Summary
Det huvudsakliga syftet med denna studie var att anpassa nålen nedsänkt förglasning (NIV) förfarandet för att frysa hela zebrafiskar testiklarna. Dessutom testades repeterbarheten av metod i fem olika zebrafiskar stammar.
Abstract
Aktuella trender inom naturvetenskap och bioteknik leda till skapandet av tusentals nya linjer i modellorganismer som därmed leder till behovet av nya metoder för säker förvaring av genetiska resurser utöver de gemensamma metoderna för att hålla häckningskolonier. Det huvudsakliga syftet med denna studie var att anpassa nålen nedsänkt förglasning (NIV) förfarandet för att frysa hela zebrafiskar testiklarna. Frysförvaring av tidigt stadium könsceller av hela testiklarna NIV erbjuder möjligheter för förvaring av zebrafisk genetiska resurser, särskilt eftersom efter transplantation kan de mogna till både manliga och kvinnliga könsceller. Testiklarna var censurerade, fäst på en akupunktur nål, jämviktas i två cryoprotective media (Jämviktstiden lösning innehållande 1,5 M metanol och 1,5 M propylenglykol; och förglasning lösning innehållande 3 M dimetyl sulfoxid och 3 M propylenglykol) och slungades in i flytande kväve. Prover värmdes i en serie av tre åtföljande värmande lösningar. De främsta fördelarna med denna teknik är (1) avsaknaden av spermier efter rötning av värmde testiklarna vilket underlättar nedströms manipulationer; (2) Ultra snabb nedkylning möjliggör optimal exponering av vävnader till flytande kväve därför maximera kylning och att minska den nödvändiga koncentrationen av cryoprotectants, vilket minskar deras toxicitet. (3) synkrona exponering för flera testiklarna cryoprotectants och flytande kväve; och (4) repeterbarhet visat genom att erhålla bärkraft över 50% i fem olika zebrafiskar stammar.
Introduction
Nya trender inom naturvetenskap och bioteknik har lett till skapandet av tusentals nya mutant rader av möss, Drosophila, zebrafiskar och andra arter som används som modellorganismer i biomedicinsk och andra vetenskaper1. Dessutom som nya tekniker utvecklas och blir tillgängliga, öka numrerar av muterade linjer stadigt2. Detta leder till nödvändigheten för en säker förvaring av genetiska resurser utöver de gemensamma metoderna för att hålla häckningskolonier. Som en metod som möjliggör säker förvaring av genetiska resurser på obestämd tid, frysförvaring erbjuder många fördelar som förlängning av reproduktiva säsong, kringgår behovet av fortlöpande underhåll av avelsbestånd, och det är mer kostnads - och Labor-effektiv2.
Protokoll för spermier frysförvaring utvecklats under de senaste flera år2,3,4 erbjuder möjlighet till framgångsrik lagring av zebrafisk manliga genetiskt material. Dock ännu Frysförvaring av ägg eller embryon i fisk inte möjligt på grund av deras komplexa struktur och stora mängder äggula material. Nyligen, öva av transplantation av primordiala könsceller (PGCs) eller spermatogoniala stamceller (SSCs) erbjuder en bypass till denna barriär genom att utveckla till funktionella spermier och ägg efter transplantation5. Frysförvaring av SSCs erbjuder därför en ny gräns i bevarande av sällsynta och värdefulla genetiska resurser.
Även om frysförvaring erbjuder många fördelar, genererar långsam-rate frysprocessen flera tillstånd som kan leda till cell skada2. Dessa inkluderar intracellulär och extracellulär isbildning, dehydrering, frysskyddmedel toxicitet och andra. Intracellulära is skadar cellerna, extracellulär is kan leda till mekanisk krossning av celler, medan vatten diffusion från cellerna under långsam-rate frysning kan leda till uttorkning6. Nyligen, förglasning som en teknik som förhindrar de negativa effekterna av isbildande har tillämpats i frysförvaring fisk könsceller7,8,9. Den presenterar en ultra snabb kylning teknik genom vilka interna och externa media förvandlas till ett amorft/glasartad tillstånd utan crystalizing till is7,10. Framgångsrika förglasning av testikelcancer och äggstockscancer vävnad har varit framgår i fågelinfluensa och däggdjur arter10,11,12, vilket öppnar möjligheter för dess tillämpning i fisk, liksom.
