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Developmental Biology

人脐血内皮祖细胞的分离

Published: September 14, 2017 doi: 10.3791/56021
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, University of Arkansas

Summary

该协议的目的是分离脐血内皮祖细胞。一些应用包括利用这些细胞作为生物标志物来识别心血管风险患者, 治疗缺血性疾病, 并创建组织工程的血管和心脏瓣膜结构。

Abstract

Ashara 和同事们首次报告了外周血中内皮祖细胞 (内皮) 的存在及其在血管中的参与情况1。后来, 其他人记录了来自骨髓的类似类型的内皮的存在2,3。最近, 奥约德和英格拉姆表明, 内皮从脐血获得了较高的增殖潜能与孤立的成人外周血4,5,6。除了参与产后血管, 内皮也显示了承诺作为一个细胞源创建组织工程血管和心脏瓣膜构建7,8。存在各种隔离协议, 其中一些涉及在内皮和造血标志物的帮助下从先前提到的来源获得的单个核细胞的细胞分类, 或培养这些具有特殊内皮生长的跨国公司中, 或这些技术的组合9。在这里, 我们提出了一个内皮的分离和培养的协议使用专门的内皮培养基补充生长因子, 不使用 immunosorting, 其次是对孤立细胞的表征使用西部印迹和免疫.

Introduction

一些调查人员研究了人类内皮的特征和潜能5,10,11,12,13。内皮可以被描述为在缺氧、缺血、损伤或肿瘤形成的部位有能力黏附于内皮组织的循环细胞, 并有助于形成新的血管结构4,14。他们观察到的参与新生血管, 以产后血管的形式, 导致了对这些细胞的病理生理学的理解和他们的用途在治疗应用4,15, 16. 一个人的内皮的数量已被证明与心血管病病理学相关9、15、161718 ,20。其他研究也将内皮分化成成纤维细胞样表型, 并建议这些细胞可用于组织工程心脏瓣膜7,21。

由于调查4之间的差异, 没有明确确定分离内皮所需的特定细胞表面分子。跨国公司对某一矩阵的附着力, 暴露于各种培养条件下, 已由几个组1、17、22、23进行, 建议假定内皮可能显示不同的表型属性。这些性质包括缺乏吞噬能力, 管形成在基质, 和摄取 Dil-乙酰低密度脂蛋白。高克隆和增殖电位是内皮可以排列5的两个属性。内皮也可以形成体外小管当共与人胎肺成纤维细胞的4。这些细胞是已知的表达内皮细胞表面标记和分享一些造血标记13,24,25。积极表达的标记, 被广泛接受的分内皮是 CD31, CD34, 血管内皮生长因子受体 2 (VEGFR2), 冯血友病因子 (vWF), CD133, c-试剂盒, 血管内皮钙黏蛋白 (VE 钙黏附素)4,18. co-express CD90、CD45、CD14、CD115 或α-平滑肌肌动蛋白 (α-SMA) 的细胞不被认为是内皮, 因为它们的增殖潜能有限, 吞噬细菌的能力, 以及无法形成de 从头人类容器在体内4,7。本文概述了一个改进的协议, 分离内皮祖细胞从人脐血不需要任何细胞排序协议。本文以 CD31、CD34 和 VEGFR2 为阳性标记, 用α-SMA 作为负性指标。

本文提出了一种利用生长因子 (华) 对脐血内皮祖细胞进行无细胞分类的分离培养方法。该华包含血管内皮生长因子 (VEGF) 和成纤维细胞生长因子 (增殖素), 它能增强内皮细胞膜的存活、增生和迁移26。它还包括抗坏血酸, 它负责维持细胞的鹅卵石形态;胰岛素样生长 factor-1 (IGF-1), 提供血管生成和迁移功能;和肝素, 在培养基26中导致生长因子的长期稳定性改善。其他生长因子添加到内皮细胞培养基包括补充表皮生长因子 (egf), 这有助于刺激细胞增殖和分化, 和氢化可的松, 其中使细胞的 egf26.我们表明, 这一特定生长培养基的使用产生的内皮比内皮基培养基 (循证医学) 或 Dulbecco 氏改良鹰培养基 (DMEM) 的数量更高。

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Protocol

这项研究是在阿肯色大学机构审查委员会的批准下进行的 (批准编号 16-04-722)。在阿肯色州脐血库的柠檬酸盐磷酸葡萄糖 (方案) 溶液中收集脐血单位, 而不符合储存要求的单位则捐给研究。在环境温度下, 脐带血单位在收集24小时内快递到实验室.

