Summary
Marvstromaceller (MSC'er) med neurale potentialer findes inden for knoglemarven. Vores protokol beriger denne population af celler via hypoxisk forkonditionering og derefter leder dem til at blive modne Schwann-celler.
Abstract
Dette manuskript beskriver et middel til at berige for neurale progenitorer fra marvstromcelle (MSC) populationen og derefter henvise dem til den modne Schwann-cellefate. Vi udsatte rotte- og humane MSC'er til forbigående hypoxiske tilstande (1% ilt i 16 timer) efterfulgt af ekspansion som neurospherer på sublimat med lav tilhæftning med supplerende epidermal vækstfaktor (EGF) / basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF). Neurospheres blev podet på poly-D-lysin / laminin-coatet vævskulturplast og dyrket i en gliogen cocktail indeholdende p-heregulin, bFGF og blodpladeafledt vækstfaktor (PDGF) til dannelse af Schwann-cellelignende celler (SCLC'er). SCLC'er blev rettet mod skæbneforpligtelse via dyrkultur i 2 uger med rensede dorsalrotganglia (DRG) neuroner opnået fra E14-15 gravid Sprague Dawley rotter. Modne Schwann-celler viser persistens i S100p / p75-ekspression og kan danne myelin-segmenter. Celler dannet på denne måde har potentiale aPlikationer i autolog celletransplantation efter rygmarvsskade såvel som i sygdomsmodellering.
Introduction
Transplantationen af neurale progenitorer og deres derivater demonstrerer løfte som en behandlingsstrategi efter traumatisk nerveskade 1 , 2 og neurodegenerering 3 , 4 . Før klinisk anvendelse er det vigtigt at sikre: i) en metode til at få adgang til og udvide en autolog kilde til stamceller / stamceller og ii) et middel til at lede dem til relevante modne celletyper 3 . Vores interesse for celleterapi for rygmarvsskade fik os til at søge en robust autolog cellekilde af neurale progenitorer fra voksne væv.
En subpopulering af MSC'er stammer fra neuralkammen og er let tilgængelig fra marvhulen. Disse celler er neurale progenitorer, der kan generere neuroner og glia 5 . Dyrmodeller af cerebral iskæmi viser, at hypoxi fremmer prolinen Iferation og multipotens af neurale progenitorer i hjernen 6 . Dette var grundlaget for at udnytte hypoxisk forkonditionering som et middel til at ekspandere på margenafledte neurale progenitorer.
Transplantationen af Schwann-celler i den skadede rygmarv fremmer regenerering 2 . SCLC'er kan genereres fra MSC'er ved hjælp af supplering med gliogene faktorer ( dvs. P-Heregulin, bFGF og PDGF-AA), men demonstrerer fænotypisk ustabilitet. Ved tilbagetrækning af vækstfaktorer vender de tilbage til en fibroblastlignende fænotype 7 . Fænotypisk ustabilitet er uønsket ved celletransplantation på grund af risikoen for afvigende differentiering og carcinogenese. Da Schwann-celleprecursorer er associeret med axonbundler inden for den embryonale perifere nerve 8 , blev vi ført til coculture-SCLC'er med oprensede embryonale DRG-neuroner 7 ,Ass = "xref"> 9. Resulterende modne Schwann-celler er skæbneforpligtede og demonstrerer funktion in vitro 7 , 9 og in vivo 10 .
Vores protokol til berigelse af neurale progenitorer fra MSC'er er enkel og effektiv og resulterer i en stigning i celleantal til efterfølgende analyser. Afledningen af skæbnebegyndte Schwann-celler via coculture-platformen muliggør undersøgelse af glialdifferentiering og generering af stabile og funktionelle Schwann-celler til potentiel klinisk anvendelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer involveret dyr blev udført i nøje overensstemmelse med NIH Guide for pleje og brug af laboratoriedyr og godkendt af Udvalget for Anvendelse af Levende Dyr til Undervisning og Forskning, Li Ka Shing Medicinsk Fakultet, Hongkong Universitet. Humane knoglemarvsprøver blev opnået fra iliac crest af sunde donorer efter at have opnået informeret samtykke. Protokoller blev godkendt af Institutional Review Board, University of Hong Kong.
1. Fremstilling af rotte-MSC-kulturer
- Harvest af MSC'er fra lårbenet
- Autoklaver alle dissektionsværktøjer ( fx dissekerende saks, stumpstikkede skærse og tandpinde) ved 180 ° C i mindst 2 timer før brug.
