Summary
Målet med denne protokol er at isolere endotelceller stamceller fra navlestrengsblod. Nogle af applikationer omfatter brug af disse celler som en biomarkør for at identificere patienter med hjerte-kar-risiko, behandling af iskæmisk sygdomme, og at skabe væv-manipuleret vaskulære og hjertet ventilen konstruktioner.
Abstract
Eksistens i endothelial stamceller (EPCs) i perifert blod og sit engagement i vasculogenesis blev først rapporteret af Ashara og kolleger1. Senere, dokumenteret andre eksistensen af lignende typer af EPCs stammer fra knoglemarven2,3. Mere nylig, Yoder og Ingram viste at EPCs stammer fra navlestrengsblod havde en højere proliferativ potentiale i forhold til dem isoleret fra voksen perifere blod4,5,6. Ud over at være involveret i postnatal vasculogenesis, har EPCs også vist lovende som en celle kilde til oprettelse af væv-manipuleret vaskulære og hjertet ventilen konstruktioner7,8. Forskellige isolation protokoller findes, hvoraf nogle omfatter celle sortering af mononukleære celler (multinationale selskaber), der stammer fra kilder nævnt tidligere ved hjælp af endotel og hæmatopoietisk markører, eller dyrkning af disse multinationale selskaber med specialiserede endotel vækst medium, eller en kombination af disse teknikker9. Her præsenterer vi en protokol til isolering og kultur af EPCs ved hjælp af specialiseret endotel medium suppleret med vækstfaktorer, uden brug af immunosorting, efterfulgt af en karakterisering af isolerede celler ved hjælp af Western blotting og immunfarvning.
Introduction
Flere forskere har studeret karakteristika og potentiale af menneskelige EPCs5,10,11,12,13. EPCs kan betegnes som cirkulerende celler, der har evnen til at overholde endotel væv i lokaliteter af hypoxi, iskæmi, skade eller tumordannelse og bidrage til dannelsen af nye vaskulære strukturer4,14. Deres observerede inddragelse i neovascularization, i form af postnatal vasculogenesis, har ført til en forståelse af Patofysiologi af disse celler og deres anvendelse i terapeutiske anvendelser4,15, 16. antallet af EPCs i individ har vist sig at være korreleret med hjerte-kar-patologi9,15,16,17,18,19 ,20. Andre undersøgelser har også opdelte EPCs ind i en ventil fibroblast-lignende fænotype og foreslået, at disse celler kan bruges til vævsmanipulering hjerte ventiler7,21.
Bestemt celle overflade molekyler nødvendigt at isolere EPCs er ikke blevet klart identificeret på grund af uoverensstemmelser mellem undersøgelser4. Vedhæftning af multinationale selskaber til en bestemt matrix, med udsættelse for en række dyrkningsbetingelser, er udført af flere grupper1,17,22,23, tyder på, at formodede EPCs kan vise forskellige fænotypiske egenskaber. Disse egenskaber omfatter manglende phagocytotic evne, tube dannelse i Matrigel og optagelsen af Dil-acetyleret low-density lipoprotein. Høj clonogenic og proliferativ potentiale er to egenskaber med hvilke EPCs kan være hierarchized5. EPCs kan også indgå i vitro tubuli når cocultured med menneskelige fosterets lunge fibroblaster4. Disse celler er kendt for at udtrykke endotel celle overflade markører og at dele nogle af hæmatopoietisk markører13,24,25. De positivt udtryk markører, der er bredt accepteret til fænotyper EPCs er CD31, CD34, vaskulær endotel vækstfaktor receptor 2 (VEGFR2), von Willebrands faktor (vWF), CD133, c-Kit, og vaskulære endotel cadherin (VE-cadherin)4 , 18. celler, der co express CD90, CD45, CD14, CD115 eller alpha-glat muskel aktin (α-SMA) ikke anses for at være EPCs på grund af deres begrænsede proliferativ potentielle, evne til at phagocytosis bakterier, og manglende evne til at danne de novo menneskelige fartøjer i vivo4,7. Denne artikel beskriver en modificeret protokol for isolation i endothelial stamceller fra menneskelige navlestrengsblod uden behov for enhver celle sortering protokoller. Til denne artikel brugt vi CD31, CD34 og VEGFR2 som de positive markører, med α-SMA som negativ indikator.
