Summary
Bu çalışmanın temel amacı iğne adapte Vitrifiye (NIV) yordamı tüm Zebra balığı testis cryopreserve dalmış oldu. Ayrıca, beş farklı Zebra balığı suşları yönteminde tekrarlanabilirlik test edildi.
Abstract
Böylece kolonileri damızlık tutmanın ortak uygulamalar dışında genetik kaynaklarının güvenli depolama için yeni yöntemler için gerekliliğini önde gelen model organizmalar yeni satırları binlerce kurulması için bilim ve biyoteknoloji mevcut eğilimler yol. Bu çalışmanın temel amacı iğne adapte Vitrifiye (NIV) yordamı tüm Zebra balığı testis cryopreserve dalmış oldu. Özellikle nakli sonra erkek ve dişi gamet olgun beri dondurma bütün testisler tarafından aşamasındaki germ hücrelerinin NIV genetik kaynakları, Zebra balığı Muhafazası için olanaklar sunuyor. Testisler, iki cryoprotective medyada (1.5 M metanol ve 1,5 M propilen glikol; içeren denge çözüm ve Vitrifiye çözüm 3 M Dimetil sülfoksit ve 3 M propilen glikol içeren) equilibrated bir akupunktur iğnesi üzerinde pinned eksize ve sıvı azot içine daldı. Örnekleri bir dizi üç sonucu ısınma çözümleri ısındı. Bu teknik en önemli avantajları (1) sperm eksikliği aşağı akım manipülasyonlar; böylece kolaylaştırmak ısıtılan testis sindirim sonra vardır. (2) ultra hızlı sıvı nitrojen bu nedenle soğutma ve cryoprotectants, böylece onların toksisite azaltmak gerekli konsantrasyonu azaltarak en üst düzeye çıkarma en uygun maruz dokuların etkinleştirme soğutma; (3) birkaç testisler zaman uyumlu maruz kalma cryoprotectants ve sıvı azot; ve beş farklı Zebra balığı suşların % 50 üzerinde canlılık elde ederek (4) tekrarlanabilirlik gösterdi.
Introduction
Bilim ve biyoteknoloji yeni eğilimler fareler, Drosophila, Zebra balığı ve canlılar arasında Biyomedikal ve diğer Bilimler1kullanılan diğer türler yeni mutant satırları binlerce yaratılmasına yol açmıştır. Yeni teknolojiler geliştirdi ve kullanılabilir hale gelir, Ayrıca, mutant satırların numaralarını giderek2artar. Bu genetik kaynakları kolonileri damızlık tutmanın ortak uygulamalar ötesinde bir güvenli depolama için gerekliliğini yol açar. Belirsiz bir süre için genetik kaynaklarının güvenli depolama sağlayan bir yöntem olarak olarak üreme sezonu, uzantısı broodstock sürekli bakım gereksinimini kaçınmanızı sağlar ve daha fazla maliyet - dondurma birçok avantaj sunar ve emek verimli2.
Geçtiğimiz birkaç yıl2,3,4 sırasında geliştirilen sperm dondurma protokollerde Zebra balığı erkek genetik materyal başarılı Muhafazası için fırsat sunuyoruz. Ancak, yumurta veya balık embriyo dondurma henüz onların karmaşık yapısı ve sarısı malzeme büyük miktarda nedeniyle mümkün değildir. Son zamanlarda, primordial germ hücreleri (PGCs) veya spermatogonial (SSCs) kök hücre nakli pratiği fonksiyonel sperm ve yumurta nakli5sonra geliştirerek bu bariyer için yan yol sunmaktadır. Bu nedenle, dondurma SSCs, nadir ve değerli genetik kaynakların korunması yeni bir sınır sağlar.