- Forbered MSC vækstmedium bestående af minimal essentiel medium alfa modifikation (αMEM) suppleret med 15% føtalt bovint serum (FBS) og penicillin / streptomycin (P / S, 1% v / v).
- Offer unge Sprague Dawley rotter (200-250 g legemsvægt) ved overdosering med pentobarbiton (240 mg / kg legemsvægt, intraperitoneal).
BEMÆRK: Marveprøver fra forskellige rotter skal behandles separat. - Placer de ofrede dyr i liggende stilling. Rengør deres underliv og underbenene grundigt med 70% ethanol.
- Fjern hud og subkutant væv over mediale lår ved hjælp af fint dissekerende saks og tang. Fjern lårmusklerne periferisk indtil lårbenet er udsat. Fortsæt dette proximalt og distalt indtil knæ og hofte led er set. Diskuter lårbenet gennem hofte- og knæleddet ved hjælp af trukket skære saks.
BEMÆRK: Overfør ikke lårbenet for at udsætte marvhulen på dette stadium. Overfør intakte lårbener til en laminar flow vævskulturhætte til videre behandling. - Brug stump tippet skære saks for at transektere de distale og proksimale ender af lårbenet gennem metafysen.
- Anbring en 70 μm cellesilinder over et 50 ml konisk rør. Indsæt en 21 G, 10 ml sprøjte indeholdende phosphatpufret saltopløsning (PBS, 10 mM Na 2 HPO 4 , pH 7,4) i den eksponerede lårgangskanal og skyll margenindholdet i det koniske rør ved gentagen skylning.
BEMÆRK: Ca. 20 ml PBS bruges til at skylle hver lårben. Hvis farven på det skyllede indhold forbliver blodfarvet og uklart, kan et større volumen anvendes. - Opsaml cellerne ved centrifugering ved 480 xg i 5 minutter. Kassér supernatanten. Resuspender cellepelleten i 10 ml MSC vækstmedium. Plader cellerne på en 10 cm vævskulturskål. Placer vævskulturskålene i en celleinkubator (37 ° C, 5% CO2). Optag den første dag for plating som dag 0.
BEMÆRK: Indstil bremsen i alle trin med centrifugering for maksimal deceleration.
- Etablering og udvidelse af MSC kolonier
BEMÆRK: Denne protokol rElier på vævskulturplasthæftning som et middel til at selektere for MSC'er inde fra marvhulen 11 . Benmärgsindholdet tillades at klæbe til vævskulturplastik i 2 dage.- På dag 2 skyl kulturpladerne tre gange med 10 ml PBS for at fjerne ikke-adhærente celler. Udskift PBS med 10 ml MSC vækstmedium efter skylning. Vask cellerne med PBS og genopfyld med MSC vækstmedium hver 3. dag.
BEMÆRK: MSC kolonier bør være synlige på dag 6-7 ( figur 2A ). - Passager cellerne om dagen 10 ved at fjerne vækstmediet og skylle cellerne med PBS. Tilsæt 1,5 ml rekombinant enzymatisk celledissociationsreagens og inkuber ved 37 ° C i 5 minutter. Tilsæt 3 ml MSC vækstmedium for at neutralisere reaktionen. Saml de adskilte celler ved centrifugering ved 250 xg i 5 minutter.
- Kvantificer cellerne i pelleten ved hjælp af et hæmocytometer efter en passende fortynding i PBS.
- Frøpassagerede celler ved en tæthed på 40.000 celler / cm2 i en 10 cm dyrkningsplade i MSC vækstmedium.
BEMÆRK: Rotte MSC'er skal nå 80-90% konfluens inden for 2 dage efter passage ( Figur 2B ). Celler kan passages som beskrevet i trin 1.2.2 for op til 8 passager. MSC'er kan karakteriseres ved hjælp af immuncytokemi og deres evne til trilineardifferentiering ( Figur 3 ) 12 . Kun MSC kulturer mellem passager 3 og 8 er genstand for efterfølgende hypoxisk forkonditionering og neurale progenitor berigelse. MSC'er med større passagenummer vedtager en udpladet morfologi ( figur 2C ) og producerer ikke tilstrækkeligt antal neurale progenitorer. Disse kulturer skal kasseres.
- På dag 2 skyl kulturpladerne tre gange med 10 ml PBS for at fjerne ikke-adhærente celler. Udskift PBS med 10 ml MSC vækstmedium efter skylning. Vask cellerne med PBS og genopfyld med MSC vækstmedium hver 3. dag.
