Summary
Målet med detta protokoll är att isolera endothelial stamceller från navelsträngsblod. Vissa applikationer inkluderar använder dessa celler som en biomarkör för att identifiera patienter med kardiovaskulär risk, behandling av ischemisk sjukdomar, och skapa vävnadstekniska vaskulär och hjärtat ventil konstruerar.
Abstract
Förekomsten av endothelial stamceller (EPC) i perifert blod och sitt engagemang i vasculogenesis rapporterades först av Ashara och kollegor1. Senare, dokumenterade andra förekomsten av liknande typer av EPCs med ursprung från benmärgen2,3. Mer nyligen, Yoder och Ingram visade att EPCs härrör från navelsträngsblod hade en högre proliferativ potential jämfört med sådana isolerade från vuxen perifert blod4,5,6. Förutom att vara involverad i postnatal vasculogenesis, har EPCs också visat löfte som en cell för att skapa vävnadstekniska vaskulär och hjärtat ventil konstruktioner7,8. Olika isolering protokoll finns, av vilka några innebär cell sortering av mononukleära celler (multinationella) härrör från de källor som tidigare nämnts med hjälp av endothelial och hematopoetiska markörer eller odla dessa multinationella företag med specialiserade endothelial tillväxt medium, eller en kombination av dessa tekniker9. Här presenterar vi ett protokoll för isolering och kultur av EPCs använder specialiserade endothelial medium kompletteras med tillväxtfaktorer, utan användning av immunosorting, följt av karakterisering av de isolerade celler med Western blotting och immunfärgning.
Introduction
Flera utredare har studerat egenskaper och potential av mänskliga EPCs5,10,11,12,13. EPCs kan beskrivas som cirkulerande celler som har förmåga att följa endothelial vävnad i platser av syrebrist, ischemi, skada eller tumörbildning och bidra till bildandet av nya vaskulära strukturer4,14. Deras observerade engagemang i kärlnybildning, i form av postnatal vasculogenesis, har lett till en förståelse av patofysiologin av dessa celler och deras användning i terapeutiska tillämpningar4,15, 16. antalet EPCs i en individ har visat sig vara korrelerade med kardiovaskulär patologi9,15,16,17,18,19 ,20. Andra studier har också differentierade EPCs till en ventil fibroblast-liknande fenotyp och föreslagit att dessa celler kan användas för vävnadsteknik hjärta ventiler7,21.
Viss cell surface molekyler behövs för att isolera EPCs inte tydligt har identifierats tack vare diskrepanser mellan utredningar4. Vidhäftningen av multinationella företag till en viss matris, med exponering för en mängd olika odlingsbetingelser, har utförts av flera grupper1,17,22,23, tyder på att förmodad EPCs kan Visa olika fenotypiska egenskaper. Dessa egenskaper omfattar brist phagocytotic förmåga, tube bildande i Matrigel och upptaget av Dil-acetylerade low-density lipoprotein. Den höga clonogenic och proliferativ potentialen är två egenskaper som EPCs kan vara hierarchized5. EPCs kan också bilda in vitro- tubuli när cocultured med mänskliga fostrets lunga fibroblaster4. Dessa celler är kända att Uttrycka endotelceller yta markörer och dela några av de hematopoetiska markörer13,24,25. De positivt uttryckt markörer som är allmänt vedertagna för fenotypning EPCs är CD31, CD34, vaskulär endotelial tillväxtfaktor receptor 2 (VEGFR2), von Willebrands faktor (vWF), CD133, c-Kit och vaskulär endotelial cadherin (VE-cadherin)4 , 18. celler som tillsammans uttrycker CD90, CD45, CD14, CD115 eller alpha-smooth muscle aktin (α-SMA) anses inte vara EPCs på grund av deras begränsade proliferativ potential, förmåga att phagocytose bakterier och oförmåga att bilda de novo mänskliga fartyg i vivo4,7. Denna artikel beskriver ett modifierat protokoll för isolering av endothelial stamceller från mänskliga navelsträngsblod utan behov av någon cell sortering protokoll. Den här artikeln använde vi CD31, CD34 och VEGFR2 som positiva markörer, med α-SMA som negativ indikator.
