Summary
이 프로토콜의 목표는 내 피 뿌리 탯 줄 혈액에서 세포를 분리. 조직 설계 만드는 혈관 및 심장 밸브 구성 및 응용 프로그램의 일부는 biomarker로 심혈 관 위험, 허 혈 성 질환 치료 환자를 식별 하는 데 이러한 세포를 사용 하 여 포함 됩니다.
Abstract
내 피 조상 세포 (Epc) 말 초 혈액에서의 존재와 vasculogenesis에의 참여 Ashara와 동료1에 의해 처음 보고 되었다. 나중에, 다른 비슷한 유형의 골2,3에서 발생 하는 Epc의 실존 문서화. 더 최근에, 요더와 Epc 탯 줄 혈액에서 파생 했다 잉 그램은 높은 증식 잠재력 성인 주변에서 고립 된 사람에 비해 혈액4,,56했다. 출생 후 vasculogenesis에 참여 하 고, 떨어져 Epc 또한 나타났습니다 약속 만드는 조직 설계 혈관 및 심장 밸브 구조7,8셀 원본으로. 존재 하는 다양 한 격리 프로토콜, 일부는 포함 하는 단 세포 (MNCs) 내 피 및 조 혈 마커의 도움으로 설명한 소스에서 파생 된 셀 정렬 또는 특수 내 피 성장 이러한 MNCs를 경작 중간, 또는 이러한 기법9의 조합. 여기, 선물이 고립에 대 한 프로토콜 및 사용 하 여 Epc의 문화 전문 내 피 중간 immunosorting, 뒤에 서쪽에 게 더 럽 히기을 사용 하 여 격리 된 세포의 특성의 사용 없이 성장 인자를 보충 하 고 immunostaining입니다.
Introduction
여러 조사 특성 및 인간의 Epc5,,1011,,1213의 잠재력을 공부 했다. Epc 세포 저 산소 증, 허 혈, 부상, 또는 종양 형성의 사이트에 내 피 조직에 고착 하 고 새로운 혈관 구조4,14의 형성에 기여 하는 능력을가지고 순환 이라고 할 수 있습니다. 출생 후 vasculogenesis의 형태로 neovascularization에 그들의 관찰된 관련 이상 이러한 세포의 치료 응용 프로그램4,15, 에 그들의 사용에 대 한 이해를 주도하 고 있다 16. 개인의 Epc 수 심장 혈관 병 리9,15,,1617,18,19와 상관을 보였다 ,20. 다른 연구는 Epc 밸브 구와 같은 표현 형으로 분화 또한 있고이 세포 조직 공학 심장 밸브7,21사용할 수 제안.
Epc를 분리 하는 데 필요한 특정 세포 표면 분자는 하지 명확 하 게 확인 되었습니다 조사4사이 불일치 때문에. 다양 한 문화 조건에 노출 특정 매트릭스 MNCs의 접착 여러 그룹1,17,,2223, putative Epc 수 있습니다 제안에 의해 수행 되었습니다. 다른 phenotypic 속성을 표시 합니다. 이러한 속성에는 phagocytotic, Matrigel에 관 형성 능력과 Dil acetylated 저밀도 지 단백질의 이해의 부족 포함 됩니다. 높은 clonogenic 및 증식 잠재력 어떤 Epc hierarchized5수 하는 두 개의 속성이 있습니다. Epc 또한 생체 외에서 tubules 때 인간의 태아 폐 섬유 아 세포4cocultured를 형성할 수 있습니다. 이 세포는 내 피 세포 표면 마커를 표현 하 고 조 혈 마커13,,2425의 일부를 공유 하 알려져 있습니다. 긍정적으로 표현된 마커를 형질 Epc에 대 한 널리 받아들여진다는 CD31, CD34, 혈관 내 피 성장 인자 수용 체 2 (VEGFR2), 폰 Willebrand 인자 (vWF), CD133, c-Kit 및 혈관 내 피 cadherin (VE-cadherin)4 , 18. 공동 CD90, CD45, CD14, CD115, 또는 알파-부드러운 근육 걸 (α-SMA)를 표현 하는 세포 phagocytose 박테리아와 드 노 보 인간을 형성 하는 무 능력을 그들의 한정 된 증식 잠재력, 능력 때문에 Epc 수로 간주 되지 않습니다 선박 vivo에서4,7. 이 문서는 수정 된 프로토콜 프로토콜 정렬 셀에 대 한 필요 없이 인간 탯 줄 혈액에서 내 피 조상 세포의 고립에 대 한 설명. 이 문서에 대 한 CD31, CD34, 및 VEGFR2 부정적인 지표로 α-SMA와 긍정적인 마커로 사용 우리.