2. Fremstilling af humane BMSC-kulturer
- Fortynd 1 ml humant knoglemarvs aspirat med 9 ml MSC vækstmedium og plad denCeller på en 10 cm vævskulturskål. Oprethold kulturerne i en celleinkubator (37 ° C, 5% CO2).
- Fjern mediet efter 2 dage og skyll forsigtigt dyrene tre gange med 10 ml PBS for at fjerne ikke-adhærente celler. Efter den sidste skylning fjernes PBS og erstattes med 10 ml MSC vækstmedium. Genopfyld vækstmediet efter hver 3 dages dyrkning efter PBS-skylningen.
BEMÆRK: MSC kolonier bør være synlige på dag 6-7. Antallet af kolonier kan variere mellem forsøgspersoner. - Passager cellerne på dag 10, som beskrevet i trin 1.2.2. Kvantificer cellerne i pelleten ved hjælp af et hæmocytometer efter en passende fortynding i PBS. Sæd de passagerede celler ved en tæthed på 40.000 celler / cm2 på en 10 cm dyrkningsplade i MSC vækstmedium.
BEMÆRK: Human MSCs ( Figur 2D ) viser en lignende morfologi til rotte-MSC'er og bør også nå 80-90% sammenflydelse inden for 2 dage efter passage. De burde være charaCterized ved hjælp af immuncytokemi og deres evne til trilineage differentiering 12 . Som med rotte-MSC'er er humane MSC'er, der er mellem passage 3 og 8, underkastet efterfølgende hypoxisk forkonditionering og neural progenitor berigelse.
3. Hypoksisk Forbehandling
- Afmonter hypoxikammerkomponenterne ( dvs. bund, låg, bakker) efter frigivelse af ringklemmen og tør de enkelte dele rent med 70% ethanol. Placer kammerkomponenterne i en laminær strøm vævskulturhætte til sterilisering under UV-lys i 15 min.
- Før hypoxisk forkonditionering, fjern mediet og skyll rotte- og humane MSC kulturer (sektioner 1 og 2) med 10 ml PBS. Udskift PBS med 10 ml MSC vækstmedium suppleret med 25 mM HEPES.
BEMÆRK: MSC'erne, der dyrkes på 10 cm skål, skulle have nået 80-90% konfluens før de bliver underlagt hypoxisk forkonditionering. - Placer culTure retter inden for hypoxiakammeret. Monter kammerkomponenterne igen og spænd ringklemmen. Spyl en gasblanding af 99% N2 / 1% O2 ind i kammeret ved en strømningshastighed på 10 l / min i 5 minutter.
- Sæt de forbindende ender af hypoxiakammeret for at sikre, at der ikke er gaslækage. Placer kammeret inde i celleinkubatoren (37 ° C, 5% CO2) i 16 timer.
- Efter afslutningen af den hypoxiske forkonditionering skal kulturerne fjernes fra kammeret til forberedelse af den efterfølgende neurale progenitor berigelse kultur.
4. Neural Progenitor Enrichment Culture
- Forbered neuroproduktmedium bestående af Dulbeccos modificerede ørnemedium / Ham's næringsblanding F12 (DMEM / F12) suppleret med B27 (2% v / v), basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF, 20 ng / ml), epidermal vækstfaktor (EGF, 20 ng / ml) og P / S (1% v / v).
- Fjern de hypoxiske forkonditionerede rotte / humane MSC'er som beskrevet i trin 1.2.2.Saml de adskilte celler ved centrifugering ved 250 xg i 5 minutter. Kvantificer cellerne i pelleten ved hjælp af et hæmocytometer efter passende fortynding i PBS.
- Resuspender cellerne i neurale progenitormedium og frø på low-attachment, 6-brøndsplader med en densitet på 6.000 celler / cm2. Anbring kulturen i en celleinkubator (37 ° C, 5% CO2) i 12 dage. Genopfyld 75% af det neurale progenitormedium hver 3. dag.
BEMÆRK: Større ikke-vedhæftede celleklynger bør overholdes på dag 6-7. På dag 10-12 kan neurospherer med en diameter ≥ 100 μm observeres ( figur 4 ). Hypoksiske prækonditionerede MSC'er bør give flere neurosfærer sammenlignet med MSC'er dyrket under normoxiske forhold 9 . - Saml neurospheres på dag 12 ved at aspirere dem i en 10 ml pipette og overføre dem til et 15 ml konisk rør. Centrifug neurosfærerne ved 250 xg i 5 minutter.
BEMÆRK: Neurospheres kan væreKarakteriseret på dag 12 for neurale progenitor markører, såsom nestin og GFAP 7 .
