Summary
O objetivo do presente protocolo é isolar as células progenitoras endoteliais do sangue do cordão umbilical. Algumas das aplicações incluem o uso dessas células como um biomarcador para identificar pacientes com risco cardiovascular, tratamento de doenças isquêmicas, e criando engenharia de tecido vascular e coração válvula de construções.
Abstract
A existência de células progenitoras endoteliais (EPCs) no sangue periférico e sua participação na vasculogenesis foi primeiramente relatada por Ashara e colegas1. Mais tarde, outros documentada a existência de tipos similares de EPCs provenientes da medula óssea2,3. Mais recentemente, Yoder e Ingram mostraram que os EPCs derivado de sangue de cordão umbilical tinham um potencial proliferativo mais elevado em comparação com os isolados de adulto periférico de sangue4,5,6. Além de estar envolvido em vasculogenesis pós-natal, EPCs mostraram também promessa como uma fonte de célula para criar engenharia de tecido vascular e coração válvula construções7,8. Existem vários protocolos de isolamento, alguns dos quais envolvem a classificação de células de células mononucleares (MNCs) derivadas das fontes mencionadas anteriormente, com a ajuda de marcadores endoteliais e hematopoiéticos ou cultivo essas multinacionais com crescimento endotelial especializado médio, ou uma combinação destas técnicas9. Aqui, apresentamos um protocolo para o isolamento e cultura de EPCs usando especializada endotelial suplementado com fatores de crescimento, sem o uso de immunosorting, seguido pela caracterização das células isoladas usando mancha ocidental e immunostaining.
Introduction
Diversos investigadores estudaram as características e o potencial humano EPCs5,10,11,12,13. EPCs podem ser descritos como circulantes de células que têm a capacidade de aderir ao tecido endotelial em sites de hipóxia, isquemia, lesão ou formação de tumor e contribuir para a formação de novas estruturas vasculares4,14. Seu envolvimento observado em neovascularização, sob a forma de vasculogenesis pós-natal, conduziu a uma compreensão da fisiopatologia destas células e a sua utilização em aplicações terapêuticas4,15, 16. o número de EPCs em um indivíduo foi mostrado para ser correlacionados com patologia cardiovascular9,15,16,17,18,19 ,20. Outros estudos também diferenciadas EPCs em um fenótipo de fibroblasto tipo de válvula e propôs que estas células poderiam ser utilizadas para a engenharia de tecidos coração válvulas7,21.
As moléculas de superfície celular particular precisava isolar EPCs não foram claramente identificadas devido a discrepâncias entre as investigações4. A adesão das multinacionais para uma certa matriz, com a exposição a uma variedade de condições de cultura, foi realizada por vários grupos1,17,22,23, sugerindo que os EPCs putativos pode Exiba Propriedades fenotípicas diferentes. Essas propriedades incluem a falta de capacidade de phagocytotic, formação do tubo em Matrigel e da captação de lipoproteínas de baixa densidade Dil-acetilado. A alta clonogenic e potencial proliferativa são duas propriedades com quais EPCs pode ser hierarquizada5. EPCs podem também formar em vitro túbulos quando cocultured com pulmão fetal humano de fibroblastos4. Estas células são conhecidas para expressar marcadores de superfície de células endoteliais e compartilhar alguns dos marcadores hematopoiéticas13,24,25. Os marcadores positivamente expressos que são amplamente aceitos para fenotipagem EPCs são CD31, CD34, receptor de fator de crescimento vascular endotelial 2 (VEGFR2), von Willebrand (vWF) de fator, CD133, c-Kit e vascular endotelial caderina (VE-caderina)4 , 18. as células que expressam co CD90, CD45, CD14, CD115 ou actina de músculo liso-alfa (α-SMA) não são consideradas ser EPCs devido à sua limitada capacidade potencial, proliferativa de fagocitam bactérias e incapacidade para formar de novo humano vasos na vivo4,7. Este artigo descreve um protocolo modificado para o isolamento de células progenitoras endoteliais humano sangue do cordão umbilical sem necessidade de qualquer célula protocolos de classificação. Neste artigo, usamos CD31, CD34 e VEGFR2 como os marcadores positivos, com α-SMA como o indicador negativo.