1. 从脐血中分离内皮祖细胞

  1. 试剂的制备。
    1. 通过将内皮基底培养基 (循证医学) 添加到10% 胎牛血清 (FBS), 并辅以 20 ng/毫升胰岛素样生长因子 (igf-i), 以制备华, 1 和 #181; g/毫升抗坏血酸, 5 ng/毫升重组人表皮生长因子 (肽), 22.5 和 #181; g/毫升肝素, 0.5 ng/毫升血管内皮生长因子 (VEGF), 以及 10 ng/毫升重组人成纤维细胞生长因子 b (rhFGF b), 0.2 和 #181; g/毫升氢化可的松, 2% 青霉素-链霉素-谷氨酰胺。用 0.2 #181 砜 (PES) 膜真空过滤器对培养基进行杀菌.
    2. 制备大鼠尾 i 型胶原溶液, 浓度为50和 #181; 使用0.02 的乙酸。使用0.2 和 #181; m 注射器过滤器对此解决方案进行消毒.
    3. 预涂 6-井板2毫升制备的大鼠尾 i 胶原溶液为每一个井。将它们放置在 5% CO 2 和37和 #176 的恒温箱中, 在播种前至少1小时.
    4. 用汉克斯平衡盐溶液 (HBSS) 在1:1 浓度下稀释大约25毫升脐血.
    5. 使用150毫米氯化钠、1% 海卫 X-100、0.5% 钠胆酸、1毫米和 #946、甘油、0.1% SDS 和 50 mm 三 (pH 8.0) 制备无线电免疫沉淀试验 (帕) 缓冲液.
  2. 隔离内皮祖细胞。
    1. 将所有准备好的试剂放在37和 #176 的水浴中预热; 隔离之前的 C.
    2. 在50毫升离心管中加入20毫升密度梯度介质试剂.
    3. 小心地在含有密度梯度介质的离心管中20毫升稀释的脐带血, 而不打破这一层, 目的是将吸管对准管子的侧壁.
    4. 分离血液的组分根据他们的密度 ( 图 1 ) 由离心在 800 x g 为30分钟在室温下, 与离心机转子的闸。请勿干扰不同的层.
    5. 通过小心地将等离子层移到管外, 而不干扰其他细胞层, 直到吸管尖端能够到达跨国公司层 (请参见 图 1 )。丢弃已移除的等离子体.
      注: 在使用吸管提示去除等离子体的同时, 在跨国公司层 ( 图 1 ) 的上方留出一小层等离子, 以减少干扰.
    6. 使用装有18口径针头的注射器并将其转移到一个新的离心管上, 收集包含跨国公司的巴菲外衣.
    7. 向所收集的跨国公司添加同等数量的循证医学. 离心这些管在 500 x g 为10分钟在4和 #176; 放弃上清.
      注: 细胞团将出现红色, 因为存在红细胞/红细胞.
    8. 添加5毫升氯化铵溶液, 以溶解红血球。在冰上孵育这管 5-10 分钟, 偶尔晃动.
      注意: 在这一步中应谨慎行事, 不要超过时间期限, 因为这可能对跨国公司有害.
    9. 离心管 500 x g 为10分钟, 在4和 #176; C 和丢弃上清。如果红细胞坚持, 重复步骤1.2.8 和 1.2.9, 直到没有看到红色的颗粒.
    10. 在准备好的华中重颗粒, 并使用例来计算跨国公司的数量.
    11. 吸入鼠尾 i 胶原蛋白涂层 6-井板 (从步骤 1.1.3) 和洗涤井三次与1x 磷酸盐缓冲盐水 (PBS).
    12. 种子的跨国公司颗粒悬浮在华到胶原板的浓度为 1 x 10 7 跨国公司在每个井。将它放在37和 #176; C, 5% CO 2 孵化器.
    13. 24 小时后, 吸气培养基, 用华冲洗一次。添加3毫升的华介质到每一个井, 并把它放回37和 #176; C, 5% CO 2 孵化器.
    14. 每天7天用新鲜华培养基补充板材。7天后, 每隔一天更换华介质.
    15. 使用明亮的野外显微镜, 每天拍摄6孔板的图像, 以追踪内皮细胞的进展情况。标记的板块, 殖民地出现, 以保持他们的成长轨迹.
      注意: 它通常需要5和9天的殖民地出现在文化中.
  3. 扩展内皮祖细胞。
    1. 将 T-25 培养瓶与鼠尾 i 型胶原蛋白 (50 和 #181; g/毫升), 并将其放置在37和 #176; C, 5% CO 2 孵化器至少60分钟的吸气和洗涤 T-25 细胞培养瓶三次与 1x PBS 之前播种的细胞.
    2. 处理的内皮细胞, 当他们达到约3毫米大小使用150和 #181; 每井0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液。将6井板放回37和 #176; C, 5% CO 2 孵化器 2-3 min.
    3. 轻轻敲击6井板, 将所附的电池取出。立即添加2毫升的华, 并恢复15毫升离心管中的细胞.
    4. 使用例计数单元格并计算初始种子密度.
    5. 旋转15毫升离心管在 400 x g 重5分钟的细胞团在华和种子 T-25 烧瓶与〜50万细胞。将此烧瓶标记为通道 1, 并将 T-25 烧瓶放回37和 #176; C, 5% CO 2 孵化器.
      注意: 细胞可以被镀在循证医学和 DMEM 来比较的增长与华.
    6. 对于进一步的通道, 当烧瓶达到90% 汇合, 按照步骤 1.3.1 1.3.5 和设定的细胞在 10 4 细胞/cm 2 T-75 或 T-175 细胞培养烧瓶。继续描述隔离单元格 (步骤2和 3).