이 문서에서는, 우리는 분리 하 고 셀을 사용 하 여 정렬 없이 탯 줄 혈액에서 내 피 뿌리 세포를 배양 하는 방법 전문 성장 요인 (EGM) 보충 하는 내 피 성장 매체 제안 합니다. 이 EGM이 혈관 내 피 성장 인자 (VEGF)와 섬유 아 세포 성장 인자 (FGF), 생존, 확산, 그리고 내 피 세포26의 마이그레이션 향상 포함 되어 있습니다. 그것은 또한 포함 하는 셀;의 조약돌 형태를 유지 하는 의약품 인슐린 같은 성장 인자-1 (IGF-1), 신생 및 철새 기능; 그리고 헤 파 린,26의 중간 성장 요인의 향상 된 장기 안정성을 하면. 내 피 세포 배양에 추가 다른 성장 인자 자극 세포 증식 및 분화, EGF26 하 셀 sensitizes 날린 데 도움이 표 피 성장 인자 (EGF)와 보완을 포함 . 우리는이 특정 성장 매체를 사용 하 여 내 피 기저 매체 (EBM) 또는 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM)에 비해 Epc의 높은 숫자를 생성 보여줍니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
이 연구 아칸소 기관 검토 위원회 (승인 번호 16-04-722) 대학교의 승인을 실시 되었다. 탯 줄 혈액 단위 구 연산 인산 포도 당 (일일) 솔루션 아칸소 코드 혈액 은행에서 수집 그리고 저장에 대 한 요구 사항을 충족 하지 않았다 단위 연구에 대 한 기증 했다. 코드 혈액 단위 했다 주위 온도에 컬렉션의 24 시간 이내 실험실에 couriered.
1. 절연의 내 피 조상 세포 탯 줄 혈액에서
- 시 약의 준비.
인슐린 같은 성장 인자 (IGF)의 20 ng/mL, 1 µ g/mL 의약품, 5 ng/mL 재조합 인간 표 피 성장 인자 (rhEGF), 22.5 µ g/mL
- 준비 EGM 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)에 내 피 기저 매체 (EBM)을 추가 하 여 보완 헤 파 린, 그리고 0.5 ng/mL 혈관 내 피 성장 인자 (VEGF)와 10 ng/mL의 재조합 인간 섬유 아 세포 성장 인자 B (rhFGF-B), 0.2 µ g/mL 날린, 2% 페니실린-스-글루타민. 0.2 µ m polyethersulfone (PES) 멤브레인 진공 필터를 사용 하 여 배양 소독.
- 준비 쥐 나 콜라겐 솔루션 0.02 N 초 산을 사용 하 여 50 µ g/mL의 농도에서 꼬리. 0.2 µ m 주사기 필터를 사용 하 여이 솔루션을 소독.
- 사전 코트 6-잘 접시 준비 쥐의 2 개 mL 나 각 잘 콜라겐 솔루션 꼬리. 뿌리기 전에 5% CO 2와 적어도 1 시간 동안 37 ° C에서 유지 하는 인큐베이터에 배치.
- 탯 줄 혈액으로 행 크 균형 소금 솔루션 (HBSS) 1:1 농도의 약 25 mL를 희석.
- 준비 라디오 면역 강 수 분석 결과 150 m m 염화 나트륨, 1% 트라이 톤 X-100, 0.5% 나트륨 deoxycholate, 1 m m β-glycerophosphate, 0.1 %SDS, 및 50 mM Tris (pH 8.0)를 사용 하 여 (RIPA) 버퍼.
- 내 피 조상 세포의 고립.
- 따뜻한 모든 준비 물 목욕 격리 전에 37 ° C에서 유지 시 약.
- 밀도 그라데이션 중간 시 약 20 mL 50 mL 원심 분리기 튜브 추가.
- 신중 하 게 20 mL 튜브의 측면 벽 쪽으로 피 펫을 목표로 하 여이 레이어를 깨지 않고 밀도 그라데이션 매체를 포함 하는 원심 분리기 튜브에 희석된 코드 혈액의 레이어.
- 에서 원심 분리기 회전자의 브레이크와 함께 실 온에서 30 분 동안 800 x g에서 centrifuging 그들의 밀도 ( 그림 1)에 따라 혈액의 구성 요소를 구분 합니다. 다른 레이어를 방해 하지 마십시오.