5. Generering af skæbnebegyndte Schwann-celler via kulturen med DRG-neuroner
- Fremstilling af rensede DRG-neuroner af råtta
- Autoklaver alle dissektionsværktøjer ( dvs. dissektionssaks, pincet, to mikrodissektionstænger og mikrodissektionssaks) ved 180 ° C i mindst 2 timer før brug.
- Coat 6-brønds vævskulturplader med poly-D-lysin (PDL, 10 μg / ml i PBS) ved 4 ° C natten over. Fjern PDL og skyll med 1,5 ml PBS pr. Brønd.
- Fortsæt med coating af pladerne med laminin (10 μg / ml i PBS) ved 37 ° C i 2 timer. Skyl pladerne med 1,5 ml PBS pr. Brønd.
- Forbered DRG neuron vedligeholdelsesmedium, der består af neurobasalt medium suppleret med B27 (2% v / v), L-glutamin (1% v / v), nervevækstfaktor (NGF, 20 ng / ml) og P / S % V / v).
- Forbered DRG-neuronrensningsmedium, der består af neurobasalt medium suppleret med B27 (2% v / v), L-glutamin (1%), NGF (20 ng / ml), P / S (1%), fluorodeoxyuridin (FDU, 10 Μg / ml) og uridin (10 μg / ml).
- Offer gravide rotter ved svangerskabsdag 14-15 ved pentobarbital overdosering (240 mg / kg legemsvægt, intraperitoneal).
- Placer de ofrede dyr i liggende stilling. Rens deres mave grundigt med 70% ethanol.
- Skær dyrets nedre abdominalvæg i længderetningen ved hjælp af fint dissekerende saks og tang. Identificer og fjern livmoderen ved hjælp af dissektionssaks. Skær livmodervæggen for at eksponere og udtrække embryonerne. Overfør embryonerne til en steril, 10 cm kulturskål fyldt med PBS. Placer kulturskålen på is.
- Overfør embryonet beregnet til dissektion til en steril, 10 cm kulturskål fyldt med PBS (stuetemperatur) og position den under et dissektionsmikroskop. Fød embryoen i tilbøjelig stilling.
IKKEE: Den hvide rygmarv og de vedhæftede DRG'er kan ses over det dorsale aspekt af embryoet gennem dets gennemskinnelige hud. - Indsæt microdissecting tang på hver side af rygmarven og brug stump dissektion til at begynde at adskille rygmarven fra det omgivende blødt væv. Skær rygmarven fri fra dyret ved hjælp af mikrodissekteringstænger langs halsåbningen og halen. Udfør yderligere stump dissektion over det ventrale aspekt af ledningen for at frigøre det fra det omgivende blødt væv.
- Brug microdissecting tang til at fjerne resterende blødt væv over det dorsale aspekt af den frigjorte rygmarv.
BEMÆRK: På dette stadium bør kun rygmarv, nerve rødder og vedhæftet DRG forblive. - Afmonter individuelle DRG'er fra deres forbindende nerve rødder ved hjælp af microdissecting tang. Brug en pipettepen fastgjort til en 1 ml spids for at overføre DRG'erne til et 1,5 ml sterilt centrifugerør indeholdende PBS.
BEMÆRK: For hvert 1,5 ml rør, maksimalt100 DRG'er kan indkvarteres. - Centrifuger DRG'erne ved 250 xg i 5 minutter og resuspender dem i rekombinant enzymatisk celledissociationsreagens (200 μl pr. Rør). Inkuber (37 ° C, 5% CO2) i 10 min. Centrifuger DRG'erne ved 250 xg i 5 minutter, fjern supernatanten og resuspender i DRG neuron vedligeholdelsesmedium. Dissocér pelleten ved forsigtig triturering ved anvendelse af en 200 μl pipettespids. Kvantificer cellerne i pelleten ved hjælp af et hæmocytometer efter en passende fortynding.
- Sæd cellerne ved en tæthed på 5.000 celler / cm2 i PDL / laminincoated 6-brøndsplader i 1,5 ml DRG neuron vedligeholdelsesmedium pr. Brønd. Efter to dages dyrkning, fjern DRG neuron vedligeholdelsesmediet, skyll med PBS og erstat med DRG neuron rensningsmedium.