Neste artigo, propomos um método de isolamento e cultivo de células progenitoras endoteliais do sangue do cordão umbilical sem célula classificação usando especializadas suplementado de crescimento endoteliais com fatores de crescimento (EGM). Este EGM contém fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e fator de crescimento fibroblástico (FGF), que realçam a sobrevivência, proliferação e migração de células endoteliais26. Ele também inclui o ácido ascórbico, que é responsável por manter a morfologia de paralelepípedos de células; insulin-como fator de crescimento-1 (IGF-1), que fornece angiogênico e função migratória; e heparina, que faz com que a melhor estabilidade a longo prazo dos fatores de crescimento no médio26. Outros fatores de crescimento adicionados ao meio de cultura de células endoteliais inclui suplementação com fator de crescimento epidérmico (EGF), que ajuda na proliferação de célula estimulante e diferenciação e hidrocortisona, que sensibiliza as células para EGF26 . Nós mostramos que o uso deste meio de crescimento específico produz maior número de EPCs comparados ao meio basal endotelial (EBM) ou médio de Eagle modificado (DMEM de Dulbecco).
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Protocol
esta pesquisa foi realizada com a aprovação da Universidade de Arkansas institucional Review Board (número de aprovação de 16-04-722). Unidades de sangue de cordão umbilical foram coletadas em solução de citrato fosfato dextrose (CPD) no banco de sangue de cordão de Arkansas, e as unidades que não cumprem o requisito de armazenamento foram doadas para pesquisa. Unidades de sangue de cordão foram enviadas ao laboratório dentro de 24 h de coleção à temperatura ambiente.
1. isolamento de progenitoras endoteliais células do sangue do cordão
- preparação dos reagentes.
- EGM preparar adicionando meio basal endotelial (EBM) a 10% de soro fetal bovino (FBS) suplementado com 20 ng/mL de fator de crescimento semelhante à insulina (IGF), 1 µ g/mL de ácido ascórbico, 5 ng/mL recombinante humano fator de crescimento epidérmico (rhEGF), 22,5 µ g/mL heparina e 0,5 ng/mL vascular fator de crescimento endotelial (VEGF), juntamente com 10 ng/mL de recombinante humano fator de crescimento B (rhFGF-B), 0,2 µ g/mL hidrocortisona e 2% penicilina-estreptomicina-glutamina. Esterilizar o meio de cultura usando um filtro de 0,2 µm polietersulfona (PES) membrana vácuo.
- Preparar rato eu cauda solução de colágeno em uma concentração de 50 µ g/mL usando 0,02 N de ácido acético. Esterilizar esta solução usando um filtro de seringa 0,2 µm. Placas de 6 boas
- pré-revestimento com 2 mL de rato preparado eu cauda solução de colágeno para cada poço. Colocá-los numa incubadora mantida em 5% de CO 2 e 37 ° C, durante pelo menos 1 h antes da semeadura.
- Diluir cerca de 25 mL de sangue do cordão umbilical com Hanks equilibrado sal solução (HBSS) numa concentração de 1:1.
- Preparar precipitação de rádio-imuno ensaio (RIPA) Buffer usando cloreto de sódio de 150 mM, 1% Triton X-100, 0,5% de sódio Deoxycholate do, β-glicerofosfato de 1mm, 0,1% SDS e 50 mM Tris (pH 8.0).
- Isolamento de células progenitoras endoteliais.
- Tudo quente preparado reagentes em banho-maria a 37 ° C antes do isolamento.
- Adicionar 20 mL de reagente de médio gradiente de densidade para um tubo de centrífuga de 50 mL.
- Camada cuidadosamente 20 mL de sangue do cordão umbilical diluídos em tubo de centrífuga contendo meio de gradiente de densidade sem quebrar essa camada apontando a pipeta para as paredes laterais do tubo.
- Separar os componentes de sangue com base em suas densidades ( Figura 1) por centrifugação a 800 x g durante 30 min à temperatura ambiente, com o freio do rotor da centrífuga. Não perturbe as diferentes camadas.