I denne artikel foreslår vi en metode til at isolere og dyrkning endotelceller stamceller fra navlestrengsblod uden celle sortering ved hjælp af specialiseret endotel vækstmediet suppleret med vækstfaktorer (EGM). Denne EGM indeholder vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) og fibroblast vækstfaktor (FGF), som forbedrer overlevelsen, spredning og migration af endothelceller26. Det omfatter også ascorbinsyre, som er ansvarlig for at vedligeholde den brostensbelagte morfologi af celler; insulin-lignende vækstfaktor-1 (IGF-1), som giver angiogene og vandrende funktion; og heparin, som medfører forbedret stabilitet på lang sigt af vækstfaktorer i de mellemstore26. Andre vækstfaktorer, tilføjes i endothelial cellekulturmedium omfatter tilskud med epidermal vækst faktor (EGF), som hjælper med at stimulere celleproliferation og differentiering og hydrocortison, som sensitizes celler til EGF26 . Vi viser, at brugen af denne særlige vækstmedium giver højere antal EPCs sammenlignet med endotel basal medium (EBM) eller Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
denne forskning blev udført med godkendelse af University of Arkansas institutionelle Review Board (godkendelsesnummer 16-04-722). Umbilical cord blood enheder blev indsamlet i citrat phosphat dextrose (CPD) løsning på Arkansas ledning blodbank, og enheder, der ikke opfyldte kravet om oplagring blev doneret til forskning. Ledning blod enheder blev leveret til laboratoriet inden for 24 timer af samling ved omgivelsestemperatur.
1. isolation i Endothelial stamceller fra navlestrengsblod
- forberedelse af reagenser.
- Forberede EGM ved at tilføje endotel basal medium (EBM) til 10% føtal bovint serum (FBS) suppleret med 20 ng/mL af insulin-lignende vækstfaktor (IGF), 1 µg/mL ascorbinsyre, 5 ng/mL rekombinant human epidermal vækstfaktor (rhEGF), 22,5 µg/mL heparin og 0,5 ng/mL vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF), samt 10 ng/mL af Rekombinante humane Fibroblast vækstfaktor B (rhFGF-B), 0,2 µg/mL hydrocortison og 2% penicillin-streptomycin-glutamin. Sterilisere dyrkningsmediet ved hjælp af en 0,2 µm polyethersulfone (PES) vakuum membranfilter.
- Forbered rotte hale jeg kollagen løsning ved en koncentration på 50 µg/mL ved hjælp af 0,02 N eddikesyre. Sterilisere denne løsning ved hjælp af en 0,2 µm sprøjte filteret.
- Før pels 6-godt plader med 2 mL af rede rotte hale jeg kollagen løsning til hver brønd. Placere dem i en inkubator fastholdes på 5% CO 2 og 37 ° C i mindst 1 time før såning.
- Fortyndes ca 25 mL af navlestrengsblod med Hanks Balanced Salt løsning (HBSS) i en koncentration på 1:1.
- Forbered radio-immuno nedbør assay (RIPA) Buffer ved hjælp af 150 mM natriumchlorid, 1% Triton X-100, 0,5% natrium deoxycholate, 1 mM β-glycerophosphate, 0,1% SDS og 50 mM Tris (pH 8,0).
- Isolation i endothelial stamceller.
- Varm alle forberedt reagenser i et vandbad, vedligeholdes ved 37 ° C før isolation.
- Tilsættes 20 mL tæthed gradient medium reagens til en 50 mL-centrifugerør.
- Omhyggeligt lag 20 mL fortyndet navlestrengsblod i centrifugeglasset indeholdende befolkningstæthed gradient medium uden at bryde dette lag ved at sigte pipette mod sidevæggene af røret.
- Separate komponenter af blod baseret på deres tætheder ( figur 1) ved centrifugering ved 800 x g i 30 min. ved stuetemperatur, med bremser af centrifugerotoren off. Lave ikke forstyrre de forskellige lag.
