Summary
תאים מוחיים סטרומליים (MSC) עם פוטנציאל עצבי קיימים בתוך מוח העצם. הפרוטוקול שלנו מעשיר אוכלוסייה זו של תאים באמצעות תנאים מוקדמים היפוקסי ולאחר מכן מפנה אותם להפוך לתאי Schwann בוגרת.
Abstract
כתב יד זה מתאר אמצעי להעשרתם של אבות עצביים מאוכלוסיית תאי החלב (MSC) ולאחר מכן להפנותם אל גורל התא הבוגר של שוואן. ערכנו חולדות וחולי סרטן אנושיים לתנאים היפוקסיים חולפים (חמצן של 1% ל -16 שעות), ולאחר מכן התרחבות כנוירוספרה על מצע נמוך עם גורם גדילה של אפידרמיס (EGF) / תוספת גורמי גידולי פיברובלסטים בסיסיים (bFGF). Neurospheres היו seeded על פולי-D- ליזין / laminin מצופה רקמה תרבות פלסטיק ו מתורבת בקוקטייל gliogenic המכיל β-Heregulin, bFGF, ו טסיות הנגזרות גורם הצמיחה (PDGF) לייצר תאים דמויי תא שוואן (SCLCs). SCLCs היו מופנים למחויבות הגורל באמצעות coculture במשך 2 שבועות עם נוירונים השורש הגבי מטוהרים (DRG) נוצרים המתקבלים E14-15 הרות חולדה Sprague Dawley. תאים בשלה שוואן להוכיח התמדה ביטוי S100β / p75 ויכול ליצור קטעי myelin. תאים שנוצרו באופן זה יש פוטנציאל אPplications ב השתלת תאים אוטולוגיים בעקבות פגיעה בחוט השדרה, כמו גם דוגמנות המחלה.
Introduction
השתלת אבות עצביים ונגזרותיהם מדגימה את ההבטחה כאסטרטגיה טיפולית בעקבות פגיעה עצבית טראומטית 1 , 2 ונוירוגנרטיון 3 , 4 . לפני היישום הקליני, זה חיוני כדי להבטיח: א) שיטה לגישה והרחבה על מקור אוטולוגי של גזע / תאים אב ו 2) אמצעי לכוון אותם סוגי תאים רלוונטיים, בוגרת 3 . ההתעניינות שלנו בטיפול בתאי פציעה בחוט השדרה הובילה אותנו לחפש מקור תא אוטולוגי חזק ואבולוצי של אבות עצביים ברקמות של מבוגרים.
תת אוכלוסיות של MSC מקורן בכף עצבי, והוא נגיש בקלות מחלל המפרק. תאים אלה הם אבות עצביים שיכולים ליצור נוירונים וגליה 5 . מודלים של בעלי חיים של איסכמיה מוחית מראים כי היפוקסיה מקדמת את ההרגעה Iferation ו multipotency של אבות עצביים בתוך המוח 6 . זה היה הבסיס לשימוש התנאי היפוקסי כאמצעי להרחבת על אבות עצביים הנגזרים על מוח.
השתלת תאי Schwann לתוך חוט השדרה הפצוע מקדם התחדשות 2 . SCLCs ניתן לייצר MSCs באמצעות תוספת עם גורמים gliogenic ( כלומר, β-Heregulin, bFGF, ו PDGF-AA), אבל להפגין יציבות פנוטיפית. עם הנסיגה של גורמי גדילה, הם לחזור פנוטיפ דמוי fibroblast 7 . אי-יציבות פנוטיפית אינה רצויה בהשתלות תאים בשל הסיכון של הבחנה חריגה וסרטן. כמו מבשרי התא Schwann קשורות עם צרורות האקסון בתוך העצב ההיקפי עובריים 8 , הובילו cLCulture coculture עם נוירונים DRG מטוהרים עובריים 7 ,התחת = "xref"> 9. תאים בוגרת שוואן בשלבים הם גורל מחויבים להפגין פונקציה במבחנה 7 , 9 ו in vivo 10 .
הפרוטוקול שלנו להעשרת אבות עצביים מ MSC הוא פשוט ויעיל ותוצאות גידול במספר התא עבור מבחני הבאים. הגזירה של תאי גורן מחויבים באמצעות פלטפורמת coculture מאפשר לימוד של הבדל גלייה ועל הדור של תאים שוואן יציבה ופונקציונלית עבור יישומים קליניים פוטנציאליים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים הקשורים לבעלי חיים בוצעו בהתאם קפדנית עם המדריך NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ואושרה על ידי הוועדה לשימוש בבעלי חיים להוראה ולחקר, הפקולטה לרפואה של אוניברסיטת קה-שינג, אוניברסיטת הונג קונג. דגימות מוח העצם של האדם התקבלו מהכסף האיליאק של התורמים הבריאים לאחר קבלת הסכמה מדעת. הפרוטוקולים אושרו על ידי המוסד לביקורת מוסדית, אוניברסיטת הונג קונג.
