Summary
Het belangrijkste doel van deze studie was aan te passen de naald ondergedompeld verglazing (NIV) procedure om te cryopreserve hele zebrafish teelballen. Daarnaast is de herhaalbaarheid van de methode in vijf verschillende zebrafish stammen was getest.
Abstract
Huidige trends in science en biotechnologie leiden tot de oprichting van duizenden nieuwe lijnen in modelorganismen, waardoor de noodzaak voor nieuwe methoden voor de veilige opslag van genetische hulpbronnen buiten de gemeenschappelijke praktijken van het houden van de kolonies kweken. Het belangrijkste doel van deze studie was aan te passen de naald ondergedompeld verglazing (NIV) procedure om te cryopreserve hele zebrafish teelballen. Cryopreservatie van beginnende geslachtscellen door hele teelballen NIV biedt mogelijkheden voor de opslag van zebravis genetische hulpbronnen, vooral omdat na de transplantatie ze in zowel mannelijke als vrouwelijke gameten rijpen kunnen. Teelballen waren weggesneden, gevestigd op een acupunctuur-naald, geëquilibreerd in twee cryoprotective media (oplossing met 1,5 M methanol en 1,5 M propyleenglycol; en verglazing oplossing met dimethylsulfoxide van 3 M en 3 M propyleenglycol) en duik in vloeibare stikstof. Monsters werden opgewarmd in een reeks van drie oplossingen voor daaruit voortvloeiende opwarming van de aarde. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn (1) het ontbreken van spermatozoïden na vertering van verwarmde teelballen waardoor downstream manipulaties; (2) Ultra snelle koeling waardoor de optimale Gasbedwelming met behulp van weefsels vloeibare stikstof, dus het maximaliseren van de koeling en het verminderen van de vereiste concentratie van cryoprotectant, waardoor hun toxiciteit; (3) synchrone Gasbedwelming met behulp van verschillende teelballen cryoprotectant en vloeibare stikstof; en (4) herhaalbaarheid aangetoond door het verkrijgen van de levensvatbaarheid van boven de 50% in vijf verschillende zebrafish stammen.
Introduction
Nieuwe trends in science en biotechnologie hebben geleid tot de oprichting van duizenden nieuwe mutant lijnen van muizen, Drosophila, zebravis en andere soorten gebruikt als modelorganismen transferoefeningen biomedische en andere wetenschappen1. Bovendien, als nieuwe technologieën worden ontwikkeld en beschikbaar, de nummers van mutant lijnen verhogen gestaag2. Dit leidt tot de noodzaak voor een veilige opslag van genetische hulpbronnen buiten de gemeenschappelijke praktijken van het houden van de kolonies kweken. Als een methode waarmee de veilige opslag van genetische hulpbronnen voor onbepaalde tijd, cryopreservatie biedt vele voordelen, zoals uitbreiding van reproductieve seizoen, omzeilt de behoefte aan continu onderhoud van broodstock, en het is meer kosten - en arbeid-efficiënte2.
Protocollen voor sperma cryopreservatie ontwikkeld tijdens de afgelopen verscheidene jaren2,3,4 bieden de mogelijkheid voor succesvolle opslag van zebravis mannelijke genetisch materiaal. Cryopreservatie van eieren of embryo's in vis is echter nog niet mogelijk als gevolg van hun complexe structuur en grote hoeveelheden dooier materiaal. Onlangs, de praktijk van transplantatie van primordiaal geslachtscellen (PGCs) of spermatogonial stamcellen (levens) biedt een rondweg om deze barrière door ontwikkelt zich tot functionele sperma en eieren na transplantatie5. Cryopreservatie van levens biedt daarom een nieuwe grens in het behoud van zeldzame en waardevolle genetische hulpbronnen.