2。利用西印迹的分离细胞的特性

  1. 添加 50-100 和 #181; 在每个通道中, 当按照扩展步骤来描述孤立细胞的特征时, 会溶解缓冲液。收集大约50万或更多细胞的蛋白质.
  2. 吸管向上和向下用力, 以破裂的细胞和释放的蛋白质。将缓冲区收集并传输到离心管.
  3. 旋转离心管在 500 x g 和小心地转移上清到一个新的离心管。标签和存储的管在-80 和 #176; C 长期存储.
  4. 量化每管中的蛋白质数量使用布拉德福德和 #39; s 或分析分析 27 , 28 , 29 .
  5. 使用标准程序执行西文印迹 27 , 28 , 29 。分析5和 #181; CD31、CD34、VEGFR2 和 #945 表达的总蛋白 g;-SMA。使用和 #945;-蛋白用于对数据进行规范化.

3。间接免疫荧光

  1. 几种18毫米玻璃片在50% 乙醇和干燥他们。将清洁的片放在一个12井的盘子里过夜, 在生物安全罩里, 用紫外线灯消毒.
  2. 用50和 #18 涂片1、大鼠尾 i 型胶原蛋白, 并将板材转移至37和 #176; C、5% CO 2 孵化器至少 60 min.
  3. 吸出胶原蛋白, 并将1毫升的 1x PBS 添加到 12-井板上以清洗片。吸气 1x PBS 并重复两次.
  4. 种子25万培养内皮在每个井并且安置他们回到37和 #176; C, 5% CO 2 孵化器在执行免疫之前至少3天.
  5. 用 1x PBS 清洗盘3次。在每个井中加入1毫升的 ice-cold 甲醇, 在室温下孵育15分钟来固定细胞.
  6. 执行免疫使用标准协议 27 、 28 、 29 。在适当的稀释上使用抗体 ( 例如, CD31 (1:20), CD34 (1:50), 和 #945;-SMA (1:100) 和 VEGFR2 (1:50)).
  7. 使用荧光显微镜拍摄 immunostained 片的图像.