1. הכנת תרבויות MSC עכברוש
- קציר של MSCs מן הירך
- החיטוי כל כלי לנתיחה ( כלומר, מספריים לנתח בסדר , מספריים חיתוך קהה בוטה, ואת מלקחיים שיניים) ב 180 מעלות צלזיוס לפחות 2 שעות לפני השימוש.
- הכן בינוני MSC צמיחה המורכב מינימלי בינוני חיוניים - שינוי אלפא (αMEM) בתוספת 15% בסרום שור עוברית (FBS) ו פניצילין / סטרפטומיצין (P / S, 1% v / v).
- קרבן גברים צעירים Sprague Dawley חולדות (200-250 גרם bodyweight) על ידי מנת יתר pentobarbitone (240 מ"ג / ק"ג bodyweight, intraperitoneal).
הערה: דגימות מח עצם מעכברושים שונים יש לעבד בנפרד. - מניחים את הקרבנות במצב שכיבה. נקו את הבטן ואת הגפיים התחתונות ביסודיות עם אתנול 70%.
- הסר את העור ואת רקמות תת עורית על הירכיים המדיאלי באמצעות מספריים לנתח דק מלקחיים. הסר את שרירי הירך circumferentially עד עצם הירך נחשפת. המשך את זה באופן פרוקסימלי ודיסקלי עד הברכיים ואת מפרקי הירך נראים. לנטרל את עצם הירך דרך מפרק הירך והברכיים באמצעות מספריים חותך קהה.
הערה: אל תעביר את עצם הירך כדי לחשוף את חלל החלב בשלב זה. העברת עצם הירך שלם אל מכסה המנוע זרימת למינרית רקמה לעיבוד נוסף. - השתמש במספריים חותך קהה בוטה כדי transect את הקצוות דיסטלי ו הפרוקסימלי של עצם הירך באמצעות המטאפיזה.
- מניחים מסנן 70 מיקרומטר תא מעל צינור 50 מ"ל חרוטי. הכנס מזרק 21 G, 10 מ"ל המכיל פוספט שנאגרו מלוחים (PBS, 10 mM Na 2 HPO 4 , pH 7.4) לתוך תעלת הירך חשוף לשטוף את תוכן החץ לתוך צינור חרוטי על ידי שטיפה חוזרת.
הערה: כ 20 מ"ל של PBS משמש לשטוף כל עצם הירך. אם צבע של תוכן סומק נשאר מוכתם בדם עכירות, נפח גדול יותר ניתן להשתמש. - איסוף התאים על ידי צנטריפוגה ב XG 480 במשך 5 דקות. מחק את supernatant. Resuspend תא גלולה ב 10 מ"ל של מדיום צמיחה MSC. פלייט התאים על צלחת 10 ס"מ רקמה תרבותית. הציג את הכלים תרבות רקמות לתוך חממה תא (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ). רשום את היום הראשון של ציפוי כמו יום 0.
הערה: בכל השלבים הקשורים צנטריפוגה, להגדיר את הבלם עבור האטה מקסימלית.
- הקמה והרחבה של מושבות MSC
הערה: פרוטוקול זה rאליס על תרבות רקמות פלסטיק דבקות כאמצעי לבחור עבור MSCs מתוך חלל החוט 11 . תוכן מוח העצם מותר לדבוק תרבות פלסטיק רקמות במשך 2 ימים.- ביום 2, לשטוף את צלחות תרבות שלוש פעמים עם 10 מ"ל של PBS להסיר תאים שאינם חסיד. החלף את PBS עם 10 מ"ל של מדיום צמיחה MSC לאחר שטיפה. שטפו את התאים עם PBS ו לחדש עם בינוני MSC צמיחה כל 3 ימים.
הערה: מושבות MSC צריך להיות גלוי עד יום 6-7 ( איור 2 א ). - מעבר התאים על ידי יום 10 על ידי הסרת בינוני הצמיחה ושטיפת התאים עם PBS. הוסף 1.5 מ"ל של רקומביננטי האנזימטית תא דיסוציאציה מגיב ו דגירה על 37 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות. הוסף 3 מ"ל של מדיום צמיחה MSC לנטרל את התגובה. איסוף תאים מנותקים על ידי צנטריפוגה ב XG 250 במשך 5 דקות.
- לכמת את התאים בתוך גלולה באמצעות hemocytometer לאחר דילול המתאים PBS.
- זרעים תאים passaged בצפיפות של 40,000 תאים / ס"מ 2 לתוך צלחת 10 ס"מ תרבות בינוני MSC צמיחה.
הערה: MSCs עכברוש צריך להגיע מפגש 80-90% בתוך 2 ימים של passaging ( איור 2 ב ). תאים ניתן passaged כמתואר בשלב 1.2.2 עד 8 מעברים. MSCs יכול להיות מאופיין באמצעות אימונוכיטוכימיה ואת יכולתם של בידול הטרילוג '( איור 3 ) 12 . רק תרבויות MSC בין מעברים 3 ו - 8 כפופים להתקדמות היפוקסית הבאים העשרה העשרה עצבית. MSCs של מספר המעבר גדול לאמץ מורפולוגיה שטוח ( איור 2 ג ) ולא לייצר מספר מספיק של אבות עצביים. תרבויות אלה יש להשליך.
