Summary
Lo scopo principale di questo studio era di adattare l'ago immerso procedura di vitrificazione (NIV) per crioconservare intero zebrafish testicoli. Inoltre, è stata testata la ripetibilità del metodo in cinque zebrafish diversi ceppi.
Abstract
Attuali tendenze nella scienza e nella biotecnologia portano alla creazione di migliaia di nuove linee in organismi modello, determinando così la necessità di nuovi metodi per la conservazione delle risorse genetiche oltre le comuni pratiche di mantenere colonie riproduttive. Lo scopo principale di questo studio era di adattare l'ago immerso procedura di vitrificazione (NIV) per crioconservare intero zebrafish testicoli. Crioconservazione delle cellule di germe iniziale di testicoli interi NIV offre possibilità per lo stoccaggio di zebrafish risorse genetiche, soprattutto perché dopo il trapianto può maturare in gameti maschili e femminili. Testicoli sono stati asportati, appuntato su un ago di agopuntura, equilibrato in due mezzi di Crioprotettivi (soluzione di equilibrazione contenente metanolo di 1,5 M e 1,5 M glicole propilenico; e soluzione di vitrificazione contenente dimetilsolfossido di 3 M e 3 M glicole propilenico) e ' immerso in azoto liquido. I campioni venivano riscaldati in una serie di tre soluzioni di riscaldamento conseguente. I principali vantaggi di questa tecnica sono (1) la mancanza di spermatozoi dopo digestione dei testicoli riscaldati, facilitando così le manipolazioni a valle; (2) ultra-rapido raffreddamento che permette l'esposizione ottima dei tessuti a azoto liquido quindi massimizzare il raffreddamento e ridurre la concentrazione necessaria di crioprotettori, riducendo la loro tossicità; (3) esposizione sincrono dei testicoli parecchie ai crioprotettori e azoto liquido; e ripetibilità (4) dimostra come ottenere redditività di oltre il 50% in cinque differenti zebrafish ceppi.
Introduction
Nuove tendenze nella scienza e nella biotecnologia hanno portato alla creazione di migliaia di nuove linee mutanti di topo, Drosophila, zebrafish e altre specie utilizzate come organismi modello in biomedica e altre scienze1. Inoltre, come nuove tecnologie vengono sviluppate e diventano disponibili, i numeri di linee mutanti costantemente aumentano2. Questo porta alla necessità per una conservazione sicura delle risorse genetiche oltre le comuni pratiche di mantenere colonie riproduttive. Come un metodo che consente l'archiviazione sicura delle risorse genetiche per un periodo di tempo indefinito, crioconservazione offre molti vantaggi come estensione della stagione riproduttiva, aggira la necessità per la manutenzione continua dei riproduttori, ed è più costo - e Labor-efficiente2.
Protocolli per la crioconservazione di spermatozoi sviluppato durante il passato parecchi anni2,3,4 offrono la possibilità di successo deposito di materiale genetico maschile di zebrafish. Tuttavia, la crioconservazione degli ovuli o embrioni di pesce non è ancora possibile grazie alla loro struttura complessa e di grandi quantità di materiale di tuorlo. Recentemente, la pratica del trapianto di cellule primordiali germinali (PGC) o cellule staminali spermatogoniali (SSCs) offre un bypass per questa barriera di svilupparsi dopo trapianto5in funzionali degli spermatozoi e uova. Crioconservazione delle CSS offre quindi una nuova frontiera nella conservazione delle risorse genetiche rare e preziose.
Anche se crioconservazione offre molti vantaggi, il processo di congelamento lento-tasso genera diverse condizioni che possono portare a cella danno2. Questi includono la formazione di ghiaccio intracellulare ed extracellulare, disidratazione, tossicità crioprotettore e altri. Ghiaccio intracellulare danneggia le cellule, ghiaccio extracellulare può portare a frantumazione meccanica delle cellule, mentre la diffusione dell'acqua dalle cellule durante il congelamento lento-tasso può condurre a disidratazione6. Recentemente, vetrificazione come una tecnica che impedisce gli effetti negativi della formazione di ghiaccio è stata applicata nella crioconservazione di gameti di pesce7,8,9. Esso presenta una tecnica di raffreddamento ultra-rapida attraverso il quale i mezzi di comunicazione interne ed esterne trasformare in uno stato amorfo/vetroso senza cristallizzazione in ghiaccio7,10. Vetrificazione successo del tessuto testicolare e ovarico è stata provata in specie di uccelli e mammiferi10,11,12, aprendo così la possibilità per la sua applicazione in pesce, pure.