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Representative Results

内皮祖细胞的分离和扩展:
提供了一个示意图 (图 1) 描述了整个协议。采用密度梯度介质对人脐血密度梯度离心法进行了不同的血成分层观察。在将跨国公司播种到胶原处理的盘子上时, 首先观察到5天和 7 (图 2A) 之间的菌落的生长。这些殖民地继续生长并且有纺锤形的细胞形态学 (图 2A-2D) 在早期的阶段, 以后进步到一个鹅卵石象形态学 (图 2E-2F)。图 3A显示了区域性中的单元格与时间的总数, 每个数据点表示每个通道中所捕获的单元格的累计数量。图 3B描述了在种植跨国公司后, 在经过胶原处理的6井板上第一个蚁群所产生的平均时间。

使用西方印迹的特性:
图 4A显示了对照各种抗体测试的西印迹膜的代表性结果。我们的结果表明, 细胞是积极的 CD31 和 CD34。CD31 (图 4B) 和 CD34 (图 4C) 的表达式在随后的段落中出现了减少, 而 VEGFR2 (图 4D) 在以后的段落中同样被表达, 与第一通过有更高的表达。我们还观察到, 内皮没有表达间充质细胞标记α-SMA (图 4E)。人脐静脉内皮细胞 (内皮) 和瓣膜间质细胞 (VIC) 细胞裂解分别被用作阳性和阴性对照。内皮是已知的表达 CD31, CD34, 和 VEGFR2, 而受害者表达α-SMA。

Figure 1
图 1: EPC 隔离示意图.开始隔离, 稀释脐血与 HBSS, 并在密度梯度培养基上仔细分层, 如图所示。对分层血液进行密度梯度离心, 以获得不同层次的血液, 这是由跨国公司 (巴菲大衣), 密度梯度培养基, 粒, 和红细胞。所提供的子集图像显示了这些不同的层。跨国公司被收集和植入到一个胶原处理细胞培养板。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2.细胞菌落的进展.(A-E)有代表性的 EPC 群的明亮场图像随着时间的推移。注意, 蚁群在早期阶段有纺锤形细胞, 采用鹅卵石形态。(E) 在 3 T-75 烧瓶中培养的 EPC 代表图像。缩放栏 = 200 µm.请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3:内皮的增长曲线(a) 图描述了在一段时间内生长的单元格数, 每个数据点都表示在每个通道中捕获的单元格数 (P0-P10) (n = 4)。(B) 第一个 EPC 群所用的时间出现在6井板 (n = 4) 中。误差线表示平均值的标准误差 (SEM)。未发现使用 one-way 方差分析的统计学意义。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: 西部印迹.(A) 用各种抗体染色的印迹膜。内皮裂解液和 VIC 裂解液被用作阳性对照。(B) 以α-蛋白正常化的 CD31 带的平均强度。(C) CD34 带的平均强度, 用α-蛋白进行归一化。(D) 用α-蛋白正常化的 VEGFR2 带的平均强度。(E) 以α-蛋白 (n = 3-6) 规范化的α-SMA 带的平均强度。误差线表示 SEM。未发现使用 one-way 方差分析的统计学意义。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5:免疫.CD31、CD34、VEGFR2 和α-SMA 在不同通道中培养的内皮华7天和 immunostained 的代表性图像。缩放栏-100 µm.请单击此处查看此图的较大版本.

Supplemental Figure 1
补充图 1:图中描述了在华、循证医学和 DMEM 中培养的7天内单位面积的单元格数。华显示, 与媒体相比, 细胞生长更高 (循证医学和 DMEM)。数据显示统计学意义, 与 p 和 #60; 0.01, 使用 one-way 方差分析 (n = 2)。请单击此处查看此图的较大版本.

Supplemental Figure 2

/>>补充图 2:在循证医学中培养的内皮的代表性图像为7天, immunostained 为 CD31、CD34、VEGFR2 和α-SMA。缩放栏 = 100 µm.请单击此处查看此图的较大版本.