BEMÆRK: For hver rensningscyklus behandler DRG-kulturerne med rensningsmedium i 2 dage efterfulgt af 1 inkubationsdag i vedligeholdelsesmedium. Efter 3-4 rensningscykler, remmenOval af all endogen glia forventes 7 . Dette bør tage cirka 14 dage. Oprensede kulturer tester positive for neuronmarkøren TUJ1 og er fraværende for S100β-ekspression ( Figur 5 ).
- Generering af Schwann-cellelignende celler
- Fremstil glial induktionsmedium bestående af aMEM suppleret med p-heregulin (100 ng / ml), bFGF (10 ng / ml), blodpladeafledt vækstfaktor (PDGF-AA, 5 ng / ml), FBS (10%) og P / S (1% v / v).
- Plade neurosfærerne fremstillet i afsnit 4 i PDL / laminin-coatede 6-brøndsplader med en tæthed på 5-10 sfærer pr cm2 i 1,5 ml glial induktionsmedium pr. Brønd. Udskift glial induktionsmedium hver 2. dag efter skylning af cellerne med PBS.
BEMÆRK: Celler fra podede neurospherer ses at migrere udadtil ved dag 2. I dag 7 har migrerende celler et konisk udseende og skulle demonstrere immunopositivitet for Schwann-cellenMarkører p75 neurotrophin receptor (p75) og S100β7. Disse celler benævnes SCLC'er.
- Kokultur af SCLC'er med DRG-neuroner
- Forbered coculture medium bestående af DRG neuron vedligeholdelsesmedium (trin 5.1.4) og glial induktionsmedium (trin 5.2.1) ved et volumenforhold mellem 1: 1 og volumen.
- Fremstil Schwann-cellevedligeholdelsesmedium bestående af DMEM / F12 suppleret med FBS (5%), P-Heregulin (10 ng / ml) og P / S (1% v / v).
- Fjern kulturmediet fra dag 7 SCLC'er, skyll dem med PBS og inkuber dem med 0,5 ml / brønd af rekombinant enzymatisk celledissociationsreagens ved 37 ° C i 5 minutter. Resuspendere SCLC'erne i coculture medium.
- Kvantificere cellerne ved hjælp af en hæmocytometer efter en passende fortynding.
- Sæd SCLC'erne på rensede DRG-neuronkulturer ved en tæthed på 1000 celler / cm2. Oprethold kulturerne i 14 dage, med mellemlang udskiftning hver anden dag.
BEMÆRK: Under coculture erhvervede SCLC'er den spindellignende morfologi, der er typisk for modne Schwann-celler ( figur 6 ). Disse celler fortsætter i deres fænotype efter tilbagetrækning af vækstfaktorer og er i stand til at myelinere axoner in vitro og in vivo 7 , 10 . Positiviteten af Schwann-celle markører ( dvs. p75 og S100β) bør overvåges ved immunofluorescens. - Efter færdiggørelse af coculture er passage-begærede Schwann-celler, som beskrevet i trin 1.2.2. Brug 0,5 ml dissocieringsreagens pr. Brønd. Kvantificere cellerne ved hjælp af en hæmocytometer efter en passende fortynding.
- Resuspenge skæbne-forpligtede Schwann-celler i Schwann-cellevedligeholdelsesmedium ved en tæthed på 10.000 celler / cm2. Frøceller i PDL / laminincoated 6-brønds plader til immunofluorescens.
BEMÆRK: Coculturer indeholder uundgåeligt MSC'er, som har vedtaget en fibroblastCelle skæbne 7 . Disse celler passerer sammen med skæbne-engagerede Schwann-celler ved afslutningen af kulturen. Schwann-celler, som ligger oven på dette fibroblast-underlag, kan let løsnes og udvides yderligere efter skylning med "kold stråler" af PBS (4 ° C) som beskrevet andetsteds 13 . Skæbnebegrænsede Schwann-celler kan udvides i vedligeholdelsesmedium i 1 måned.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En oversigt over nøglefaser i vores protokol er illustreret i figur 1 . Sammenfattende udvælges rotte- og humane MSC'er ved vedhæftning til vævskulturplastik. Udvidede MSC'er er forbehandlet med hypoxi og udsættes derefter for neurosfæredannende tilstande. Neurospheres er belagt og tilladt at differentiere i SCLC'er. SCLC'er kultiveres med oprensede DRG-neuroner for at generere skæbnebegyndte Schwann-celler.