Hoewel cryopreservatie vele voordelen biedt, het vriesproces van slow-tarief genereert verschillende omstandigheden die tot cel schade2 leiden kunnen. Het gaat hierbij om intracellulaire en extracellulaire ijsvorming, uitdroging, cryoprotectant toxiciteit en anderen. Intracellulair ijs schadelijk is voor de cellen, extracellulaire ijs kan leiden tot mechanische persing van de cellen, terwijl de diffusie van water uit de cellen tijdens vertragen-tarief bevriezing kan leiden tot uitdroging6. Onlangs, heeft de cryopreservatie van vis gameten7,8,9verglazing als een techniek waardoor de negatieve effecten van ijsvorming zijn toegepast. Het presenteert een ultra snelle koeling techniek waardoor de interne en externe media omzetten in een amorfe/glazig staat zonder crystalizing in ijs7,10. Succesvolle verglazing van testiculaire en ovarieel weefsel heeft aangetoond in aviaire en zoogdieren soorten10,11,12, dus het openen van mogelijkheden voor de toepassing in de vis, alsmede.
In deze studie presenteren wij de naald ondergedompeld verglazing (NIV) procedure voor cryopreservatie van hele zebrafish teelballen. We tonen een betrouwbare methode voor de isolatie van de zebravis beginnende kiemcellen zonder besmetting en een cryopreservatie proces dat relatief hoge bedragen van beginnende kiemcellen met een geringe aanwezigheid van andere cellen, met name van spermacellen levert. Tot de beste van onze kennis is dit de eerste studie om aan te tonen een gedetailleerde gevisualiseerde protocol voor ultra snelle koeling van vis gonadale weefsel en zebrafish germline cellen. Bovendien, herhaalbaarheid van de methode is aangetoond in vijf verschillende zebrafish stammen: AB wild type, casper (roy- / -; nacre- / -), leopard (leot1/t1), vasa [GS (vas::eGFP)] en Wilms tumor [GS (wt1b::eGFP 1)] transgene lijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de Hongaarse Animal Welfare wet.
1. reagens voorbereiding
- Stamoplossingen
- Bereiden 1 M trehalose door 0.378 g trehalose dihydraat toe te voegen in 1 mL dH2O. Mix, goed tot het volledig oplost.
- Bereiden 1 M sacharose door toe te voegen 0.342 g van sacharose in 1 mL dH2O. Mix goed totdat het volledig oplost.
- Bereiden 1 M HEPES door 0.238 g HEPES toe te voegen aan 1 mL dH2O. Mix, goed tot het volledig oplost.
- 20 mg/mL collagenase (290 U/mg) voor te bereiden door 100 mg 5 ml PBS toe te voegen. Meng totdat het oplost. Steriel filter via 0,2 µm filters. Aliquot 50 µL in 0,2 mL PCR buizen en bevriezen bij - 20 ° C.
- Bereiden van 15 mg/mL trypsine (~ 10000 U/mg) door 75 mg 5 ml PBS toe te voegen. Meng totdat het oplost. Steriel filter via 0,2 µm filters. Aliquot 50 µL in 0,2 mL PCR buizen en bevriezen bij - 20 ° C.
- Bereiden van 1 mg/mL DNase ik (~ 3000 U/mg) door toevoeging van 5 mg naar 5 mL PBS. Meng totdat het oplost. Steriel filter via 0,2 µm filters. Aliquot 50 µL in 0,2 mL PCR buizen en bevriezen bij - 20 ° C.
- 0,4% trypan blauwe voorbereiden door 40 mg trypan blauw 10 ml PBS toe te voegen. Steriel filter via 0,2 µm filters. Aliquot 1 mL in buizen van 1,5 mL.
- Bereiden van 200 mg/L MS-222 (tricaïne methaan sulfonaat) door toevoeging van 200 mg MS-222 in 1 L voor dH2O. Mix goed totdat het volledig oplost. Bovendien, de MS-222 Bufferoplossing met natriumbicarbonaat aan een neutrale pH van 7.0.
- Oplossingen voor de verglazing
- Oplossing (ES) bereiden: bereiden van 2 mL van ES door het mengen van 121.5 µL van methanol (MeOH; 1,5 M), 220 µL van propyleenglycol (PG; 1,5 M), 200 µL van FBS (10%), 200 µL van trehalose stockoplossing (0.1 M), 50 µL van HEPES-stockoplossing (25 mM) en 1208.5 µL van L-15 in een 2 mL-buis.