Dondurma pek çok avantajları sunuyor olsa bile, yavaş hızı dondurma işlemi hücre hasarı2' ye neden olabilir birkaç koşulları oluşturur. Bu hücre içi ve hücre dışı buz oluşumu, dehidratasyon, cryoprotectant toksisite ve diğerleri içerir. Hücre içi buz hücreleri zarar, hücre dışı buz hücrelerden su Difüzyon sırasında yavaş kuru buz gibi su kaybı6için neden olabilir iken mekanik hücreleri, kırma için neden olabilir. Son zamanlarda, Vitrifiye buz oluşumu olumsuz etkilerini önleyen bir teknik olarak balık gamet7,8,9dondurma uygulanmıştır. Bir ultra hızlı soğutma tekniği ile iç ve dış ortam buz7,10crystalizing olmadan amorf/cam gibi bir duruma çevirmek sunar. Testis ve Yumurtalık dokusunun başarılı vitrifikasyon böylece uygulama için olanaklar balık de açılış kuş ve memeli türleri10,11,12' kanıtlandığı.
Bu çalışmada, biz iğne batırılır Vitrifiye (NIV) yordamı tüm Zebra balığı testis dondurma için mevcut. Zebra balığı aşamasındaki germ hücreleri kirlenme ve nispeten yüksek miktarda aşamasındaki germ hücreleri düşük varlığı diğer hücreleri, özellikle sperm hücreleri ile verimleri bir dondurma işlemi olmadan yalıtım için güvenilir bir yöntem gösterilmektedir. Bizim bilgi en iyi şekilde, bu ultra hızlı soğutma balık Gonad doku ve Zebra balığı germline hücreleri için detaylı bir görüntülenmeyecektir protokol göstermek için ilk çalışmadır. Ayrıca, tekrarlanabilirlik yönteminin beş farklı Zebra balığı suşları içinde gösterilmiştir: AB vahşi türü, casper (roy- / -; sedef- / -), leopard (leot1/t1), vasa [Tg (vas::eGFP)] ve Wilms tümörü [Tg (wt1b::eGFP 1)] transgenik hattı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm yöntem tanımlamak burada Macar hayvan refah hukuk tarafından onaylanmıştır.
1. reaktif hazırlık
- Hisse senedi çözümleri
- 1 M trehalose de tamamen eriyene kadar trehalose dihydrate 0,378 g dH2O. Mix 1 mL ekleyerek hazırlayın.
- 1 M Sükroz de tamamen eriyene kadar dH2O. Mix 1 mL sukroz 0.342 g ekleyerek hazırlayın.
- 1 M HEPES de tamamen eriyene kadar dH2O. Mix 1 mL HEPES 0,238 g ekleyerek hazırlayın.
- 20 mg/mL collagenase (290 U/mg) 100 mg 5 mL için PBS de ekleyerek hazırlayın. İyice eriyene kadar karıştırın. 0.2 µm filtreler steril filtreden. Aliquot 50 µL içine 0.2 mL PCR tüpleri ve 20 ° C'de - dondurma
- 15 mg/mL tripsin hazırlamak (~ 10000 U/mg) 75 mg 5 mL için PBS de ekleyerek. İyice eriyene kadar karıştırın. 0.2 µm filtreler steril filtreden. Aliquot 50 µL içine 0.2 mL PCR tüpleri ve 20 ° C'de - dondurma
- 1 mg/mL Dnaz hazırlamak ben (~ 3000 U/mg) 5 mg 5 mL için PBS de ekleyerek. İyice eriyene kadar karıştırın. 0.2 µm filtreler steril filtreden. Aliquot 50 µL içine 0.2 mL PCR tüpleri ve 20 ° C'de - dondurma
- %0,4 trypan mavi PBS için 10 mL trypan mavi 40 mg ekleyerek hazırlayın. 0.2 µm filtreler steril filtreden. 1.5 mL tüpler içine aliquot 1 mL.
- 200 mg/L MS hazırlamak-de tamamen eriyene kadar ekleyerek MS-222 200 mg 1 litre dH2O. Mix 222 (Tricaine metan Sülfonat). Buna ek olarak, MS-222 çözüm nötr pH 7.0 için sodyum bikarbonat ile tampon.
- Vitrifiye için çözümler
- Denge çözüm (ES) hazırlamak: ES 2 mL metanol (MeOH; 1,5 M), 121.5 µL karıştırılarak hazırlamak propilen glikol (PG; 1,5 M), 220 µL FBS (% 10), trehalose hisse senedi çözüm (0,1 M), 50 µL HEPES hisse senedi çözüm (25 mM) ve L-15 1208.5 µL 2 içine 200 µL 200 µL mL tüp.