In questo studio, presentiamo la procedura di vitrificazione (NIV) ago immerso per la crioconservazione di zebrafish tutta i testicoli. Dimostriamo un metodo affidabile per l'isolamento di cellule germinali di zebrafish fase iniziale senza contaminazione e un processo di crioconservazione che produce quantità elevate relativamente precoce delle cellule di germe con una bassa presenza di altre cellule, soprattutto gli spermatozoi. Al meglio della nostra conoscenza, questo è il primo studio a dimostrare un protocollo dettagliato visualizzato in quel momento per ultra-rapido raffreddamento del tessuto gonadico pesce e cellule germinali zebrafish. Inoltre, è evidenziato la ripetibilità del metodo in cinque differenti zebrafish ceppi: AB wild-type, casper (roy- / -; madreperla- / -), leopardo (leot1/t1), vasa [Tg (vas::eGFP)] e linea transgenica di Wilms tumore [Tg (wt1b::eGFP 1)].
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Protocol
Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati il diritto ungherese del benessere animale.
1. preparazione dei reagenti
- Soluzioni di riserva
- Preparare 1 M trealosio aggiungendo 0,378 g di trealosio diidrato in 1 mL di dH2O. Mix bene fino a quando si scioglie completamente.
- Preparare 1 M saccarosio aggiungendo 0,342 g di saccarosio in 1 mL di dH2O. Mix bene fino a quando si scioglie completamente.
- Preparare 1 M HEPES aggiungendo 0,238 g di HEPES a 1 mL di dH2O. Mix bene fino a quando si scioglie completamente.
- Preparare della collagenosi 20 mg/mL (290 U/mg) con l'aggiunta di 100 mg a 5 mL di PBS. Mescolare accuratamente fino a quando non si scioglie. Filtro sterile attraverso filtri di 0,2 µm. Aliquotare 50 µ l in 0,2 mL PCR tubi e congelare a - 20 ° C.
- Preparare la tripsina 15mg/mL (~ 10000 U/mg) con l'aggiunta di 75 mg per 5 mL di PBS. Mescolare accuratamente fino a quando non si scioglie. Filtro sterile attraverso filtri di 0,2 µm. Aliquotare 50 µ l in 0,2 mL PCR tubi e congelare a - 20 ° C.
- Preparare 1 mg/mL dnasi I (~ 3000 U/mg) con l'aggiunta di 5 mg a 5 mL di PBS. Mescolare accuratamente fino a quando non si scioglie. Filtro sterile attraverso filtri di 0,2 µm. Aliquotare 50 µ l in 0,2 mL PCR tubi e congelare a - 20 ° C.
- Preparare 0,4% trypan blu aggiungendo 40 mg di trypan blu a 10 mL di PBS. Filtro sterile attraverso filtri di 0,2 µm. Aliquotare 1 mL in provette da 1,5 mL.
- Preparare 200 mg/L MS-222 (tricaina solfonato di metano) con l'aggiunta di 200 mg di MS-222 in 1 L di dH2O. Mix bene fino a quando si scioglie completamente. Inoltre, soluzione tampone il MS-222 con bicarbonato di sodio per un pH neutro di 7.0.
- Soluzioni per la vitrificazione
- Preparare la soluzione di equilibrazione (ES): preparare 2 mL di ES mescolando 121,5 µ l di metanolo (MeOH; 1,5 M), 220 µ l di glicole propilenico (PG; 1,5 M), 200 µ l di FBS (10%), 200 µ l di soluzione madre di trealosio (0,1 M), 50 µ l di soluzione madre HEPES (25 mM) e 1208.5 µ l di L-15 in un 2 tubo da mL.