- Fjerne plasma lag af omhyggeligt pipettering det ud af røret uden at forstyrre andre celle lag indtil pipette tip er købedygtig nå til MNC lag (Se figur 1). Kassér den fjernede plasma.
Bemærk: Mens du bruger pipette tips til at fjerne plasmaet, lad et lille lag af plasma over MNC lag ( figur 1) for at reducere de forstyrrelser. - Indsamle buffy coat, der indeholder de multinationale selskaber ved hjælp af en sprøjte, monteret på en 18-gauge kanyle og overføre det til en frisk centrifugeglas.
- Tilføjes et lige saa stort volumen af EBM de indsamlede Middelhavstredjelandene. Centrifuge disse rør på 500 x g i 10 min. ved 4 ° C. Fjern supernatanten.
Bemærk: Celle pellet vil vises rødt på grund af tilstedeværelsen af røde blodlegemer/erytrocytter. - Tilsættes 5 mL ammoniumchlorid til lyse røde blodlegemer. Inkuber dette rør på is i 5-10 min. under lejlighedsvis omrystning.
Bemærk: Vær forsigtig under dette trin må ikke overstige varigheden, som det kan være skadeligt for de multinationale selskaber. - Centrifugeres rør ved 500 x g i 10 min. ved 4 ° C, og supernatanten. Hvis erytrocytter fortsætter, Gentag trin 1.2.8 og 1.2.9 indtil ingen rød farve er observeret i toerstoffet.
- Resuspenderes i rede EGM og bruge hemocytometer til at tælle de multinationale selskaber.
- Aspirat rotte hale jeg kollagen-belagt 6-godt plade (fra trin 1.1.3) og brøndene vaskes tre gange med 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS).
- Frø MNC pellet genopslemmes EGM til kollagen pladen ved en koncentration på 1 x 10 7 multinationale selskaber i hver brønd. Placere den i 37 ° C, 5% CO 2 inkubator.
- Efter 24 h, Aspirér medium og brøndene vaskes en gang med ekstraordinær generalforsamling. Tilsættes 3 mL EGM medium til hver brønd og læg det tilbage i den 37 ° C, 5% CO 2 inkubator.
- Genopbygge pladen med friske EGM medium hver dag i 7 dage. Efter 7 dage, ændre EGM medium hver anden dag.
- Ved hjælp af en lysfelt mikroskop, tage billeder af 6-godt pladen hver dag for at spore progression i endothelial celle kolonier. Markere den plade, hvor kolonierne opstår til at holde styr på deres vækst.
Bemærk: Det tager normalt mellem 5 og 9 dage til kolonier i kultur.
- Ekspansion i endothelial stamceller.
- Frakke T-25 kultur kolben med rotte hale jeg kollagen (50 µg/mL) og placere den i 37 ° C, 5% CO 2 inkubator for mindst 60 min. aspirat og vaske T-25 celle kultur kolbe tre gange med 1 x PBS før såning cellerne.
- Trypsinize i endothelial celle kolonier, når de når omkring 3 mm i størrelse ved hjælp af 150 µL 0,05% Trypsin-EDTA-oploesning i hver brønd. 6-godt pladen anbringes tilbage til 37 ° C, 5% CO 2 inkubator for 2-3 min.
- Forsigtigt trykke 6-godt plade for at løsne de tilknyttede celler. Straks tilsættes 2 mL EGM og genoprette cellerne i en 15 mL centrifugeglas.
- Tælle celler ved hjælp af en hemocytometer og beregne den indledende seeding tæthed.
- Spin 15 mL centrifugeres rør ved 400 x g i 5 min. resuspenderes celle EGM og frø T-25 kolben med ~ 500.000 celler. Markere denne kolbe som Passage 1 og kolben T-25 tilbage i 37 ° C, 5% CO 2 inkubator.
Bemærk: Celler kan være forgyldt i EBM og DMEM at sammenligne vækst med EGM. - For yderligere passager, når kolben når 90% sammenløb, Følg trin 1.3.1 - 1.3.5 og reseed celler på 10 4 celler/cm 2 på T-75 eller T-175 celle kultur kolber. Fortsæt til karakterisering af de isolerede celler (trin 2 og 3).