- Vitrifiye çözüm (VS) hazırlamak: PG (3 M), Dimetil sülfoksit 426 µL 439 µL karıştırılarak vs 2 mL hazırlamak (bana2yani; 3 M), 200 FBS (% 10), trehalose hisse senedi çözüm (0,1 M), HEPES 50 µL 200 µL µL stok çözüm (25 mM) ve L-15 685 µL bir 2 mL tüp.
- Isınma için çözümler
- Isınma çözüm 1 (WS1) hazırlamak: WS1 1,5 mL 2 mL tüp içinde FBS (% 10), sukroz hisse senedi çözüm (3 M) 450 µL 150 µL karıştırarak hazırlayın ve L-15 900 µL.
- Isınma çözüm 2 (WS2) hazırlamak: WS2 1,5 mL 2 mL tüp içinde FBS (% 10), sukroz hisse senedi çözüm (1 M) 150 µL 150 µL karıştırarak hazırlayın ve L-15 1200 µL.
- Isınma çözüm 3 (WS3) hazırlamak: WS2 1,5 mL 2 mL tüp içinde karıştırma 150 µL FBS (% 10) tarafından hazırlamak ve L-15 1350 µL.
- Sindirim çözüm hazırlamak: her örnek hazırlamak için sindirim çözeltinin 500 µL 50 µL collagenase hisse senedi çözüm (2 mg/mL), 50 µL tripsin hisse senedi çözüm (1.5 mg/mL) karıştırılarak, 10 µL Dnaz, ben (20 µg/mL) ve L-15 390 µL 2 ml tüp.
- Diseksiyon Araçları'nı edinmeniz: makas, microscissors, cımbız, eğri cımbız ve akupunktur iğneleri.
2. testis koleksiyonu
- 200 mg/L MS içeren bir tabak içine yerleştirerek balık ötenazi-222 (pH = 7). Diseksiyon ile devam etmeden önce solungaçları hareket durdu ve o en az 10 dk ölüm hipoksi tarafından emin olmak için o andan beri geçti emin olun.
- Kağıt havlu üzerinde okşamaya tarafından kuru balık ve sırt tarafında bir diseksiyon Mat yerleştirin.
- Öncelikle pelvis ve göğüs yüzgeçleri daha kolay diseksiyon için kesti.
- Yatay olarak cilt üzerinde balık göğüs yüzgeçleri arasında göbek makasla kesme ve cilt ve temel kas göbek boyunca anal yüzgeç kadar kesti.
- Balık vücut boşluğuna açın ve iğnelerle diseksiyon mat sol ve sağ vücut duvara pin.
Not: Testis Yüzme kesesi (şekil 1) her iki tarafında gastrointestinal organ yukarıda yer alır.
- Kirlenmesini önlemek için sindirim organları almaz ama nazikçe onları bir kenara itmek ve testis karşı taraftan kaldırın. Testisler vücut duvara bağlı olan çok dikkatli bir şekilde çıkarın ve bağlantı Periton microscissors tarafından kesilmiş.
- Ayrıca, kirlenmesini önlemek için ilk olarak testis % 70 etanol 2 s ve sonra yer için onları koyarak sterilize buzda bir 96-şey tabakta L-15 onları.
Not: gerekli ise, temiz testis yağ dokusu ve büyük damarları stereomicroscope altında tam kan
3. hızlı testis dokusunun soğutma
- Mark iğneler bağlı olarak örnek uygun etiketleri yazın ve denge (ES) ve Vitrifiye Çözümleri (VS) hazırlayın.
- Testis daha büyük bir iyi tabak veya çanak ve PIN iki ya da üç testisler (veya daha fazla iğne boyutuna bağlı olarak) bir steril akupunktur iğnesi aktarın.
- Öncelikle testis eğri cımbız üstüne getirin. Testis ortasında iğne üzerine getirin ve dikkatle testis yukarı cımbızla çekin.
- Testis delinme sonra hafifçe yukarı doğru iğne üst doğru çekin. Testis birbirinden ayrılır ve onlar are değil düşme ya da aşağı kayan olduğunu doğrulayın.