I denna studie presenterar vi nål nedsänkt förglasning (NIV) förfarandet för Frysförvaring av hela zebrafiskar testiklarna. Vi visar en pålitlig metod för isolering av zebrafisk tidigt stadium könsceller utan kontaminering och frysförvaring process som ger relativt höga mängder tidigt stadium könsceller med en låg förekomst av andra celler, särskilt spermier. Bäst av vår kunskap är detta den första studien som visar en detaljerad visualiserade protokoll för Ultra snabb kylning av fisk gonadala vävnad och zebrafiskar könsceller celler. Dessutom repeterbarhet av metoden demonstreras i fem olika zebrafiskar stammar: AB vildtyp, casper (roy- / -; pärlemor- / -), leopard (leot1/t1), vasa [Tg (vas::eGFP)] och Wilms tumör [Tg (wt1b::eGFP 1)] transgena linje.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av den ungerska djur välfärd lagen.
1. REAGENSBEREDNING
- Stamlösningar
- Laga 1 M trehalos genom att lägga 0.378 g trehalosdihydrat i 1 mL av dH2O. Blanda väl tills det löser sig helt.
- Laga 1 M sackaros genom att lägga 0.342 g sackaros i 1 mL av dH2O. Blanda väl tills det löser sig helt.
- Laga 1 M HEPES genom att lägga till 0.238 g HEPES 1 ml dH2O. Blanda väl tills det löser sig helt.
- Förbereda 20 mg/mL kollagenas (290 U/mg) genom att lägga till 100 mg till 5 mL PBS. Blanda väl tills det upplöser. Sterila filter genom 0,2 µm filter. Alikvotens 50 µL till 0,2 mL PCR-rör och frysa vid - 20 ° C.
- Förbereda 15 mg/mL trypsin (~ 10000 U/mg) genom att lägga till 75 mg till 5 mL PBS. Blanda väl tills det upplöser. Sterila filter genom 0,2 µm filter. Alikvotens 50 µL till 0,2 mL PCR-rör och frysa vid - 20 ° C.
- Förbereda 1 mg/mL DNAS jag (~ 3000 U/mg) genom att lägga till 5 mg 5 mL PBS. Blanda väl tills det upplöser. Sterila filter genom 0,2 µm filter. Alikvotens 50 µL till 0,2 mL PCR-rör och frysa vid - 20 ° C.
- Förbereda 0,4% trypan blå genom att lägga till 40 mg av trypan blå 10 mL PBS. Sterila filter genom 0,2 µm filter. Alikvotens 1 mL i 1,5 mL rör.
- Förbereda 200 mg/L MS-222 (Tricaine metan sulfonat) genom att lägga 200 mg av MS-222 i 1 L dH2O. Blanda väl tills det löser sig helt. Dessutom den MS-222 buffertlösning med natriumbikarbonat till ett neutralt pH-värde på 7,0.
- Lösningar för förglasning
- Förbereda Jämviktstiden lösning (ES): Förbered 2 mL ES genom att blanda 121,5 µL av metanol (MeOH, 1,5 M), 220 µL av propylenglykol (PG; 1,5 M), 200 µL av FBS (10%), 200 µL av trehalos stamlösning (0.1 M), 50 µL HEPES stamlösning (25 mM) och 1208.5 µL av l-15 in en 2 mL tub.
- Förbereda förglasning lösning (VS): Förbered 2 mL VS genom att blanda 439 µL av PG (3 M), 426 µL av dimetyl sulfoxid (mig2så; 3 M), 200 µL av FBS (10%), 200 µL av trehalos stamlösning (0.1 M), 50 µL av HEPES lagerför lösning (25 mM) och 685 µL av l-15 in i en 2 mL tub.
- Lösningar för uppvärmningen
- Förbereda värmande lösning 1 (WS1): Förbered 1,5 mL WS1 i en 2 mL tub genom att blanda 150 µL av FBS (10%), 450 µL av sackaros stamlösning (3 M) och 900 µL av l-15.
- Förbereda värmande lösning 2 (WS2): Förbered 1,5 mL WS2 i en 2 mL tub genom att blanda 150 µL av FBS (10%), 150 µL av sackaros stamlösning (1 M) och 1200 µL av l-15.