I denna artikel föreslår vi en metod att isolera och odla endothelial stamceller från navelsträngsblod utan cell sortering använder specialiserade endothelial odlingsmedium kompletteras med tillväxtfaktorer (EGM). Denna extra bolagsstämma innehåller vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF) och fibroblast tillväxtfaktor (FGF), som förbättrar överlevnad, spridning och migration av endotelceller26. Det omfattar även askorbinsyra, som är ansvarig för att upprätthålla kullersten morfologi av celler; insulin-liknande tillväxtfaktor-1 (IGF-1), som ger angiogena och flyttande funktion; och heparin, som orsakar förbättrad långsiktig stabilitet av tillväxtfaktorer i den medelstora26. Andra tillväxtfaktorer som tillsätts den endothelial cellodlingsmedium inkluderar tillskott med epidermal tillväxtfaktor (EGF), som hjälper till att stimulera cellproliferation och differentiering och hydrokortison, som väcker intresse cellerna att EGF26 . Vi visar att användningen av denna specifika odlingsmedium ger högre numrerar av EPCs jämfört endothelial basala medium (EBM) eller Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
denna forskning utfördes med godkännande av universitetar av Arkansas institutionella Review Board (godkännandenummer 16-04-722). Navelsträngen blod enheter samlades i citrat fosfat (CPD) glukoslösning på den Arkansas navelsträngsblod Bank, och enheter som inte uppfyller kravet för lagring skänktes för forskning. Sladd blod enheter var kurir till lab inom 24 h samling vid omgivningstemperaturer.
1. isolering av Endothelial stamceller från navelsträngsblod
- beredning av reagens.
- Förbereda bolagsstämman genom att lägga till endotel basala medium (EBM) 10% fetalt bovint serum (FBS) kompletteras med 20 ng/mL av Insulinliknande tillväxtfaktor (IGF), 1 µg/mL askorbinsyra, 5 ng/mL rekombinant human epidermal tillväxtfaktor (rhEGF), 22,5 µg/mL heparin och 0,5 ng/mL vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF), samt 10 ng/mL av rekombinant human Fibroblast growth factor B (rhFGF-B), 0,2 µg/mL hydrokortison och 2% penicillin-streptomycin-glutamin. Sterilisera odlingssubstratet med ett 0,2 µm polyetersulfon (PES) vakuum membranfilter.
- Förbered råtta svans jag kollagen lösning med en koncentration på 50 µg/mL med 0,02 N ättiksyra. Sterilisera denna lösning med ett 0,2 µm spruta filter.
- Före kappa 6-väl plattor med 2 mL beredd råtta svans jag kollagen lösning för varje brunn. Placera dem i en inkubator som underhålls på 5% CO 2 och 37 ° C i minst 1 h innan sådd.
- Späd ungefär 25 mL av navelsträngsblod med Hanks balanserad Salt lösning (HBSS) vid en koncentration av 1:1.
- Förbereda radio-immuno nederbörd assay (RIPA) buffert med 150 mM natriumklorid, 1% Triton x-100, 0,5% natriumdeoxikolat, 1 mM β-glycerofosfat, 0,1% SDS och 50 mM Tris (pH 8,0).
- Isolering av endothelial progenitorceller.
- Varma alla beredda reagens i ett vattenbad som hålls vid 37 ° C före isoleringsperioden.
- Tillsätt 20 mL av täthet lutning medium reagens till en 50 mL centrifugrör.
- Noggrant lager 20 mL utspädd navelsträngsblod i centrifugröret innehållande täthet lutning medium utan att bryta detta lager genom att sikta pipetten mot sidoväggarna i röret.
- Separera komponenterna i blodet baserat på deras densiteter ( figur 1) genom centrifugering vid 800 x g i 30 min i rumstemperatur, med bromsarna på centrifugrotorns off. Stör inte de olika lagrarna.
- Ta bort plasma lagret av noggrant pipettering det ur röret utan att störa andra cell lager tills pipettspetsen är kunna nå MNC lager (se figur 1). Kasta bort plasma.