- 다른 셀 피 펫 팁 MNC에 도달할 수 있게 될 때까지 레이어 레이어 ( 그림 1 참조)을 방해 하지 않고 튜브에서 신중 하 게 pipetting으로 플라즈마 레이어를 제거 합니다. 제거 된 플라즈마 삭제.
참고: 피 펫 팁을 사용 하 여 플라즈마를 제거를 하는 동안 떠나 MNC 레이어 ( 그림 1) 장애를 줄이기 위해 위에 플라즈마의 작은 층. - MNCs 18 게이지 바늘에 장착 한 주사기를 사용 하 여 포함 된 버 피 코트를 수집 하 고 신선한 원심 분리기 튜브 전송.
- EBM의 동일한 볼륨 수집된 MNCs. 원심 분리기를이 관에 추가 10 분 동안 500 x g 4에 ° C. 삭제는 상쾌한.
참고: 셀 펠 릿 나타납니다 붉은 적혈구/적혈구의 존재 때문에. - 붉은 혈액 세포를 lyse 염화 염화 물 해결책의 5 mL를 추가 합니다. 가끔 흔들어와 5-10 분 동안 얼음이 튜브를 품 어.
참고: 주의 고려 해야한다이 단계 동안에 지속 시간을 초과 하지 그것은 MNCs에 유해할 수 있다. - 원심 4 ° C에서 10 분 동안 500 x g에서 튜브와 삭제는 상쾌한. 적혈구 계속 되 면, 단계 단계를 반복 1.2.8 및 1.2.9 아니 붉은 색 펠 릿에서 관찰 됩니다.
- 준비 EGM에 펠 릿을 resuspend를 사용 하는 hemocytometer는 MNCs 계산.
- Aspirate 쥐 꼬리를 나 콜라겐 코팅 6 잘 플레이트 (1.1.3 단계)에서 고 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 1와 3 번 웰 스 세척.
- 1 x 10 7에 각 잘 MNCs의 농도에 콜라겐 플레이트 EGM에 resuspended MNC 펠 렛 씨앗. 37 ° C, 5% CO 2 배양 기에.
- 후 24 h 매체를 발음 하 고 한번 EGM와 웰 스를 씻어. 각 잘을 EGM 매체의 3 mL를 추가 하 고 37 ° C, 5% CO 2 배양 기에 다시 배치.
- 신선한 EGM 매체와 접시 7 일 동안 매일 보충. 7 일 후 변경 EGM 매체 매일.
- 식민지 내 피 세포의 진행을 추적 하기 위해 매일 6 잘 플레이트의 이미지를 받아 밝은 분야 현미경을 사용 하 여. 식민지 그들의 성장을 위해 발생 하는 플레이트 표시.
참고: 그것은 일반적으로 5 ~ 9 일 문화에 식민지를 위한 걸립니다.
- 내 피 조상 세포의 확장.
- 코트 쥐와 T-25 문화 플라스 크 나 콜라겐 (50 µ g/mL) 꼬리를 37 ° C, 5% CO 2 인큐베이터 적어도 60 분 Aspirate에에서 배치 하 고 셀을 뿌리기 전에 1 x PBS와 세 번 T-25 셀 문화 플라스 크를 씻고.
- Trypsinize 내 피 세포 식민지 각 우물에서 0.05% 트립 신-EDTA 용액의 150 µ L를 사용 하 여 크기 약 3 m m를 도달할 때. 6 잘 플레이트 37 ° C, 5% CO 2 배양 기 2-3 분에 대 한 다시 넣습니다
- 는 부드럽게 연결 된 셀을 꺼내 려 6 잘 플레이트를 누릅니다. 즉시 EGM의 2 개 mL를 추가 하 고 15 mL 원심 분리기 튜브에 세포를 복구.
- 는 hemocytometer를 사용 하 여 셀의 개수 및 초기 시드 밀도 계산.
- 스핀 15 mL 원심 분리기 튜브 5 분에 대 한 400 x g에서 EGM에 셀 펠 릿 Resuspend 고 ~ 500000 셀 T-25 플라스 크를 시드합니다. 통로 1이 술병을 표시 하 고 37 ° C, 5% CO 2 배양 기에 다시 T-25 플라스 크를 배치.
참고: 셀은 EBM과 DMEM EGM와 성장 비교에서 도금 될 수 있다. - 추가 구절에 대 한 플라스 크에 도달 하면 90% 합류, 단계 1.3.1-1.3.5 고 T-75 또는 T-175 셀 문화 플라스 크에 10 4 셀/c m 2에서 셀을 다시 시드합니다. 고립 된 세포 (2 단계와 3 단계)의 특성을.