- Remover a camada de plasma pipetando cuidadosamente la fora do tubo sem perturbar outras células da camada camadas até que a ponta da pipeta é capaz de atingir o MNC (ver Figura 1). Descartar o plasma removido.
Nota: Enquanto estiver usando pontas de pipetas para remover o plasma, deixar uma pequena camada de plasma acima da camada MNC ( Figura 1) para reduzir as perturbações. - Recolher o casaco buffy que contém as MNCs usando uma seringa equipada com uma agulha de calibre 18 e transferi-lo para um tubo de centrifugação fresco.
- Adicionar um volume igual de EBM para centrífuga coletados MNCs. estes tubos 500 x g durante 10 minutos no 4 ° C. descartar o sobrenadante.
Nota: O centrifugado aparecerá vermelho por causa da presença de glóbulos vermelhos/eritrócitos. - Adicionar 5 mL de solução de cloreto de amónio para lisar células vermelhas do sangue. Incubar o tubo no gelo por 5-10 min, agitando ocasionalmente.
Nota: Devem ser tomadas precauções durante esta etapa para não exceder o tempo de duração, como pode ser prejudicial para as MNCs. - Centrifugar os tubos a 500 x g durante 10 minutos a 4 ° C e descartar o sobrenadante. Se hemácias persistirem, repita as etapas 1.2.8 e 1.2.9 até sem cor vermelha é observada em pelota.
- Resuspenda o pellet em EGM preparado e usar o hemocytometer para contar as MNCs.
- Aspirado o rato eu cauda colágeno-revestido 6 placa (da etapa 1.1.3) e lavar os poços três vezes com 1x tampão fosfato salino (PBS).
- Sementes a pelota MNC resuspended na EGM para a placa de colágeno em uma concentração de 1 x 10 7 MNCs em cada poço. Coloque-o na 37 ° C, 5% CO 2 incubadora.
- Após 24 h, Aspire o meio e lavar os poços uma vez com EGM. Adicionar 3 mL de meio EGM a cada poço e colocá-lo na 37 ° C, 5% CO 2 incubadora.
- Repor a placa com meio EGM fresco todos os dias durante 7 dias. Após 7 dias, alterar o meio EGM cada outro dia.
- Usando um microscópio de campo claro, tirar imagens da placa 6-bem todos os dias para controlar a progressão das colônias de células endoteliais. Marcar a placa onde surgem as colônias de acompanhar o seu crescimento.
Nota: Normalmente demora entre 5 e 9 dias para as colônias que aparecem na cultura.
- Expansão de células progenitoras endoteliais.
- Casaco do frasco de cultura T-25 com rato eu cauda colágeno (50 µ g/mL) e colocá-lo na 37 ° C, 5% CO 2 incubadora de pelo menos 60 min. aspirar e lavar o frasco de cultura de células T-25 três vezes com PBS 1x antes da semeadura das células.
- Trypsinize as colônias de células endoteliais, quando atingem cerca de 3 mm de tamanho usando 150 µ l de solução de tripsina-EDTA 0,05% em cada poço. Colocar a placa de 6 volta a 37 ° C, 5% CO 2 incubadora para 2-3 min.
- Bata levemente a placa de 6 para desalojar as células anexadas. Imediatamente adicione 2 mL de EGM e recuperar as células em um tubo de centrífuga de 15 mL.
- Contar as células usando um hemocytometer e calcular a densidade de semeadura inicial. Tubos de
- rotação da centrífuga de 15 mL a 400 x g, durante 5 min. Ressuspender as células em EGM e o balão de T-25 com ~ 500.000 células da semente. Marque este frasco como passagem 1 e colocar o balão de T-25 volta a 37 ° C, 5% CO 2 incubadora.
Nota: As células podem ser chapeadas no EBM e DMEM para comparar o crescimento com EGM. - Para mais passagens, quando o frasco atinge 90% confluência, siga os passos 1.3.1 - 1.3.5 e propagar novamente as células de 10 4 células/cm 2 em frascos de cultura de células T-75 ou T-175. Prossiga para a caracterização das células isoladas (etapas 2 e 3).