- Verglazing oplossing (VS) voor te bereiden: bereiden van 2 mL van de VS door het mengen van 439 µL van PG (3 M), 426 µL van dimethylsulfoxide (Me2dus; 3 M), 200 µL van FBS (10%), 200 µL van trehalose stockoplossing (0.1 M), 50 µL van HEPES stock oplossing (25 mM) en 685 µL van L-15 in een 2 mL-buis.
- Oplossingenvoor opwarming van de aarde
- Opwarming van de aarde oplossing 1 (WS1) bereiden: bereiden van 1,5 mL WS1 in een tube 2 mL door het mengen van 150 µL van FBS (10%), 450 µL van sacharose stockoplossing (3 M) en 900 µL van L-15.
- Opwarming van de aarde oplossing 2 (WS2) bereiden: bereiden van 1,5 mL WS2 in een tube 2 mL door het mengen van 150 µL van FBS (10%), 150 µL van sacharose stockoplossing (1 M) en 1200 µL van L-15.
- Opwarming van de aarde oplossing 3 (WS3) bereiden: bereiden van 1,5 mL WS2 in een tube 2 mL door mengen 150 µL FBS (10%) en 1350 µL van L-15.
- Bereiden van spijsvertering oplossing: voor elk monster bereid 500 µL van de spijsvertering-oplossing door het mengen van 50 µL van collagenase stockoplossing (2 mg/mL), 50 µL van trypsine stockoplossing (1,5 mg/mL), 10 µL van DNase ik (20 µg/mL) en 390 µL van L-15 in een 2 mL tube.
- Dissectie's aanschaffen: schaar, microscissors, pincet, gebogen pincet en acupunctuurnaalden.
2. de testes collectie
- De vis euthanaseren door deze te plaatsen in een schotel met 200 mg/L MS-222 (pH = 7). Voordat u verdergaat met de dissectie, ervoor te zorgen dat de kieuwen zijn gestopt met het verplaatsen en dat ten minste 10 minuten zijn verstreken sinds dat moment om dood door hypoxie.
- De vis drogen door het klopte op een papieren handdoek en breng dit aan de dorsale zijde op een ontleden mat.
- Ten eerste afgesneden de bekken- en borstvinnen vinnen voor gemakkelijker dissectie.
- Horizontaal snip de huid op de buik van de vis tussen de borstvinnen en snijd de huid en onderliggende spieren langs de buik tot de anaalvin.
- Open de lichaamsholte van de vis en de linker- en lichaam muur aan de dissectie mat pins met naalden.
Opmerking: De teelballen bevinden zich boven de gastro-intestinale organen aan beide zijden van de blaas zwemmen (Figuur 1).
- Voorkom besmetting en niet nemen de gastro-intestinale organen, maar zachtjes duw ze aan de ene kant en de testis uit de tegengestelde kant verwijderen. Teelballen zijn aangesloten op de muur van het lichaam dus verwijder ze zorgvuldig en snijd het aansluitende buikvlies door microscissors.
- Bovendien, om te voorkomen dat besmetting, ten eerste steriliseren de teelballen door ze in 70% ethanol voor 2 s, en vervolgens plaats hen in L-15 op een 96-wells-plaat op ijs.
Opmerking: Als het nodig is, schoon-testikels uit vetweefsel en grote bloed vaartuigen juist onder de stereomicroscoop
3. Ultra-snelle koeling van de zaadbalweefsel
- Mark naalden met passende etiketten afhankelijk van het monster Typ en bereiden de evenwichtsinstelling (ES) en de verglazing oplossingen (VS).
- Overbrengen in de teelballen een grotere goed bord of schotel en pin twee tot drie teelballen (of meer afhankelijk van de grootte van de naald) op een steriele acupunctuur naald.
- In de eerste plaats de testis bovenop gebogen pincet. Plaats de punt van de naald in het midden van de testis en trek voorzichtig de testis omhoog met de pincet.
- Na het prikken de testis, Trek voorzichtig het omhoog naar de top van de naald. Controleer of de teelballen van elkaar zijn gescheiden en dat zij niet eraf of glijdend van.