2. 격리 된 셀 사용 하 여 서 부 럽의
격리 된 셀 특성 확장 단계를 따라 모든 통로에- 추가 50-100 µ L의 세포의 용 해 버퍼. 약 500000 이상의 세포에서 단백질을 수집.
- 세포 파열 풀어 단백질을 적극적으로 위쪽 및 아래쪽 플라스틱. 수집 하 고 전송 버퍼 microcentrifuge 튜브.
- 500 x g에서 microcentrifuge 튜브를 회전 하 고 신중 하 게 새로운 microcentrifuge 튜브에는 상쾌한 전송. 레이블 및 장기 저장을 위한-80 ° C에서 튜브를 저장.
- 어느 브래드 퍼 드를 사용 하 여 각 튜브에 있는 단백질의 양을 계량 ' s 또는 BCA 시험 27 , , 28 29.
- 서양 blotting 표준 절차 27 , , 28 29를 사용 하 여 수행 합니다. 5 µ g CD31, CD34, VEGFR2, 및 α-SMA의 표현에 대 한 총 단백질의 분석. 데이터 정규화에 대 한 α-tubulin 사용.
3. 간접 면역 형광
- Sonicate 50% 에탄올에서 18 m m 유리 coverslips 고 그들을 건조. 두고 깨끗 한 coverslips biosafety 두건에서 하룻밤 12-잘 접시에 UV 빛에 그들을 소독.
- 코트 50 & # 18와 coverslips1; g/mL의 쥐 나 콜라겐 꼬리 및 접시를 37 ℃, 5% CO 2 배양 기 적어도 60 분에 대 한 전송
- 는 콜라겐을 발음 하 고 씻고는 coverslips 12-잘 접시에 1 x PBS의 1 mL를 추가 합니다. 1 x PBS를 발음 하 고 두 번 반복.
- 씨앗 250000 경작에 각 잘 37 ° C, 5% CO 2 배양 기 immunostaining를 수행 하기 전에 적어도 3 일 동안 다시 Epc.
- 세척 3 번 1 x PBS 가진 접시. 각 우물에 얼음 처럼 차가운 메탄올의 1 mL을 추가 하 고 셀을 해결 하기 위해 15 분 동안 실 온에서 품 어.
- Immunostaining 표준 프로토콜 27 , , 28 29를 사용 하 여 수행 합니다. 그들의 적절 한 희석에 항 체를 사용 하 여 (예를 들어, CD31 (1:20), CD34 (1:50), α-SMA (1: 100), 및 VEGFR2 (1:50)).
- Epifluorescence 현미경을 사용 하 여 immunostained coverslips의 이미지.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
절연 및 내 피 조상 세포의 확장:
회로도 (그림 1) 전체 프로토콜을 묘사한 제공 됩니다. 다른 혈액 구성 요소 레이어 밀도 밀도 그라데이션 매체와 인간 탯 줄 혈액의 그라데이션 원심 다음 관찰 되었다. 콜라겐 치료 접시에 MNCs를 시드 시 식민지의 파생물 일 5와 7 (그림 2A) 사이 처음 관찰 되었다. 이러한 식민지 성장을 계속 하 고 나중 조약돌 모양의 형태 (그림 2E-2 층) 진행 초기 단계에서 스핀 들 모양의 세포 형태학 (그림 2A-2D)를 했다. 그림 3 A 문화, 시간 대 셀의 총 수를 표시 하 고 각 데이터 요소는 각 통로에 수확 하는 셀의 누적 수를 나타냅니다. 그림 3 B 첫 번째 식민지는 MNCs 시드 후 콜라겐 치료 6 잘 플레이트에서 발생 하는 평균 시간을 보여 줍니다.
서쪽에 게 더 럽 히기을 사용 하 여 특성:
그림 4 A 대표 결과 서쪽의 오 점 막 다양 한 항 체에 대 한 테스트를 보여줍니다. 우리의 결과 셀 CD31와 CD34 긍정 했다 건의 한다. CD31의 식 (그림 4B)와 CD34 (그림 4C) 등장 이후 구절 감소 반면 VEGFR2 (그림 4D) 첫 번째 이후 구절에서 동등 하 게 표현 했다 통로 높은 식은 데입니다. 우리는 또한는 Epc 엽 세포 마커 α-SMA (그림 4E)을 표현 하지 않았다 관찰. 인간의 배꼽 정 맥 내 피 세포 (HUVEC)와 판 막 병 중간 셀 (VIC) 세포 lysates 각각 양수와 음수 컨트롤로 사용 되었다. HUVECs는 표현 CD31, CD34, VEGFR2, 피해 자들은 α-SMA 표현으로 알려져 있습니다.