Morfologien af dyrkede rotter og humane MSC'er er illustreret i figur 2 . Deres sunde koniske morfologi er vist i modsætning til det firkantede udseende af MSC'er, der opretholdes for høje passageantal, som har mistet deres multipotensitet. Udvidede rotter og humane kolonier bør demonstrere ekspressionen af MSC markører, et fravær af hæmatopoietiske stamcelle markører og kapaciteten til trilineage difFerentiation ( figur 3 ). Friske MSC'er fra mellem passager 3 og 8 er underkastet hypoxisk forkonditionering i 16 timer og passeres derefter til dyrkningsplader med lav adhærens med EGF / bFGF-tilskud. Hypoksisk forkonditionering resulterer i større antal neurospherer, såvel som større gennemsnitlige neurosfærstørrelser ( Figur 4 ).
Neurospheres pletteres på PDL / laminin-belagte kulturplader og induceres til at blive SCLC'er ved dyrkning i glial induktionsmedium indeholdende P-Heregulin, bFGF og PDGF-AA. SCLC'er udviser den karakteristiske koniske morfologi af Schwann-celler og den tilsvarende markørekspression, men de er fænotypisk ustabile og vender tilbage til en fibroblastfænotype ved afbrydelsen af vækstfaktorer
Kokultur med sensoriske neuroner er en forudsætning for at tilvejebringe en celle-intrinsisk swKløe til skæbne forpligtelse. Oprettelsen af rensede DRG-netværk opnås ved hjælp af pulserende behandling med FDU og uridin for at fjerne endogent glia og bør bekræftes ved fravær af S100β-immunopositivitet ( Figur 5 ). På dag 7 passeres SCLC'er og dyrkes med oprensede DRG-neuroner i 14 dage ( figur 6 ). Efter færdiggørelsen af kultursektoren bør modne, skæbnebegyndte Schwann-celler fremstå.
Figur 1: Oversigt over protokollen. Benmärg er opnået fra enten rotter femur eller humant iliac crest aspirater. MSC'er fra knoglemarven kan vedhæfte og ekspandere på vævskulturplastik. For at berige for MSC'er med neuralt potentiale forkonditioneres cellerne i 1% 02 i 16 timer og passeres derefter til low adhesionskultur plAtes med bFGF / EGF supplementation. Dette resulterer i dannelsen af neurospherer, som er pletteret på PDL / laminincoated vævskulturplast og dyrket i glial induktionsmedium til dannelse af SCLC'er. SCLC'er passages og dyrkes med oprensede DRG-neuroner i 2 uger for at lede dem til modenhed. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Etablering af MSC kolonier. Større MSC-kolonier bør være synlige 6-7 dage efter pletteringen af knoglemarvsceller på vævskulturplast. Et repræsentativt billede af en rotte-MSC-koloni er vist ( A ), mens humane kolonier viser et lignende udseende. Kolonier kan passages på dag 10. Synes ved højere forstørrelse, både rotte (B ) og humane ( D ) MSC'er udviser en karakteristisk fibroblastlignende morfologi efter passage. MSC'er, der opretholdes for høje passage numre, erhverver en flad, firkantet morfologi ( C ) og bør kasseres. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Karakterisering af MSC'er. ( A - D ) Repræsentative billeder af menneskelige MSC'er. MSC'er kan karakteriseres ved udtryk for passende markører, såsom CD90 ( A ), CD73 ( B ) og Stro-1 ( C ) og ved fravær af hæmatopoietiske stamcellemarkører, såsom CD45 ( D ). ( E - G ) Rat MSC'er isoleret og ekspanderet som beskrevet i protokollen demonstrerer multipotens i deres evne til at danne adipocytter ( E ; fedtaflejringer farvet med Sudan Red), osteoblaster ( F ; pericellulær matrix farvet med Alizarin Red) og chondrocytter ( G ; proteoglycaner farvet med Safranin- O) under passende kulturbetingelser. Skalestænger = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Berigelse af neurale progenitorer fra MSC'er. Både rotte ( A ) og humane ( C ) MSC'er danner neurospherer, når de dyrkes ved vævskulturplast med lav adhesion i medium suppleret med EGF / bFGF. Numrene og gennemsnitsdiameteren af rotte (
Figur 5: Etablering af rensede rotte DRG-netværk. Oprensede DRG-netværk etableres efter pulserende behandling med de antimitotiske midler FDU og uridin (A). Neurit netværk, der er blottet for S100β-udtrykkende endogent glia (B), er klar til dyrkning med SCLC'er. Skalestænger = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Frembringelse af knoglemarvafledte Schwann-celler via dyrkultur med DRG-neuroner. Efter at have afsluttet 2 ugers dyrkning med oprensede DRG-neuroner og humane SCLC'er, fremkommer spindelformede, skæbne-engagerede Schwann-celler fra både normoxi- og hypoxiebehandlede grupper ( A og D ). Disse celler udtrykker Schwann-cellemarkørerne p75 (B og E) og S100β (C og F). Ekspression af humant nucleiantigen (HuNeu) demonstrerer, at de S100β-positive celler ikke forurenede glialceller stammende fra rotte-DRG'er. Skalestænger = 100 μm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er vigtigt at bevare MSC'ernes stivhed forud for berigelsen af neurale progenitorer via hypoxisk forkonditionering og neurosfærekultur. Ud fra vores erfaring kan multipotente MSC pålideligt identificeres af deres langstrakte fibroblastlignende morfologi. I modsætning hertil kan MSC'er, som har vedtaget en mere udpladet, firkantet morfologi med fremtrædende cytoskeletale stressfibre, ikke let vedtage neurale cellefates og bør kasseres. Generelt bruger vi ikke MSC'er med passage numre større end otte. For at bevare deres stilhed er det afgørende at straks passere MSC'er, før de når 100% sammenflydelse. Omvendt er opretholdelse af MSC'er ved en for lav sammenflugt uønsket. Ud fra vores erfaring sørger MSC'er med en tæthed på 40.000 celler / cm2 eller blot ved at passere celler, der er 80% konfluente i forholdet 1: 2, hvilket giver de bedste resultater.
