Summary
Hovedformålet med denne studien var å tilpasse nålen midt vitrifikasjon (NIV) prosedyre for å cryopreserve hele sebrafisk testiklene. I tillegg ble repeatability av metoden i fem forskjellige sebrafisk stammer testet.
Abstract
Dagens trender i vitenskap og bioteknologi føre til etablering av nye linjer i modellen organismer og dermed fører til nødvendigheten av nye metoder for sikker lagring av genetiske ressurser utenfor den felles praksisen av avl kolonier. Hovedformålet med denne studien var å tilpasse nålen midt vitrifikasjon (NIV) prosedyre for å cryopreserve hele sebrafisk testiklene. Kryonisk bevaring av tidlig stadium bakterie celler av hele testiklene NIV tilbyr muligheter for lagring av sebrafisk genetiske ressurser, spesielt siden etter transplantasjon kan de eldre til både mannlige og kvinnelige gameter. Prøvene ble fjernet, festet på en akupunktur p, equilibrated i to cryoprotective media (balanse løsning som inneholder 1,5 M metanol og 1,5 M propylenglykol; og vitrifikasjon inneholder 3 M dimethyl sulfoxide og 3 M propylenglykol) og styrtet ut i flytende nitrogen. Prøvene ble varmet i en serie av tre påfølgende oppvarming løsninger. De viktigste fordelene med denne teknikken er (1) mangel på spermatozoa etter fordøyelsen av varmet testiklene dermed tilrettelegge nedstrøms manipulasjoner; (2) Ultra rask nedkjøling muliggjør optimale eksponering for vev flytende nitrogen derfor maksimere kjøling og redusere nødvendige konsentrasjonen av cryoprotectants, og dermed redusere giftigheten; (3) synkron eksponering for flere testiklene cryoprotectants og flytende nitrogen; og (4) repeterbarhet demonstrert ved å skaffe levedyktigheten til over 50% i fem forskjellige sebrafisk stammer.
Introduction
Romanen trender i vitenskap og bioteknologi har ført til etableringen av nye mutant linjer av mus, Drosophila, sebrafisk og andre arter som modell organismer i biomedisinsk og andre vitenskaper1. Videre som nye teknologier er utviklet og blir tilgjengelig, øke antall mutant linjer stadig2. Dette fører til nødvendigheten for en sikker lagring av genetiske ressurser utenfor den felles praksisen av avl kolonier. Som en metode som gir trygg lagring av genetiske ressurser på ubestemt tid, kryonisk bevaring tilbyr mange fordeler som forlengelse av reproduktive sesongen, omgår behovet for kontinuerlig vedlikehold av fiskestammer, og det er flere kostnader - og arbeidskrevende effektiv2.
Protokoller for sperm kryonisk bevaring utviklet under siste flere år2,3,4 tilbyr muligheten for vellykket lagring av sebrafisk mannlige genetisk materiale. Imidlertid er kryonisk bevaring av egg eller embryo i fisk ennå ikke mulig på grunn av deres kompleks struktur og store mengder eggeplomme materiale. Nylig, praktisering av transplantasjon av primordial bakterie celler (PGCs) eller spermatogonial stamceller (SSCs) tilbyr en bypass å denne barrieren ved å utvikle i funksjonelle sæd og egg etter transplantasjon5. Derfor tilbyr kryonisk bevaring av SSCs en ny grense i bevaring av sjeldne og verdifulle genetiske ressurser.
Selv om kryonisk bevaring gir mange fordeler, genererer langsom hastighet frysing prosessen flere forhold som kan føre til celle skade2. Disse inkluderer intracellulær og ekstracellulære isdannelse, dehydrering, kryoprotektant giftighet og andre. Intracellulær is skader cellene, ekstracellulære isen kan føre til mekanisk knusing av celler, mens vann diffusjon fra cellene under sakte-rate frysing kan føre til dehydrering6. Nylig vitrifikasjon som en teknikk som hindrer de negative effektene av isdannelse har vært brukt i kryonisk bevaring av fisk gameter7,8,9. Den presenterer en svært rask nedkjøling teknikk som interne og eksterne media blir en amorf/glassaktig tilstand uten crystalizing i isen7,10. Vellykket vitrifikasjon av testicular og eggstokkreft vev har vært dokumentert i avian og pattedyr10,11,12, dermed åpne muligheter for sin søknad i fisk, også.