Obs: När du använder pipettspetsar ta bort plasma, lämna en liten lager av plasma över MNC skiktet ( figur 1) för att minska störningar. - Samlar de buffy coat som innehåller de multinationella företag med hjälp av en spruta till en 18 gauge nål och överföra det till ett färskt centrifugrör.
- Lägga till en lika stor volym av EBM i insamlade multinationella. centrifugen dessa rör vid 500 x g under 10 minuter vid 4 ° C. Kassera supernatanten.
Obs: Cellpelleten visas röda på grund av förekomsten av röda blodkroppar/erytrocyter. - Tillsätt 5 mL ammoniumkloridlösning att lysera röda blodkroppar. Inkubera denna tube på is för 5-10 min, med enstaka skakar.
Obs: Bör vara försiktig under detta steg inte överskrider tidslängden, eftersom det kan vara skadligt för multinationella. - Centrifugera rören vid 500 x g i 10 minuter vid 4 ° C och kasta bort supernatanten. Om erytrocyter kvarstår, upprepa steg 1.2.8 och 1.2.9 tills ingen röd färg observeras i pelleten.
- Återsuspendera pelleten i beredda extra bolagsstämma och använda hemocytometer för att räkna multinationella.
- Aspirera råtta svans jag kollagen-belagd 6-well plate (från steg 1.1.3) och Tvätta brunnarna tre gånger med 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Utsäde MNC pelleten resuspended i extra bolagsstämma till kollagen plattan med en koncentration på 1 x 10 7 multinationella företag i varje brunn. Placera den i 37 ° C, 5% CO 2 inkubator.
- Efter 24 h, sug ut mediet och Tvätta brunnarna en gång med extra bolagsstämma. Tillsätt 3 mL extra bolagsstämma medium till varje brunn och placera den tillbaka i 37 ° C, 5% CO 2 inkubator.
- Fylla plattan med färska EGM medium varje dag i 7 dagar. Efter 7 dagar, ändra extra bolagsstämma medium varannan dag.
- Med ljusa fält Mikroskop, ta bilder av 6-väl plattan varje dag för att spåra utvecklingen av endotelceller kolonier. Markera den plattan där kolonierna uppstår att hålla koll på deras tillväxt.
Obs: Det tar vanligtvis mellan 5 och 9 dagar för kolonierna att visas i kultur.
- Expansion av endothelial stamceller.
- Coat T-25 kultur kolven med råtta svans jag kollagen (50 µg/mL) och placera den i 37 ° C, 5% CO 2 inkubator i minst 60 min. Aspirera och tvätta T-25 cell kultur kolven tre gånger med 1 x PBS före sådd cellerna.
- Trypsinize endotelceller kolonierna när de når ca 3 mm i storlek med 150 µL 0,05% Trypsin-EDTA-lösning i varje brunn. Placera 6-väl plattan tillbaka i de 37 ° C, 5% CO 2 inkubator för 2-3 min.
- Knacka försiktigt 6-väl plattan för att rubba de bifogade cellerna. Omedelbart och tillsätt 2 mL av extra bolagsstämma och återvinna cellerna i en 15 mL centrifugrör.
- Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer och beräkna det ursprungliga sådd densitet.
- Spin 15 mL centrifugen rör vid 400 x g för 5 min. Återsuspendera cellpelleten i extra bolagsstämma och utsäde T-25 kolven med ~ 500 000 celler. Markera denna kolv som Passage 1 och placera T-25 kolven tillbaka i 37 ° C, 5% CO 2 inkubator.
Obs: Celler kan beläggas i EBM och DMEM jämföra tillväxten med EGM. - För ytterligare passager, när kolven når 90% sammanflödet, Följ steg 1.3.1 - 1.3.5 och Reseeda cellerna på 10 4 celler/cm 2 på T-75 eller T-175 cell kultur kolvar. Gå vidare till karakterisering av de isolerade cellerna (steg 2 och 3).
