), 787-796 (2011).
- Tondreau, T., et al. Isolation of BM mesenchymal stem cells by plastic adhesion or negative selection: phenotype, proliferation kinetics and differentiation potential. Cytotherapy. 6 (4), 372-379 (2004).
- Baksh, D., Song, L., Tuan, R. S. Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. J Cell Mol Med. 8 (3), 301-316 (2004).
- Jirsova, K., Sodaar, P., Mandys, V., Bar, P. R. Cold jet: a method to obtain pure Schwann cell cultures without the need for cytotoxic, apoptosis-inducing drug treatment. J. Neurosci. Methods. 78 (1-2), 133-137 (1997).