2. Karakterisering af isolerede celler ved hjælp af Western Blotting
- Tilføj 50-100 µL af lysis buffer på hver passage når trinnene udvidelse til at karakterisere de isolerede celler. Indsamle proteiner fra cirka 500.000 eller flere celler.
- Pipetteres op og ned kraftigt at briste cellerne og frigive proteiner. Indsamle og overføre bufferen til et microcentrifuge.
- Spinde microcentrifuge røret på 500 x g og overføre omhyggeligt supernatanten til et nyt microcentrifuge-rør. Etiket og gemme rør ved-80 ° C til langtidsopbevaring.
- Kvantificere mængden af proteiner i hvert rør ved hjælp af enten Bradford ' s eller BCA assay 27 , 28 , 29.
- Udføre Western blotting ved standardprocedurer 27 , 28 , 29. Analysere 5 µg af total protein for udtryk for CD31, CD34, VEGFR2 og α-SMA. Bruge α-tubulin til at normalisere dataene.
3. Indirekte immunfluorescens
- sonikeres 18-mm glas coverslips i 50% ethanol og tør dem. Forlade den rene coverslips i en 12-godt plade overnatning i biosikkerhed hætte med en UV lys på at sterilisere dem.
- Frakke coverslips med 50 & #181; g/mL af rotte hale jeg kollagen og overføre pladen til en 37 ° C, 5% CO 2 inkubator for mindst 60 min.
- Opsug kollagen og tilsættes 1 mL PBS, 1 x 12-godt pladen til at vaske coverslips. Opsug 1 x PBS og gentage to gange.
- Frø 250.000 kulturperler EPCs i hvert godt og placere dem tilbage i 37 ° C, 5% CO 2 inkubator for mindst 3 dage før han udfører immunfarvning.
- Vaske plade 3 gange med 1 x PBS. Tilsæt 1 mL iskold methanol til hver brønd og Inkuber ved stuetemperatur i 15 min. at lave cellerne.
- Udføre immunfarvning ved hjælp af en standardprotokol 27 , 28 , 29. Bruge antistoffer på deres passende fortyndinger (f.eks. CD31 (1:20), CD34 (1:50), α-SMA (1: 100) og VEGFR2 (1:50)).
- Tage billeder af den immunostained coverslips ved hjælp af et epifluorescensmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Isolation og ekspansion i Endothelial stamceller:
En skematisk (figur 1) er fastsat skildrer den samlede protokol. Forskellige blod komponent lag blev observeret efter tæthed gradient centrifugering af menneskelige navlestrengsblod med tæthed gradient medium. Ved såning multinationale selskaber på de kollagen-behandlede plader, blev udkommet af kolonier først observeret mellem dage 5 og 7 (fig. 2A). Disse kolonier fortsatte med at vokse og havde en spindel-formet celle morfologi (figur 2A-2D) i de tidlige stadier, som senere har udviklet sig til en brosten-lignende morfologi (figur 2E-2F). Figur 3 A viser det samlede antal celler versus tid i kulturen, og hvert datapunkt repræsenterer det kumulative antal celler høstet på hver passage. Figur 3 B skildrer den gennemsnitlige tid, det tager for den første koloni til at opstå i kollagen-behandlede 6-godt plade efter såning de multinationale selskaber.
Karakterisering ved hjælp af Western Blotting:
Figur 4 A viser repræsentative resultater af vestlige duppes membran, som blev testet imod de forskellige antistoffer. Vores resultater tyder på, at cellerne var positiv for CD31 og CD34. Udtryk for CD31 (fig. 4B) og CD34 (fig. 4C) syntes at falde over efterfølgende passager, mens VEGFR2 (figur 4D) blev udtrykt ligeligt i senere passager, med først passage at have højere udtryk. Vi bemærkede også, at EPCs ikke udtrykke mesenchymale celler markør α-SMA (fig. 4E). Menneskelige umbilical vene endotelceller (HUVEC) og utætte hjerteklapper interstitielle celler (VIC) cellelysater blev brugt som positive og negative kontroller, henholdsvis. HUVECs er kendt for at udtrykke CD31, CD34 og VEGFR2, mens VIC'erne express α-SMA.