I denne studien presenterer vi p midt vitrifikasjon (NIV) fremgangsmåten for kryonisk bevaring av hele sebrafisk testiklene. Vi viser en pålitelig metode for isolering av sebrafisk tidlig stadium bakterie celler uten forurensning og en kryonisk bevaring prosess som gir relativt store mengder tidlig stadium bakterie celler med en lav forekomst av andre celler, spesielt spermatozoa. Best av vår kunnskap er dette den første studien å demonstrere en detaljert visualisert protokoll for ultra rask nedkjøling av fisk gonadal vev og sebrafisk germline celler. I tillegg repeterbarhet metoden demonstreres i fem forskjellige sebrafisk stammer: AB wild type, casper (roy- / -; nacre- / -), leopard (leot1/t1), vasa [vs (vas::eGFP)] og Wilms svulst [vs (wt1b::eGFP 1)] transgene linje.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av ungarske dyr velferd loven.
1. forberedelse av reagenser
- Lager løsninger
- Klargjør 1 M trehalose ved å legge 0.378 g av trehalose dihydrate i 1 mL av dH2O. Mix også til det oppløses helt.
- Klargjør 1 M sukrose ved å legge 0.342 g av sukrose i 1 mL av dH2O. Mix også til det oppløses helt.
- Forberede 1 M HEPES ved å legge 0.238 g HEPES til 1 mL av dH2O. Bland godt til det oppløses helt.
- Forberede 20 mg/mL collagenase (290 U/mg) ved å legge til 100 mg 5 mL av PBS. Bland godt til det oppløses. Sterilt filter gjennom 0,2 µm filtre. Aliquot 50 µL i 0,2 mL PCR rør og fryse på - 20 ° C.
- Forberede 15 mg/mL trypsin (~ 10000 U/mg) ved å legge til 75 mg 5 mL av PBS. Bland godt til det oppløses. Sterilt filter gjennom 0,2 µm filtre. Aliquot 50 µL i 0,2 mL PCR rør og fryse på - 20 ° C.
- Forberede 1 mg/mL DNase jeg (~ 3000 U/mg) ved å legge til 5 mg 5 mL av PBS. Bland godt til det oppløses. Sterilt filter gjennom 0,2 µm filtre. Aliquot 50 µL i 0,2 mL PCR rør og fryse på - 20 ° C.
- Forberede 0,4% trypan blå ved å legge til 40 mg trypan blå 10 mL PBS. Sterilt filter gjennom 0,2 µm filtre. Aliquot 1 mL i 1,5 mL rør.
- Forberede 200 mg/L MS-222 (Tricaine metan sulfonate) av tilføyer 200 mg MS-222 i 1 L dH2O. Bland godt til det oppløses helt. I tillegg buffer MS-222 løsning med natrium bikarbonat til en nøytral pH av 7.0.
- Løsninger for vitrifikasjon
- Forberede balanse løsning (ES): forberede 2 mL ES ved å blande 121.5 µL av metanol (MeOH, 1,5 M), 220 µL av propylenglykol (PG, 1,5 M), 200 µL av FBS (10%), 200 µL trehalose lager løsning (0.1 M), 50 µL HEPES lager løsning (25 mM) og 1208.5 µL av L-15 i en 2 mL tube.
- Forberede vitrifikasjon (VS): forberede 2 mL VS ved å blande 439 µL av PG (3 M), 426 µL av dimethyl sulfoxide (meg2; 3 M), 200 µL av FBS (10%), 200 µL trehalose lager løsning (0.1 M), 50 µL av HEPES lager løsning (25 mM) og 685 µL av L-15 i en 2 mL tube.
- Løsninger for oppvarming
- Forberede oppvarming løsning 1 (WS1): forberede 1,5 mL av WS1 i en 2 mL tube ved å blande 150 µL av FBS (10%), 450 µL av sukrose lagerløsning (3 M) og 900 µL av L-15.
- Forberede oppvarming løsning 2 (WS2): forberede 1,5 mL av WS2 i en 2 mL tube ved å blande 150 µL av FBS (10%), 150 µL av sukrose lagerløsning (1 M) og 1200 µL av L-15.
- Forberede oppvarming løsning 3 (WS3): forberede 1,5 mL av WS2 i en 2 mL tube av miksing 150 µL FBS (10%) og 1350 µL av L-15.