- Förbereda värmande lösning 3 (WS3): förbereda 1,5 mL WS2 i en 2 mL tub av blandande 150 µL FBS (10%) och 1350 µL av l-15.
- Förbereda matsmältningen lösning: för varje prov förbereda 500 µL av matsmältningen lösningen genom att blanda 50 µL av kollagenas stamlösning (2 mg/mL), 50 µL av trypsin stamlösning (1,5 mg/mL), 10 µL av DNAS jag (20 µg/mL) och 390 µL av l-15 i en 2 mL tub.
- Få dissektion verktyg: sax, microscissors, pincett, böjd pincett och akupunktur nålar.
2. testiklarna samling
- Avliva fisken genom att placera det i en maträtt som innehåller 200 mg/L MS-222 (pH = 7). Innan du fortsätter med dissektion, kontrollera att gälarna har slutat röra sig och att minst 10 minuter har gått sedan det ögonblicket att döden genom hypoxi.
- Torka fisken genom att klappa den på en pappershandduk och placera den på dess ryggsidan på en dissekera matta.
- För det första avskuren bäcken och byxor fenorna för enklare dissektion.
- Horisontellt klipp huden på magen av fisk mellan bröstfenorna och skär hud och underliggande muskel längs magen tills anal fenan.
- Öppna kroppen hålighet i fisken och pin vänster och höger kroppen väggen till dissektion mattan med nålar.
Obs: Testiklarna finns ovanför de gastrointestinala organ på båda sidor av simning urinblåsan (figur 1).
- För att förhindra kontaminering, inte ta ut de gastrointestinala organ, men försiktigt skjuta dem åt sidan och ta bort testiklarna från den motsatta sidan. Testiklarna är anslutna till kroppen väggen så ta bort dem försiktigt och skär anslutande bukhinnan av microscissors.
- Dessutom, för att förhindra kontamination, först sterilisera testiklarna genom att sätta dem i 70% etanol för 2 s, och placera dem i l-15 på en plattan med 96 brunnar på is.
Obs: Om det är nödvändigt, ren testiklarna från fettvävnad och stora blodkärl precis under stereomikroskopet
3. Ultra-snabb kylning av testikelcancer vävnad
- Mark nålar lämpliga etiketter beroende på provet skriver och förbereda Jämviktstiden (ES) och förglasning lösningar (VS).
- Överföra testiklarna till en större väl platta eller maträtt och stift två till tre testiklarna (eller mer beroende på storleken på nålen) på en steril akupunktur nål.
- För det första position testiklarna ovanpå böjd pincett. Placera punkten av nålen mitt i testiklarna och dra försiktigt testiklarna uppåt med pincetten.
- Efter punktering testiklarna, försiktigt dra den uppåt mot toppen av nålen. Kontrollera att testiklarna är separerade från varandra och att de inte ramlar av eller glida ner.
- Plats nålar med fästa testiklar i en 2 mL tub fylld med l-15 tills förglasning (vid 25 ˚C; lagringstiden bör inte överstiga 1 h).
Obs: Fästa testiklarna på nålen bör ske snabbt för att förhindra uttorkning av testiklarna.
- Överför nålen med testiklarna till Jämviktstiden lösningen och inkubera i 5 min vid 25˚C.
- Överför nålen till förglasning lösningen och inkubera i 30 s vid 25˚C.
- Ta bort nålen från förglasning lösningen, snabbt och skonsamt absorberar den återstående lösningen från vävnaden av en steril pappershandduk. Var försiktig för att undvika testiklarna klibba till pappershandduk eller falla av.
- Snabbt placera nålen i flytande kväve placeras i en frigolitlåda.
Obs: Gör detta steg snabbt för att undvika exponering av vävnad för flytande kväve dunsten. Använd låga volymer av flytande kväve för att förhindra korskontaminering av prover. - Håll nålen i flytande kväve i en sluten frigolitlåda för 5-10 min.
- Precool en öppnade 4,5 mL cryotube och sin mössa i samma box.
- Efter 5-10 min, överföra varje nål i en separat cryotube under ytan av flytande kväve och Stäng cryotube.
Varning: Använd alltid skyddskläder (t.ex. isolerade handskar) när arbetar med flytande kväve som exponering kan leda till svåra köldskador. - Placera cryotube på en metall sockerrör och placera den i cryobank behållaren så fort som möjligt. Lagra proverna i en kanister lagring dewar tills vidare användning.