- Preparare la soluzione di vitrificazione (VS): preparare 2 mL di VS mescolando 439 µ l di PG (3 M), 426 µ l di solfossido dimetilico (Me2così; 3M), 200 µ l di FBS (10%), 200 µ l di soluzione madre di trealosio (0,1 M), 50 µ l di HEPES stock soluzione (25 mM) e 685 µ l di L-15 in un provetta da 2 mL.
- Soluzioni per il riscaldamento
- Preparare la soluzione di riscaldamento 1 (WS1): preparare 1,5 mL di WS1 in una provetta da 2 mL con 150 µ l di FBS (10%), 450 µ l di soluzione madre di saccarosio (3 M) e 900 µ l di L-15.
- Preparare soluzione scaldavivande 2 (WS2): preparare 1,5 mL di WS2 in una provetta da 2 mL con 150 µ l di FBS (10%), 150 µ l di soluzione madre di saccarosio (1 M) e 1200 µ l di L-15.
- Preparare la soluzione di riscaldamento 3 (WS3): preparare 1,5 mL di WS2 in una provetta da 2 mL di miscelazione 150 µ l di FBS (10%) e 1350 µ l di L-15.
- Preparare la soluzione di digestione: per ogni campione preparare 500 µ l della soluzione digestione mescolando 50 µ l di soluzione madre di collagenasi (2 mg/mL), 50 µ l di soluzione madre di tripsina (1,5 mg/mL), 10 µ l di dnasi I (20 µ g/mL) e 390 µ l di L-15 in un mL 2 tubo.
- Ottenere strumenti di dissezione: forbici, microforbici, pinzette, Pinzette curve e aghi per agopuntura.
2. testicoli collezione
- Eutanasia il pesce mettendolo in un piatto contenente 200 mg/L MS-222 (pH = 7). Prima di continuare con la dissezione, assicurarsi che le branchie hanno smesso di muoversi e che almeno 10 minuti sono passati da quel momento per garantire la morte da ipossia.
- Asciugate il pesce da pacche su un tovagliolo di carta e posizionarlo sul lato dorsale su una stuoia di dissezione.
- In primo luogo tagliare le pinne pettorali e pelviche per dissezione più facile.
- Orizzontalmente snip la pelle sul ventre del pesce tra le pinne pettorali e tagliare la pelle e il muscolo di fondo lungo il ventre fino alla pinna anale.
- Aprire la cavità del corpo del pesce e il pin la parete del corpo sinistra e destra al tappeto di dissezione con aghi.
Nota: I testicoli si trovano sopra gli organi gastrointestinali su entrambi i lati della vescica natatoria (Figura 1).
- Per evitare la contaminazione, non estrarre gli organi gastrointestinali, ma delicatamente spingerle verso un lato e rimuovere il testicolo dal lato avversario. Testicoli sono collegati alla parete del corpo quindi rimuoverli con attenzione e tagliare il collegamento peritoneo di microforbici.
- Inoltre, al fine di prevenire la contaminazione, in primo luogo sterilizzare i testicoli da metterli in etanolo al 70% per 2 s e quindi posto loro in L-15 su una piastra a 96 pozzetti sul ghiaccio.
Nota: Se è necessario, testicoli puliti dal tessuto adiposo e grandi vasi precisamente sotto lo stereomicroscopio sanguigni
3. ultra-rapido raffreddamento del tessuto testicolare
- Aghi di Mark con etichette appropriate a seconda del campione digitare e preparano l'equilibrazione (ES) e soluzioni di vitrificazione (VS).
- Trasferire i testicoli in una piastra ben più grande o piatto e perno a due testicoli (o più a seconda delle dimensioni dell'ago) su un ago di agopuntura sterili.
- In primo luogo posizione del testicolo in cima curve pinzette. Mettere la punta dell'ago nel mezzo del testicolo e tirare verso l'alto il testicolo con le pinzette.
- Dopo perforazione del testicolo, tirarlo delicatamente verso l'alto verso la parte superiore dell'ago. Assicurarsi che i testicoli sono separati gli uni dagli altri e che non vengano a cadere o scivolare giù.