- Forberede fordøyelsen løsning: for hvert utvalg forberede 500 µL av fordøyelsen løsning ved å blande 50 µL av collagenase lagerløsning (2 mg/mL), 50 µL av trypsin lagerløsning (1.5 mg/mL), 10 µL av DNase jeg (20 µg/mL) og 390 µL av L-15 i en 2 mL tube.
- Få disseksjon verktøy: saks, microscissors, pinsetter, buede pinsett og Akupunkturnåler.
2. testiklene samling
- Euthanize fisken ved å plassere den i en tallerken med 200 mg/L MS-222 (pH = 7). Før du fortsetter med dissection, kontroller at gjellene har sluttet å flytte og at minst 10 min har gått siden det øyeblikket å sikre død av hypoksi.
- Tørk fisken av klappe den på et papirhåndkle og plasserer den på sin dorsal side på dissecting mat.
- For det første kuttet av bekken og pectoral finnene for enklere disseksjon.
- Vannrett bekkasin huden på magen på fisken mellom brystfinner og skjære i hud og underliggende muskel langs magen til Gattfinnen.
- Åpne kroppens hulrom av fisk og feste venstre og høyre kroppen veggen til disseksjon matten med nåler.
Merk: Testiklene er plassert over gastrointestinal organer på begge sider av svømme blæren (figur 1).
- For å hindre forurensning, ikke ta ut gastrointestinal organer, men forsiktig presse dem til side og fjern testikkel fra motstanderens side. Testiklene er koblet til kroppen veggen så fjerne dem nøye og kutte koble peritoneum med microscissors.
- I tillegg for å hindre forurensning, for det første sterilisere testiklene ved 70% etanol for 2 s og deretter sted dem i L-15 på en 96-brønns plate på is.
Merk: Hvis det er nødvendig, rent testiklene fra fettvev og store blod fartøy nøyaktig under stereomicroscope
3. ultra-rask nedkjøling av Testicular vev
- Merk nåler med riktig etiketter avhengig av prøven type og forberede balanse (ES) og vitrifikasjonsvæske (VS).
- Overføre testiklene til en større godt tallerken eller FAT og pin to til tre testiklene (eller mer avhengig av nålen) på en steril akupunkturnål.
- Først plasser testikkel på buede pinsett. Plasser poenget med nålen i midten testikkel og trekk forsiktig testikkel oppover med pinsett.
- Etter punktering testikkel, trekk det forsiktig oppover mot toppen av nålen. Kontroller testiklene skilles fra hverandre og at de ikke falle av eller skyve ned.
- Plass nåler med festede testiklene i en 2 mL tube fylt med L-15 til vitrifikasjon (på 25 grader; lagringstid bør ikke overstige 1 time).
Merk: Låsing testiklene på p bør gjøres raskt for å hindre testiklene tørker ut.
- Overføre nålen med testiklene til balanse løsningen og ruge i 5 min på 25˚C.
- Overføre nålen inn i vitrifikasjon og Inkuber for 30 s på 25˚C.
- Fjerne nålen fra vitrifikasjon, raskt og forsiktig absorbere gjenværende løsningen fra vev av sterile papirhåndkle. Vær forsiktig for å unngå testiklene stikker til papirhåndkle eller tilbakegang.
- Raskt plassere nålen i flytende nitrogen plassert i en Styrofoam.
Merk: Gjøre denne steg raskt for å unngå eksponering for vev flytende nitrogen damp. Bruk lave volumer av flytende nitrogen for å hindre kryss-forurensning av eksempler. - Holde nålen flytende nitrogen i en lukket Styrofoam i 5-10 min.
- Nedkjøling et åpen 4,5 mL cryotube og dens cap i samme boks.
- Etter 5-10 min, overføre hver nål i en separat cryotube under overflaten av flytende nitrogen og Lukk på cryotube.
Forsiktig: Bruk alltid beskyttelsesklær (for eksempel isolert hansker) når arbeider med flytende nitrogen som eksponering kan føre til alvorlig frostskader. - Plasser cryotube på metall stokk og plasser den i beholderen cryobank så fort som mulig. Lagre prøvene i en canister lagring dewar inntil videre bruk.