- ביום 2, לשטוף את צלחות תרבות שלוש פעמים עם 10 מ"ל של PBS להסיר תאים שאינם חסיד. החלף את PBS עם 10 מ"ל של מדיום צמיחה MSC לאחר שטיפה. שטפו את התאים עם PBS ו לחדש עם בינוני MSC צמיחה כל 3 ימים.
2. הכנת תרבויות BMSC אנושיות
- לדלל 1 מ"ל של מח עצם האדם לשאוב עם 9 מ"ל של המדיום MSC צמיחה צלחתתאים על צלחת 10 ס"מ רקמה תרבות. לשמור על התרבויות בתא חממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ).
- הסר את המדיום לאחר 2 ימים ולשטוף בעדינות את התרבויות שלוש פעמים עם 10 מ"ל של PBS כדי להסיר תאים חסיד. לאחר שטיפה הסופי, להסיר את PBS ולהחליף אותו עם 10 מ"ל של מדיום צמיחה MSC. Replenish בינוני הצמיחה לאחר כל 3 ימים של תרבות לאחר שטיפת PBS.
הערה: מושבות MSC צריך להיות גלוי עד יום 6-7. מספר המושבות עשוי להשתנות בין נושאים. - מעבר התאים ביום 10, כמתואר בשלב 1.2.2. לכמת את התאים בתוך גלולה באמצעות hemocytometer לאחר דילול המתאים PBS. זרע תאים passaged בצפיפות של 40,000 תאים / ס"מ 2 על צלחת 10 ס"מ תרבות בינוני MSC צמיחה.
הערה: MSCs האדם ( איור 2 ד ) להפגין מורפולוגיה דומה חולדה MSCs וכן צריך להגיע מפגש 80-90% בתוך 2 ימים של passaging. הם צריכים להיות charaCterized באמצעות אימונוציטוכימיה ואת יכולתם של בידול. כמו MSCs חולדה, MSCs אנושיים כי הם בין המעבר 3 ו 8 כפופים מראש hypoxic מראש והעשרה העשרה עצבית.
3. תנאים מוקדמים היפוקסיים
- לפרק את רכיבי היפוקסיה קאמרית ( כלומר, בסיס, מכסה, מגשים) לאחר שחרור מהדק טבעת ולנגב חלקים בודדים נקיים עם אתנול 70%. מניחים את הרכיבים קאמרית בתוך מכסה המנוע זרימת למינרית רקמה סטריליזציה תחת אור UV במשך 15 דקות.
- לפני מראש hypoxic, להסיר את המדיום ולשטוף את עכברוש האדם MSC תרבויות (סעיפים 1 ו -2) עם 10 מ"ל של PBS. החלף את PBS עם 10 מ"ל של מדיום צמיחה MSC בתוספת 25 HEPES מ"מ.
הערה: MSCs מתורבת על 10 ס"מ צלחות צריך להגיע 80-90% confluency לפני להיות כפוף לתנאי היפוקסית. - מניחים את culTure מנות בתוך החדר היפוקסיה. להרכיב את המרכיבים קאמרית להדק את הטבעת טבעת. שטוף תערובת גז של 99% N 2 /1% O 2 לתוך החדר בקצב זרימה של 10 L / min במשך 5 דקות.
- חותם את הקצוות המחוברים של החדר היפוקסיה כדי להבטיח שאין דליפת גז. מניחים את החדר בתוך חממה תא (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ) במשך 16 שעות.
- עם השלמת מראש hypoxic, להסיר את התרבויות מן החדר כהכנה לתרבות העשרה העצב הבא.
4. תרבות העצבים העשרה תרבות העשרה
- הכנת המדיום העצבתי המורכב ממגוון הנשר המשוקלל של Dulbecco / F12 (DMEM / F12) בתוספת B27 (2% v / v), גורם גדילה בסיסי בפיברובלסטים (bFGF, 20 ng / mL), גורם גדילה באפידרמיס (EGF, 20 ng / mL), ו- P / S (1% v / v).
- לנתק את עכבר מראש hypoxic / MSCs האדם, כמתואר בשלב 1.2.2.איסוף תאים מנותקים על ידי צנטריפוגה ב XG 250 במשך 5 דקות. לכמת את התאים בתוך גלולה באמצעות hemocytometer לאחר דילול המתאים PBS.
- Resuspend התאים במדיום אב עצביים וזרע על מצורף נמוך, 6-גם צלחות בצפיפות של 6,000 תאים / ס"מ 2 . מניחים את התרבות חממה תא (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ) במשך 12 ימים. Replenish 75% של המדיום העצבתי כל 3 ימים.
הערה: גודלי התא שאינם חסידים לא נצרכים יש לשמור על ידי 6-7 יום. ביום 10-12, neurospheres עם קוטר ≥ 100 מיקרומטר ניתן לראות ( איור 4 ). היפוקסי מותנה מראש MSCs צריך לייצר יותר neurospheres לעומת MSCs מתורבת בתנאים נורמקסית 9 . - איסוף neurospheres ביום 12 על ידי aspirating אותם לתוך פיפטה 10 מ"ל והעברתם צינור 15 חרוטי מ"ל. צנטריפוגה neurospheres ב 250 xg במשך 5 דקות.