Supplemental Figure 3
补充图 3:DMEM 内皮的代表性图像为7天, immunostained 为 CD31、CD34、VEGFR2 和α-SMA。缩放栏 = 100 µm.请单击此处查看此图的较大版本.

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Discussion

如前所述, 附着内皮具有鹅卵石形态。我们的孤立的跨国公司从一个纺锤形的细胞殖民地 (图 2A-2D) 发展到一个鹅卵石殖民地 (图 2E-2F), 在文化中的十天内。内皮的标记不同的研究组, 即晚期内皮祖细胞10, 血管内皮细胞的形成,5, 或内皮祖细胞12。应该指出的是, 这些细胞在功能上相同, 表达相似的细胞表面标记。在培养期内观察到的单元格数 (图 3) 增加到几乎 108单元格, 类似于以前的出版物和内皮的高增殖电位的典型值3,5。事实上, 发现从人脐血中获得的内皮具有很高的增殖潜能, 在衰老前表现出数个种群 doublings 与成人外周血内皮分离的结果相比,5,10。

我们的西部印迹结果 (图 4A) 显示了 CD31、CD34 和 VEGFR2 的存在, 裂解从内皮获得的细胞与阳性对照, 内皮。内皮快车 CD31、CD34、VEGFR2 和活化的维克-址。与以前的报告10,18类似, CD31 的表达式随着通道的增加而减小。在 CD34 和 VEGFR2 的情况下, 表达模式也很相似, 在这两种标记都是在第一个段落和相对较低但相等的数量在后面的段落强烈表达。这一数据显示了一种趋势, 与以前的组的结果一致, 其中 immunosorting-based 协议用于隔离脐带血衍生的内皮12。一般情况下, 内皮不表达间质标记, 并验证分离的细胞不是间质性的, 我们 immunolabeled 我们的西方印迹膜与α-SMA。结果表明, 与从被害人采集的阳性对照细胞裂解相比, 培养的内皮中没有α-sma 的表达, 表现出α-sma 抗体的强烈表达。

为了证明华允许增加细胞增殖与用于内皮的其他培养基相比, 我们培养了三种不同类型的培养基中的细胞: DMEM、循证医学和华 (如前所述, 补充了生长因子的循证医学).全部被补充了以 10% FBS。我们在一个12井板的每一个井中播种不同通道的细胞。补充图 1显示了不同介质配方中每单位区域内每个井段的单元格数量。我们注意到, 在华培养的内皮显示细胞数量稳步增加, 在循证医学中的细胞, 在最初的三天内, 细胞数量的增加速度减慢, 随后平稳。这表明, 内皮仍然可以生存在循证医学, 但缺乏增长因素阻碍扩散。我们还注意到, 内皮培养的 DMEM 数量下降, 表明这种特殊的培养基配方不适合其生存或增殖。我们的免疫数据显示, 在华 (图 5) 中培养的内皮与循证医学 (补充图 2) 和内皮 (补充图 3) 中的 DMEM 相比, 表达的 CD31 更多。将图 5与补充图 2和补充图 3进行比较, 可以看出这些单元不受其他单元格类型的污染。此外, 在比较 immunostained 内皮 (图 5) 时, 我们可以定性地说明 CD31 和 CD34 的表达式在较高的通道上下降, 支持我们的西部印迹数据 (图 4)。

重申, 我们建议的协议的主要目标是证明一个人可以通过培养血液跨国公司在专业选择性介质中分离内皮祖细胞。这是为了表明, 内皮可以隔离没有复杂的设备和程序, 不像其他方法, 涉及使用流式细胞仪-要么立即在跨国公司隔离1,3,20,30或在菌落成长为单层后, 依次为 replating4、10、12、13、23。EPC 殖民地通常出现在天5和9之间。因此, 我们的方法是一种更快、更经济高效的隔离内皮的方法。这项技术的主要限制是, CD31 和 CD34 的表达减少与随后的通道, 这可能表明, 细胞正在失去其祖表型。因此, 建议在使用本协议时, 应使用从5或更低的通道中获得的细胞进行实验。