- 2 mL tüp içinde sabitlenmiş testis iğnelerle dolu yer L-15 kadar vitrifikasyon ile (25 ˚C; saklama süresi 1 h geçmemelidir).
Not: testis iğne sabitleme hızlı testis kurumasını önlemek için yapılmalıdır.
- Testis iğneyle denge çözüm içine aktarmak ve 25˚C, 5 min için kuluçkaya.
- İğne vitrifikasyon çözüm içine aktarmak ve 30 için kuluçkaya 25˚C s.
- İğne vitrifikasyon çözümden kaldırmak için hızlı bir şekilde ve yavaşça dokusundan kalan çözüm bir steril kağıt havlu emmek. Kağıt havlu yapışmasını veya düşme testis önlemek için dikkatli olun.
- Hızlı bir şekilde sıvı azot bir Styrofoam kutusu yerleştirilmiş iğne yerleştirin.
Not: hızlı bir şekilde sıvı azot buharı için doku maruz önlemek için bu adımı yapmak. Sıvı azot düşük hacimli Çapraz bulaşma örneklerin engellemek için kullanın. - 5-10dk için kapalı bir Styrofoam kutusu içinde sıvı azot iğne tutun.
- Bir açılan 4.5 mL cryotube ve onun cap aynı kutusunda precool.
- 5-10 dk sonra sıvı azot yüzeyinin altında ayrı bir cryotube içine her iğne transfer ve cryotube kapatın.
Dikkat: Her zaman (örneğin, İZOLELİ eldiven) koruyucu giysi kullandığınızda pozlama için şiddetli soğuktan yol açabilir gibi sıvı azot ile çalışma. - Cryotube metal baston üzerine yerleştirin ve kısa sürede cryobank teneke kutu yerleştirin. Örnekleri bir teneke kutu depoda saklamak dewar kullanmaya devam etmenize kadar.
4. ısınma yordamı
- Her iğne ayrı ayrı sıcak. Tüm ısınma çözümler 25 ° C'de olmalıdır
- Cryotube metal baston üzerinden bağlantısını kesin ve sıvı azot bir strafor kutu içinde saklanan içine dalma.
- Cryotube (forseps kullanarak) sıvı azot Buhar açmak ve iğne sıvı azot bırakın.
- İğne çok hızlı ilk ısınma çözüm aktarmak ve (25 ° C'de) 1 dk. için kuluçkaya. Hızlı bir şekilde onun havada aktarım sırasında ısınma önlemek için iğne transfer emin olun.
- İğne ikinci ısınma çözüm içine aktarmak ve 3 dak (25 ° C'de) için kuluçkaya.
- İğne üçüncü ısınma çözüm içine aktarmak ve (25 ° C'de) 5 min için kuluçkaya.
- Testis iğne üzerinden onları aşağıya doğru eğimli cımbızla kaydırarak serbest bırakın. Tek tek bir kuyuya ayrı (96-şey plaka) ısıtılan her testis dolu 250 µL % 10 ile desteklenmiş L-15 ile yer FBS. Kuyuları örnek göre etiketlenir emin olun. İyi plaka tüm örneklerini ısındı kadar buz üzerinde ve daha fazla çalışma kadar tutun.
5. doku sindirim
- Ayrılma çözeltinin 500 µL her örneği ayrı 2 mL tüpler için hazır olun. Örnek koduna göre tüpler etiketleyin. Oda sıcaklığında 5 min için hazırlanan ayrılma çözüm kuluçkaya.
- Sindirim çözüm içine ısıtılmış doku ekleyin ve küçük makas en az 30 hareketlerle küçük parçalar halinde kesin.
- Kesme doku 90 dk 25 ˚C az için titreyen bir plaka üzerinde kuluçkaya.
- L-15 ve 100 µL FBS, 400 µL ekleyerek sindirim işlemini durdurmak (% 10 FBS v/v). Kısaca çözüm sallamak ve oda sıcaklığında 1 dk. için kuluçkaya.
- Elde edilen çözüm 1.5 mL tüp içine 50 µm filtreler aracılığıyla filtre. Buna göre tüplere etiket.