הערה: Neurospheres יכול להיותהמאופיינת ביום 12 עבור סמנים עצביים, כגון nestin ו- GFAP 7 .
5. הדור של גורל- Schwann תאים באמצעות Coculture עם נוירונים DRG
- הכנת נוירונים עכברוש DRG מטוהרים
- החיטוי כל כלי לנתיחה ( כלומר מספריים לנתיחה, מלקחיים, שני מלקחיים microdissection, ומספריים microdissecting) ב 180 מעלות צלזיוס למשך לפחות 2 שעות לפני השימוש.
- מעיל 6-גם תרבות רקמות צלחות עם פולי- D- ליזין (PDL, 10 מיקרוגרם / מ"ל PBS) ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. הסר את PDL ולשטוף עם 1.5 מ"ל של PBS לכל טוב.
- להמשיך בציפוי צלחות עם laminin (10 מיקרוגרם / מ"ל ב PBS) ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. שוטפים את הצלחות עם 1.5 מ"ל של PBS לכל טוב.
- הכן בינוני תחזוקה נוירון DRG, המורכב בינוני בינונית בתוספת B27 (2% v / v), L- גלוטמין (1% v / v), גורם הגדילה העצבים (NGF, 20 ng / mL), ו P / S (1 % V / v).
- הכנת בינוני טיהור נוירון DRG, המורכב בינוני בינונית בתוספת B27 (2% v / v), L- גלוטמין (1%), NGF (20 ng / mL), P / S (1%), fluorodeoxyuridine (FDU, 10 מיקרוגרם / מ"ל), ו uridine (10 מיקרוגרם / מ"ל).
- להקריב חולדות בהריון ביום 14-14 על ידי מנת יתר pentobarbital (240 מ"ג / ק"ג משקל גוף, intraperitoneal).
- מניחים את הקרבנות במצב שכיבה. נקו את הבטן ביסודיות עם אתנול 70%.
- חותכים את דופן הבטן התחתונה של בעל החיים longitudinally באמצעות מספריים לנתח את המלקחיים בסדר. לזהות ולהסיר את הרחם באמצעות מספריים לנתיחה. חותכים את דופן הרחם כדי לחשוף ולחלץ את העוברים. מעבירים את העוברים כדי צלחת סטרילית, 10 ס"מ תרבות מלא PBS. מניחים את צלחת התרבות על הקרח.
- מעבירים את העובר המיועד לנתיחה כדי סטרילית, 10 ס"מ צלחת תרבות מלא PBS (טמפרטורת החדר) ומקם אותו מתחת מיקרוסקופ לנתיחה. יש את העובר במצב נוטה.
לֹאE: חוט השדרה הלבני ואת DRGs המצורפת ניתן לראות על פני הגבי של העובר, דרך העור שקוף שלה. - הכנס microdissecting מלקחיים לאורך כל צד של חוט השדרה ולהשתמש דיסקציה קהה להתחיל להפריד את חוט השדרה הרקמה הרכה שמסביב. חותכים את חוט השדרה חינם מן החיה באמצעות מלקחיים microdissecting לאורך פתיחת הצוואר זנב בדל. בצע דיסקציה בוטה נוספת על היבט הגחון של חוט כדי לשחרר אותו הרקמה הרכה שמסביב.
- השתמש microdissecting מלקחיים כדי להסיר רקמות רכות שיורית על ההיבט הגבי של חוט השדרה משוחרר.
הערה: בשלב זה, רק את חוט השדרה, שורשי העצבים, DRG המצורפת צריך להישאר. - לנתק DRGs בודדים מן השורשים העצב המחברים שלהם באמצעות מלקחיים microdissecting. השתמש עט פיפטה המצורפת קצה 1 מ"ל להעביר את DRGs ל 1.5 מ"ל, צינור צנטריפוגה סטרילית המכיל PBS.
הערה: עבור כל צינור 1.5 מ"ל, לכל היותר100 DRGs ניתן לאכלס. - צנטריפוגה DRGs ב 250 xg במשך 5 דקות resuspend אותם רקומביננטי אנזימטי תא דיסוציאציה מגיב (200 μL לכל צינור). דגירה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ) במשך 10 דקות. צנטריפוגה DRGs ב 250 xg במשך 5 דקות, להסיר את supernatant, ו resuspend במדיום תחזוקה נוירון DRG. לנתק את גלולה על ידי טחינה דקה באמצעות 200 פיפטה μL קצה. לכמת את התאים בתוך גלולה באמצעות hemocytometer לאחר דילול המתאים.
- זרע התאים בצפיפות של 5,000 תאים / ס"מ 2 לתוך PDL / laminin מצופה 6 צלחות היטב 1.5 מ"ל של מדיום תחזוקה נוירון DRG לכל טוב. לאחר יומיים של תרבות, להסיר את המדיום DRG נוירון תחזוקה, לשטוף עם PBS, ולהחליף בינוני טיהור נוירון DRG.
