Summary
O principal objetivo deste estudo foi adaptar-se a agulha imerso procedimento de vitrificação (NVI) para cryopreserve toda zebrafish testículos. Além disso, a repetibilidade do método em cinco estirpes diferentes zebrafish foi testada.
Abstract
As tendências atuais na ciência e biotecnologia levam à criação de milhares de novas linhas em organismos-modelo, assim, levando à necessidade de novos métodos para o armazenamento seguro dos recursos genéticos, além de práticas comuns de manter colônias de reprodução. O principal objetivo deste estudo foi adaptar-se a agulha imerso procedimento de vitrificação (NVI) para cryopreserve toda zebrafish testículos. Criopreservação de células germinativas de fase inicial pelos testículos todo NIV oferece possibilidades para o armazenamento de zebrafish recursos genéticos, especialmente desde que após transplante eles podem amadurecer em gâmetas masculinas e femininas. Os testículos foram extirpados, preso em uma agulha de acupuntura, incubada em dois meios de cryoprotective (solução de equilibração contendo metanol de 1,5 M e 1,5 M propilenoglicol; e solução de vitrificação contendo o sulfoxide dimethyl 3M e 3M propileno glicol) e caiu em nitrogênio líquido. Amostras foram aquecidas em uma série de três soluções de aquecimento consequentes. As principais vantagens desta técnica são (1) a falta de espermatozoides após a digestão dos testículos aquecidos, facilitando assim a jusante manipulações; (2) ultra rápido resfriamento permitindo a exposição ideal dos tecidos ao nitrogênio líquido, portanto, maximizando o resfriamento e reduzindo a concentração necessária de crioprotectores, reduzindo assim a sua toxicidade; (3) síncrona exposição dos testículos vários crioprotectores e nitrogênio líquido; e (4) repetibilidade demonstrado pela obtenção de viabilidade de acima de 50% em cinco estirpes diferentes do zebrafish.
Introduction
Novas tendências na ciência e biotecnologia levaram à criação de milhares de novas linhas de mutantes de camundongos, drosófila, zebrafish e outras espécies utilizadas como organismos modelo em biomédicas e outras ciências1. Além disso, como novas tecnologias são desenvolvidas e se tornam disponíveis, os números das linhas mutantes constantemente aumentam2. Isto leva à necessidade para um armazenamento seguro dos recursos genéticos, além de práticas comuns de manter colônias de reprodução. Como um método que permite a armazenagem segura dos recursos genéticos por um período indefinido de tempo, criopreservação oferece muitas vantagens, tais como extensão da temporada reprodutiva, contorna a necessidade de manutenção contínua dos reprodutores, e é mais custo - e eficiência do trabalho2.
Protocolos de criopreservação de espermatozoides desenvolvidos durante os últimos vários anos2,3,4 oferecem a oportunidade para armazenamento bem sucedida do zebrafish material genético masculino. No entanto, criopreservação de ovos ou embriões de peixe ainda não é possível devido à sua estrutura complexa e grandes quantidades de material de gema. Recentemente, a prática do transplante de células germinativas primordiais (PGCs) ou células-tronco das espermatogónias (SSCs) oferece um desvio para essa barreira, desenvolvendo-se em ovos e esperma funcional após transplante5. Portanto, a criopreservação de SSCs oferece uma nova fronteira na conservação dos recursos genéticos raros e valiosos.
Apesar de criopreservação oferece muitas vantagens, o processo de congelação lenta-taxa gera várias condições que podem levar a célula danos2. Estes incluem a formação de gelo intracelular e extracelular, desidratação, toxicidade crioprotetoras e outros. Gelo intracelular danifica as células, gelo extracelular pode levar ao esmagamento mecânico das células, enquanto a difusão de água das células durante a lenta taxa de congelamento pode levar a desidratação6. Recentemente, foi aplicada na criopreservação de gâmetas de peixe a7,8,9vitrificação como uma técnica que previne os efeitos negativos da formação de gelo. Apresenta uma técnica de resfriamento ultra rápida através do qual os meios de comunicação internos e externos se transformar em um estado amorfo/vítreo sem reveladores em gelo7,10. Bem sucedida vitrificação de tecido ovariano e testicular tem sido evidenciada na espécie aviária e mamíferos10,11,12, abrindo assim as possibilidades de sua aplicação em peixes, também.