Figur 1 : Skematisk af EPC Isolation. Start isolation ved at fortynde ledningen blod med HBSS og lagdeling det omhyggeligt på toppen af den tæthed gradient medium, som vist. Tæthed gradient centrifugering af lagdelt blodet er udført for at opnå forskellige lag af blod, der består af multinationale selskaber (buffy coat), tæthed gradient medium, granulocytter og røde blodlegemer. Delmængde billede der viser disse forskellige lag. Multinationale selskaber er indsamlet og tilsås på en kollagen-behandlede celle kultur tallerken. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Progression af celle koloni. (A-E) Repræsentative lysfelt billeder af EPC koloni progression over tid. Bemærk at kolonien har spindel-formet celler i de tidlige faser, vedtage brostensbelagte morfologi. (E) repræsentativt billede af EPC kulturperler i T-75 kolbe på passage 3. Skalalinjen = 200 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Vækstkurver af EPCs. (A) grafen viser antallet af celler vokser over en periode, og hver af datapunktet betegner cellen nummer høstet under hver passage (P0 - P10) (n = 4). (B) tid, det tager for det første EPC koloni skal vises i 6-godt plade (n = 4). Fejllinjer betegne standardafvigelsen på middelværdien (SEM). Ingen Statistisk signifikans blev fundet ved hjælp af en-vejs ANOVA. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Western Blotting. (A) vestlige skamplet membran farves med forskellige antistoffer. HUVEC lysate og VIC lysate blev anvendt som positiv kontrol. (B) gennemsnitlig intensitet af CD31 bands normaliseret med α-tubulin. (C) gennemsnitlig intensitet af CD34 bands normaliseret med α-tubulin. (D) gennemsnitlig intensitet af VEGFR2 bands normaliseret med α-tubulin. (E) gennemsnitlig intensitet af α-SMA bands normaliseret med α-tubulin (n = 3-6). Fejllinjer betegne SEM. Ingen Statistisk signifikans blev fundet ved hjælp af en-vejs ANOVA. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Immunfarvning. Repræsentative billeder af EPCs kulturperler EGM i 7 dage og immunostained på forskellige passager for CD31, CD34, VEGFR2 og α-SMA. Skala bar - 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 1: Grafen viser antallet af celler pr. arealenhed over en periode på 7 dage når kulturperler i EGM, EBM og DMEM. EGM viste højere cellevækst sammenlignet med medierne (EBM og DMEM). Data viste Statistisk signifikans, med p < 0,01, ved hjælp af en-vejs ANOVA (n = 2). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
/ > Supplerende figur 2: repræsentative billeder af EPCs kulturperler i EBM i 7 dage og immunostained for CD31, CD34, VEGFR2 og α-SMA. Skalalinjen = 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 3: Repræsentative billeder af EPCs kulturperler i DMEM til 7 dage og immunostained for CD31, CD34, VEGFR2 og α-SMA. Skalalinjen = 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som tidligere nævnt tilhænger EPCs besidder en cobblestone morfologi. Vores isolerede Middelhavstredjelandene skred fra en spindel-formet celle koloni (figur 2A-2D) i de tidlige stadier til en cobblestone koloni (figur 2E-2F) over en periode af ti dage i kultur. EPCs er blevet stemplet forskelligt af forskellige forskergrupper, nemlig som sent endotel stamfader celler10, endotel kolonidannende celler5eller endotel stamfader celler12. Det skal bemærkes, at disse celler er funktionelt ens og give udtryk for lignende celle overflade markører. Antallet af celler observeret under perioden kultur (figur 3) steg til næsten 108 celler, svarende til tidligere publikationer og typisk høj proliferativ potentialet i EPCs3,5. Faktisk blev det konstateret, at EPCs opnået fra menneskelige navlestrengsblod viste en høj proliferativ potentielle og demonstreret adskillige befolkning doublings før det gennemgår gulne i forhold til EPCs isoleret fra voksne menneskers perifert blod5 , 10.