- Plaats de naalden met vastgezette teelballen in een tube 2 mL gevuld met L-15 tot verglazing (bij 25 ˚C; opslagtijd moet niet meer dan 1 h).
Opmerking: De teelballen vastzetten op de naald moet gebeuren snel om te voorkomen dat de teelballen uitdrogen.
- Breng de naald met de teelballen in de oplossing en incubeer gedurende 5 min op 25˚C.
- Breng de naald in de verglazing oplossing en incubeer 30 s bij 25˚C.
- Verwijder de naald uit de verglazing oplossing, snel en zachtjes absorberen de resterende oplossing van het weefsel door een steriel papier handdoek. Wees voorzichtig om te voorkomen dat de teelballen vasthouden aan de papieren handdoek of eraf.
- Plaats de naald snel in vloeibare stikstof geplaatst in een doos van piepschuim.
Opmerking: Deze stap snel om te voorkomen dat blootstelling van weefsel aan de vloeibare stikstof damp doen. Het gebruik van lage volumes van vloeibare stikstof ter voorkoming van kruisbesmetting van monsters. - Houd de naald in vloeibare stikstof in een gesloten doos van piepschuim voor 5-10 min.
- Precool een geopende 4.5 mL cryotube en haar cap in hetzelfde vak.
- Na 5-10 min, elke naald overboeken naar een aparte cryotube onder het oppervlak van de vloeibare stikstof en sluit de cryotube.
Let op: Gebruik altijd beschermende kleding (zoals geïsoleerde handschoenen) wanneer werken met vloeibare stikstof, zoals blootstelling tot ernstige bevriezing leiden kan. - Plaats de cryotube op een metalen stok en plaats het in de cryobank bus zo snel mogelijk. Opslaan van de monsters in een busje opslag dewar tot verder gebruik.
4. opwarming van de aarde Procedure
- Elke naald afzonderlijk warm. Alle oplossingen van de opwarming van de aarde moet bij 25 ° C.
- Loskoppelen van de cryotube van de metalen stok en duik het in vloeibare stikstof zijn opgeslagen in een doos van piepschuim.
- Open het cryotube in de damp van de vloeibare stikstof (met pincet) en introductie van de naald in de vloeibare stikstof.
- Breng de naald zeer snel in de eerste oplossing voor opwarming van de aarde en incubeer gedurende 1 min (bij 25 ° C). Zorg ervoor dat de naald snel om te voorkomen dat de opwarming van de aarde in de lucht tijdens de overdracht overdragen.
- Breng de naald in de tweede oplossing voor opwarming van de aarde en incubeer gedurende 3 minuten (bij 25 ° C).
- Breng de naald in de derde oplossing voor opwarming van de aarde en incubeer gedurende 5 min (bij 25 ° C).
- Los de teelballen van de naald glijden ze naar beneden met een gebogen pincet. Plaats elke verwarmde testis individueel in een aparte put (96-wells-plaat) gevuld met 250 µL van L-15 aangevuld met 10% FBS. Zorg ervoor dat de putten worden aangeduid volgens het monster. Houd het goed plaat op ijs totdat alle monsters worden opgewarmd en tot verdere werkzaamheden.
5. de weefsels spijsvertering
- Bereiden 500 µL van de dissociatie-oplossing voor elk monster in aparte 2 mL tubes. Label de buizen volgens de code van de steekproef. Laat de oplossing bereid dissociatie gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur inwerken.
- Voeg het verwarmde weefsel in de oplossing van de spijsvertering en snijd het in kleine stukjes door ten minste 30 bewegingen van kleine schaar.
- Incubeer de gesneden weefsel op een schudden plaat voor 90 min op 25 ˚C.
- Stop het spijsverteringsproces door toevoeging van 400 µL van L-15 en 100 µL van FBS (10% FBS v/v). Kort zwenk de kolf en laat 1 minuut bij kamertemperatuur inwerken.
- De verkregen oplossing wordt gefiltreerd door 50 µm filters in een 1,5 mL-buis. Label de buizen dienovereenkomstig.
- Centrifugeer de gefilterde oplossing bij 200 × g gedurende 10 minuten op 25 ˚C.