Neste estudo, apresentamos o processo de vitrificação (NVI) agulha imergido para a criopreservação de testículos de zebrafish toda. Vamos demonstrar um método confiável para o isolamento do zebrafish estágio inicial de pilhas de germe sem contaminação e um processo de criopreservação que produz relativamente grandes quantidades de células germinativas de fase inicial com uma baixa presença de outras células, especialmente de espermatozoides. O melhor de nosso conhecimento, este é o primeiro estudo a demonstrar um protocolo detalhado visualizado para refrigeração ultra rápida de tecido gonadal de peixe e as células da linha germinal do zebrafish. Além disso, a repetibilidade do método é demonstrada no cinco estirpes diferentes zebrafish: AB tipo selvagem, casper (roy- / -; nácar- / -), leopardo (leo,t1/t1), vasa [Tg (vas::eGFP)] e linha de transgénicos Wilms tumor [Tg (wt1b::eGFP 1)].
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Protocol
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pela lei húngara de bem-estar Animal.
1. preparação do reagente
- Soluções conservadas em estoque
- Prepare 1 M trealose adicionando 0,378 g de trealose di-hidratado em 1 mL de dH2Mix O. bem até que se dissolva completamente.
- Prepare-se 1 M de sacarose adicionando 0,342 g de sacarose em 1 mL de dH2Mix O. bem até que se dissolva completamente.
- Prepare 1 M HEPES adicionando 0,238 g de HEPES a 1 mL de dH2Mix O. bem até que se dissolva completamente.
- Prepare a colagenase 20 mg/mL (290 U/mg) pela adição de 100 mg para 5 mL de PBS. Misture bem até que se dissolva. Filtro estéril através de 0,2 µm de filtros. Alíquota de 50 μL em 0,2 mL PCR tubos e congelar a - 20 ° C.
- Preparar a tripsina de 15 mg/mL (~ 10000 U/mg) adicionando-se 75 mg a 5 mL de PBS. Misture bem até que se dissolva. Filtro estéril através de 0,2 µm de filtros. Alíquota de 50 μL em 0,2 mL PCR tubos e congelar a - 20 ° C.
- Prepare-se 1 mg/mL DNase eu (~ 3000 U/mg) pela adição de 5 mg a 5 mL de PBS. Misture bem até que se dissolva. Filtro estéril através de 0,2 µm de filtros. Alíquota de 50 μL em 0,2 mL PCR tubos e congelar a - 20 ° C.
- Prepare-se 0,4% trypan azul adicionando-se 40 mg de azul de Tripan a 10 mL de PBS. Filtro estéril através de 0,2 µm de filtros. Alíquota 1 mL em tubos de 1,5 mL.
- Preparar a 200 mg/L de MS-222 (sulfonato de metano tricaina) adicionando-se 200 mg de MS-222 em 1 L de dH2Mix O. bem até que se dissolva completamente. Além disso, o MS-222 tampão com bicarbonato de sódio para um pH neutro de 7.0.
- Soluções para vitrificação
- Preparar a solução de equilíbrio (ES): preparar 2 mL de ES misturando 121.5 µ l de metanol (MeOH; 1,5 M), 220 µ l de propilenoglicol (PG; 1,5 M), 200 µ l de FBS (10%), 200 µ l da solução estoque de trealose (0,1 M), 50 µ l de solução-mãe de HEPES (25 mM) e 1208.5 µ l de L-15 em um 2 tubo mL.
- Preparar a solução de vitrificação (VS): preparar 2 mL de VS misturando 439 µ l de PG (3 M), 426 µ l de dimetil sulfóxido (Me2então; 3 M), 200 µ l de FBS (10%), 200 µ l de solução-mãe de trealose (0,1 M), 50 µ l de HEPES estoque solução (25 mM) e 685 µ l de L-15 em um tubo de 2 mL.
- Soluções para o aquecimento
- Preparar a solução de aquecimento 1 (WS1): preparar 1,5 mL de WS1 em um tubo de 2 mL misturando 150 µ l de FBS (10%), 450 µ l de solução de sacarose (3M) e 900 µ l de L-15.
- Preparar a solução de aquecimento 2 (WS2): preparar 1,5 mL de WS2 em um tubo de 2 mL misturando 150 µ l de FBS (10%), 150 µ l de solução de sacarose (1 M) e 1200 µ l de L-15.
- Preparar a solução de aquecimento 3 (WS3): preparar 1,5 mL de WS2 em um tubo de 2 mL por mistura de 150 µ l FBS (10%) e 1350 µ l de L-15.