2. Caracterização de células isoladas usando Western Bloting
- Adicionar 50-100 µ l do lysis buffer em cada passagem quando seguindo os passos de expansão para caracterizar as células isoladas. Recolher proteínas de aproximadamente 500.000 ou mais células.
- Pipetar acima e para baixo vigorosamente para romper as células e liberar as proteínas. Coletar e transferir a reserva para um tubo de microcentrifugadora.
- Girar o tubo microcentrifuga a 500 x g e transfira cuidadosamente o sobrenadante para um novo tubo de microcentrifugadora. Rotular e armazenar os tubos a-80 ° C para armazenamento a longo prazo.
- Quantificar a quantidade de proteínas em cada tubo utilizando qualquer Bradford ' s ou BCA do ensaio de 28 , de 27 , 29.
- Realizar a mancha usando os procedimentos padrão de 28 , de 27 , 29 ocidental. Analise a 5 µ g de proteína total para a expressão de CD34 CD31, VEGFR2 e α-SMA. Use o α-tubulina para normalizar os dados.
3. Imunofluorescência indireta
- proceda à sonicação as lamelas de vidro 18mm em etanol a 50% e secá-las. Deixar as lamelas limpas em uma placa de 12 durante a noite de biossegurança capuz com um UV acesa para esterilizá-los.
- Casaco as lamelas com 50 & #181; g/mL de rato eu cauda colágeno e transferir a placa para a 37 ° C, 5% CO 2 incubadora pelo menos 60 min.
- Aspire o colágeno e adicionar 1 mL de 1X PBS para a placa de 12 para lavar as lamelas. Aspire a PBS 1x e repita duas vezes.
- 250.000 sementes cultivadas EPCs em cada poço e lugá-los de volta a 37 ° C, 5% CO 2 incubadora durante pelo menos 3 dias antes de efectuar immunostaining.
- Lavar a placa 3 vezes com PBS 1x. Adicione 1 mL de metanol gelada a cada poço e incubar a temperatura ambiente por 15 min consertar as células.
- Realizar immunostaining usando um protocolo padrão de 27 , 28 , 29. Usar os anticorpos em suas diluições apropriadas (por exemplo, CD31 (01:20), CD34 (01:50), α-SMA (1: 100) e VEGFR2 (01:50)).
- Imagens das lamelas de immunostained usando um microscópio de epifluorescência.
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Representative Results
Isolamento e expansão de células progenitoras endoteliais:
Um esquema (Figura 1) é fornecido retratando o protocolo geral. As camadas de componente de sangue diferentes foram observadas após centrifugação gradiente de densidade do sangue de cordão humano com médio gradiente de densidade. Após semeadura MNCs nas chapas de colágeno-tratados, a consequência natural das colônias foi observado pela primeira vez entre os dias 5 e 7(Figura 2). Estas colônias continuaram a crescer e tinham uma morfologia de células fusiformes (Figura 2A-2D) nas fases iniciais, que mais tarde evoluiu para uma paralelepípedo, como morfologia (Figura 2E-2F). Figura 3 A mostra o número total de células versus tempo em cultura, e cada ponto de dados representa o número cumulativo de células colhidas em cada passagem. Figura 3 B retrata o tempo médio despendido para a primeira colônia a surgir na placa 6-bem tratada com colágeno após a semeadura as MNCs.
Caracterização usando mancha ocidental:
Figura 4 A mostra o representante resultados do Western blot membrana que foi testada contra os vários anticorpos. Nossos resultados sugerem que as células eram positivas para CD31 e CD34. A expressão do CD31 (Figura 4B) e CD34 (Figura 4C) apareceu para diminuir ao longo de passagens subsequentes, Considerando que o VEGFR2 (Figura 4-D) manifestou-se igualmente nas passagens mais tarde, com o primeiro passagem, tendo maior expressão. Observou-se também que os EPCs não expressar a células mesenquimais marcador α-SMA (Figura 4E). Células endoteliais (HUVEC) da veia umbilical humana e lisados celulares de células intersticiais valvular (VIC) foram usados como controles positivos e negativos, respectivamente. HX é conhecidos por expressar CD31, CD34 e VEGFR2, enquanto vítimas expressam α-SMA.