- Zorgvuldig Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 20 µL van L15 aangevuld met 10% FBS. Handmatig schud de buis totdat de pellet volledig is opgelost. Houd de celsuspensie op ijs of op 4 ˚C tot verder gebruik.
6. levensvatbaarheid evaluatie en cel tellen
- Meng 5 µL celsuspensie en 5 µL van 0.4% trypan blauw-oplossing in een tube van de PCR op passende wijze gelabelde 0,2 mL. Als verschillende volumes worden gebruikt, zorg ervoor dat de verdunningsverhouding van 1:1 blijft.
- Deze schorsing gedurende 1 tot 3 minuten bij kamertemperatuur (25 ° C) incuberen.
- Controleer de levensvatbaarheid van elk monster in een hemocytometer onder de Microscoop.
- Het aantal levende cellen (onbevlekt door trypan blue) in 15 velden. Bereken het totale aantal cellen in 20 µm van de celsuspensie. De schorsing is nu klaar voor alle downstream-toepassingen.
Opmerking: Bij het optimaliseren van de procedure voor andere soorten met grotere lichaamslengte, gebruik testis fragmenten van gelijk gewicht. Testes van de ene persoon voor alle experimentele groepen gebruiken om te voorkomen dat individuele variabiliteit in de resultaten. In het geval van zebravis, we profiteerde van het feit dat links en rechts testis moet bevatten een gelijke (of vergelijkbaar) aantal geslachtscellen13 (Zie de vertegenwoordiger resultaten). De linker testis werd gehouden als een besturingselement terwijl de juiste testis verglaasd/opgewarmd was. Levensvatbaarheid percentage werd berekend het aantal cellen van de verglaasd/opgewarmd testis t.o.v. het aantal cellen van de verse testis geïsoleerd werd geïsoleerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gemiddeld, het aantal beginnende kiemcellen geïsoleerd uit een enkele verse zebrafish testis varieerde tussen de 40.000 en 200.000 cellen afhankelijk van de grootte van de vis. Wanneer verteren verse zebrafish teelballen in alle 5 stammen, waren vroege-kiemcellen niet de enige cellen aanwezig in de cel suspensies (Figuur 2). Naast de beginnende geslachtscellen, werden talrijke spermacellen teruggevonden. Aan de andere kant, waren er veel minder spermacellen na vertering van cryopreserved testes. Hieruit bleek dat spermacellen dit ultra snelle koeling protocol niet overleven, en dat zij waarschijnlijk worden geëlimineerd tijdens het verteringsproces, die resulteert in een veel schonere schorsing van beginnende kiemcellen.
Er waren geen significante verschillen in het aantal geslachtscellen vroeg stadium tussen de linker- en teelballen (1 ± 0,5 × 105 vs 1.1 ± 0,7 × 105) van één individu aangetoond door het verteren van verse testes van drie AB zebrafish mannetjes (one-way ANOVA ; F (1,4) = 0,04, p = 0.85). In alle zebrafish lijnen die worden gebruikt in deze studie, leverde het huidige ultra snelle koeling protocol gemiddelde levensvatbaarheid tarieven hoger is dan 50% (tabel 1).
| AB wild type | Casper | Leopard | Vasa transgene | Wilms tumor transgene | ||
| Aantal levende cellen (× 10-4) | Verse testis | 14,5 ± 3,9 | 9,5 ± 2,3 | 12.7 ± 2.4 | 14,5 ± 5.6 | 4,8 ± 1.8 |
| Verglaasd testis | 8.7 ± 2.8 | 7.2 ± 3.0 | 8.8 ± 1,7 | 7.6 ± 3.7 | 2.4 ± 0,7 | |
| Levensvatbaarheid (%) | 58 ± 9 | 72 ± 13 | 69 ± 1 | 50 ± 6 | 53 ± 13 |
Tabel 1. Aantal levende cellen en levensvatbaarheid percentages (bedoel ± SD) verkregen uit verse of verglaasd/verwarmd zebrafish testis. Resultaten worden gepresenteerd voor de vijf regels van de geteste zebrafish: AB wild type, casper (roy- / -; nacre- / -), leopard (leot1/t1), vasa [GS (vas::eGFP)] en Wilms tumor [GS (wt1b::eGFP 1)] transgene lijn.