2. Karakterisering av isolerade celler använder Western Blotting
- Lägg till 50-100 µL av Lys buffert vid varje passage när stegen expansion att karakterisera de isolera cellerna. Samla proteiner från cirka 500 000 eller fler celler.
- Pipettera upp och ner kraftigt att brista cellerna och släppa proteinerna. Samla in och överföra bufferten till en mikrocentrifug rör.
- Snurra mikrocentrifug röret vid 500 x g och överför noggrant supernatanten till ett nytt mikrocentrifug rör. Etikett och förvara rören vid-80 ° C för långsiktig lagring.
- Kvantifiera mängden proteiner i varje rör använder antingen Bradford ' s eller BCA assay 27 , 28 , 29.
- Utföra Western blotting använder standardprocedurerna 27 , 28 , 29. Analysera 5 µg totalt protein för uttrycket av CD31, CD34, VEGFR2 och α-SMA. Använda α-tubulin för att normalisera data.
3. Indirekt immunofluorescens
- Sonikera 18-mm glas coverslips i 50% etanol och torka dem. Lämna den rena coverslips i en 12-well platta övernattning i biosäkerhet huven med en UV-ljus på att sterilisera dem.
- Coat coverslips med 50 & #181; g/mL av råtta svans jag kollagen och överföra plattan till en 37 ° C, 5% CO 2 inkubator i minst 60 min.
- Aspirera kollagen och tillsätt 1 mL 1 x PBS till 12-väl plattan att tvätta coverslips. Aspirera 1 x PBS och upprepa två gånger.
- Utsäde 250.000 odlade EPCs i varje brunn och placera tillbaka dem i 37 ° C, 5% CO 2 inkubator för minst 3 dagar innan de utför immunfärgning.
- Tvätta plattan 3 gånger med 1 x PBS. Tillsätt 1 mL iskall metanol till varje brunn och odla i rumstemperatur i 15 min att fixa cellerna.
- Genomföra immunfärgning använder ett standardprotokoll 27 , 28 , 29. Använda antikropparna på deras lämpliga utspädningar (t.ex. CD31 (1:20), CD34 (1:50), α-SMA (1: 100) och VEGFR2 (1:50)).
- Ta bilder av den immunostained coverslips använder ett epifluorescensmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Isolering och Expansion av Endothelial stamceller:
En schematisk (figur 1) tillhandahålls som skildrar övergripande protokollet. Olika blod komponent lagren observerades efter densitet gradient centrifugering av mänskliga navelsträngsblod med täthet lutning medium. Vid sådd multinationella företag på kollagen-behandlade plattorna, observerades först utväxten av kolonier mellan dagar 5 och 7 (figur 2A). Dessa kolonier fortsatte att växa och hade en spolformad cellmorfologi (figur 2A-2D) i ett tidigt skede, som senare utvecklats till en kullersten-liknande morfologi (figur 2E-2F). Figur 3 A visar det totala antalet celler mot tiden i kultur och varje datapunkt representerar det kumulativa antalet celler skördas vid varje passage. Figur 3 B skildrar genomsnittlig tid för den första kolonin att uppstå i kollagen-behandlade 6-väl plattan efter sådd de multinationella företag.
Karakterisering med Western Blotting:
Figur 4 A visar representant resultaten av Western blot membran som testades mot de olika antikropparna. Våra resultat tyder på att cellerna var positivt för CD31 och CD34. Uttrycket av CD31 (figur 4B) och CD34 (figur 4C) tycktes minskar under efterföljande passager, medan VEGFR2 (figur 4D) uttrycktes lika i senare passager, med först passagen har högre uttryck. Vi har också observerats att EPCs inte uttryckligt mesenkymala celler markör α-SMA (figur 4E). Mänskliga umbilical ven endotelceller (HUVEC) och valvulär interstitiella celler (VIC) cell lysates användes som positiva och negativa kontroller, respektive. HUVECs är kända för att uttrycka CD31, CD34 och VEGFR2, medan VICs express α-SMA.