그림 1 : EPC 격리의 도식. HBSS와 밀도 그라데이션 매체 위에 그것을 신중 하 게 레이어 링 diluting 코드 격리 혈액을 같이 시작 합니다. 계층화 된 혈액의 밀도 그라데이션 원심 MNCs (버 피 코트), 밀도 그라데이션 매체, granulocytes, Rbc의 구성 된 혈액의 고유한 레이어를 얻기 위해 수행 됩니다. 제공 하는 하위 집합 이미지는 이러한 여러 계층을 보여 줍니다. MNCs는 수집 하 고 콜라겐 치료 세포 배양 접시에 다시 시드해야. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . 셀 서식의 진행. (A-E) 시간이 지남에 EPC 식민지 진행의 대표적인 밝은 필드 이미지. 참고 식민지는 조약돌 형태를 채택 하는 초기 단계에서 스핀 들 모양의 세포. (E) 통로 3에 T-75 플라스 크에서 경작 하는 EPC의 대표 이미지. 눈금 막대 = 200 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: Epc의 성장 곡선. (A) 시간의 기간 동안 성장 하는 셀의 수를 묘사 하는 그래프 및 데이터 포인트의 각 셀을 나타냅니다 번호 각 통로 (P0-P10) 동안 수확 (n = 4). 6 잘 플레이트에 나타나는 첫 번째 EPC 식민지에 대 한 (B) 시간 (n = 4). 오차 막대는 평균 (SEM)의 표준 오차를 나타냅니다. 아니 통계적 의미는 일방통행 ANOVA를 사용 하 여 발견 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 서 부 럽. (A) 서쪽 오 점 막 분리 다양 한 항 체로 얼룩진 HUVEC lysate과 빅 lysate 긍정적인 컨트롤으로 사용 되었다. (B) α-tubulin와 정규화 CD31 밴드의 평균 강도. (C)와 α-tubulin 정규화 CD34 밴드의 평균 강도. (D)와 α-tubulin 정규화 VEGFR2 밴드의 평균 강도. Α-SMA 밴드의 평균 강도 (E)와 α-tubulin 정규화 (n = 3-6). 오차 막대 표시는 SEM. 아니 통계적 의미는 일방통행 ANOVA를 사용 하 여 발견 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: Immunostaining. Epc CD31, CD34, VEGFR2, 및 α-SMA를 위한 7 일 및 다양 한 구절에서 immunostained EGM에서 경작의 대표 이미지. 눈금 막대-100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 그림 1: 7 일의 기간 동안 단위 면적 당 셀의 수를 묘사 하는 그래프 EGM, EBM, 및 DMEM 배양 할 때. EGM은 미디어 (EBM 및 DMEM)에 비해 더 높은 세포 성장을 보였다. 데이터 통계적 의미, p 보여주었다 < 0.01, 일방통행 ANOVA를 사용 하 여 (n = 2). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
/ > 보충 그림 2: Epc CD31, CD34, VEGFR2, 및 α-SMA 7 일 및 immunostained EBM에서 경작의 대표 이미지. 눈금 막대 = 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 그림 3: Epc CD31, CD34, VEGFR2, 및 α-SMA 7 일 및 immunostained DMEM에 교양의 대표 이미지. 눈금 막대 = 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
앞에서 설명 했 듯이, 점착 Epc 조약돌 형태를가지고 있습니다. 우리의 절연된 MNCs 진행 스핀 들 모양의 셀 식민지 (그림 2A 2D)에서 초기 단계에 조약돌 식민지 (그림 2E-2 층) 문화에 10 일의 기간 동안. Epc는으로 분류 되었습니다 다른 연구 그룹에 의해 다르게 즉 늦은 내 피 조상 세포10, 셀5또는 내 피 조상 세포12형성 내 피 식민지. 이 세포는 기능적으로 동일 및 유사한 세포 표면 마커 익스프레스 주목 한다. 기간 문화 (그림 3) 거의 108 셀 이전 게시에 유사한과 Epc3,5의 높은 증식 가능성의 증가 관찰 하는 셀의 수입니다. 실제로, 그것은 Epc 성인 인간 주변 혈액5 에서 고립 된 Epc에 비해 노화를 진행 하기 전에 높은 증식 잠재력과 시연 여러 인구 doublings를 보여준 인간 탯 줄 혈액에서 얻은 발견 , 10.