הערה: עבור כל מחזור טיהור, לטפל תרבויות DRG עם המדיום טיהור במשך 2 ימים, ואחריו יום 1 של הדגירה במדיום תחזוקה. לאחר 3-4 טיהור מחזורי, remסגלגל של כל גליה אנדוגני צפוי 7 . זה אמור להימשך כ 14 ימים. תרבויות מטוהרים הבדיקה חיובית עבור TUJ1 סמן נוירונים נעדרים הביטוי S100β ( איור 5 ).
- דור של תאים דמויי תא של שוואן
- הכן בינוני אינדוקציה גלייה המורכב αMEM בתוספת β-Heregulin (100 ng / mL), bFGF (10 ng / ml), גורם טסיות נגזר הצמיחה (PDGF-AA, 5 ng / mL), FBS (10%), ו P / S (1% v / v).
- פלייט את neurospheres מוכן בסעיף 4 ב PDL / laminin מצופה 6-צלחות היטב בצפיפות של 5-10 כדורים לכל ס"מ 2 ב 1.5 מ"ל של המדידה אינדוקציה גליה לכל טוב. החלף המדידה אינדוקציה גלייה כל 2 ימים לאחר שטיפה התאים עם PBS.
הערה: תאים מ neurospheres seeded נראים נודדים החוצה על ידי יום 2. לפי יום 7, תאים נודדים יש מראה מחודדות צריך להוכיח אימונוסוסיטיביות עבור התא Schwannסמנים p75 קולטן neurotrophin (p75) ו S100β 7 . תאים אלה נקראים SCLCs.
- Coculture של SCLCs עם נוירונים DRG
- הכן בינוני coculture מורכבת בינוני DRG נוירון תחזוקה (שלב 5.1.4) ו אינדוקציה אינדוקציה גלייה (שלב 5.2.1) ב 1: 1 נפח לנפח יחס.
- הכן בינוני Schwann תחזוקה התא המורכב DMEM / F12 בתוספת FBS (5%), β-Heregulin (10 ng / mL), ו P / S (1% v / v).
- הסר את המדיום תרבות מיום 7 SCLCs, לשטוף אותם עם PBS, ו דגירה אותם עם 0.5 מ"ל / טוב של recombinant תא האנזים דיסוציאציה תא ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות. Resuspend SCLCs במדיום coculture.
- לכמת את התאים באמצעות hemocytometer לאחר דילול המתאים.
- זרע SCLCs על מטוהרים תרבויות נוירון DRG בצפיפות של 1,000 תאים / ס"מ 2 . לשמור על cocultures במשך 14 ימים, עם החלפת בינוני כל יומיים.
הערה: במהלך coculture, SCLCs רכשה את המורפולוגיה דמוי ציר, כי הוא אופייני תאים שוואן בוגרת ( איור 6 ). תאים אלה נמשכים פנוטיפ שלהם לאחר הנסיגה של גורמי גדילה מסוגלים myoninate אקסונים במבחנה in vivo 7 , 10 . את החיוביות של סמנים תא Schwann ( כלומר, p75 ו S100β) צריך להיות פיקוח על ידי immunofluorescence. - עם השלמת coculture, מעבר גורל, שבוצעו תאים שוואן, כמתואר בשלב 1.2.2. השתמש 0.5 מ"ל של מגיב דיסוציאציה לכל טוב. לכמת את התאים באמצעות hemocytometer לאחר דילול המתאים.
- Resuspend גורל מחויבים תאים Schwann במדיום תחזוקה שוואן שו בצפיפות של 10,000 תאים / ס"מ 2 . תאים זרע לתוך PDL / laminin מצופה 6-גם צלחות עבור immunofluorescence.
הערה: Cocultures בהכרח להכיל MSCs כי אימצו fibroblastגורל התאים 7 . תאים אלה הם passaged יחד עם גורל מחויבים תאים Schwann עם השלמת coculture. תאים Schwann שוכב על גבי זה תשתית fibroblast יכול להיות מנותק בקלות נוספת התרחבה לאחר שטיפה עם "מטוסי קר" של PBS (4 ° C), כפי שתואר במקום אחר 13 . גורל- Schwann תאים מתאימים ניתן להרחיב במדיום תחזוקה במשך חודש 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סקירה של שלבי המפתח בפרוטוקול שלנו הוא באיור 1 . לסיכום, חולדה MSCs אנושיים נבחרים על ידי דבקות פלסטיק תרבות רקמות. MSC מורחב מותנים מראש עם היפוקסיה והם כפופים לתנאי נוירופר. Neurospheres הם מצופה מותר להבדיל SCLCs. SCLCs הם cocultured עם נוירונים DRG מטוהרים לייצר גורל מחויבים תאים Schwann.