Figur 1 : Schematisk av EPC isolering. Start isolering genom att späda sladd blod med HBSS och skiktning det försiktigt ovanpå täthet lutning medium, som visas. Densitet gradient centrifugering av skiktad blod bärs ut för att få distinkta lager av blod, som består av multinationella företag (buffy coat), täthet lutning medium, granulocyter och röda blodkroppar. Delmängd bilden som visar dessa olika lager. Multinationella företag samlas in och uppdateras på kollagen-behandlade cell kultur plåt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Progression av Cell kolonin. (A-E) Representativa ljusa fält bilder av EPC kolonin progression över tiden. Observera att kolonin har spolformad celler i ett tidigt skede, att anta kullersten morfologi. (E) representativ bild av EPC odlade i en T-75 kolv på passage 3. Skalstapeln = 200 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3: Tillväxtkurvor för EPCs. (A) diagrammet visar antalet celler som växer över en tidsperiod och varje datapunkten betecknar cellen nummer skördas under varje passage (P0 - P10) (n = 4). (B) tid det tar för den första EPC kolonin ska visas i 6-väl plattan (n = 4). Felstaplar beteckna standardavvikelsen för medelvärdet (SEM). Ingen statistisk signifikans hittades med envägs ANOVA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Western Blotting. (A) Western blot membran fläckade av olika antikroppar. HUVEC lysate och VIC lysate användes som positiva kontroller. (B) genomsnittliga intensitet av CD31 band normaliserade med α-tubulin. (C) genomsnittliga intensitet av CD34 band normaliserade med α-tubulin. (D) genomsnittliga intensitet av VEGFR2 band normaliserade med α-tubulin. (E) genomsnittliga intensitet av α-SMA band normaliserade med α-tubulin (n = 3-6). Felstaplar beteckna SEM. Ingen statistisk signifikans hittades med envägs ANOVA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Immunfärgning. Representativa bilder av EPCs odlade i extra bolagsstämma för 7 dagar och immunostained på olika passager för CD31, CD34, VEGFR2 och α-SMA. Skala bar - 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 1: Diagrammet visar antalet celler per ytenhet under en period på 7 dagar när odlade i extra bolagsstämma, EBM och DMEM. Extra bolagsstämma visade högre celltillväxt jämfört med media (EBM och DMEM). Data visade statistisk signifikans, med p < 0,01, med envägs ANOVA (n = 2). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
/ > Kompletterande figur 2: representativa bilder av EPCs odlade i EBM för 7 dagar och immunostained för CD31, CD34, VEGFR2 och α-SMA. Skalstapeln = 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 3: Representativa bilder av EPCs odlade i DMEM för 7 dagar och immunostained för CD31, CD34, VEGFR2 och α-SMA. Skalstapeln = 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som tidigare nämnts, anhängare EPCs besitter en kullersten morfologi. Våra isolerade multinationella företag utvecklats från en spolformad cell koloni (figur 2A-2D) i ett tidigt skede till en kullersten koloni (figur 2E-2F) under en period av tio dagar i kultur. EPCs har märkts på olika sätt av olika forskargrupper, nämligen som sena endothelial progenitor celler10, endothelial kolonibildande celler5eller endotelceller progenitor celler12. Det bör noteras att dessa celler är funktionellt identiska och uttrycka liknande cell yta markörer. Antalet celler som observerats under kultur period (figur 3) ökade till nästan 108 celler, analogt med tidigare publikationer och typiska hög proliferativ potential av EPCs3,5. Faktiskt, det konstaterades att EPCs erhållits från mänskliga navelsträngsblod visade en hög proliferativ potentiella och visat flera befolkningen dubbleringar innan de genomgick åldras jämfört EPCs isolerade från vuxna människors perifert blod5 , 10.