우리의 서쪽 더 럽 히 결과(그림 4)에 긍정적인 통제, HUVEC에 비해 Epc에서 얻은 세포 lysates CD31, CD34, 및 VEGFR2의 존재를 보여주었다. HUVECs는 CD31, CD34, VEGFR2을 표현 하 고 빅 익스프레스 α-sSMA 활성화. 이전 보고서10,18마찬가지로 CD31 표현의 높은 통행으로 감소. 식 패턴 또한 CD34 및 VEGFR2, 어디 두 마커 첫 대목에서 고 나중 구절에서 상대적으로 낮은 하지만 동일한 금액에 강력 하 게 표현 했다 유사 했다. 이 데이터는 이전 그룹의 결과, immunosorting 기반 프로토콜 코드 혈액 파생 Epc12를 격리 하는 데 사용 되었다와 그 추세를 보여줍니다. 일반적으로, Epc 엽 마커를 표현 하지 않는 고, 고립 된 세포 자연, 엽 되지 않았습니다 확인 하려면 우리 immunolabeled α-SMA와 우리의 서쪽 오 점 막. 우리의 결과 명확 하 게 긍정적인 통제 세포 lysates 피해자, α-SMA 항 체의 강한 식 전시에서 수집한에 비해 교양된 Epc에 α-SMA 식이 없는 다는 것을 보여준다.
EGM Epc에 대 한 사용 되는 다른 문화 매체에 비해 증가 세포 증식에 대 한 허용을 보여 우리 미디어의 세 가지 유형의 셀 배양: DMEM, EBM, 그리고 EGM (즉, 앞에서 설명한 대로 성장 인자를 보충 하는 EBM). 모두 10% 보충 되었다 FBS. 우리는 12-잘 접시의 각 음에 다른 구절의 셀 시드. 추가 그림 1 문화 다른 미디어 공식에 시간이 지남에 따라 각 잘에서 단위 면적 당 셀 수를 보여 줍니다. 우리는 EGM에 교양된 Epc 나타났다 꾸준한 증가 셀 수에 셀, EBM에 대 한 거기 plateaued 이후 첫 3 일 동안 셀 수에서 증가의 느린 속도 참고. 이 Epc, EBM에 여전히 살아남을 수 있지만 성장 요인의 부재 지체 확산 나왔다. 우리는 또한 그 Epc 교양 DMEM 감소 번호에 제안 하는 특정 중간 배합이 그들의 생존 또는 확산에 적합 하지 않습니다 것을 유의 하십시오. Immunostaining 데이터 EGM (그림 5)에서 교양된 Epc CD31 EBM (보충 그림 2)와 DMEM (보충 그림 3)에서 경작 하는 Epc에 비해 더 많은 표현 보여줍니다. 추가 그림 2 와 그림 3 추가 그림 5 를 비교, 그것은 볼 수 있습니다 세포는 다른 세포 유형으로 오염 되지 했다. 또한, immunostained Epc (그림 5)을 비교할 때 우리 수 질적 상태 CD31 표현 CD34 높은 구절 이상 감소 지원 우리의 서쪽 오 점 데이터 (그림 4).
거듭, 우리의 제안 된 프로토콜의 기본 목표는 입증 한 자란 혈액 MNCs 전문된 선택적 미디어에 의해 내 피 뿌리 세포를 분리할 수입니다. 이것은 Epc 정교한 장비 및 절차, cytometry-MNC 절연1,,320 직후 어느 쪽이 든의 사용을 포함 하는 다른 방법과 달리 없이 고립 될 수 있다 표시 하 , 30 또는 식민지로 단층-성장 후4,10,12,13,23replating 다음. EPC 식민지 일 5와 9 사이 일반적으로 나타납니다. 우리의 방법은 따라서 Epc를 격리 하기 위한 신속 하 고 비용 효율적인 방법이입니다. 이 기술의 주요 한계 CD31 CD34의 식 세포의 조상 형을 잃고 있다 제안 수 후속 통행으로 감소 이다. 따라서, 한 경우이 프로토콜을 사용 하 여 실험을 실시 5 또는 더 낮은 통로에서 얻은 세포를 사용 해야 하는 것이 좋습니다.