Vores Western blotting resultater (figur 4A) viste tilstedeværelsen af CD31, CD34 og VEGFR2 på cellelysater fremstillet af EPCs i forhold til den positive kontrol, HUVEC. HUVECs express CD31, CD34 og VEGFR2 og aktiveret VIC udtrykkelige α-sSMA. Svarende til tidligere rapporter10,18, udtryk for CD31 faldt med højere passager. Udtryk mønster var også lignende CD34 og VEGFR2, hvor begge markører blev udtrykt stærkt i den første passage og relativt lavere men lige beløb i senere passager. Denne data viser en tendens, der er i overensstemmelse med tidligere grupper resultater, hvor immunosorting-baserede protokoller blev brugt til at isolere ledningen blod-afledte EPCs12. Generelt, EPCs ikke udtrykke mesenchymale markører og at kontrollere, at de isolerede celler ikke var mesenchymale i naturen, vi immunolabeled vores vestlige skamplet membraner med α-SMA. Vores resultater viser tydeligt, at der var ingen α-SMA udtryk i de kulturperler EPCs sammenlignet med positiv kontrol cellelysater indsamlet fra VIC'erne, der udviser stærke udtryk af α-SMA antistof.
For at demonstrere, at EGM giver mulighed for øget celleproliferation i forhold til andre medier anvendt til EPCs, vi kulturperler celler i tre forskellige typer af medier: DMEM, EBM og EGM (dvs., EBM suppleret med vækstfaktorer, som beskrevet tidligere). Alle blev suppleret med 10% FBS. Vi seedede celler af forskellige passager i hver brønd med en 12-godt plade. Supplerende figur 1 viser antallet af celler pr. arealenhed i hver brønd med tiden i kultur i forskellige medier formuleringer. Vi bemærker, at EPCs kulturperler EGM viste en støt stigning i celle nummer og for celler i EBM, der var en langsommere stigningstakt i celle nummer under de første tre dage, som efterfølgende plateaued. Dette tyder på, at EPCs kunne stadig overleve i EBM, men mangel af vækstfaktorer forhindret spredning. Vi bemærker også, at EPCs kulturperler i DMEM tilbagegang i antallet, tyder på, at denne særlige medium formulering ikke er egnet til deres overlevelse eller spredning. Vores immunfarvning data viser, at EPCs kulturperler EGM (figur 5) udtrykte CD31 mere i forhold til EPCs kulturperler i EBM (supplerende figur 2) og DMEM (supplerende figur 3). Sammenligning figur 5 med supplerende figur 2 og supplerende figur 3, kan det ses, at cellerne ikke blev forurenet med andre celletyper. Også, når man sammenligner immunostained EPCs (figur 5), kan vi kvalitativt fastslå at udtrykket af CD31 og CD34 faldt over højere passager, støtte vores vestlige skamplet data (figur 4).
For at gentage, er det primære mål for vores foreslåede protokol til at demonstrere, at man kan isolere endotelceller stamceller af dyrkningsbaserede blod multinationale selskaber i specialiserede selektiv medier. Dette er for at vise at EPCs kan være isoleret uden avanceret udstyr og procedurer, i modsætning til andre metoder, der indebærer brug af flowcytometri - enten umiddelbart efter MNC isolation1,3,20 , 30 eller efter kolonierne er vokset til en éncellelag - efterfulgt af replating4,10,12,13,23. EPC kolonier vises normalt mellem dage 5 og 9. Vores metode er således en hurtigere og mere omkostningseffektiv metode til at isolere EPCs. Den primære begrænsning af denne teknik er, at udtrykket af CD31 og CD34 aftager med efterfølgende passager, som kunne foreslå, at cellerne er ved at miste deres stamfader fænotype. Det anbefales således, at man bør bruge celler fra passage 5 eller lavere for at udføre eksperimenter selv benytter denne protokol.
Forholdsregler bør tages efter tæthed centrifugering ikke forstyrre de forskellige lag, når der tages hætten centrifugeret rør tilbage, og også når du fjerner plasmaet. En anden kritisk trin vedrører erytrocyt lysis, hvor en længere inkubationstiden kan potentielt skade MNC. Det anbefales derfor ikke at gentage dette trin mere end to gange. Faktisk, da den medium aspiration foretages 24 timer efter plating, spormængder af erytrocytter er fjernet, som de er ikke-tilhænger. Alternative substrater, ligesom fibronektin eller gelatine, kan mens ikke er testet af os, også bruges efter bestemte protokoller til at oprette celle kultur belægninger. Ved at ansætte mindre ændring i de indledende trin, kan forskere isolere ikke-tilhænger EPCs30.