- 200 × g 10 dk 25 ˚C az için filtre uygulanmış çözüm santrifüj kapasitesi.
- Dikkatle süpernatant kaldırmak ve 20 µL % 10 ile desteklenmiş L15 Pelet resuspend FBS. Pelet tamamen eriyene kadar el ile tüp sallamak. Hücre süspansiyon 4 ˚C veya buz üzerinde daha fazla kullanımda kadar devam.
6. canlılığı değerlendirme ve Hücre sayımı
- Mix 5 µL hücre süspansiyon ve 5 µL % 0,4 trypan mavi çözüm bir uygun şekilde etiketlenmiş 0.2 mL PCR tüp. Farklı birimler kullanılırsa, emin olun seyreltme oranı 1:1 kalır.
- Bu süspansiyon, oda sıcaklığında (25 ° C) 1-3 dk için kuluçkaya.
- Bir hemasitometre mikroskop altında her örnekte canlılığı kontrol edin.
- 15 alanları (trypan mavi tarafından günahı) canlı hücreleri saymak. Hücrelerde hücre süspansiyon 20 µm toplam sayısını hesaplayın. Süspansiyon artık herhangi bir aşağı akım uygulama için hazırdır.
Not: yordamı büyük vücut büyüklüğü ile diğer türler için en iyi duruma getirme, eşit ağırlık, testis parçaları kullanın. Testis bir birey tüm deneysel grupları için gelen sonuçlarda bireysel farklılıklarına önlemek için kullanın. Zebra balığı söz konusu olduğunda, biz aslında bu sol yararlandı ve sağ testis germ hücreleri13 eşit (ya da çok benzer) sayısı içermelidir (temsilcisi sonuçları görmek). Sağ testis Vitrifiye/sıcak iken sol testis bir denetim olarak tutuldu. Canlılığı yüzdesi hesaplanmıştır taze testis izole hücre sayısı karşılaştırıldığında Vitrifiye/ısındı testislerden izole hücre sayısı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ortalama olarak, aşamasındaki germ hücreleri tek taze Zebra balığı testislerden izole balığın büyüklüğüne bağlı olarak 40.000 ve 200.000 hücreler arasında değişmekteydi. Ne zaman tüm 5 suşları taze Zebra balığı testis sindirerek, erken germ hücreleri tek hücre hücre süspansiyonlar (Şekil 2) mevcut değildi. Aşamasındaki germ hücreleri çok sayıda sperm hücreleri de bulundu. Öte yandan, cryopreserved testis sindirim sonra çok daha az sperm elde edildi. Bu spermlerin Bu ultra hızlı soğutma Protokolü hayatta yoktur ve onlar büyük olasılıkla aşamasındaki germ hücreleri bir temiz kadar askıya verimleri sindirim işlemi sırasında ortadan belirtti.
Sol ve sağ testis (1 ± 0,5 × 105 vs 1.1 ± 0.7 × 105) tek bir bireyin üç AB Zebra balığı erkeklerin (tek yönlü ANOVA taze testis sindirerek tarafından gösterdi arasında aşamasındaki germ hücreleri yok önemli farklılıklar vardı ; F (1,4) 0,04, p = 0,85 =). Bu çalışmada kullanılan tüm Zebra balığı satırlarında geçerli ultra hızlı soğutma Protokolü (tablo 1) % 50 daha yüksek ortalama canlılık oranları vermiştir.
| AB vahşi türü | Casper | Leopar | Vasa transgenik | Wilms tümörü transgenik | ||
| Canlı hücreleri (× 104) | Taze testis | 14,5 ± 3.9 | 9.5 ± 2,3 | 12,7 ± 2.4 | 14,5 ± 5,6 | 4.8 ± 1.8 |
| Vitrifiye testis | 8.7 ± 2.8 | 7.2 ± 3,0 | 8,8 ± 1.7 | 7,6 ± 3.7 | 2.4 ± 0.7 | |
| Canlılık (%) | 58 ± 9 | 72 ± 13 | 69 ± 1 | 50 ± 6 | 53 ± 13 |
Tablo 1. Canlı hücreleri ve taze veya Vitrifiye/ısındı Zebra balığı testislerden elde canlılık yüzdeleri (± SD demek) sayısı. Sonuçları beş test Zebra balığı satır için sunulmaktadır: AB vahşi türü, casper (roy- / -; sedef- / -), leopard (leot1/t1), vasa [Tg (vas::eGFP)] ve Wilms tümörü [Tg (wt1b::eGFP 1)] transgenik hattı.