- Luogo pieno di aghi con i testicoli appuntati in una provetta da 2 mL con L-15 fino a vetrificazione (a 25 ˚ c; tempo di conservazione non deve superare 1 h).
Nota: Pinning i testicoli dell'ago dovrebbe essere fatto velocemente per evitare i testicoli dall'asciugarsi.
- Trasferire l'ago con i testicoli in soluzione di equilibrazione e incubare per 5 min a 25 ˚ c.
- Trasferire l'ago nella soluzione di vitrificazione e incubare per 30 s a 25 ˚ c.
- Rimuovere l'ago dalla soluzione di vitrificazione, rapidamente e delicatamente assorbire la soluzione rimanente dal tessuto di un tovagliolo di carta sterile. Usare cautela per evitare i testicoli che attacca per il tovagliolo di carta o cadere.
- Inserire rapidamente l'ago nell'azoto liquido, posizionato in una scatola di polistirolo.
Nota: Fare questo passo rapidamente per evitare l'esposizione del tessuto per il vapore di azoto liquido. Utilizzare volumi bassi di azoto liquido per evitare la contaminazione incrociata dei campioni. - Tenere l'ago in azoto liquido in una scatola di polistirolo chiusa per 5-10 min.
- Preraffreddare un stoccaggio PROVETTE CRIOGENIA aperto 4,5 mL e il tappo nella stessa casella.
- Dopo 5-10 min, trasferire ogni ago in un separato stoccaggio PROVETTE CRIOGENIA sotto la superficie dell'azoto liquido e chiudere lo stoccaggio provette criogenia.
Attenzione: Utilizzare sempre abbigliamento protettivo (quali guanti isolanti) quando lavorare con azoto liquido come esposizione può portare a gravi congelamenti. - Posizionare lo stoccaggio PROVETTE CRIOGENIA su una canna di metallo e posizionarlo nel sebatoio criobanca velocemente come possibile. Conservare i campioni in un deposito di contenitore dewar fino all'ulteriore utilizzo.
4. procedura di riscaldamento
- Riscaldare ogni ago separatamente. Tutte le soluzioni di riscaldamento dovrebbero essere a 25 ° C.
- Staccare lo stoccaggio PROVETTE CRIOGENIA dalla canna in metallo e immergerlo nell'azoto liquido memorizzato in una scatola di polistirolo.
- Aprire lo stoccaggio PROVETTE CRIOGENIA nel vapore di azoto liquido (utilizzando forcipe) e rilasciare l'ago nell'azoto liquido.
- Trasferire l'ago molto veloce nella prima soluzione di riscaldamento e incubare per 1 min (a 25 ° C). Assicurarsi di trasferire l'ago rapidamente per evitare il suo riscaldamento nell'aria durante il trasferimento.
- Trasferire l'ago nella seconda soluzione scaldavivande e incubare per 3 min (a 25 ° C).
- Trasferire l'ago nella terza soluzione scaldavivande e incubare per 5 min (a 25 ° C).
- Rilasciare i testicoli dall'ago di facendole scorrere verso il basso con una pinzetta curva. Luogo ogni testicolo riscaldato individualmente in un pozzo separato (piastra a 96 pozzetti) riempito con 250 µ l di L-15 supplementato con 10% FBS. Assicurarsi che i pozzi sono etichettati secondo il campione. Tenere la piastra ben su ghiaccio fino a quando tutti i campioni sono riscaldati e fino ad ulteriore lavoro.
5. tessuto digestione
- Preparare 500 µ l di soluzione di dissociazione per ciascun campione in provette separate da 2 mL. Etichettare le provette secondo il codice del campione. Incubare la soluzione preparata dissociazione per 5 min a temperatura ambiente.
- Aggiungere il tessuto riscaldato nella soluzione di digestione e tagliarlo in piccoli pezzi da almeno 30 movimenti di piccole forbici.
- Incubare il tessuto tagliato su una piastra di agitazione per 90 min a 25 ˚ c.
- Interrompere il processo di digestione aggiungendo 400 µ l di L-15 e 100 µ l di FBS (FBS 10% v/v). Brevemente, agitare bene la soluzione e incubare per 1 min a temperatura ambiente.