Afslutningsvis har vi rapporteret en metode til at isolere EPCs fra navlestrengsblod. Det er vigtigt at bemærke, at EPCs ikke udtryk markører som α-SMA, tyder på, at ikke der er mesenchymale-lignende celler. Faktisk, α-SMA fungerer som en vigtig markør når de forsøger at studere EPCs endotel-mesenchymale overgang (endo-MT). Endo-MT er en cellulær transdifferentiation processen hvor endotelceller er kendt for at miste deres specifikke markører og at omdanne til en mesenchymale-lignende celle fænotype. Det har vist sig at EPCs kan gennemgå denne overgang i overværelse af omdanne vækst faktor-β7 og kan frigive ekstracellulære Membranproteiner på deres væv-manipuleret stilladser8. Alle disse observationer tyder løfte om EPCs til brug som en autolog celle kilde til at oprette en hjerteklap eller andre hjerte-kar-væv-manipuleret konstruktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette materiale er baseret på arbejde støttet af National Science Foundation under Grant nr. CMMI-1452943 og af University of Arkansas udmærkelse College. Vi vil også gerne anerkende Arkansas ledning blodbank for at forsyne os med ledningen blod enheder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A) For isolation and culturing | |||
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | This product comes with all the growth factors needed to make the Endothelial Growth Medium |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher Scientific | 26140079 | |
| Pencillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| Ficoll-Paque | GE Heatlhcare | 17-1440-02 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Thermofisher Scientific | 14170-112 | |
| Ammonium Chloride | Stem Cell Technologies | 7850 | |
| 1x Phosphate Buffer Saline | Thermofisher Scientific | 14190250 | |
| Rat Tail I Collagen | Corning | 354236 | |
| Glacial Acetic Acid | Amresco | 0714-500ML | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| HEPES buffer | Thermofisher Scientific | 15630080 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Thermofisher Scientific | 10566-016 | |
| B) Antibodies and cell lysates | |||
| CD31 | Abcam | ab28364 | 1:250 dilution for Western blotting |
| CD34 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7045 | 1:100 dilution for Western blotting |
| α-SMA | abcam | ab5694 | 1:100 dilution for Western blotting |
| α-tubulin | abcam | ab7291 | 1:2,500 dilution for Western blotting |
| VEGFR2 | abcam | sc504 | 1:100 dilution for Western blotting |
| Human umbilical vein endothelial cell lysate | Santa Cruz Biotechnology | sc24709 | |
| Valve interstitial cell lysate | Primary cell line cultured from own lab and lysed with RIPA buffer | ||
| C) Western blotting and immunostaining | |||
| 10x Tris/Glycine/SDS buffer | Biorad | 161-0772 | Used as running buffer |
| 10x Tris/Glycine buffer | Biorad | 161-0771 | Used as transfer buffer |
| Immobilon-FL transfer membrane | Merck Millipore | IPFL0010 | This is a PVDF transfer membrane that has 45 µm pore size and is mentioned in the protocol as western blot membrane |
| 4x Laemmli sample buffer | Biorad | 161-0747 | |
| 2-mercaptoethanol | Biorad | 161-0710 | |
| 10% Criterion TGX precast gel | Biorad | 5671033 | |
| Prolong Gold antifade | Thermofisher Scientific | P36930 | Used for mounting immunostained coverslips for long term storage |
| Methanol | VWR Analytical | BDH1135-4LP |
References
- Asahara, T., et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 275 (5302), 964-967 (1997).
- Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. J Clin Invest. 105 (1), 71-77 (2000).
- Shi, Q., et al. Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells. Blood. 92 (2), 362-367 (1998).
- Hirschi, K. K., Ingram, D. A., Yoder, M. C. Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (9), 1584-1595 (2008).
- Ingram, D. A., et al. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood. 104 (9), 2752-2760 (2004).
- Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).
- Sales, V. L., et al. Transforming growth factor-beta1 modulates extracellular matrix production, proliferation, and apoptosis of endothelial progenitor cells in tissue-engineering scaffolds. Circulation. 114, 1 Suppl 193-199 (2006).