Våra Western blotting resultat (figur 4A) visade förekomst av CD31, CD34 och VEGFR2 på den cellen lysates erhålls från EPCs jämfört med den positiva kontrollen, HUVEC. HUVECs express CD31, CD34 och VEGFR2 och aktiverat VIC express α-sSMA. Liknar föregående rapporter10,18, uttrycket av CD31 minskade med högre passager. Det uttryck pattern liknade också när det gäller CD34 och VEGFR2, där båda markörerna uttrycktes starkt i första passagen och i relativt lägre men lika mängder i senare passager. Dessa data visar en trend som är överens med tidigare gruppernas resultat, där immunosorting-baserade protokoll användes för att isolera sladd blod-derived EPCs12. I allmänhet EPCs inte uttrycker mesenkymala markörer och, för att kontrollera att de isolera cellerna inte var mesenkymala i naturen, vi immunolabeled vår Western blot membran med α-SMA. Våra resultat visar tydligt att det fanns inget α-SMA uttryck i de odlade EPCs jämfört med positiv kontroll cell lysates samlas in från VICs, som uppvisar starkt uttryck av α-SMA antikroppar.
För att demonstrera att extra bolagsstämma möjliggör ökad cellproliferation jämfört med andra odlingssubstrat som används för EPCs, vi odlade celler i tre olika typer av media: DMEM, EBM och extra bolagsstämma (dvs EBM kompletteras med tillväxtfaktorer, som beskrivs tidigare). Alla kompletterades med 10% FBS. Vi seedade celler av olika passager i varje brunn 12-bra platta. Kompletterande bild1 visar antalet celler per ytenhet i varje brunn över tiden i kultur i olika media formuleringar. Vi noterar att de odlade i EGM EPCs visade en stadig ökning i antalet celler och celler i EBM, fanns en långsammare ökningstakt i cell nummer under de första tre dagarna, som därefter nått sitt tak. Detta tyder på att EPCs kunde fortfarande överleva i EBM, men avsaknad av tillväxtfaktorer hindrat spridning. Vi noterar också att EPCs odlade DMEM minskar i antal, vilket tyder på att denna särskilt medelstora formulering inte är lämplig för deras överlevnad eller spridning. Våra immunfärgning data visar att EPCs odlade i EGM (figur 5) uttryckt CD31 mer jämfört med EPCs odlade i EBM (kompletterande figur 2) och DMEM (kompletterande diagram 3). Jämför figur 5 med kompletterande bild 2 och kompletterande figur 3, kan det ses att cellerna inte var förorenade med andra celltyper. Också, när man jämför immunostained EPCs (figur 5), kan vi kvalitativt konstatera att uttrycket av CD31 och CD34 minskat över högre passager, stödja våra Western blot data (figur 4).
För att upprepa, är det primära målet för vår föreslagna protokollet att visa att man kan isolera endothelial stamceller genom odling blod multinationella företag i specialiserade selektiva medier. Detta är att visa att EPCs kan isoleras utan avancerad utrustning och förfaranden, till skillnad från andra metoder som innebär användning av flödescytometri - antingen omedelbart efter MNC isolering1,3,20 , 30 eller efter kolonierna har vuxit till en enskiktslager - följt av replating4,10,12,13,23. EPC kolonierna visas vanligtvis mellan dag 5 och 9. Vår metod är således en snabbare och mer kostnadseffektiv metod för att isolera EPCs. Den primära begränsningen av denna teknik är att uttrycket av CD31 och CD34 minskar med efterföljande passager, som kunde föreslå att cellerna förlorar sin stamfader fenotyp. Det rekommenderas därför att man bör använda celler från passage 5 eller lägre för att genomföra experiment om använder detta protokoll.
Försiktighetsåtgärder bör vidtas efter den täthet centrifugeringen att inte störa de olika lagrarna med hänsyn centrifugeras rören tillbaka till huven och även när du tar bort plasma. Ett annat viktigt steg avser erytrocyt Lys, där en längre inkubationstid kan potentiellt skada MNC. Det rekommenderas därför inte att upprepa detta steg mer än två gånger. Verkligen, eftersom den medelstora aspiration utförs 24 h efter plätering, spårmängder av erytrocyter tas bort, eftersom de är icke-anhängare. Alternativa substrat, som Fibronektin eller gelatin, kan medan inte testats av oss, också användas enligt de specifika protokoll för att skapa cell kultur beläggningar. Genom att använda mindre ändring i de första stegen, kan forskare isolera icke-anhängare EPCs30.