한다 주의 밀도 원심 분리 후에 후드에 centrifuged 튜브를 다시 찍을 때 다른 레이어를 방해 하지도 플라즈마를 제거할 때. 또 다른 중요 한 단계는 적혈구 세포의 용 해, 장시간 보육 잠재적으로 MNC를 손상 될 수 있습니다 어디에 적용 됩니다. 그것은 따라서 하지 두 번 이상이 단계를 반복 하는 것이 좋습니다. 사실, 중간 포부를 도금 후 24 h를 실시, 이후 상당량 적혈구의 제거 됩니다, 그들은 비 부착. Fibronectin 또는 젤라틴 같은 대체 기판, 우리가 테스트 하지 동안 사용할 수 있습니다 또한 특정 프로토콜에 따라 만드는 셀 문화 코팅. 초기 단계에서 사소한 수정, 채용 연구원 비 점착 Epc30을 격리 수 있습니다.
결론적으로, 우리는 탯 줄 혈액에서 Epc를 분리 하는 방법을 보고 있다. 그것은 그는 Epc 표현 하지 않는 α-SMA, 같은 마커 제안 하지 엽 같은 셀 다는 것을 주의 하는 것이 중요. 실제로, α-SMA는 Epc의 내 피 엽 전환 (엔도-몬태나) 연구 하려고 할 때 중요 한 표식으로 제공 합니다. 엔도-몬태나는 세포 transdifferentiation 프로세스는 내 피 세포는 그들의 특정 마커를 잃고 고 엽 같은 세포 표현 형을 변환할. 그것은 보였다 Epc 변형 성장 인자-β7 의이 변화를 받을 수 있습니다 그리고 그들의 조직 설계 건설 기계8 세포 외 막 단백질을 풀어 놓을 수 있다. 이러한 모든 관측 심장 밸브 또는 다른 심장 혈관 조직 설계 구조를 만들려고 헌 셀 원본으로 사용 하기 위해 Epc의 약속을 나타냅니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 자료는 부여 번호 아래 국립 과학 재단에서 지 원하는 작업 기반 CMMI 1452943 고 아칸소 대학 명예 대학에 의해. 우리 또한 아칸소 코드 혈액 은행 코드 혈액 단위를 제공 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A) For isolation and culturing | |||
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | This product comes with all the growth factors needed to make the Endothelial Growth Medium |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher Scientific | 26140079 | |
| Pencillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| Ficoll-Paque | GE Heatlhcare | 17-1440-02 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Thermofisher Scientific | 14170-112 | |
| Ammonium Chloride | Stem Cell Technologies | 7850 | |
| 1x Phosphate Buffer Saline | Thermofisher Scientific | 14190250 | |
| Rat Tail I Collagen | Corning | 354236 | |
| Glacial Acetic Acid | Amresco | 0714-500ML | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| HEPES buffer | Thermofisher Scientific | 15630080 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Thermofisher Scientific | 10566-016 | |
| B) Antibodies and cell lysates | |||
| CD31 | Abcam | ab28364 | 1:250 dilution for Western blotting |
| CD34 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7045 | 1:100 dilution for Western blotting |
| α-SMA | abcam | ab5694 | 1:100 dilution for Western blotting |
| α-tubulin | abcam | ab7291 | 1:2,500 dilution for Western blotting |
| VEGFR2 | abcam | sc504 | 1:100 dilution for Western blotting |
| Human umbilical vein endothelial cell lysate | Santa Cruz Biotechnology | sc24709 | |
| Valve interstitial cell lysate | Primary cell line cultured from own lab and lysed with RIPA buffer | ||
| C) Western blotting and immunostaining | |||
| 10x Tris/Glycine/SDS buffer | Biorad | 161-0772 | Used as running buffer |
| 10x Tris/Glycine buffer | Biorad | 161-0771 | Used as transfer buffer |
| Immobilon-FL transfer membrane | Merck Millipore | IPFL0010 | This is a PVDF transfer membrane that has 45 µm pore size and is mentioned in the protocol as western blot membrane |
| 4x Laemmli sample buffer | Biorad | 161-0747 | |
| 2-mercaptoethanol | Biorad | 161-0710 | |
| 10% Criterion TGX precast gel | Biorad | 5671033 | |
| Prolong Gold antifade | Thermofisher Scientific | P36930 | Used for mounting immunostained coverslips for long term storage |
| Methanol | VWR Analytical | BDH1135-4LP |
References
- Asahara, T., et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 275 (5302), 964-967 (1997).
- Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. J Clin Invest. 105 (1), 71-77 (2000).
- Shi, Q., et al. Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells. Blood. 92 (2), 362-367 (1998).