4. oppvarming prosedyre
- Varm hver nål separat. Alle oppvarming løsninger bør være på 25 ° C.
- Koble fra cryotube fra metall stokk og styrte den inn i flytende nitrogen lagret i en Styrofoam.
- Åpne cryotube i flytende nitrogen damp (med tang) og slipp nålen i flytende nitrogen.
- Overføre nålen veldig fort i den første oppvarming løsningen og ruge for 1 min (ved 25 ° C). Pass på å overføre nålen raskt for å hindre sin oppvarming i luften under overføring.
- Overføre nålen i andre oppvarming løsningen og ruge for 3 min (ved 25 ° C).
- Overføre nålen i tredje oppvarming løsningen og ruge i 5 min (ved 25 ° C).
- Slipp testiklene på p ved å dra dem ned med buet pinsett. Sted hver varmet testikkel individuelt i en egen brønn (96-brønns plate) fylt med 250 µL av L-15 med 10% FBS. Kontroller at brønnene er merket etter prøven. Hold godt platen på is inntil alle prøver varmet og til videre arbeid.
5. vev fordøyelse
- Klargjør 500 µL av dissosiasjon løsningen for hvert utvalg i separate 2 mL rør. Etiketten rør etter koden for prøven. Inkuber forberedt dissosiasjon løsningen for 5 min ved romtemperatur.
- Sammenlegge varmet vevet i fordøyelsen løsningen og skjær den i små biter av minst 30 bevegelser liten saks.
- Inkuber kuttet vev på en risting plate for 90 min på 25 grader.
- Stoppe fordøyelsen prosessen ved å legge til 400 µL av L-15 og 100 µL av FBS (10% FBS v/v). Kort riste løsningen og ruge i 1 min i romtemperatur.
- Filtrere innhentet løsningen gjennom 50 µm filtre i en 1,5 mL tube. Etiketten rør tilsvarende.
- Sentrifuge filtrerte løsningen på 200 × g i 10 min på 25 grader.
- Nøye fjerne nedbryting og resuspend pellet i 20 µL av L15 supplert med 10% FBS. Manuelt rist røret til pellet er fullstendig oppløst. Holde celle suspensjon på isen eller i 4 grader til videre bruk.
6. levedyktighet evaluering og celle teller
- Mix 5 µL av cellen suspensjon og 5 µL 0,4% trypan blå løsning i en hensiktsmessig merket 0,2 mL PCR rør. Hvis ulike volumer, må du kontrollere at fortynning forholdet 1:1 restene.
- Inkuber denne suspensjon i 1 til 3 minutter ved romtemperatur (25 ° C).
- Sjekk levedyktigheten til hvert utvalg i en hemocytometer under mikroskop.
- Tell antallet lever celler (unstained kvinne trypan Blue) i 15 felt. Beregne antall celler i 20 µm av cellen suspensjon. Suspensjon er nå klar for alle nedstrøms programmer.
Merk: Når du optimaliserer fremgangsmåten for andre arter med større kroppsstørrelse, bruke testikkel fragmenter av lik vekt. Bruke testiklene fra en person for alle eksperimentelle grupper for å unngå individuelle variasjon i resultatene. Ved sebrafisk, vi tok fordel av faktum at venstre og høyre testikkel bør inneholde et lik (eller veldig lignende) antall bakterie celler13 (se representant resultatene). Venstre testikkel ble holdt som en kontroll mens høyre testikkel var vitrified/varmet. Levedyktighet prosent ble beregnet antall celler isolert fra vitrified/varmet testikkel sammenlignet med antall celler isolert fra frisk testikkel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gjennomsnittlig antall tidlig stadium bakterie celler isolert fra en enkelt frisk sebrafisk testikkel varierte mellom 40.000 og 200.000 celler avhengig av fisken. Når fordøye frisk sebrafisk testiklene i alle 5 stammer, var tidlig-bakterie celler ikke de eneste cellene i cellen suspensjoner (figur 2). Ved tidlig stadium bakterie celler fant mange spermatozoa også. På den annen side, var det langt mindre spermatozoa etter fordøyelsen av cryopreserved testiklene. Dette indikerte at spermatozoa ikke overleve denne ultra rask nedkjøling protokollen, og at de er mest sannsynlig eliminert under fordøyelsen prosessen, som gir en mye renere suspensjon av tidlig stadium bakterie celler.