Figuur 1. Ontleed volwassen zebrafish demonstreren de positie van verschillende anatomische structuren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Cellen schorsingen bereid uit verse en verglaasd/opgewarmd zebrafish zaadbalweefsel uit vijf lijnen van de geteste zebrafish (AB wild type, casper (roy- / -; nacre- / -), leopard (leot1/t1), vasa [GS (vas::eGFP)] en Wilms tumor [GS (wt1b::eGFP 1)] transgene lijn) beeld met fase contrast microscopie. Schaal bar: 40 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het voornaamste doel van deze studie was ondergedompeld Ultra snelle koeling procedure ontwikkeld voor aviaire en zoogdieren soorten10,11,12 te cryopreservatie van vis testis (zebravis als model aan te passen van de naald organisme). Allermeest naar de eerdere studies ten aanzien van cryopreservatie van genetische hulpbronnen van de zebravis waren voornamelijk gericht op cryopreservatie van zebravis sperma2,3,4. Echter protocols voor cryopreservatie van rijpe eicellen en embryo's zijn niet ontwikkeld nog, hoewel sommige recente studies tonen aan dat cryopreservatie van eicellen van de vroeg-stadium is plausibel14,15. In deze studie bewezen we succesvolle cryopreservatie van zebravis testis die nieuwe mogelijkheden voor de opslag van waardevolle genetische hulpbronnen, biedt vooral omdat na de transplantatie ze in zowel mannelijke als vrouwelijke gameten5 rijpen kunnen .
Tot de beste van onze kennis is dit de eerste studie behandelt de ultra snelle afkoeling van de zebravis weefsel door de methode NIV. Soortgelijke studies omvatten verglazing van zebravis teelballen in 0,25 mL plastic rietjes16 en verglazing van zebravis eierstokken in gesloten metalen containers14. Het belangrijkste voordeel van NIV ten opzichte van de twee genoemde containers is de rechtstreekse blootstelling van teelballen aan de vloeibare stikstof met minimale hoeveelheid cryoprotectant wordt gehecht aan hen, dus het maximaliseren van de koeling tarief10. De toename van de koeling tarief vermindert de vereiste concentratie van cryoprotectant, waardoor hun toxiciteit. Bovendien, alle stukken van het weefsel kunnen worden blootgesteld aan de cryoprotectant en vloeibare stikstof synchroon. Rechtstreekse blootstelling aan de vloeibare stikstof kan wel een nadeel ten aanzien van kruisbesmetting. Het is mogelijk dat bacteriën of virussen aanwezig in de vloeibare stikstof zijn en dat directe weefsel blootstelling tot besmetting leiden kan. Daarom raden we zich te onthouden van het hergebruik van vloeibare stikstof bij het uitvoeren van NIV en te ontdoen van de gebruikte vloeibare stikstof na afkoeling. Metalen containers bieden voordelen in dit verband voorgestelde14, maar ze waren aangepaste gemaakt, en zijn niet gemakkelijk toegankelijk voor alle laboratoria.
Bij het vergelijken van ultra snelle koeling te vertragen-tarief bevriezing, is een cruciaal voordeel van ultra snelle koeling de afwezigheid van spermatozoïden na vertering. Langzaam-tarief bevriezing methoden in sommige argentea vissoorten aangetoond dat soortgelijke protocollen opleveren vergelijkbare levensvatbaarheid van zowel beginnende kiemcellen en spermacellen17 resulterend in hoge spermacellen nummers na vertering van de cryopreserved weefsel. Onze resultaten in zebrafish (huidige studie), karper en goudvis (niet-gepubliceerde resultaten) wijzen erop dat er zeer weinig spermacellen na vertering van de verwarmde weefsels en dat doen ze niet deze procedure overleven en krijgen verteerd wat vereenvoudigt stroomafwaarts toepassingen omdat geen extra verrijking procedures nodig zijn.