4. uppvärmningen förfarande
- Varm varje nål separat. Alla värmande lösningar bör vara vid 25 ° C.
- Lossa cryotube från metall sockerrör och störta det i flytande kväve lagras i en frigolitlåda.
- Öppna cryotube i flytande kväve ånga (med tången) och släppa nålen i det flytande kvävgasen.
- Överför nålen mycket snabbt till den första värmande lösningen och inkubera i 1 min (vid 25 ° C). Se till att överföra nålen snabbt för att förhindra dess uppvärmningen i luften under överföringen.
- Överföra nålen i andra värmande lösning och inkubera i 3 min (vid 25 ° C).
- Överföra nålen in i tredje uppvärmningen lösningen och inkubera i 5 min (vid 25 ° C).
- Släppa testiklarna från nålen genom att skjuta dem nedåt med böjd pincett. Plats varje värmde testiklarna individuellt i en separat brunn (plattan med 96 brunnar) fylld med 250 µL av l-15 kompletteras med 10% FBS. Kontrollera att brunnarna är märkta enligt provet. Hålla väl plattan på is tills alla prover värms och tills vidare arbete.
5. vävnad matsmältningen
- Förbereda 500 µL av dissociation lösningen för varje prov i separat 2 mL rör. Märk rören enligt koden för provet. Inkubera beredda dissociation lösningen för 5 min i rumstemperatur.
- Lägg till värmde vävnaden i matsmältningen lösning och skär den i små bitar av minst 30 rörelser i liten sax.
- Inkubera skära vävnaden på en skakande platta för 90 min vid 25 ˚C.
- Stoppa rötningsprocessen genom att lägga till 400 µL av L-15 och 100 µL av FBS (10% FBS v/v). Kort skaka lösningen och inkubera i 1 minut vid rumstemperatur.
- Filtrera den erhållna lösningen genom 50 µm filter i en 1,5 mL tub. Märk rören med detta.
- Centrifugera filtrerade lösningen vid 200 × g i 10 minuter vid 25 ˚C.
- Ta försiktigt bort supernatanten och återsuspendera pelleten i 20 µL av L15 kompletteras med 10% FBS. Manuellt skaka tuben tills pelleten är helt upplöst. Hålla cellsuspension på isen eller på 4 ° c tills vidare användning.
6. bärkraft utvärdering och Cell räknar
- Blanda 5 µL cellsuspension och 5 µL av 0,4% trypan blå lösning i ett lämpligt märkta 0,2 mL PCR-rör. Om olika volymer används, kontrollera att utspädningsfaktorn av 1:1 kvar.
- Inkubera denna suspension för 1 till 3 min i rumstemperatur (25 ° C).
- Kontrollera livskraft hos varje prov i en hemocytometer under mikroskopet.
- Räkna antalet levande celler (ofärgade av trypan blå) i 15 fält. Beräkna det totala antalet celler i 20 µm av cellsuspensionen. Suspensionen är nu redo för alla efterföljande program.
Obs: När du optimerar förfarandet för andra arter med större kroppsstorlek, använda testiklarna fragment av lika vikt. Använda testiklarna från en privatperson för alla experimentella grupper för att undvika variabilitet i resultaten. När det gäller zebrafiskar, vi drog fördel av faktumen att vänster och höger testikel bör innehålla en lika (eller mycket liknande) antal könsceller13 (se representativa resultat). Den vänstra testikeln hölls som en kontroll medan rätt testiklarna var förglasad/värmde. Lönsamhet procentandelen beräknades antalet celler isolerade från förglasad/värmde testiklarna jämfört med antalet celler isolerade från färska testiklarna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Genomsnitt antal nystartade könsceller isolerade från en enda färska zebrafiskar testiklarna varierade mellan 40 000 och 200 000 celler beroende på storleken på fisken. När smälta färska zebrafiskar testiklarna i alla 5 stammar, var tidig-könsceller inte bara cellerna i cellsuspensioner (figur 2). Bredvid de nystartade könscellerna hittades många spermier också. Däremot, fanns det långt mindre spermier efter rötning av frysförvarade testiklarna. Detta anges att spermier överlever inte detta Ultra snabb kylning protokoll, och att de mest sannolikt elimineras under rötningsprocessen, vilket ger en mycket renare suspension av tidigt stadium könsceller.