Det var ingen betydelige forskjeller i antall tidlig stadium bakterie celler mellom venstre og høyre testiklene (1 ± 0,5 × 105 vs 1.1 ± 0,7 × 105) av en enkeltperson demonstrert av fordøye frisk testiklene av tre AB sebrafisk menn (enveis ANOVA ; F (1,4) = 0,04, p = 0,85). Alle sebrafisk linjene brukt i denne studien gitt gjeldende ultra rask nedkjøling protokollen gjennomsnittlig levedyktighet priser høyere enn 50% (tabell 1).
| AB villtype | Casper | Leopard | Vasa transgene | Wilms tumor transgene | ||
| Antallet lever celler (× 104) | Frisk testikkel | 14.5 ± 3.9 | 9.5 ± 2.3 | 12,7 ± 2.4 | 14.5 ± 5.6 | 4.8 ± 1.8 |
| Vitrified testikkel | 8.7 ± 2.8 | 7.2 ± 3.0 | 8,8 ± 1.7 | 7,6 ± 3.7 | 2.4 ± 0,7 | |
| Levedyktighet (%) | 58 ± 9 | 72 ± 13 | 69 ± 1 | 50 ± 6 | 53 ± 13 |
Tabell 1. Antallet lever celler og levedyktighet prosenter (mener ± SD) fra friske eller vitrified/varmet sebrafisk testikkel. Resultatene presenteres for fem testet sebrafisk linjene: AB wild type, casper (roy- / -; nacre- / -), leopard (leot1/t1), vasa [vs (vas::eGFP)] og Wilms svulst [vs (wt1b::eGFP 1)] transgene linje.
Figur 1. Dissekert voksen sebrafisk viser plasseringen av ulike anatomiske strukturer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Celler suspensjoner forberedt fra friske og vitrified/varmet sebrafisk testicular vev fra fem testet sebrafisk linjer (AB wild type, casper (roy- / -; nacre- / -), leopard (leot1/t1), vasa [vs (vas::eGFP)] og Wilms svulst [vs (wt1b::eGFP 1)] transgene linje) avbildet med kontrast mikroskopi. Skala bar: 40 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hovedformålet med denne studien var å tilpasse nålen midt ultra rask nedkjøling prosedyre utviklet for fugleinfluensa og pattedyr10,11,12 til kryonisk bevaring av fisk testikkel (sebrafisk som modell organisme). De fleste av de tidligere studiene om kryonisk bevaring sebrafisk genetiske ressurser var hovedsakelig fokusert på kryonisk bevaring av sebrafisk sperm2,3,4. Imidlertid protokoller for kryonisk bevaring av eldre oocytes og embryo har ikke vært utviklet ennå, selv om enkelte studier viser at kryonisk bevaring av tidlig stadium oocytes er sannsynlig14,15. I denne studien viste vi vellykket kryonisk bevaring av sebrafisk spermatogonia som gir nye muligheter for lagring av verdifull genetiske ressurser, spesielt siden etter transplantasjon kan de eldre til både mannlige og kvinnelige gameter5 .
Best av vår kunnskap er dette den første studien håndteringen ultra rask nedkjøling av sebrafisk vev av metoden NIV. Lignende studier inkludert vitrifikasjon av sebrafisk testiklene i 0,25 mL plast sugerør16 og vitrifikasjon av sebrafisk eggstokkene i lukket metal beholdere14. Den største fordelen med NIV sammenlignet med de to nevnte beholderne er direkte eksponering på testiklene til flytende nitrogen med minimale mengder cryoprotectants knyttet til dem, derfor maksimere kjøling rate10. Økningen i kjøling rate reduserer nødvendig konsentrasjonen av cryoprotectants, og dermed redusere deres toksisitet. Videre, alle vev brikker kan bli utsatt for cryoprotectants og flytende nitrogen synkront. Men kan direkte eksponering mot flytende nitrogen ha en ulempe når det gjelder kryssforurensning. Det er mulig at bakterier eller virus finnes i flytende nitrogen og at direkte vev eksponering kan føre til forurensning. Derfor foreslår vi å avstå fra å bruke flytende nitrogen når du utfører Salmene og forkaste brukte flytende nitrogen etter avkjøling. Foreslått metal beholdere tilbyr fordeler i denne forbindelse14, men de var tilpasset laget og er ikke lett tilgjengelig for alle laboratorier.