- Hirschi, K. K., Ingram, D. A., Yoder, M. C. Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (9), 1584-1595 (2008).
- Ingram, D. A., et al. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood. 104 (9), 2752-2760 (2004).
- Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).
- Sales, V. L., et al. Transforming growth factor-beta1 modulates extracellular matrix production, proliferation, and apoptosis of endothelial progenitor cells in tissue-engineering scaffolds. Circulation. 114, 1 Suppl 193-199 (2006).
- Sales, V. L., et al. Endothelial Progenitor Cells as a Sole Source for Ex Vivo Seeding of Tissue-Engineered Heart Valves. Tissue Eng Pt A. 16 (1), 257-267 (2010).
- Liew, A., Barry, F., O'Brien, T. Endothelial progenitor cells: diagnostic and therapeutic considerations. Bioessays. 28 (3), 261-270 (2006).
- Hur, J., et al. Characterization of two types of endothelial progenitor cells and their different contributions to neovasculogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24 (2), 288-293 (2004).
- Ingram, D. A., Caplice, N. M., Yoder, M. C. Unresolved questions, changing definitions, and novel paradigms for defining endothelial progenitor cells. Blood. 106 (5), 1525-1531 (2005).
- Melero-Martin, J. M., et al. In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells. Blood. 109 (11), 4761-4768 (2007).
- Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. Chapter 13. An in vivo experimental model for postnatal vasculogenesis. Methods Enzymol. 445, 303-329 (2008).
- Yoder, M. C.
- Siddique, A., Shantsila, E., Lip, G. Y. H., Varma, C. Endothelial progenitor cells: what use for the cardiologist. J Angiogenes Res. 2 (6), (2010).
- Camci-Unal, G., et al. Surface-modified hyaluronic acid hydrogels to capture endothelial progenitor cells. Soft Matter. 6 (20), 5120-5126 (2010).
- Hill, J. M., et al. Circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk. N Engl J Med. 348 (7), 593-600 (2003).
- Young, P. P., Vaughan, D. E., Hatzopoulos, A. K. Biologic properties of endothelial progenitor cells and their potential for cell therapy. Prog Cardiovasc Dis. 49 (6), 421-429 (2007).
- Mehta, J. L., Szwedo, J. Circulating endothelial progenitor cells, microparticles and vascular disease. J Hypertens. 28 (8), 1611-1613 (2010).
- Nevskaya, T., et al. Circulating endothelial progenitor cells in systemic sclerosis are related to impaired angiogenesis and vascular disease manifestations. Ann Rheum Dis. 66, 67-67 (2007).
- Cebotari, S., et al. Clinical application of tissue engineered human heart valves using autologous progenitor cells. Circulation. 114, 1 Suppl 132-137 (2006).
- Ito, H., et al. Endothelial progenitor cells as putative targets for angiostatin. Cancer Res. 59 (23), 5875-5877 (1999).
- Vasa, M., et al. Increase in circulating endothelial progenitor cells by statin therapy in patients with stable coronary artery disease. Circulation. 103 (24), 2885-2890 (2001).
- Wu, X., et al. Tissue-engineered microvessels on three-dimensional biodegradable scaffolds using human endothelial progenitor cells. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (2), 480-487 (2004).
- Boyer, M., et al. Isolation of endothelial cells and their progenitor cells from human peripheral blood. J Vasc Surg. 31 (1), Pt 1 181-189 (2000).
- Huber, B., Czaja, A. M., Kluger, P. J. Influence of epidermal growth factor (EGF) and hydrocortisone on the co-culture of mature adipocytes and endothelial cells for vascularized adipose tissue engineering. Cell Biol Int. 40 (5), 569-578 (2016).
- Sturdivant, N. M., Smith, S. G., Ali, S. F., Wolchok, J. C., Balachandran, K. Acetazolamide Mitigates Astrocyte Cellular Edema Following Mild Traumatic Brain Injury. Sci Rep. 6, 33330 (2016).
- Lam, N. T., Muldoon, T. J., Quinn, K. P., Rajaram, N., Balachandran, K. Valve interstitial cell contractile strength and metabolic state are dependent on its shape. Integr Biol (Camb). 8 (10), 1079-1089 (2016).
- Tandon, I., et al. Valve interstitial cell shape modulates cell contractility independent of cell phenotype. J Biomech. 49 (14), 3289-3297 (2016).
- Cockshell, M. P., Bonder, C. S. Isolation and Culture of Human CD133+ Non-adherent Endothelial Forming Cells. Bio-Protocol. 6 (7), (2016).