מורפולוגיה של עכברוש תרבותי MSCs אנושי באיור 2 . מורפולוגיה בריאה שלהם מחודדת מוצג בניגוד למראה quadrangular של MSCs מתוחזקת על מספרי המעבר גבוהה, אשר איבדו את ריבוי שלהם. עכברוש מורחבת מושבות אנושיות צריך להדגים את הביטוי של סמנים MSC, היעדר של סמנים תא גזע hematopoietic, ואת היכולת trilineage שוניםFerentiation ( איור 3 ). MSCs בריאים בין מעברים 3 ו - 8 כפופים תנאים מוקדמים היפוקסית עבור 16 שעות והם לאחר מכן passaged על צלחות תרבות דבקות נמוכה עם תוספי EGF / bFGF. תוצאות מוקדמות היפוקסית במספר גדול יותר של neurospheres, כמו גם גדלים גדולים יותר neurosphere ממוצע ( איור 4 ).
Neurospheres הם מצופה על לוחות PDL / laminin מצופה תרבות המושרה להיות SCLCs על ידי תרבות במדיום אינדוקציה גלייה המכיל β-Heregulin, bFGF, ו- PDGF-AA. SCLCs להציג את המורפולוגיה tapered אופייני של תאים Schwann ואת הביטוי סמן המתאים, אך הם פנוטיפלית יציבה לחזור הפנוטיפ fibroblast על הפסקת של גורמי גדילה
Coculture עם נוירונים חושית היא תנאי מוקדם להביא sw- המהות הפנימיתלגרד את המחויבות הגורל. הקמת רשתות DRG מטוהרים מושגת באמצעות טיפול פעמו עם FDU ו uridine להסיר גליה אנדוגני צריך להיות מאושר על ידי היעדר של S100β immunopositivity ( איור 5 ). ביום 7, SCLCs הם passaged ו cocultured עם נוירונים DRG מטוהרים במשך 14 ימים ( איור 6 ). עם השלמת coculture, בוגרת, גורל מחויבים תאים שוואן צריך לצאת.
איור 1: סקירה כללית של הפרוטוקול. מוח העצם מתקבל על ידי הירך עכברוש או aspirates הקשתית iliac האדם. MSCs מתוך מוח העצם יכולים לצרף ולהרחיב על פלסטיק רקמות תרבות. על מנת להעשיר עבור MSC עם פוטנציאל עצבי, תאים הם תנאים מוקדמים ב 1% O 2 במשך 16 שעות ולאחר מכן passaged על תרבות דבקות נמוכה plAtes עם תוספי bFGF / EGF. התוצאה היא היווצרות של neurospheres, אשר מצופה על פלסטיק PDL / laminin מצופה תרבות רקמה ותרבותית במדיום אינדוקציה גלייה לייצר SCLCs. SCLCs הם passaged ו cocultured עם נוירונים DRG מטוהרים במשך 2 שבועות על מנת לכוון אותם לפדיון. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: הקמת מושבות MSC. מושבות MSC גודל צריך להיות גלוי 6-7 ימים לאחר ציפוי של תאים מוח העצם על פלסטיק תרבות רקמות. תמונה נציג של עכברוש MSC מושבה מוצג ( א ), ואילו מושבות האדם להפגין מראה דומה. המושבות ניתן passaged ביום 10. ראה הגדלה גבוהה יותר, הן חולדה (B ) ואת האדם ( D ) MSCs להפגין פיברובלסטים דמויי פיפרובלאסט כמו לאחר passaging. MSCs כי הם שמרו על מספרי המעבר גבוה לרכוש מורפולוגיה שטוחה, מרובעת ( C ) ויש להשליך. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: אפיון של MSCs. ( A - D ) נציג תמונות של MSCs האדם. MSCs יכול להיות מאופיין על ידי ביטוי של סמנים המתאימים, כגון CD90 ( A ), CD73 ( B ), ו Stro-1 ( C ), ועל ידי היעדר סמנים תא גזע hematopoietic, כגון CD45 ( D ). ( E - G ) חולדה MSCS מבודדים מורחבת כמתואר בפרוטוקול להוכיח multipotency ביכולתם ליצור adipocytes ( E , פיקדונות שומן מוכתמים אדום סודן), osteoblasts ( F , מטריקס תאיים מוכתם עם אליזרין אדום), ו chondrocytes ( G , proteoglycans מוכתם Safranin- O) בתנאים התרבות המתאימים. סולם ברים = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: העשרה של אבות עצביים מ MSCs. הן חולדה ( A ) האדם ( C ) MSCs טופס neurospheres כאשר מתורבת על דבקות נמוכה פלסטיק תרבות פלסטיק בינוני בתוספת EGF / bFGF. המספרים ואת הקוטר הממוצע של חולדה (