- Filtrare la soluzione ottenuta attraverso 50 µm filtri in una provetta da 1,5 mL. Etichettare le provette di conseguenza.
- Centrifugare la soluzione filtrata a 200 × g per 10 min a 25 ˚ c.
- Con attenzione rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in 20 µ l di L15 supplementato con 10% FBS. Agitare manualmente il tubo fino a che il pellet sia completamente disciolta. Mantenere la sospensione cellulare in ghiaccio o a 4 ° c fino al successivo utilizzo.
6. valutazione vitalità e conta cellulare
- Mix 5 µ l di sospensione cellulare e 5 µ l di soluzione di blu di trypan 0,4% in una provetta PCR adeguatamente etichettata 0,2 mL. Se vengono utilizzati diversi volumi, assicurarsi che il rapporto di diluizione di 1:1 rimane.
- Incubare la sospensione per 1 a 3 min a temperatura ambiente (25 ° C).
- Verifica la fattibilità di ogni campione in un emocitometro sotto il microscopio.
- Contare il numero di cellule vive (senza macchia di tripan blu) in 15 campi. Calcolare il numero totale di cellule in 20 µm della sospensione delle cellule. La sospensione è ora pronta per qualsiasi applicazione a valle.
Nota: Quando si ottimizza la procedura per le altre specie con corpo più grande, utilizzare frammenti di testicolo di uguale peso. Utilizzare testicoli da un individuo per tutti i gruppi sperimentali al fine di evitare la variabilità individuale nei risultati. Nel caso di zebrafish, abbiamo approfittato del fatto che sinistra e testicolo di destra deve contenere un numero pari (o molto simile) di cellule germinali13 (vedere i risultati di rappresentante). Il testicolo di sinistra è stato mantenuto come controllo mentre il testicolo di destra era vetrificato/riscaldati. Percentuale di redditività è stato calcolato il numero di cellule isolate dal testicolo vetrificato/riscaldato rispetto al numero di cellule isolate dal testicolo fresco.
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Representative Results
In media, il numero delle cellule di germe iniziale isolato da un testicolo singolo zebrafish fresco variava tra 40.000 e 200.000 cellule a seconda delle dimensioni del pesce. Quando nei testicoli di zebrafish fresco in tutti i 5 ceppi di digestione, cellule germinali primi non erano sola cellule presenti nelle sospensioni delle cellule (Figura 2). Al lato delle cellule di germe iniziale, numerosi gli spermatozoi sono stati trovati pure. D'altra parte, c'erano molto meno spermatozoi dopo digestione dei testicoli crioconservati. Questo indicato che gli spermatozoi non sopravvivono questo protocollo di raffreddamento ultra-rapido, e che sono molto probabilmente eliminato durante il processo di digestione, che produce una sospensione molto pulita delle cellule di germe della presto-fase.
Non c'erano differenze significative nel numero di cellule germinali precoce tra i testicoli di sinistra e destra (1 ± 0,5 × 105 vs 1.1 ± 0.7 × 105) di un singolo individuo ha dimostrato digerendo freschi testicoli dei maschi di tre AB zebrafish (One-way ANOVA ; F (1,4) = 0,04, p = 0.85). In tutte le linee di zebrafish utilizzate in questo studio, l'attuale protocollo di raffreddamento ultra-rapido dato i tassi di redditività media superiore al 50% (tabella 1).
| AB wild-type | Casper | Leopardo | Vasa transgenici | Tumore di Wilms transgenico | ||
| Numero di cellule vive (10 ×4) | Testicolo fresco | 14,5 ± 3,9 | 9,5 ± 2.3 | 12,7 ± 2.4 | 14,5 ± 5,6 | 4,8 ± 1,8 |
| Testicolo vetrificato | 8.7 ± 2.8 | 7,2 ± 3.0 | 8.8 ± 1.7 | 7.6 ± 3,7 | 2.4 ± 0,7 | |
| Vitalità (%) | 58 ± 9 | 72 ± 13 | 69 ± 1 | 50 ± 6 | 53 ± 13 |
Tabella 1. Numero di cellule vive e le percentuali di redditività (media ± DS) ottenute dal testicolo di zebrafish freschi o vetrificato/riscaldato. I risultati sono presentati per le cinque linee di zebrafish testata: AB wild-type, casper (roy- / -; madreperla- / -), leopardo (leot1/t1), vasa [Tg (vas::eGFP)] e linea transgenica di Wilms tumore [Tg (wt1b::eGFP 1)].