Det fanns inga signifikanta skillnader i antalet nystartade könsceller mellan vänster och höger testiklarna (1 ± 0,5 × 105 vs 1,1 ± 0,7 × 105) av en enskild individ som framgår av smälta färska testiklarna av tre AB zebrafiskar hanar (one-way ANOVA ; F (1,4) = 0,04, p = 0,85). I alla zebrafiskar linjer används i denna studie, gav det nuvarande Ultra snabb kylning protokollet genomsnittliga lönsamhet priser högre än 50% (tabell 1).
| AB vildtyp | Casper | Leopard | Vasa transgena | Wilms tumör transgena | ||
| Antalet levande celler (× 104) | Färsk testiklarna | 14,5 ± 3.9 | 9,5 ± 2.3 | 12,7 ± 2.4 | 14,5 ± 5,6 | 4,8 ± 1,8 |
| Förglasat testiklarna | 8,7 ± 2,8 | 7,2 ± 3.0 | 8,8 ± 1,7 | 7,6 ± 3,7 | 2.4 ± 0,7 | |
| Lönsamhet (%) | 58 ± 9 | 72 ± 13 | 69 ± 1 | 50 ± 6 | 53 ± 13 |
Tabell 1. Antalet levande celler och livskraft procentsatser (genomsnitt ± SD) erhålls från färska eller förglasat/värmde zebrafiskar testiklarna. Resultat presenteras för de fem testa zebrafiskar raderna: AB vildtyp, casper (roy- / -; pärlemor- / -), leopard (leot1/t1), vasa [Tg (vas::eGFP)] och Wilms tumör [Tg (wt1b::eGFP 1)] transgena linje.
Figur 1. Dissekerade vuxen zebrafiskar visar positionen för olika anatomiska strukturer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Cells suspensioner beredda från färska och förglasad/värmde zebrafiskar testikelvävnad från fem testade zebrafiskar linjer (AB vildtyp, casper (roy- / -; pärlemor- / -), leopard (leot1/t1), vasa [Tg (vas::eGFP)] och Wilms tumör [Tg (wt1b::eGFP 1)] transgena line) avbildas med faskontrast mikroskopi. Skalstapeln: 40 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det huvudsakliga syftet med denna studie var att anpassa nålen nedsänkt Ultra snabb kylning förfarandet utvecklats för fågelinfluensa och däggdjur arter10,11,12 till Frysförvaring av fisk testiklarna (zebrafiskar som modell organism). De flesta tidigare studier angående Frysförvaring av zebrafisk genetiska resurser var främst inriktad på Frysförvaring av zebrafisk spermier2,3,4. Dock protokoll för Frysförvaring av mogna äggceller och embryon har inte utvecklats ännu, även om vissa nyare studier visar att frysförvaring tidigt stadium oocyter är rimliga14,15. I denna studie har vi visat framgångsrika Frysförvaring av zebrafisk spermatogonier som erbjuder nya möjligheter för förvaring av värdefulla genetiska resurser, särskilt eftersom efter transplantation kan de mogna till både manliga och kvinnliga könsceller5 .
Bäst av vår kunskap är den första studie som behandlingen för Ultra snabb kylning av zebrafisk vävnad av metoden NIV. Liknande studier inkluderade förglasning av zebrafisk testiklarna i 0,25 mL plast strån16 och förglasning av zebrafisk äggstockarna i slutna metall behållare14. Den största fördelen med NIV jämfört med de två nämnda behållarna är testiklarna direkt exponering för flytande kväve med minimal volymer av cryoprotectants att vara fäst vid dem, därför maximera kylning hastighet10. Ökningen av kylningshastigheten minskar krävs koncentrationen av cryoprotectants, vilket minskar deras giftighet. Dessutom kan alla vävnad bitar utsättas för den cryoprotectants och flytande kväve synkront. Direkt exponering för flytande kväve kan dock ha en nackdel när det gäller korskontaminering. Det är möjligt att bakterier eller virus finns i det flytande kvävgasen och att direkt vävnad exponering kan leda till kontaminering. Vi föreslår därför att avstå från att återanvända flytande kväve när de utför NIV och kassera den använda flytande kvävgasen efter kylning. Föreslagna metallbehållare erbjudande fördelar i detta avseende14, men de var anpassade gjort och är inte lättillgänglig för alla laboratorier.