Er zijn verschillende kritische stappen binnen dit protocol. De eerste is om verontreiniging te voorkomen tijdens het proces van isolement omdat het tot een afname van het aantal cellen verkregen leiden kan en downstream toepassingen kan belemmeren. Een van de cruciale stappen excisie van teelballen waar bacteriële besmetting optreden van ingewanden beschadigd is (dus het is best niet te verwonden of volledig verwijderen van de ingewanden) of van de huid als het dezelfde dissectie gereedschap gebruikt voor het snijden van de huid en het verwijderen van de teelballen. Ten tweede, wees voorzichtig bij het vastzetten teelballen aan de acupunctuur-naald, want het is mogelijk dat de teelballen af vallen of schuif naar beneden. Momenteel testen we verschillende methoden om te voorkomen dat de teelballen glijden tijdens de verglazing procedure (vloeibare stikstof temperaturen). Ten derde, aandacht besteden aan de periode van blootstelling aan de cryoprotectant. Blootstelling van de teelballen (en dus cellen) aan hoge cryoprotectant concentraties (vooral in de oplossing van verglazing) voor kan te lang leiden tot celdood als gevolg van cryoprotectant toxiciteit. Ook wees voorzichtig bij het storten van de naalden in vloeibare stikstof; Veeg van de overdaad aan VS aangezien het kan invloed hebben op het koelproces en duik de naalden snel om te voorkomen dat blootstelling aan de damp van vloeibare stikstof. Tot slot breng de teelballen van vloeibare stikstof in de opwarming van de aarde media snel om te voorkomen dat voorbarig opwarming van de aarde in de lucht tijdens de overdracht.
In het huidige document presenteren we de procedure voor cryopreservatie van testes van de vijf stammen van de zebravis via MeOH, PG en Me2dus als cryoprotectant doordringt. De methode levert betrouwbare resultaten voor alle geteste zebrafish stammen met een levensvatbaarheid van de cellen van boven de 50%. Het is mogelijk om het gebruik van deze methode met wijzigingen voor andere soorten, evenals. In de eerste plaats elke cryopreservatie protocol soorten specifieke en verschillende cryoprotectant opbrengst verschillende efficiëntie in verschillende soorten (d.w.z. ethyleenglycol leverde de hoogste levensvatbaarheid in acipenserids18 terwijl Me2zo leverde de hoogste levensvatbaarheid van zalmachtigen19 en cypriniden17). Bovendien moet aandacht worden besteed aan de concentraties ook gebruikt. De huidige studie en het onderzoek op de bruine forel Salmo trutta eierstokken15 aantonen dat de beste resultaten worden verkregen met behulp van dezelfde concentratie van twee cryoprotectant, maar dit in andere soorten variëren kan. Tot slot, zebravis teelballen zijn heel klein, en het is zelfs mogelijk om verschillende teelballen pin op één naald. Wanneer u werkt met soorten met grotere teelballen, is de grootte van testiculaire stukken die worden gebruikt een zeer belangrijke factor. Wij stellen voor om belichtingstijden voor grotere weefsel stukken rekening houdend rekening cryoprotectant toxiciteit en efficiëntie verhogen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door de National Research, ontwikkeling en innovatie Office van Hongarije (grant 116912 naar ÁH), het Bureau van de kosten (voedsel en landbouw kosten actie FA1205: AQUAGAMETE), de door Hungaricum Scholarship Programme (subsidie voor ZM) en de nieuwe Hongaarse nationale Excellence predoctoraal Fellowship (grant tegen EK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leibovitz media (L-15) | Sigma-Aldrich | L1518 | Supplemented with L-glutamine |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Sucrose | Acros Organics | 57-50-1 | |
| Trehalose | Acros Organics | 99-20-7 | Dihydrate |
| Methanol | Reanal | 20740-0-08-65 | |
| Propylene glycol | Reanal | 08860-1-08-65 | |
| Dimethyl sulfoxide | Reanal | 00190-1-01-65 | |
| Collagenase | Gibco | 9001-12-1 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T8003 | |
| DNase I | Panreac AppliChem | A3778 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T6146 | |
| Phospate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | Tablets for preparation of 200 ml PBS solution |
References
- Mazur, P., Leibo, S. P., Seidel, G. R. J. Cryopreservation of the germplasm of animals used in biological and medical research: Importance, impact, status, and future directions. Biol. Reprod. 78 (1), 2-12 (2008).