Når du sammenligner ultra rask nedkjøling til langsom hastighet frysing, er en viktig fordel med ultra rask nedkjøling fravær av spermatozoa etter fordøyelsen. Langsom-rate frysing metoder demonstrert i noen Karpefamilien fiskearter at like protokoller gir sammenlignbare levedyktigheten til både tidlig stadium bakterie celler og spermatozoa17 resulterer i høy spermatozoa tall etter fordøyelsen av den cryopreserved vev. Våre resultater i sebrafisk (nåværende studie), felles karpe og gullfisk (upubliserte resultater) indikerer at det er svært få spermatozoa etter fordøyelsen av varmet vev og at de ikke overleve denne fremgangsmåten og bli fordøyd som forenkler nedstrøms programmer siden ingen ytterligere berikelse prosedyrer er nødvendig.
Det er flere viktige skritt i denne protokollen. Først er å hindre enhver kontaminering under isolasjon prosessen siden det kan føre til en reduksjon i antall celler innhentet og kan hindre nedstrøms programmer. En av de avgjørende skritt er forbrukeravgift av testiklene der bakteriell forurensning kan oppstå fra skadet guts (derfor er det best å ikke skade eller fjerne tarmen) eller fra huden hvis bruker samme disseksjon verktøyet for å kutte huden og fjerne den testiklene. For det andre, vær forsiktig når låsing testiklene til akupunktur nålen siden det er mulig at testiklene faller eller gli ned. For tiden tester vi forskjellige metoder for å hindre testiklene sklir under vitrifikasjon prosedyren (flytende nitrogen temperatur). Tredje, ta hensyn til perioden av eksponering for cryoprotectants. Eksponering på testiklene (og dermed celler) for høye kryoprotektant konsentrasjoner (spesielt i vitrifikasjon) for kan lenge føre til celledød på grunn av kryoprotektant toksisitet. Også ta vare når stuper nålene i flytende nitrogen; Tørk av overflødig vs siden det kan påvirke kjøling og stupe nålene raskt for å unngå eksponering for flytende nitrogen damp. Til slutt, overføre testiklene fra flytende nitrogen til oppvarming media raskt for å unngå tidlig oppvarming i luften under overføring.
I denne utredningen presenterer vi prosedyren for kryonisk bevaring av testiklene fra fem sebrafisk stammer ved hjelp MeOH, PG og meg2så som gjennomsyre cryoprotectants. Metoden gir pålitelige resultater for alle testet sebrafisk stammer med en celle levedyktigheten til over 50%. Det er mulig å bruke denne metoden med modifikasjoner for andre arter, også. Først hver kryonisk bevaring protokoll er bestemt, og forskjellige cryoprotectants gi ulik effektivitet i ulike arter (i.e. etylenglykol gitt høyeste levedyktigheten i acipenserids18 mens meg2så gitt høyeste levedyktigheten i salmonider19 og Karpefisker17). Videre bør oppmerksomhet gis til konsentrasjoner brukes. Studien og studie på ørret Salmo trutta eggstokkene15 viser at de beste resultatene er oppnådd ved hjelp av samme konsentrasjonen av to cryoprotectants, men dette kan variere fra andre arter. Til slutt, sebrafisk testiklene er svært små, og det er også mulig å feste flere testiklene på en pinne. Når du arbeider med arter med større testiklene, er testikkelkreft stykker som brukes en svært viktig faktor. Vi foreslår for å øke eksponeringstider for større vev stykker tar konto kryoprotektant toksisitet og effektivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av National forskning, utvikling og innovasjon Office Ungarn (grant 116912 til ÁH) kostnader kontoret (mat og landbruk pris handling FA1205: AQUAGAMETE), Stipendium Hungaricum stipend programmet (grant til ZM) og nye Ungarske nasjonale Excellence Predoctoral fellesskap (grant til EK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leibovitz media (L-15) | Sigma-Aldrich | L1518 | Supplemented with L-glutamine |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Sucrose | Acros Organics | 57-50-1 | |
| Trehalose | Acros Organics | 99-20-7 | Dihydrate |
| Methanol | Reanal | 20740-0-08-65 | |
| Propylene glycol | Reanal | 08860-1-08-65 | |
| Dimethyl sulfoxide | Reanal | 00190-1-01-65 | |
| Collagenase | Gibco | 9001-12-1 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T8003 | |
| DNase I | Panreac AppliChem | A3778 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T6146 | |
| Phospate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | Tablets for preparation of 200 ml PBS solution |
References
- Mazur, P., Leibo, S. P., Seidel, G. R. J. Cryopreservation of the germplasm of animals used in biological and medical research: Importance, impact, status, and future directions. Biol. Reprod. 78 (1), 2-12 (2008).