Şekil 1. Çeşitli anatomik yapılar konumunu gösteren disseke yetişkin Zebra balığı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. Beş test Zebra balığı satır (AB vahşi türü, casper (roy- / -; taze ve Vitrifiye/ısındı Zebra balığı testis dokusundan hazırlanan süspansiyonlar hücreleri sedef- / -), leopard (leot1/t1), vasa [Tg (vas::eGFP)] ve Wilms tümörü [Tg (wt1b::eGFP 1)] transgenik hat) ile faz kontrast mikroskobu görüntüsü. Ölçek çubuğu: 40 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmanın temel amacı iğne adapte kuş ve memeli türleri10,11,12 ' ye balık testis (Zebra balığı bir model olarak dondurma için geliştirilen hızlı soğutma yordamı dalmış oldu organizma). Zebra balığı genetik kaynakları dondurma ile ilgili önceki çalışmaların en öncelikle Zebra balığı sperm2,3,4dondurma üzerinde durulmuştur. Ancak, iletişim kuralları için olgun yumurta ve embriyo dondurma değil geliştirilmiştir henüz rağmen bazı yeni çalışmalar aşamasındaki yumurta o dondurma göstermek makul14,15' tir. Bu çalışmada özellikle nakli sonra erkek ve dişi gamet5 olgun bu yana, değerli genetik kaynakların Muhafazası için yeni olanaklar sunan başarılı dondurma, Zebra balığı spermatogonia gösterdi .
Bizim bilgi en iyi şekilde, ultra hızlı Zebra balığı dokusunun NIV yöntemi tarafından soğutma ile ilk çalışma ilgili bu. Benzer çalışmaları 0.25 mL plastik çöp16 ve kapalı metal konteynerler14Zebra balığı yumurtalıklarda Vitrifiye Vitrifiye, Zebra balığı testis dahil. Ana iki belirtilen kapsayıcı için karşılaştırıldığında NIV testis cryoprotectants onlara göre bu nedenle soğutma hızı10en üst düzeye çıkarma bağlı olmak en az miktarlar ile doğrudan maruz sıvı azot için avantajdır. Soğutma oranı artış cryoprotectants, böylece onların toksisite azaltmak gerekli konsantrasyonu azaltır. Ayrıca, tüm doku parçaları cryoprotectants ve sıvı azot zaman uyumlu olarak gösterilebilir. Ancak, sıvı nitrojen doğrudan maruz Çapraz bulaşma açısından bir dezavantaj olabilir. Bu bakteri veya virüs sıvı azot içinde mevcut ve bu doğrudan doku maruz kalma kirlenme için neden olabilir mümkündür. Bu nedenle, sıvı nitrojen NIV iletken zaman yeniden kullanmasını kaçınmaya ve kullanılan sıvı azot soğutma sonra atmak için öneririz. Metal Konteynerler teklif avantajları bu bağlamda14, ancak onlar özel vardı yapılmış ve tüm laboratuvarlar için kolayca erişilebilir değildir.
Yavaş dondurma oranlı için ultra hızlı soğutma karşılaştırırken, ultra hızlı soğutma bir çok önemli avantajı sperm elde sonra sindirim olmaması. Yavaş hızı dondurucu yöntemleri bazı malum balık türleri benzer protokoller aşamasındaki germ hücreleri ve sperm elde17 yüksek sperm sayıları cryopreserved hazım sonra sonuçlanan karşılaştırılabilir canlılığı verim gösterdi doku. Bizim sonuçları Zebra balığı (çalışmada), ortak sazan ve akvaryum balığı (yayınlanmamış sonuçları) ısıtılmış dokuların sindirim sonra çok az sperm hücreleri vardır ve onlar değil bu yordamı hayatta yapmak ve almak hangi aşağı basitleştirir sindirilmiş gösterir hiçbir ek zenginleştirme yordamlar ihtiyaç vardır bu yana uygulamaları.