Figura 1 : Esquemático de EPC isolamento. Iniciar o isolamento por cabo de diluição do sangue com HBSS e mergulhá-lo cuidadosamente em cima do meio de gradiente de densidade, como mostrado. Centrifugação gradiente de densidade do sangue em camadas é executada para obter camadas distintas do sangue, que é composta de MNCs (buffy coat), médio gradiente de densidade, granulócitos e hemácias. A imagem de subconjunto fornecida mostra estas camadas diferentes. As multinacionais são coletadas e propagado novamente em uma placa de cultura de células tratada com colágeno. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Progressão da colônia celular. (A-E) Imagens representativas do brilhante-campo de progressão de colônia EPC ao longo do tempo. Observe que a colônia tem células fusiformes na fase inicial, adotando a morfologia de paralelepípedos. (E) a imagem representativa da EPC cultivada em um frasco de T-75 a passagem 3. Barra de escala = 200 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Curvas de crescimento de EPCs. (A) o gráfico mostra o número de células a crescer ao longo de um período de tempo, e cada ponto de dados denota a célula número colhido durante cada passagem (P0 - P10) (n = 4). (B) tempo despendido para a primeira colônia EPC para aparecer na placa de 6 (n = 4). As barras de erro indicam o erro padrão da média (SEM). Sem significância estatística foi encontrada usando ANOVA One-Way. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Mancha ocidental. (A) Western blot membrana corada com vários anticorpos. HUVEC lisado e VIC lisado foram usados como controles positivos. (B) a intensidade média das bandas CD31 normalizada com α-tubulina. (C) a intensidade média das bandas CD34 normalizada com α-tubulina. (D) intensidade média das bandas VEGFR2 normalizado com α-tubulina. (E) a intensidade média das bandas de α-SMA normalizada com α-tubulina (n = 3-6). As barras de erro denotam o SEM. Sem significância estatística foi encontrada usando ANOVA One-Way. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Immunostaining. Imagens representativas de EPCs cultivadas na EGM por 7 dias e immunostained em várias passagens para CD31 e CD34, VEGFR2, α-SMA. Escala da barra - 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Suplementar Figura 1: O gráfico mostra o número de células por unidade de área ao longo de um período de 7 dias quando cultivadas na EGM, EBM e DMEM. EGM mostrou maior crescimento celular em comparação com os meios de comunicação (EBM e DMEM). Os dados mostraram significância estatística, com p < 0,01, usando ANOVA One-Way (n = 2). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
/ > Suplementar Figura 2: imagens representativas de EPCs cultivadas em EBM por 7 dias e immunostained para CD31 e CD34, VEGFR2, α-SMA. Barra de escala = 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Suplementar Figura 3: Imagens representativas de EPCs cultivadas em DMEM por 7 dias e immunostained para CD31 e CD34, VEGFR2, α-SMA. Barra de escala = 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Como mencionado anteriormente, o aderente EPCs possuem uma morfologia de paralelepípedos. Nossas MNCs isoladas progrediam de uma colônia de células fusiformes (Figura 2A-2D) nas fases iniciais de uma colônia de paralelepípedos (Figura 2E-2F) durante um período de dez dias em cultura. EPCs foram chamadas diferentemente por grupos de pesquisa diferentes, ou seja, como tarde células progenitoras endoteliais10, endoteliais formadoras de células5, ou de células progenitoras endoteliais12. Deve notar-se que estas células são funcionalmente o mesmo e expressam marcadores de superfície celular similar. O número de células observadas durante o período de cultura (Figura 3) aumentado para quase 108 células, análogas às publicações anteriores e típicas de elevado potencial proliferativo de EPCs3,5. Com efeito, verificou que os EPCs obtidos humano sangue do cordão umbilical mostrou uma alta proliferativa potenciais e demonstrou vários população doublings antes de se submeter a senescência em comparação com EPCs isolados do sangue periférico humano adulto5 , 10.