- Carmichael, C., Westerfield, M., Varga, Z. M. Cryopreservation and In Vitro Fertilization at the Zebrafish International Resource Center. Methods Mol. Biol. 546, 45-65 (2009).
- Yang, H., Carmichael, C., Varga, Z. M., Tiersch, T. R. Development of a simplified and standardized protocol with potential for high-throughput for sperm cryopreservation in zebrafish Danio rerio. Theriogenology. 68 (2), 128-136 (2007).
- Morris, J. P. IV, Berghmans, S., Zahrieh, D., Neuberg, D. S., Kanki, J. P., Look, A. T. Zebrafish sperm cryopreservation with N,N-dimethylacetamide. Biotechniques. 35 (5), 956-968 (2003).
- Yoshizaki, G., et al. Spermatogonial transplantation in fish: A novel method for the preservation of genetic resources. Comp. Biochem. Physiol. Part D: Genomics Proteomics. 6 (1), 55-61 (2011).
- Gao, D., Critser, J. K.
- Asturiano, J. F., Cabrita, E., Horváth, Á Progress, challenges and perspectives on fish gamete cryopreservation: A mini-review. Gen. Comp. Endocrinol. 245, 69-76 (2017).
- Kása, E., et al. Development of sperm vitrification protocols for freshwater fish (Eurasian perch, Perca fluviatilis) and marine fish (European eel, Anguilla anguilla). Gen. Comp. Endocrinol. 245, 102-107 (2017).
- Cuevas-Uribe, R., Leibo, S. P., Daly, J., Tiersch, T. R. Production of channel catfish with sperm cryopreserved by rapid non-equilibrium cooling. Cryobiology. 63 (3), 186-197 (2011).
- Wang, Y., Xiao, Z., Li, L., Fan, W., Li, S. W. Novel needle immersed vitrification: A practical and convenient method with potential advantages in mouse and human ovarian tissue cryopreservation. Hum. Reprod. 23 (10), 2256-2265 (2008).
- Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. Production of Live Offspring from Testicular Tissue Cryopreserved by Vitrification Procedures in Japanese Quail (Coturnix japonica). Biol. Reprod. 88 (5), 124 (2013).
- Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. Novel needle-in-straw vitrification can effectively preserve the follicle morphology, viability, and vascularization of ovarian tissue in Japanese quail (Coturnix japonica). Anim. Reprod. Sci. 134 (3-4), 197-202 (2012).
- Lee, S., Yoshizaki, G. Successful cryopreservation of spermatogonia in critically endangered Manchurian trout (Brachymystax lenok). Cryobiology. 72 (2), 165-168 (2016).
- Marques, L. S., et al. Viability of zebrafish (Danio rerio) ovarian follicles after vitrification in a metal container. Cryobiology. 71 (3), 367-373 (2015).
- Lujić, J., et al. First successful vitrification of salmonid ovarian tissue. Cryobiology. 76, 154-157 (2017).
- Bono-Mestre, C., Cardona-Costa, J., García-Ximénez, F. Effects on cell viability of three zebrafish testicular cell or tissue cryopreservation methods. CryoLetters. 30 (2), 148-152 (2009).
- Marinović, Z., et al. Cryosurvival of isolated testicular cells and testicular tissue of tench Tinca tinca and goldfish Carassius auratus following slow-rate freezing. Gen. Comp. Endocrinol. 245, 77-83 (2017).
- Pšenička, M., Saito, T., Rodina, M., Dzyuba, B. Cryopreservation of early stage Siberian sturgeon Acipenser baerii germ cells, comparison of whole tissue and dissociated cells. Cryobiology. 72, 119-122 (2016).
- Lee, S., Iwasaki, Y., Shikina, S., Yoshizaki, G. Generation of functional eggs and sperm from cryopreserved whole testes. Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 110 (5), 1640-1645 (2013).