Bu iletişim kuralı içinde çeşitli kritik adımlar vardır. İlk elde edilen hücre sayısı azalmasına neden olabilir ve herhangi bir aşağı akım uygulamaları engelleyebilir beri yalıtım işlemi sırasında herhangi bir kirlenme önlemektir. Çok önemli adımlardan biri nerede bakteriyel kontaminasyon oluşabilir gelen hasar cesaret testis eksizyon (Bu nedenle yaralama ya da bağırsak tamamen kaldırmak en iyisi) veya deriden deri kesme ve kaldırma için aynı diseksiyon aracını kullanarak Eğer testisler. İkinci olarak, ne zaman testisler düşmek veya aşağı slayt mümkün olduğundan testis akupunktur iğnesi için sabitleme dikkat et. Şu anda, Vitrifiye yordamı (sıvı azot sıcaklık) sırasında kayan testis önlemek için farklı yöntemler test ediyoruz. Üçüncü olarak, cryoprotectants maruz süre dikkat edin. Testisler (ve maruz böylece hücreleri) için (özellikle de vitrifikasyon çözüm) yüksek cryoprotectant konsantrasyonları uzun hücre ölümü cryoprotectant toksisite nedeniyle neden olabilir. Ayrıca, ne zaman iğne sıvı azot dalan dikkat; Bu soğutma işlemini etkiler ve sıvı azot buharı maruz önlemek için hızlı bir şekilde iğneler Dalma VS aşırı silin. Son olarak, testislerde sıvı azot ısınma ortam hızlı bir şekilde erken havada aktarım sırasında ısınma önlemek için transfer.
Bugünkü gazetede bizMeOH, PG ve bana 2'yiçok cryoprotectants permeating olarak kullanarak yordamı testis beş Zebra balığı suşları gelen dondurma için mevcut. Yöntem % 50 üzerinde bir hücre canlılığı ile tüm test Zebra balığı suşları için güvenilir sonuçlar verir. Değişiklikleri ile diğer türler için bu yöntemi kullanmak mümkündür. İlk olarak, her dondurma protokol türleri belirli ve farklı cryoprotectants farklı türlerin farklı verimliliği verim (Yani etilen glikol vermiştir acipenserids18 bana süre içinde en yüksek canlılık2Yani «««vermiştir) en yüksek canlılık salmonids19 ve cyprinids17. Ayrıca dikkat de kullanılan konsantrasyonları verilmelidir. Bu da çalışmanın ve kahverengi alabalık Salmo trutta yumurtalık15 koordinatörlüğünde giden bu çalışma bu diğer türler içinde değişebilir ancak en iyi sonuçları iki cryoprotectants, aynı yoğunlukta kullanarak elde göstermektedir. Son olarak, Zebra balığı testis çok küçük, ve birkaç testis bir iğne üzerinde toplu iğne bile mümkündür. Türler ile daha büyük testis ile çalışırken kullanılan testis adet çok önemli bir faktör boyutudur. Hesap cryoprotectant toksisite ve verimliliği dikkate alarak daha büyük doku parçaları için pozlama süreleri artırmak için öneririz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu çalışmada ulusal araştırma, geliştirme ve yenilik Office Macaristan (grant 116912 ÁH için), maliyet office tarafından desteklenmiştir (Gıda ve tarım maliyet eylem FA1205: AQUAGAMETE), Stipendium Hungaricum burs programı (grant ZM için) ve yeni Macar Ulusal mükemmellik HGUGM Bursu (EK hibe).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leibovitz media (L-15) | Sigma-Aldrich | L1518 | Supplemented with L-glutamine |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Sucrose | Acros Organics | 57-50-1 | |
| Trehalose | Acros Organics | 99-20-7 | Dihydrate |
| Methanol | Reanal | 20740-0-08-65 | |
| Propylene glycol | Reanal | 08860-1-08-65 | |
| Dimethyl sulfoxide | Reanal | 00190-1-01-65 | |
| Collagenase | Gibco | 9001-12-1 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T8003 | |
| DNase I | Panreac AppliChem | A3778 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T6146 | |
| Phospate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | Tablets for preparation of 200 ml PBS solution |
References
- Mazur, P., Leibo, S. P., Seidel, G. R. J. Cryopreservation of the germplasm of animals used in biological and medical research: Importance, impact, status, and future directions. Biol. Reprod. 78 (1), 2-12 (2008).