איור 5: הקמת רשתות DRG מטוהרים מטוהרים. רשתות DRG מטוהרים נקבעים לאחר טיפול פעמו עם הסוכנים האנטי-אוטוביטים FDU ו- uridine (A). רשתות Neurite כי הם נטולי S100β-expressing גליה אנדוגני (B) מוכנים coculture עם SCLCs. סולם ברים = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Ether.within-page = "1"> 
איור 6: דור של מוח העצם נגזר תאים Schwann באמצעות coculture עם נוירונים DRG. עם השלמת 2 שבועות של coculture עם נוירונים DRG מטוהרים SCLCs האדם, בצורת ציר, גורל מחויבים תאים שוואן נובעים הן קבוצות נורמוקסיה ו hypoxia שטופלו ( A ו- D ). תאים אלה מבטאים את הסמנים של שוואן p75 (B ו- E) ו- S100β (C ו- F). הביטוי של אנטיגן גרעינים אנושיים (HuNeu) מוכיח כי תאים S100β חיובי לא היו מזהמים תאים גליה שמקורם DRGs חולדה. סולם ברים = 100 מיקרומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
זה חיוני כדי לשמר את "גזע" של MSCs לפני העשרה של אבות עצביים באמצעות תנאים מוקדמים היפוקסי ותרבות neurosphere. מניסיוננו, MSCs ריבוי יכול להיות מזוהה באופן מהימן על ידי מורפולוגיה fibroblast שלהם מוארך כמו. לעומת זאת, MSCs אשר אימצו מורפולוגיה מרובעת יותר, מרובעת, עם סיבי הלחץ הבולטים cytoskeletal, לא בקלות לאמץ גורל תאים עצביים יש להשליך. באופן כללי, אנחנו לא משתמשים MSCs עם מספרי המעבר יותר משמונה. כדי לשמור על הגבעול שלהם, חשוב לעבור מיד MSCs לפני שהם מגיעים המפגש 100%. לעומת זאת, שמירה על MSCs במפגש נמוך מדי אינה רצויה. מניסיוננו, זריעה MSCs בצפיפות של 40,000 תאים / ס"מ 2 , או פשוט passaging תאים כי הם 80% confluent ביחס של 1: 2, מאפשר את התוצאות הטובות ביותר.
הקמתה ותחזוקתה של רשת ה- DRG הוא מבקראל מכריע של הצלחה coculture. הזמן הדרוש הקציר DRG צריך להישמר עד למינימום. גנגליאה הפרט צריך להיות מטופל בצורה atraumatic, במיוחד במהלך ניתוק מחוט השדרה, כאשר עדיף להתמודד עם שורשי העצבים בלבד. באופן כללי, אנו שואפים לתקופה של פחות מ 2 שעות בין הזמן של הקרבת בעלי חיים העיכול האנזימטי של DRGs שנקטפו, כמו תוצאות קציר ממושך ברקמת רקמות ואובדן הכדאיות התא. ניתוק של נוירונים DRG מן השכבה במהלך התרבות הוא נתקל לעתים קרובות. כדי למנוע את זה מתרחש, ציפוי צריך להיות מוכן טרי וביצע סמוך למועד הקציר הרקמות. באופן כללי, גדול, undigested אשכולות DRG לנתק לעתים קרובות יותר לא להניב coculture הצלחה. משך העיכול האנזימטי ואת כמות הטחינה ניתן להתאים, במטרה להשיג רשת עם המראה הדומה איור 5 .
בעוד שלנו cocuLture פלטפורמה בעקביות גורם המחויבות הגורל, רק 20-30% של תרבויות מבוצע במקביל התשואה גורל מחויבים תאים Schwann 7 , 13 . לכן אנו מכינים מספיק DRGs ו SCLCs כדי לבצע יחד cocultures בשלוש עד ארבע 6 גם צלחות תרבות. אנו משער כי שילוב של גורמים הקשורים לרשת DRG הבסיסית, כולל גיל עובריים שלהם, כדאיות התא, צפיפות, טופוגרפיה, להשפיע על הצלחה coculture. אלה משתנים הבסיסית צריך להיות חקירת נוספת ו סטנדרטי. מלבד מגבלות התשואה coculture, יש צורך להחליף את הדרישה של נוירונים DRG הנגזרות עכברוש ומוצרים מן החי. יתר על כן, משך הפרוטוקול צריך להיות מקוצר. כמו שינוי מקוצר של הפרוטוקול שלנו, יש לנו הצלחה בהפקת תאים Schwann בוגרת מיום 10 neurospheres זרע ישירות על נוירונים DRG מטוהרים, ללא הדור הקודם של SCLCs , 10 .
Neurospheres מועשר באמצעות השיטה שלנו משמשים מקור איתן של תאים של השושלת העצבית ואת גליה. הפלטפורמה שלנו להכוונת תאים מבשר למחויבות הגורל יש את היתרון של מניפולציה גנטית, עם הסיכונים הגלומים שלה, ואת התאים וכתוצאה מכך הם רלוונטיים להשתלת תאים, דוגמנות המחלה, ואת המחקר של הבדל גלייה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
כל המחברים של כתב היד הזה אין כל גילוי כדי להכריז.