När man jämför Ultra snabb kylning till långsam-rate frysning, är en avgörande fördel av Ultra snabb kylning avsaknad av spermier efter matsmältningen. Långsam-rate frysning metoder visat i vissa karpfiskar arter att liknande protokoll ger jämförbara lönsamheten för både nystartade könsceller och spermier17 vilket resulterar i höga spermier siffror efter rötning av de nedfrysta vävnad. Våra resultat i zebrafisk (föreliggande studie), karp och guldfisk (opublicerade resultat) indikerar att det finns mycket få spermier efter rötning av värmde vävnader och att de inte överleva proceduren och få rötas vilket förenklar nedströms applikationer eftersom inga ytterligare berikning förfaranden behövs.
I området i närheten finns det flera kritiska steg inom detta protokoll. Först är att förhindra kontaminering under processen isolering eftersom det kan leda till en minskning av antalet celler som erhållits och kan hindra eventuella efterföljande program. En av de avgörande stegen är excision av testiklarna där bakteriell kontaminering kan inträffa från skadade tarmar (därför det är bäst att inte skada eller helt ta bort tarmen) eller från huden om med samma dissektion verktyg för att skära huden och ta bort den testiklarna. För det andra, ta hand vid fästa testiklarna på akupunktur nålen eftersom det är möjligt att testiklarna ramla eller glida ner. För närvarande testar vi olika metoder för att förhindra testiklarna glider under förfarandet för förglasning (flytande kväve temperaturer). För det tredje, uppmärksamma perioden av exponering för cryoprotectants. Exponering av testiklarna (och således celler) till höga frysskyddmedel koncentrationer (särskilt i förglasning lösningen) för kan länge leda till celldöd på grund av frysskyddmedel toxicitet. Också, var försiktig när störta nålar i flytande kväve; torka bort överskottet av VS eftersom det kan påverka kylningsprocessen och störta nålar snabbt för att undvika exponering för flytande kväve vapor. Slutligen, överföra testiklarna från flytande kväve i värmande media snabbt för att undvika för tidig uppvärmning i luften under överföringen.
I detta dokument presenterar vi förfarandet för Frysförvaring av testiklarna från fem zebrafiskar stammar med MeOH, PG och mig2så som genomsyrar cryoprotectants. Metoden ger tillförlitliga resultat för alla testade zebrafiskar stammar med en cellviabilitet av över 50%. Det är möjligt att använda denna metod med ändringar för andra arter, liksom. För det första, varje frysförvaring protokoll är artspecifika och olika cryoprotectants ger olika effektivitetsvinster i olika arter (dvs etylenglykol gav den högsta lönsamheten i acipenserids18 medan mig2så gav den högsta lönsamheten i laxfiskar19 och mörtfiskar17). Vidare bör uppmärksammas de koncentrationer används också. Föreliggande studie och den studie som genomfördes på öring Salmo trutta äggstockarna15 visar att de bästa resultaten erhålls med hjälp av samma koncentration av två cryoprotectants, men detta kan variera i andra arter. Slutligen, zebrafiskar testiklarna är mycket små, och det är även möjligt att fästa flera testiklarna på en nål. När du arbetar med arter med större testiklar, är storleken på testikelcancer bitar som används en mycket viktig faktor. Vi föreslår för att öka exponering gånger för större vävnad bitar med hänsyn till konto frysskyddmedel toxicitet och effektivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av nationell forskning, utveckling och Innovation Office av Ungern (grant 116912 att ÁH), det COST-kontoret (mat och jordbruk kostnad åtgärd FA1205: AQUAGAMETE), det Stipendium ungerska stipendieprogrammet (grant till ZM) och ny Ungerska National Excellence pre Fellowship (grant till EK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leibovitz media (L-15) | Sigma-Aldrich | L1518 | Supplemented with L-glutamine |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Sucrose | Acros Organics | 57-50-1 | |
| Trehalose | Acros Organics | 99-20-7 | Dihydrate |
| Methanol | Reanal | 20740-0-08-65 | |
| Propylene glycol | Reanal | 08860-1-08-65 | |
| Dimethyl sulfoxide | Reanal | 00190-1-01-65 | |
| Collagenase | Gibco | 9001-12-1 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T8003 | |
| DNase I | Panreac AppliChem | A3778 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T6146 | |
| Phospate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | Tablets for preparation of 200 ml PBS solution |
References
- Mazur, P., Leibo, S. P., Seidel, G. R. J. Cryopreservation of the germplasm of animals used in biological and medical research: Importance, impact, status, and future directions. Biol. Reprod. 78 (1), 2-12 (2008).