- Carmichael, C., Westerfield, M., Varga, Z. M. Cryopreservation and In Vitro Fertilization at the Zebrafish International Resource Center. Methods Mol. Biol. 546, 45-65 (2009).
- Yang, H., Carmichael, C., Varga, Z. M., Tiersch, T. R. Development of a simplified and standardized protocol with potential for high-throughput for sperm cryopreservation in zebrafish Danio rerio. Theriogenology. 68 (2), 128-136 (2007).
- Morris, J. P. IV, Berghmans, S., Zahrieh, D., Neuberg, D. S., Kanki, J. P., Look, A. T. Zebrafish sperm cryopreservation with N,N-dimethylacetamide. Biotechniques. 35 (5), 956-968 (2003).
- Yoshizaki, G., et al. Spermatogonial transplantation in fish: A novel method for the preservation of genetic resources. Comp. Biochem. Physiol. Part D: Genomics Proteomics. 6 (1), 55-61 (2011).
- Gao, D., Critser, J. K.
- Asturiano, J. F., Cabrita, E., Horváth, Á Progress, challenges and perspectives on fish gamete cryopreservation: A mini-review. Gen. Comp. Endocrinol. 245, 69-76 (2017).
- Kása, E., et al. Development of sperm vitrification protocols for freshwater fish (Eurasian perch, Perca fluviatilis) and marine fish (European eel, Anguilla anguilla). Gen. Comp. Endocrinol. 245, 102-107 (2017).
- Cuevas-Uribe, R., Leibo, S. P., Daly, J., Tiersch, T. R. Production of channel catfish with sperm cryopreserved by rapid non-equilibrium cooling. Cryobiology. 63 (3), 186-197 (2011).
- Wang, Y., Xiao, Z., Li, L., Fan, W., Li, S. W. Novel needle immersed vitrification: A practical and convenient method with potential advantages in mouse and human ovarian tissue cryopreservation. Hum. Reprod. 23 (10), 2256-2265 (2008).
- Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. Production of Live Offspring from Testicular Tissue Cryopreserved by Vitrification Procedures in Japanese Quail (Coturnix japonica). Biol. Reprod. 88 (5), 124 (2013).
- Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. Novel needle-in-straw vitrification can effectively preserve the follicle morphology, viability, and vascularization of ovarian tissue in Japanese quail (Coturnix japonica). Anim. Reprod. Sci. 134 (3-4), 197-202 (2012).
- Lee, S., Yoshizaki, G. Successful cryopreservation of spermatogonia in critically endangered Manchurian trout (Brachymystax lenok). Cryobiology. 72 (2), 165-168 (2016).
- Marques, L. S., et al. Viability of zebrafish (Danio rerio) ovarian follicles after vitrification in a metal container. Cryobiology. 71 (3), 367-373 (2015).
- Lujić, J., et al. First successful vitrification of salmonid ovarian tissue. Cryobiology. 76, 154-157 (2017).
- Bono-Mestre, C., Cardona-Costa, J., García-Ximénez, F. Effects on cell viability of three zebrafish testicular cell or tissue cryopreservation methods. CryoLetters. 30 (2), 148-152 (2009).
- Marinović, Z., et al. Cryosurvival of isolated testicular cells and testicular tissue of tench Tinca tinca and goldfish Carassius auratus following slow-rate freezing. Gen. Comp. Endocrinol. 245, 77-83 (2017).
- Pšenička, M., Saito, T., Rodina, M., Dzyuba, B. Cryopreservation of early stage Siberian sturgeon Acipenser baerii germ cells, comparison of whole tissue and dissociated cells. Cryobiology. 72, 119-122 (2016).
- Lee, S., Iwasaki, Y., Shikina, S., Yoshizaki, G. Generation of functional eggs and sperm from cryopreserved whole testes. Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 110 (5), 1640-1645 (2013).