Figura 1. Zebrafish adulto dissecata dimostrando la posizione delle varie strutture anatomiche. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 2. Le cellule di sospensioni preparate dal tessuto testicolare di zebrafish fresco e vetrificate, riscaldato da cinque linee di zebrafish testata (AB wild type, casper (roy- / -; madreperla- / -), leopardo (leot1/t1), vasa [Tg (vas::eGFP)] e Wilms tumore [Tg (wt1b::eGFP 1)] linea transgenica) imaged con microscopia di contrasto di fase. Barra della scala: 40 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Lo scopo principale di questo studio era di adattare l'ago immerso ultra-rapida procedura di raffreddamento sviluppato per specie di uccelli e mammiferi10,11,12 per la crioconservazione del testicolo di pesce (zebrafish come modello organismo). La maggior parte degli studi precedenti per quanto riguarda la crioconservazione delle risorse genetiche di zebrafish erano principalmente concentrata sulla crioconservazione di zebrafish spermatozoi2,3,4. Tuttavia, non sono stati sviluppati protocolli per la crioconservazione di ovociti maturi ed embrioni ancora, anche se alcuni studi recenti dimostrano che la crioconservazione di ovociti in fase iniziale è plausibile14,15. In questo studio abbiamo dimostrato successo crioconservazione degli spermatogoni di zebrafish che offre nuove possibilità per la conservazione delle preziose risorse genetiche, soprattutto perché dopo il trapianto può maturare in gameti maschili e femminili5 .
Al meglio della nostra conoscenza, questo è il primo studio è affrontare il raffreddamento ultra-rapido di zebrafish tessuto dal metodo NIV. Simili studi hanno incluso vetrificazione dei testicoli di zebrafish 0,25 mL cannucce di plastica16 e vetrificazione delle ovaie di zebrafish in contenitori metallici chiusi14. Il vantaggio principale di NIV rispetto ai due contenitori accennati è l'esposizione diretta dei testicoli per azoto liquido con volumi minimi di crioprotettori essere attaccati a loro, quindi massimizzare il tasso di raffreddamento10. L'aumento della velocità di raffreddamento riduce la concentrazione necessaria di crioprotettori, riducendo la loro tossicità. Inoltre, tutti i pezzi di tessuto possono essere esposti al crioprotettori e azoto liquido in modo sincrono. Tuttavia, l'esposizione diretta di azoto liquido potrebbe essere uno svantaggio per quanto riguarda la contaminazione incrociata. È possibile che i batteri o virus sono presenti nell'azoto liquido e che l'esposizione diretta del tessuto può portare alla contaminazione. Pertanto, consigliamo di astenersi dal riutilizzo di azoto liquido quando lo svolgimento di NIV e scartare l'azoto liquido usato dopo il raffreddamento. Proposto contenitori metallici offrono vantaggi a questo proposito14, tuttavia erano personalizzati fatto e non sono facilmente accessibili a tutti i laboratori.
Quando si confrontano raffreddamento ultra-rapido a lento-tasso di congelamento, un vantaggio cruciale di raffreddamento ultra-rapido è l'assenza di spermatozoi dopo la digestione. Metodi di congelamento lento-tasso ha dimostrato in alcune specie di Pesci carpa che protocolli simili rendimento comparabile vitalità di sia le cellule di germe iniziale e spermatozoi17 conseguente numero di spermatozoi elevato dopo digestione del crioconservati tessuto. I nostri risultati in zebrafish (studio presente), carpa comune e pesci rossi (dati non pubblicati) indicano che ci sono pochissimi spermatozoi dopo digestione dei tessuti riscaldati e che essi non sopravvivere questa procedura e ottenere digerito che semplifica a valle applicazioni poiché nessuna procedura ulteriore arricchimento è necessari.