- Carmichael, C., Westerfield, M., Varga, Z. M. Cryopreservation and In Vitro Fertilization at the Zebrafish International Resource Center. Methods Mol. Biol. 546, 45-65 (2009).
- Yang, H., Carmichael, C., Varga, Z. M., Tiersch, T. R. Development of a simplified and standardized protocol with potential for high-throughput for sperm cryopreservation in zebrafish Danio rerio. Theriogenology. 68 (2), 128-136 (2007).
- Morris, J. P. IV, Berghmans, S., Zahrieh, D., Neuberg, D. S., Kanki, J. P., Look, A. T. Zebrafish sperm cryopreservation with N,N-dimethylacetamide. Biotechniques. 35 (5), 956-968 (2003).
- Yoshizaki, G., et al. Spermatogonial transplantation in fish: A novel method for the preservation of genetic resources. Comp. Biochem. Physiol. Part D: Genomics Proteomics. 6 (1), 55-61 (2011).
- Gao, D., Critser, J. K.
- Asturiano, J. F., Cabrita, E., Horváth, Á Progress, challenges and perspectives on fish gamete cryopreservation: A mini-review. Gen. Comp. Endocrinol. 245, 69-76 (2017).
- Kása, E., et al. Development of sperm vitrification protocols for freshwater fish (Eurasian perch, Perca fluviatilis) and marine fish (European eel, Anguilla anguilla). Gen. Comp. Endocrinol. 245, 102-107 (2017).
- Cuevas-Uribe, R., Leibo, S. P., Daly, J., Tiersch, T. R. Production of channel catfish with sperm cryopreserved by rapid non-equilibrium cooling. Cryobiology. 63 (3), 186-197 (2011).
- Wang, Y., Xiao, Z., Li, L., Fan, W., Li, S. W. Novel needle immersed vitrification: A practical and convenient method with potential advantages in mouse and human ovarian tissue cryopreservation. Hum. Reprod. 23 (10), 2256-2265 (2008).
- Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. Production of Live Offspring from Testicular Tissue Cryopreserved by Vitrification Procedures in Japanese Quail (Coturnix japonica). Biol. Reprod. 88 (5), 124 (2013).
- Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. Novel needle-in-straw vitrification can effectively preserve the follicle morphology, viability, and vascularization of ovarian tissue in Japanese quail (Coturnix japonica). Anim. Reprod. Sci. 134 (3-4), 197-202 (2012).
- Lee, S., Yoshizaki, G. Successful cryopreservation of spermatogonia in critically endangered Manchurian trout (Brachymystax lenok). Cryobiology. 72 (2), 165-168 (2016).
- Marques, L. S., et al. Viability of zebrafish (Danio rerio) ovarian follicles after vitrification in a metal container. Cryobiology. 71 (3), 367-373 (2015).
- Lujić, J., et al. First successful vitrification of salmonid ovarian tissue. Cryobiology. 76, 154-157 (2017).
- Bono-Mestre, C., Cardona-Costa, J., García-Ximénez, F. Effects on cell viability of three zebrafish testicular cell or tissue cryopreservation methods. CryoLetters. 30 (2), 148-152 (2009).
- Marinović, Z., et al. Cryosurvival of isolated testicular cells and testicular tissue of tench Tinca tinca and goldfish Carassius auratus following slow-rate freezing. Gen. Comp. Endocrinol. 245, 77-83 (2017).
- Pšenička, M., Saito, T., Rodina, M., Dzyuba, B. Cryopreservation of early stage Siberian sturgeon Acipenser baerii germ cells, comparison of whole tissue and dissociated cells. Cryobiology. 72, 119-122 (2016).
- Lee, S., Iwasaki, Y., Shikina, S., Yoshizaki, G. Generation of functional eggs and sperm from cryopreserved whole testes. Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 110 (5), 1640-1645 (2013).