Den korrekte etablering og vedligeholdelse af DRG-netværket er kritikerAl determinant af coculture succes. Den tid, der kræves til DRG-høst, bør opretholdes til et minimum. Individuelle ganglier skal behandles på en atraumatisk måde, især under frigørelse fra rygmarven, når det er bedst kun at håndtere nerve rødderne. Generelt stræber vi efter en periode på mindre end 2 timer mellem dyretid og den enzymatiske fordøjelse af høstede DRG'er som en langvarig høst resulterer i vævsmaceration og tabet af cellelevedygtighed. Afmontering af DRG-neuroner fra substratet under dyrkningen opstår ofte. For at forhindre dette forekommer overtræket frisk tilberedt og udføres nær tidspunktet for vævshøst. Generelt løsner store, ufordøjede DRG-klynger oftere og giver ikke coculture succes. Varigheden af enzymatisk fordøjelse og mængden af triturering kan justeres med det formål at opnå et netværk med et udseende, der ligner figur 5 .
Mens vores cocuDenne platform skaber konsekvent skæbneforpligtelse, kun 20-30% af de kulturer, der udføres parallelt med skæbneforløbne Schwann-celler 7 , 13 . Vi forbereder derfor nok DRG'er og SCLC'er til samtidig at udføre kulturer i tre til fire 6-brønds kulturplader. Vi antager, at en kombination af faktorer relateret til det underliggende DRG-netværk, herunder deres embryonalder, celle levedygtighed, densitet og topografi, påvirker coculture succes. Disse underliggende variabler skal undersøges og standardiseres yderligere. Bortset fra begrænsninger i dyrkningsudbyttet bør der søges et middel til at erstatte kravet til rotterafledte DRG-neuroner og animalske produkter. Endvidere bør protokolens varighed forkortes. Som en forkortet modifikation af vores protokol har vi haft succes med at udlede modne Schwann-celler fra dag 10 neurospherer podet direkte på rensede DRG-neuroner uden forudgående generation af SCLC'er , 10 .