Acknowledgments
המחברים היו רוצים להודות ד"ר Nai-Sum וונג על מתן המנגנון קאמרית היפוקסיה וגברת אליס לואי עבור התמיכה הטכנית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| αMEM | Sigmaaldrich | M4526 | |
| DMEM/F12 | Thermofisher scientific | 12400-024 | |
| Neurobasal medium | Thermofisher scientific | 21103-049 | |
| FBS | Biosera | FB-1280/500 | |
| B27 | Thermofisher scientific | 17504-001 | |
| Epidermal growth factor (EGF) | Thermofisher scientific | PHG0313 | |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | 100-18B/100UG | |
| Nerve growth factor (NGF) | Millipore | NC011 | |
| Platelet-derived growth factor-AA (PDGF-AA) | Peprotech | 100-13A | |
| Heregulin beta-3, EGF domain (β-Her) | Millipore | 01-201 | |
| Uridine | Sigmaaldrich | U3003 | |
| 5-Fluro-2' - deoxyuridine (FDU) | Sigmaaldrich | F0503 | |
| Poly-D-lysine (PDL) | Sigmaaldrich | P7886-1G | |
| Laminin | Thermofisher scientific | 23017015 | |
| GlutaMAX | Thermofisher scientific | 35050061 | |
| Penicillin / streptomycin (P/S) | Thermofisher Scientific | 15140-122 | |
| TrypLE Express | Thermofisher Scientific | 12604-013 | |
| 10 cm plate for adherent culture | TPP | 93100 | Used for selection of MSCs by tissue culture adherence |
| 6-well plate for adherent culture | TPP | 92006 | Used for expansion of MSCs following passaging |
| UltraLow 6-well plate for non-adherent culture | Corning | 3471 | Used for neural progenitor enrichment |
| anti-human CD90(Thy-1) | BD Biosciences | 555593 | |
| anti-human CD73 | BD Biosciences | 550256 | |
| anti-human/rat STRO-1 | R&D Systems | MAB1038 | |
| anti-human nestin | R&D Systems | MAB1259 | |
| anti-human CD45 | BD Biosciences | 555480 | |
| anti-rat CD90(Thy-1) | BD Biosciences | 554895 | |
| anti-rat CD73 | BD Biosciences | 551123 | |
| anti-rat nestin | BD Biosciences | MAB1259 | |
| anti-rat CD45 | BD Biosciences | 554875 | |
| Anti-S100β | Dako | Z031101 | |
| Anti-p75 | Millipore | MAB5386 | |
| Anti-GFAP | Sigmaaldrich | G3893 | |
| Anti-Class III-beta tubulin (Tuj-1) | Covance | MMS-435P | |
| Anti-Human nuclei | Millipore | MAB1281 | |
| Hypoxia chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 | |
| HEPES buffer | Sigmaaldrich | H4034-100G |
References
- Wiliams, R. R., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation: a repair strategy for spinal cord injury? Prog Brain Res. 201, 295-312 (2012).
- Kanno, H., Pearse, D. D., Ozawa, H., Itoi, E., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation for spinal cord injury repair: its significant therapeutic potential and prospectus. Rev Neurosci. 26 (2), 121-128 (2015).
- Lindvall, O., Kokaia, Z. Stem cells in human neurodegenerative disorders--time for clinical translation? J Clin Invest. 120 (1), 29-40 (2010).
- Terzic, D., et al. Directed Differentiation of Oligodendrocyte Progenitor Cells From Mouse Induced Pluripotent Stem Cells. Cell Transplant. 25 (2), 411-424 (2016).
- Takashima, Y., et al. Neuroepithelial cells supply an initial transient wave of MSC differentiation. Cell. 129 (7), 1377-1388 (2007).
- Felling, R. J., et al. Neural stem/progenitor cells participate in the regenerative response to perinatal hypoxia/ischemia. J Neurosci. 26 (16), 4359-4369 (2006).
- Shea, G. K., Tsui, A. Y., Chan, Y. S., Shum, D. K. Bone marrow-derived Schwann cells achieve fate commitment--a prerequisite for remyelination therapy. Exp Neurol. 224 (2), 448-458 (2010).
- Jessen, K. R., Mirsky, R. The origin and development of glial cells in peripheral nerves. Nat Rev Neurosci. 6 (9), 671-682 (2005).
- Mung, K. L., et al. Rapid and efficient generation of neural progenitors from adult bone marrow stromal cells by hypoxic preconditioning. Stem Cell Res Ther. 7 (1), 146 (2016).
- Ao, Q., et al. The regeneration of transected sciatic nerves of adult rats using chitosan nerve conduits seeded with bone marrow stromal cell-derived Schwann cells. Biomaterials. 32 (3), 787-796 (2011).
- Tondreau, T., et al. Isolation of BM mesenchymal stem cells by plastic adhesion or negative selection: phenotype, proliferation kinetics and differentiation potential. Cytotherapy. 6 (4), 372-379 (2004).
- Baksh, D., Song, L., Tuan, R. S. Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. J Cell Mol Med. 8 (3), 301-316 (2004).
- Jirsova, K., Sodaar, P., Mandys, V., Bar, P. R. Cold jet: a method to obtain pure Schwann cell cultures without the need for cytotoxic, apoptosis-inducing drug treatment. J. Neurosci. Methods. 78 (1-2), 133-137 (1997).