Vi Sammanfattningsvis har rapporterat en metod för att isolera EPCs från navelsträngsblod. Det är viktigt att notera att EPCs inte uttrycker markörer som α-SMA, vilket tyder på att de inte är mesenkymala-liknande celler. Faktiskt, α-SMA fungerar som en viktig markör när du försöker studera endothelial-mesenkymala övergången (endo-MT) av EPCs. Endo-MT är en cellulär transdifferentiation process under vilken endotelceller är kända för att förlora sin specifika markörer och att omvandla till en mesenkymala-liknande cell fenotyp. Det har visat att EPCs kan genomgå denna övergång i närvaro av omvandla tillväxt factor-β7 och kan släppa extracellulära membranproteiner på deras vävnadstekniska ställningar8. Alla dessa observationer visar löfte om EPCs för användning som en autolog cell källa att skapa en hjärtklaff eller andra kardiovaskulära vävnadstekniska konstruktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta material bygger på arbete stöds av National Science Foundation under Grant nr CMMI-1452943 och av University of Arkansas Honors College. Vi vill också erkänna den Arkansas navelsträngsblod Bank för att förse oss med sladd blod enheter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A) For isolation and culturing | |||
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | This product comes with all the growth factors needed to make the Endothelial Growth Medium |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher Scientific | 26140079 | |
| Pencillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| Ficoll-Paque | GE Heatlhcare | 17-1440-02 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Thermofisher Scientific | 14170-112 | |
| Ammonium Chloride | Stem Cell Technologies | 7850 | |
| 1x Phosphate Buffer Saline | Thermofisher Scientific | 14190250 | |
| Rat Tail I Collagen | Corning | 354236 | |
| Glacial Acetic Acid | Amresco | 0714-500ML | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| HEPES buffer | Thermofisher Scientific | 15630080 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Thermofisher Scientific | 10566-016 | |
| B) Antibodies and cell lysates | |||
| CD31 | Abcam | ab28364 | 1:250 dilution for Western blotting |
| CD34 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7045 | 1:100 dilution for Western blotting |
| α-SMA | abcam | ab5694 | 1:100 dilution for Western blotting |
| α-tubulin | abcam | ab7291 | 1:2,500 dilution for Western blotting |
| VEGFR2 | abcam | sc504 | 1:100 dilution for Western blotting |
| Human umbilical vein endothelial cell lysate | Santa Cruz Biotechnology | sc24709 | |
| Valve interstitial cell lysate | Primary cell line cultured from own lab and lysed with RIPA buffer | ||
| C) Western blotting and immunostaining | |||
| 10x Tris/Glycine/SDS buffer | Biorad | 161-0772 | Used as running buffer |
| 10x Tris/Glycine buffer | Biorad | 161-0771 | Used as transfer buffer |
| Immobilon-FL transfer membrane | Merck Millipore | IPFL0010 | This is a PVDF transfer membrane that has 45 µm pore size and is mentioned in the protocol as western blot membrane |
| 4x Laemmli sample buffer | Biorad | 161-0747 | |
| 2-mercaptoethanol | Biorad | 161-0710 | |
| 10% Criterion TGX precast gel | Biorad | 5671033 | |
| Prolong Gold antifade | Thermofisher Scientific | P36930 | Used for mounting immunostained coverslips for long term storage |
| Methanol | VWR Analytical | BDH1135-4LP |
References
- Asahara, T., et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 275 (5302), 964-967 (1997).
- Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. J Clin Invest. 105 (1), 71-77 (2000).
- Shi, Q., et al. Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells. Blood. 92 (2), 362-367 (1998).
- Hirschi, K. K., Ingram, D. A., Yoder, M. C. Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (9), 1584-1595 (2008).
- Ingram, D. A., et al. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood. 104 (9), 2752-2760 (2004).
- Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).
- Sales, V. L., et al. Transforming growth factor-beta1 modulates extracellular matrix production, proliferation, and apoptosis of endothelial progenitor cells in tissue-engineering scaffolds. Circulation. 114, 1 Suppl 193-199 (2006).