Neurospherer beriget via vores metode tjener som en robust kilde til celler af neuronale og glial lineages. Vores platform til at styre precursorceller til skæbneforpligtelser har den fordel at undgå genetisk manipulation med sine iboende risici, og de resulterende celler er relevante for celletransplantation, sygdomsmodellering og undersøgelsen af glialdifferentiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere af dette manuskript har ingen oplysninger om at erklære.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende Dr. Nai-Sum Wong for at levere hypoxiakammerapparatet og fru Alice Lui til den tekniske support.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| αMEM | Sigmaaldrich | M4526 | |
| DMEM/F12 | Thermofisher scientific | 12400-024 | |
| Neurobasal medium | Thermofisher scientific | 21103-049 | |
| FBS | Biosera | FB-1280/500 | |
| B27 | Thermofisher scientific | 17504-001 | |
| Epidermal growth factor (EGF) | Thermofisher scientific | PHG0313 | |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | 100-18B/100UG | |
| Nerve growth factor (NGF) | Millipore | NC011 | |
| Platelet-derived growth factor-AA (PDGF-AA) | Peprotech | 100-13A | |
| Heregulin beta-3, EGF domain (β-Her) | Millipore | 01-201 | |
| Uridine | Sigmaaldrich | U3003 | |
| 5-Fluro-2' - deoxyuridine (FDU) | Sigmaaldrich | F0503 | |
| Poly-D-lysine (PDL) | Sigmaaldrich | P7886-1G | |
| Laminin | Thermofisher scientific | 23017015 | |
| GlutaMAX | Thermofisher scientific | 35050061 | |
| Penicillin / streptomycin (P/S) | Thermofisher Scientific | 15140-122 | |
| TrypLE Express | Thermofisher Scientific | 12604-013 | |
| 10 cm plate for adherent culture | TPP | 93100 | Used for selection of MSCs by tissue culture adherence |
| 6-well plate for adherent culture | TPP | 92006 | Used for expansion of MSCs following passaging |
| UltraLow 6-well plate for non-adherent culture | Corning | 3471 | Used for neural progenitor enrichment |
| anti-human CD90(Thy-1) | BD Biosciences | 555593 | |
| anti-human CD73 | BD Biosciences | 550256 | |
| anti-human/rat STRO-1 | R&D Systems | MAB1038 | |
| anti-human nestin | R&D Systems | MAB1259 | |
| anti-human CD45 | BD Biosciences | 555480 | |
| anti-rat CD90(Thy-1) | BD Biosciences | 554895 | |
| anti-rat CD73 | BD Biosciences | 551123 | |
| anti-rat nestin | BD Biosciences | MAB1259 | |
| anti-rat CD45 | BD Biosciences | 554875 | |
| Anti-S100β | Dako | Z031101 | |
| Anti-p75 | Millipore | MAB5386 | |
| Anti-GFAP | Sigmaaldrich | G3893 | |
| Anti-Class III-beta tubulin (Tuj-1) | Covance | MMS-435P | |
| Anti-Human nuclei | Millipore | MAB1281 | |
| Hypoxia chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 | |
| HEPES buffer | Sigmaaldrich | H4034-100G |
References
- Wiliams, R. R., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation: a repair strategy for spinal cord injury? Prog Brain Res. 201, 295-312 (2012).
- Kanno, H., Pearse, D. D., Ozawa, H., Itoi, E., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation for spinal cord injury repair: its significant therapeutic potential and prospectus. Rev Neurosci. 26 (2), 121-128 (2015).
- Lindvall, O., Kokaia, Z. Stem cells in human neurodegenerative disorders--time for clinical translation? J Clin Invest. 120 (1), 29-40 (2010).
- Terzic, D., et al. Directed Differentiation of Oligodendrocyte Progenitor Cells From Mouse Induced Pluripotent Stem Cells. Cell Transplant. 25 (2), 411-424 (2016).
- Takashima, Y., et al. Neuroepithelial cells supply an initial transient wave of MSC differentiation. Cell. 129 (7), 1377-1388 (2007).
- Felling, R. J., et al. Neural stem/progenitor cells participate in the regenerative response to perinatal hypoxia/ischemia. J Neurosci. 26 (16), 4359-4369 (2006).
- Shea, G. K., Tsui, A. Y., Chan, Y. S., Shum, D. K. Bone marrow-derived Schwann cells achieve fate commitment--a prerequisite for remyelination therapy. Exp Neurol. 224 (2), 448-458 (2010).
- Jessen, K. R., Mirsky, R. The origin and development of glial cells in peripheral nerves. Nat Rev Neurosci. 6 (9), 671-682 (2005).
- Mung, K. L., et al. Rapid and efficient generation of neural progenitors from adult bone marrow stromal cells by hypoxic preconditioning. Stem Cell Res Ther. 7 (1), 146 (2016).
- Ao, Q., et al. The regeneration of transected sciatic nerves of adult rats using chitosan nerve conduits seeded with bone marrow stromal cell-derived Schwann cells. Biomaterials. 32 (3), 787-796 (2011).
- Tondreau, T., et al. Isolation of BM mesenchymal stem cells by plastic adhesion or negative selection: phenotype, proliferation kinetics and differentiation potential. Cytotherapy. 6 (4), 372-379 (2004).
- Baksh, D., Song, L., Tuan, R. S. Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. J Cell Mol Med. 8 (3), 301-316 (2004).
- Jirsova, K., Sodaar, P., Mandys, V., Bar, P. R. Cold jet: a method to obtain pure Schwann cell cultures without the need for cytotoxic, apoptosis-inducing drug treatment. J. Neurosci. Methods. 78 (1-2), 133-137 (1997).