- Sales, V. L., et al. Endothelial Progenitor Cells as a Sole Source for Ex Vivo Seeding of Tissue-Engineered Heart Valves. Tissue Eng Pt A. 16 (1), 257-267 (2010).
- Liew, A., Barry, F., O'Brien, T. Endothelial progenitor cells: diagnostic and therapeutic considerations. Bioessays. 28 (3), 261-270 (2006).
- Hur, J., et al. Characterization of two types of endothelial progenitor cells and their different contributions to neovasculogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24 (2), 288-293 (2004).
- Ingram, D. A., Caplice, N. M., Yoder, M. C. Unresolved questions, changing definitions, and novel paradigms for defining endothelial progenitor cells. Blood. 106 (5), 1525-1531 (2005).
- Melero-Martin, J. M., et al. In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells. Blood. 109 (11), 4761-4768 (2007).
- Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. Chapter 13. An in vivo experimental model for postnatal vasculogenesis. Methods Enzymol. 445, 303-329 (2008).
- Yoder, M. C.
- Siddique, A., Shantsila, E., Lip, G. Y. H., Varma, C. Endothelial progenitor cells: what use for the cardiologist. J Angiogenes Res. 2 (6), (2010).
- Camci-Unal, G., et al. Surface-modified hyaluronic acid hydrogels to capture endothelial progenitor cells. Soft Matter. 6 (20), 5120-5126 (2010).
- Hill, J. M., et al. Circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk. N Engl J Med. 348 (7), 593-600 (2003).
- Young, P. P., Vaughan, D. E., Hatzopoulos, A. K. Biologic properties of endothelial progenitor cells and their potential for cell therapy. Prog Cardiovasc Dis. 49 (6), 421-429 (2007).
- Mehta, J. L., Szwedo, J. Circulating endothelial progenitor cells, microparticles and vascular disease. J Hypertens. 28 (8), 1611-1613 (2010).
- Nevskaya, T., et al. Circulating endothelial progenitor cells in systemic sclerosis are related to impaired angiogenesis and vascular disease manifestations. Ann Rheum Dis. 66, 67-67 (2007).
- Cebotari, S., et al. Clinical application of tissue engineered human heart valves using autologous progenitor cells. Circulation. 114, 1 Suppl 132-137 (2006).
- Ito, H., et al. Endothelial progenitor cells as putative targets for angiostatin. Cancer Res. 59 (23), 5875-5877 (1999).
- Vasa, M., et al. Increase in circulating endothelial progenitor cells by statin therapy in patients with stable coronary artery disease. Circulation. 103 (24), 2885-2890 (2001).
- Wu, X., et al. Tissue-engineered microvessels on three-dimensional biodegradable scaffolds using human endothelial progenitor cells. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (2), 480-487 (2004).
- Boyer, M., et al. Isolation of endothelial cells and their progenitor cells from human peripheral blood. J Vasc Surg. 31 (1), Pt 1 181-189 (2000).
- Huber, B., Czaja, A. M., Kluger, P. J. Influence of epidermal growth factor (EGF) and hydrocortisone on the co-culture of mature adipocytes and endothelial cells for vascularized adipose tissue engineering. Cell Biol Int. 40 (5), 569-578 (2016).
- Sturdivant, N. M., Smith, S. G., Ali, S. F., Wolchok, J. C., Balachandran, K. Acetazolamide Mitigates Astrocyte Cellular Edema Following Mild Traumatic Brain Injury. Sci Rep. 6, 33330 (2016).
- Lam, N. T., Muldoon, T. J., Quinn, K. P., Rajaram, N., Balachandran, K. Valve interstitial cell contractile strength and metabolic state are dependent on its shape. Integr Biol (Camb). 8 (10), 1079-1089 (2016).
- Tandon, I., et al. Valve interstitial cell shape modulates cell contractility independent of cell phenotype. J Biomech. 49 (14), 3289-3297 (2016).
- Cockshell, M. P., Bonder, C. S. Isolation and Culture of Human CD133+ Non-adherent Endothelial Forming Cells. Bio-Protocol. 6 (7), (2016).