Ci sono diversi passaggi critici all'interno di questo protocollo. Il primo è quello di evitare qualsiasi contaminazione durante il processo di isolamento, dal momento che può portare ad una diminuzione del numero di cellule ottenute e può ostacolare eventuali applicazioni a valle. Uno dei passaggi cruciali è l'asportazione dei testicoli dove la contaminazione batterica può verificarsi da danneggiato budella (quindi è meglio non ferire o rimuovere completamente l'intestino) o dalla pelle se utilizza lo stesso strumento di dissezione per tagliare la pelle e la rimozione del testicoli. In secondo luogo, fare attenzione quando il blocco di testicoli all'ago di agopuntura poiché è possibile che i testicoli cadono o scivolare verso il basso. Attualmente, stiamo testando diversi metodi per impedire che i testicoli scorrevole durante la procedura di vitrificazione (temperatura dell'azoto liquido). In terzo luogo, prestare attenzione al periodo di esposizione per i crioprotettori. L'esposizione dei testicoli (e quindi le cellule) ad alta concentrazione di crioprotettore (soprattutto nella soluzione vitrificazione) per troppo tempo può condurre alla morte delle cellule dovuto la tossicità crioprotettore. Inoltre, prestare attenzione quando immergersi gli aghi in azoto liquido; pulire l'eccesso di VS, dal momento che può influenzare il processo di raffreddamento e immergersi rapidamente gli aghi al fine di evitare l'esposizione al vapore di azoto liquido. Infine, trasferire i testicoli da azoto liquido in media riscaldamento rapidamente al fine di evitare la prematura riscaldamento nell'aria durante il trasferimento.
Nel presente documento presentiamo la procedura per la crioconservazione dei testicoli da cinque ceppi di zebrafish usando MeOH, PG e Me2così come permeando crioprotettori. Il metodo produce risultati affidabili per tutti i ceppi testati zebrafish con una vitalità cellulare di oltre il 50%. È possibile utilizzare questo metodo con modifiche per altre specie, pure. In primo luogo, ogni protocollo di crioconservazione è specie-specifici e differenti crioprotettori producono efficienze diverse nelle diverse specie (cioè il glicole etilenico ha reso la più alta redditività in acipenserids18 mentre io2così ha reso la più alta redditività salmonidi19 e ciprinidi17). Inoltre si dovrebbe prestare attenzione alle concentrazioni utilizzate pure. Lo studio presente e lo studio condotto su trota fario Salmo trutta ovaie15 dimostrano che i risultati migliori si ottengono utilizzando la stessa concentrazione di due crioprotettori, tuttavia questo può variare in altre specie. Infine, zebrafish testicoli sono molto piccole, ed è anche possibile di pin diversi testicoli su un ago. Quando si lavora con specie con i testicoli più grandi, le dimensioni dei pezzi testicolare che vengono utilizzati sono un fattore molto importante. Si consiglia di aumentare i tempi di esposizione per pezzi più grandi di tessuto tenendo conto crioprotettore tossicità e di efficienza.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto dai nazionali di ricerca, sviluppo e innovazione ufficio d'Ungheria (grant 116912 a MÀY), l'ufficio di costo (cibo e agricoltura costo azione FA1205: AQUAGAMETE), al programma di borse di Hungaricum Stipendium (grant a ZM) e il nuovo Hungarian National eccellenza Predoctoral Fellowship (grant a EK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leibovitz media (L-15) | Sigma-Aldrich | L1518 | Supplemented with L-glutamine |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Sucrose | Acros Organics | 57-50-1 | |
| Trehalose | Acros Organics | 99-20-7 | Dihydrate |
| Methanol | Reanal | 20740-0-08-65 | |
| Propylene glycol | Reanal | 08860-1-08-65 | |
| Dimethyl sulfoxide | Reanal | 00190-1-01-65 | |
| Collagenase | Gibco | 9001-12-1 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T8003 | |
| DNase I | Panreac AppliChem | A3778 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T6146 | |
| Phospate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | Tablets for preparation of 200 ml PBS solution |
References
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