- Sales, V. L., et al. Endothelial Progenitor Cells as a Sole Source for Ex Vivo Seeding of Tissue-Engineered Heart Valves. Tissue Eng Pt A. 16 (1), 257-267 (2010).
- Liew, A., Barry, F., O'Brien, T. Endothelial progenitor cells: diagnostic and therapeutic considerations. Bioessays. 28 (3), 261-270 (2006).
- Hur, J., et al. Characterization of two types of endothelial progenitor cells and their different contributions to neovasculogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24 (2), 288-293 (2004).
- Ingram, D. A., Caplice, N. M., Yoder, M. C. Unresolved questions, changing definitions, and novel paradigms for defining endothelial progenitor cells. Blood. 106 (5), 1525-1531 (2005).
- Melero-Martin, J. M., et al. In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells. Blood. 109 (11), 4761-4768 (2007).
- Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. Chapter 13. An in vivo experimental model for postnatal vasculogenesis. Methods Enzymol. 445, 303-329 (2008).
- Yoder, M. C.
- Siddique, A., Shantsila, E., Lip, G. Y. H., Varma, C. Endothelial progenitor cells: what use for the cardiologist. J Angiogenes Res. 2 (6), (2010).
- Camci-Unal, G., et al. Surface-modified hyaluronic acid hydrogels to capture endothelial progenitor cells. Soft Matter. 6 (20), 5120-5126 (2010).
- Hill, J. M., et al. Circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk. N Engl J Med. 348 (7), 593-600 (2003).
- Young, P. P., Vaughan, D. E., Hatzopoulos, A. K. Biologic properties of endothelial progenitor cells and their potential for cell therapy. Prog Cardiovasc Dis. 49 (6), 421-429 (2007).
- Mehta, J. L., Szwedo, J. Circulating endothelial progenitor cells, microparticles and vascular disease. J Hypertens. 28 (8), 1611-1613 (2010).
- Nevskaya, T., et al. Circulating endothelial progenitor cells in systemic sclerosis are related to impaired angiogenesis and vascular disease manifestations. Ann Rheum Dis. 66, 67-67 (2007).
- Cebotari, S., et al. Clinical application of tissue engineered human heart valves using autologous progenitor cells. Circulation. 114, 1 Suppl 132-137 (2006).
- Ito, H., et al. Endothelial progenitor cells as putative targets for angiostatin. Cancer Res. 59 (23), 5875-5877 (1999).
- Vasa, M., et al. Increase in circulating endothelial progenitor cells by statin therapy in patients with stable coronary artery disease. Circulation. 103 (24), 2885-2890 (2001).
- Wu, X., et al. Tissue-engineered microvessels on three-dimensional biodegradable scaffolds using human endothelial progenitor cells. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (2), 480-487 (2004).
- Boyer, M., et al. Isolation of endothelial cells and their progenitor cells from human peripheral blood. J Vasc Surg. 31 (1), Pt 1 181-189 (2000).
- Huber, B., Czaja, A. M., Kluger, P. J. Influence of epidermal growth factor (EGF) and hydrocortisone on the co-culture of mature adipocytes and endothelial cells for vascularized adipose tissue engineering. Cell Biol Int. 40 (5), 569-578 (2016).
- Sturdivant, N. M., Smith, S. G., Ali, S. F., Wolchok, J. C., Balachandran, K. Acetazolamide Mitigates Astrocyte Cellular Edema Following Mild Traumatic Brain Injury. Sci Rep. 6, 33330 (2016).
- Lam, N. T., Muldoon, T. J., Quinn, K. P., Rajaram, N., Balachandran, K. Valve interstitial cell contractile strength and metabolic state are dependent on its shape. Integr Biol (Camb). 8 (10), 1079-1089 (2016).
- Tandon, I., et al. Valve interstitial cell shape modulates cell contractility independent of cell phenotype. J Biomech. 49 (14), 3289-3297 (2016).
- Cockshell, M. P., Bonder, C. S. Isolation and Culture of Human CD133+ Non-adherent Endothelial Forming Cells. Bio-Protocol. 6 (7), (2016).