Nossos resultados mancha ocidentais(Figura 4)mostraram a presença de CD31, CD34 e VEGFR2 sobre os lisados celulares obtidos de EPCs, comparados com o controle positivo, HUVEC. HX express CD31, CD34 e VEGFR2 e ativado VIC expresso α-sSMA. Semelhante ao anterior relatórios10,18, a expressão do CD31 diminuiu com passagens superiores. O padrão de expressão também foi semelhante no caso de CD34 e VEGFR2, onde ambos os marcadores manifestaram-se fortemente na primeira passagem e em quantidades relativamente menores, mas iguais em passagens mais tarde. Este dados mostram uma tendência que está de acordo com os resultados dos grupos anteriores, em que os protocolos baseados em immunosorting foram usados para isolar o cabo hemoderivados EPCs12. Geralmente, EPCs não expressam marcadores mesenquimais e, para verificar que as células isoladas não eram mesenquimais na natureza, nós immunolabeled nossas membranas do Western blot com α-SMA. Nossos resultados mostram claramente que não havia nenhuma expressão de α-SMA nos EPCs culturas quando comparado com lisados celulares controle positivo, coletados de vítimas, que apresentam forte expressão de anticorpo α-SMA.
Para demonstrar que EGM permite a proliferação celular aumentada em comparação com outros meios de cultura utilizados para EPCs, nós cultivadas as células em três diferentes tipos de mídia: DMEM, EBM e EGM (i.e., EBM, suplementado com fatores de crescimento, conforme descrito anteriormente). Todos foram suplementados com 10% FBS. Temos semeado células de diferentes passagens em cada poço de uma placa de 12. Suplementar a Figura 1 mostra o número de células por unidade de área em cada bem ao longo do tempo na cultura nas formulações diferentes mídias. Notamos que os EPCs cultivadas na EGM mostraram um aumento constante no número de células e para as células em EBM, havia uma taxa mais lenta do aumento no número de células durante os três primeiros dias, que posteriormente se estabilizou. Isto sugere que os EPCs ainda poderiam sobreviver em EBM, mas a ausência de fatores de crescimento impedido a proliferação. Constatamos também que os EPCs cultivadas em declínio DMEM número, sugerindo que esta formulação particular média não é adequada para a sua sobrevivência ou proliferação. Nossos dados de imunocoloração mostram que os EPCs cultivadas na EGM (Figura 5) expressaram CD31 mais quando comparado aos EPCs cultivadas em EBM (Supplemental Figura 2) e DMEM (Supplemental Figura 3). Comparando a Figura 5 com suplementar Figura 2 e suplementar a Figura 3, pode ser visto que as células não foram contaminadas com outros tipos de células. Além disso, quando se compara o immunostained EPCs (Figura 5), podemos qualitativamente afirmar que a expressão do CD31 e CD34 baixou durante passagens superiores, apoiando nossos dados de Western blot (Figura 4).
Para reiterar, o objetivo principal de nosso protocolo proposto é demonstrar que um pode isolar células progenitoras endoteliais por cultivo sangue MNCs em meios selectivos especializados. Isso é para mostrar que os EPCs podem ser isolados sem equipamentos sofisticados e procedimentos, ao contrário de outros métodos que envolvem o uso da citometria de fluxo - imediatamente após o MNC isolamento1,3,20 , 30 ou após as colônias têm crescido em uma monocamada - seguido replating4,10,12,13,23. As colônias EPC geralmente aparecem entre os dias 5 e 9. Nosso método é, portanto, um método mais rápido e mais eficiente para isolar EPCs. A principal limitação dessa técnica é que a expressão do CD31 e CD34 diminui com passagens subsequentes, o que poderiam sugerir que as células estão perdendo seu fenótipo progenitor. Assim, é recomendável que se deve usar células obtidas da passagem 5 ou inferior conduzir experimentos se usando este protocolo.