在密度离心后应采取预防措施, 当把离心管带回发动机罩中时, 也不要干扰不同的层, 并在去除等离子体时也要注意。另一个关键的步骤是红细胞裂解, 在那里潜伏期较长可能会损害跨国公司。因此, 建议不要重复这一步骤超过两次。事实上, 由于培养基的吸入在电镀后进行24小时, 因此去除了微量的红细胞, 因为它们是换药的。替代基板, 如纤维连接蛋白或明胶, 而不是我们的测试, 也可以根据特定的协议, 用于创建细胞培养涂层。通过在初始步骤中进行细微修改, 研究人员可以隔离换药内皮30。

最后, 我们报告了一种从脐带血中分离内皮的方法。重要的是要注意, 内皮不表示像α-SMA 的标记, 表明它们不是间质样细胞。实际上, α-SMA 在研究内皮的内皮-间质过渡 (内-MT) 时起着重要的作用。内-MT 是一种细胞转分化过程, 其中内皮细胞被称为失去其特定的标记, 并转化成间质样细胞表型。结果表明, 内皮可以在转化生长因子β7的存在下进行这种转变, 并能在其组织工程支架上释放胞外膜蛋白8.所有这些观察表明, 内皮的承诺, 作为自体细胞源, 以创建心脏瓣膜或其他心血管组织工程建设。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这种材料是根据国家科学基金会资助的 No. 的工作。CMMI-1452943 和阿肯色大学荣誉学院。我们还要感谢阿肯色州脐带血库为我们提供脐血单位。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A) For isolation and culturing
EGM-2 BulletKit Lonza CC-3162 This product comes with all the growth factors needed to make the Endothelial Growth Medium
Fetal Bovine Serum Thermofisher Scientific 26140079
Pencillin-Streptomycin-Glutamine (100x) Thermofisher Scientific 10378016
Ficoll-Paque GE Heatlhcare 17-1440-02
Hank's Balanced Salt Solution Thermofisher Scientific 14170-112
Ammonium Chloride Stem Cell Technologies 7850
1x Phosphate Buffer Saline Thermofisher Scientific 14190250
Rat Tail I Collagen Corning 354236
Glacial Acetic Acid Amresco 0714-500ML
0.05% Trypsin-EDTA Thermofisher Scientific 25300054
HEPES buffer Thermofisher Scientific 15630080
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Thermofisher Scientific 10566-016
B) Antibodies and cell lysates
CD31  Abcam ab28364 1:250 dilution  for Western blotting
CD34 Santa Cruz Biotechnology sc-7045 1:100 dilution for Western blotting
α-SMA abcam ab5694 1:100 dilution for Western blotting
α-tubulin abcam ab7291 1:2,500 dilution for Western blotting
VEGFR2 abcam sc504 1:100 dilution for Western blotting
Human umbilical vein endothelial cell lysate Santa Cruz Biotechnology sc24709 
Valve interstitial cell lysate Primary cell line cultured from own lab and lysed with RIPA buffer
C) Western blotting and immunostaining
10x Tris/Glycine/SDS buffer Biorad 161-0772 Used as running buffer
10x Tris/Glycine buffer Biorad 161-0771 Used as transfer buffer
Immobilon-FL transfer membrane Merck Millipore IPFL0010 This is a PVDF transfer membrane that has 45 µm pore size and is mentioned in the protocol as western blot membrane
4x Laemmli sample buffer Biorad 161-0747
2-mercaptoethanol Biorad 161-0710
10% Criterion TGX precast gel Biorad 5671033
Prolong Gold antifade Thermofisher Scientific P36930 Used for mounting immunostained coverslips for long term storage
Methanol VWR Analytical BDH1135-4LP

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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发育生物学 问题 127 内皮祖细胞 循环祖细胞 迟发内皮前体细胞 血单个核细胞 组织工程 脐血
人脐血内皮祖细胞的分离
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Ravishankar, P., Zeballos, M. A.,… More

Ravishankar, P., Zeballos, M. A., Balachandran, K. Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood. J. Vis. Exp. (127), e56021, doi:10.3791/56021 (2017).

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