- Carmichael, C., Westerfield, M., Varga, Z. M. Cryopreservation and In Vitro Fertilization at the Zebrafish International Resource Center. Methods Mol. Biol. 546, 45-65 (2009).
- Yang, H., Carmichael, C., Varga, Z. M., Tiersch, T. R. Development of a simplified and standardized protocol with potential for high-throughput for sperm cryopreservation in zebrafish Danio rerio. Theriogenology. 68 (2), 128-136 (2007).
- Morris, J. P. IV, Berghmans, S., Zahrieh, D., Neuberg, D. S., Kanki, J. P., Look, A. T. Zebrafish sperm cryopreservation with N,N-dimethylacetamide. Biotechniques. 35 (5), 956-968 (2003).
- Yoshizaki, G., et al. Spermatogonial transplantation in fish: A novel method for the preservation of genetic resources. Comp. Biochem. Physiol. Part D: Genomics Proteomics. 6 (1), 55-61 (2011).
- Gao, D., Critser, J. K.
- Asturiano, J. F., Cabrita, E., Horváth, Á Progress, challenges and perspectives on fish gamete cryopreservation: A mini-review. Gen. Comp. Endocrinol. 245, 69-76 (2017).
- Kása, E., et al. Development of sperm vitrification protocols for freshwater fish (Eurasian perch, Perca fluviatilis) and marine fish (European eel, Anguilla anguilla). Gen. Comp. Endocrinol. 245, 102-107 (2017).
- Cuevas-Uribe, R., Leibo, S. P., Daly, J., Tiersch, T. R. Production of channel catfish with sperm cryopreserved by rapid non-equilibrium cooling. Cryobiology. 63 (3), 186-197 (2011).
- Wang, Y., Xiao, Z., Li, L., Fan, W., Li, S. W. Novel needle immersed vitrification: A practical and convenient method with potential advantages in mouse and human ovarian tissue cryopreservation. Hum. Reprod. 23 (10), 2256-2265 (2008).
- Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. Production of Live Offspring from Testicular Tissue Cryopreserved by Vitrification Procedures in Japanese Quail (Coturnix japonica). Biol. Reprod. 88 (5), 124 (2013).
- Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. Novel needle-in-straw vitrification can effectively preserve the follicle morphology, viability, and vascularization of ovarian tissue in Japanese quail (Coturnix japonica). Anim. Reprod. Sci. 134 (3-4), 197-202 (2012).
- Lee, S., Yoshizaki, G. Successful cryopreservation of spermatogonia in critically endangered Manchurian trout (Brachymystax lenok). Cryobiology. 72 (2), 165-168 (2016).
- Marques, L. S., et al. Viability of zebrafish (Danio rerio) ovarian follicles after vitrification in a metal container. Cryobiology. 71 (3), 367-373 (2015).
- Lujić, J., et al. First successful vitrification of salmonid ovarian tissue. Cryobiology. 76, 154-157 (2017).
- Bono-Mestre, C., Cardona-Costa, J., García-Ximénez, F. Effects on cell viability of three zebrafish testicular cell or tissue cryopreservation methods. CryoLetters. 30 (2), 148-152 (2009).
- Marinović, Z., et al. Cryosurvival of isolated testicular cells and testicular tissue of tench Tinca tinca and goldfish Carassius auratus following slow-rate freezing. Gen. Comp. Endocrinol. 245, 77-83 (2017).
- Pšenička, M., Saito, T., Rodina, M., Dzyuba, B. Cryopreservation of early stage Siberian sturgeon Acipenser baerii germ cells, comparison of whole tissue and dissociated cells. Cryobiology. 72, 119-122 (2016).
- Lee, S., Iwasaki, Y., Shikina, S., Yoshizaki, G. Generation of functional eggs and sperm from cryopreserved whole testes. Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 110 (5), 1640-1645 (2013).