Precauções devem ser tomadas após a centrifugação de densidade para não perturbar as diferentes camadas quando levando os tubos centrifugados para o capô e também ao retirar o plasma. Outro passo crítico refere-se a lise dos eritrócitos, onde um tempo de incubação pode potencialmente danificar o MNC. Assim, recomenda-se não repetir este passo mais de duas vezes. Com efeito, desde a aspiração média de 24 h é efectuada após o chapeamento, vestígios de eritrócitos são removidos, como eles são não-aderente. Substratos alternativos, como fibronectina ou gelatina, não testado por nós, também podem ser usados de acordo com os protocolos específicos para a criação de revestimentos de cultura celular. Empregando pequena modificação nas etapas iniciais, os investigadores podem isolar não aderente EPCs30.
Em conclusão, registramos um método de isolar EPCs do sangue do cordão umbilical. É importante notar que os EPCs não expressam marcadores como α-SMA, sugerindo que eles não são células mesenquimais. Com efeito, α-SMA serve como um importante marcador quando tentar estudar a transição endotelial-mesenquimais (endo-MT) de EPCs. Endo-MT é um processo de transdiferenciação celular celular durante o qual células endoteliais são conhecidas para perder seus marcadores específicos e transformar para um fenótipo de células mesenquimais semelhante. Tem sido demonstrado que EPCs podem passar por essa transição na presença de transformar o fator de crescimento-β7 e podem liberar proteínas de membrana extracelular em sua engenharia de tecido andaimes8. Todas estas observações indicam a promessa de EPCs para uso como uma fonte de células autólogas para criar uma válvula cardíaca ou outras construções de engenharia de tecidos cardiovasculares.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este material é baseado em trabalho, apoiado pela Fundação Nacional de ciência sob Grant no. CMMI-1452943 e pelo Colégio de honras da Universidade de Arkansas. Também gostaríamos de reconhecer o banco de sangue de cordão de Arkansas nos fornecer unidades de sangue de cordão.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A) For isolation and culturing | |||
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | This product comes with all the growth factors needed to make the Endothelial Growth Medium |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher Scientific | 26140079 | |
| Pencillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| Ficoll-Paque | GE Heatlhcare | 17-1440-02 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Thermofisher Scientific | 14170-112 | |
| Ammonium Chloride | Stem Cell Technologies | 7850 | |
| 1x Phosphate Buffer Saline | Thermofisher Scientific | 14190250 | |
| Rat Tail I Collagen | Corning | 354236 | |
| Glacial Acetic Acid | Amresco | 0714-500ML | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| HEPES buffer | Thermofisher Scientific | 15630080 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Thermofisher Scientific | 10566-016 | |
| B) Antibodies and cell lysates | |||
| CD31 | Abcam | ab28364 | 1:250 dilution for Western blotting |
| CD34 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7045 | 1:100 dilution for Western blotting |
| α-SMA | abcam | ab5694 | 1:100 dilution for Western blotting |
| α-tubulin | abcam | ab7291 | 1:2,500 dilution for Western blotting |
| VEGFR2 | abcam | sc504 | 1:100 dilution for Western blotting |
| Human umbilical vein endothelial cell lysate | Santa Cruz Biotechnology | sc24709 | |
| Valve interstitial cell lysate | Primary cell line cultured from own lab and lysed with RIPA buffer | ||
| C) Western blotting and immunostaining | |||
| 10x Tris/Glycine/SDS buffer | Biorad | 161-0772 | Used as running buffer |
| 10x Tris/Glycine buffer | Biorad | 161-0771 | Used as transfer buffer |
| Immobilon-FL transfer membrane | Merck Millipore | IPFL0010 | This is a PVDF transfer membrane that has 45 µm pore size and is mentioned in the protocol as western blot membrane |
| 4x Laemmli sample buffer | Biorad | 161-0747 | |
| 2-mercaptoethanol | Biorad | 161-0710 | |
| 10% Criterion TGX precast gel | Biorad | 5671033 | |
| Prolong Gold antifade | Thermofisher Scientific | P36930 | Used for mounting immunostained coverslips for long term storage |
| Methanol | VWR Analytical | BDH1135-4LP |
References
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