- Preparar a solução de digestão: para cada amostra prepare 500 µ l da solução de digestão, misturando-se 50 µ l de solução colagenase (2 mg/mL), 50 µ l de solução tripsina (1,5 mg/mL), 10 µ l de DNase I (20 µ g/mL) e 390 µ l de L-15 em um 2 mL do tubo.
- Obter ferramentas de dissecação: tesoura, micro-tesouras, pinças, pinças curvas e agulhas de acupuntura.
2. testículos coleção
- Eutanásia o peixe, colocando-o em um prato contendo 200 mg/L de MS-222 (pH = 7). Antes de continuar com a dissecação, certifique-se que as brânquias têm parou de se mexer e pelo menos 10 min se passaram desde aquele momento para garantir a morte por hipóxia.
- Seque o peixe, acariciando-o em uma toalha de papel e coloque-o de lado dorsal em uma esteira de dissecação.
- Em primeiro lugar, corte as barbatanas peitorais e pélvicas para dissecação mais fácil.
- Horizontalmente, cortar a pele na barriga do peixe entre as barbatanas peitorais e cortar a pele e o músculo subjacente ao longo da barriga até a nadadeira anal.
- Abra a cavidade do corpo do peixe e fixar a parede corporal esquerda e direita para o tapete de dissecação com agulhas.
Nota: Os testículos estão localizados acima os órgãos gastrointestinais em ambos os lados da natação bexiga (Figura 1).
- Para evitar contaminação, não retire os órgãos gastrointestinais, mas suavemente empurrá-los para um lado e retire o testículo do lado oposto. Os testículos estão ligados à parede do corpo então remova-os cuidadosamente e cortar o ligação peritônio por micro-tesouras.
- Além disso, a fim de evitar a contaminação, em primeiro lugar esterilizar os testículos colocando-os em etanol a 70% por 2 s e depois coloque-os em L-15 em uma placa de 96 poços no gelo.
Nota: Se for necessário, testículos limpos de tecido adiposo e grandes vasos sanguíneos precisamente sob o microscópio estereoscópico
3. ultrarápido arrefecimento do tecido Testicular
- Agulhas de Mark com Etiquetas apropriadas, dependendo do exemplo digite e preparem a equilibração (ES) e soluções de vitrificação (VS).
- Transferi os testículos para uma placa bem maior ou prato e pino dois ou três testículos (ou mais dependendo do tamanho da agulha) em uma agulha estéril de acupuntura.
- Em primeiro lugar, posição do testículo no topo curvas pinças. Coloque a ponta da agulha no meio do testículo e puxe cuidadosamente o testículo para cima, com a pinça.
- Após a punção do testículo, gentilmente puxe-o para cima em direção ao topo da agulha. Certifica-se de que os testículos são separados uns dos outros e que não estão caindo ou deslizar para baixo.
- Lugar cheio de agulhas com testículos fixados em um tubo de 2 mL com L-15 até vitrificação (em 25 ˚ c; tempo de armazenamento não deve exceder 1 h).
Nota: Condecorando os testículos a agulha deve ser feito rapidamente para evitar que os testículos de secar.
- Transferir a agulha com testículos para a solução de equilíbrio e incubar durante 5 min à 25˚C.
- Transferir a agulha para a solução de vitrificação e incube por 30 s em 25˚C.
- Retire a agulha a partir da solução de vitrificação, rapidamente e suavemente absorver o restante da solução do tecido por uma toalha de papel estéril. Tome cuidado para evitar os testículos degola para a toalha de papel ou cair.
- Rapidamente Coloque a agulha no nitrogênio líquido, colocado em uma caixa de isopor.
Nota: Fazer este passo rapidamente para evitar a exposição do tecido para o vapor de nitrogênio líquido. Use volumes baixos de nitrogênio líquido para evitar a contaminação das amostras. - Manter a agulha em nitrogênio líquido em uma caixa de isopor fechada por 5-10 min.
- Precool um criotubo abriu 4,5 mL e sua tampa na mesma caixa.
- Após 5-10 min, transfira cada agulha em um separado criotubo sob a superfície do nitrogênio líquido e fechar o criotubo.
Atenção: Sempre use roupas de proteção (como luvas isoladas) quando trabalhar com nitrogênio líquido como exposição pode levar a graves queimaduras. - Coloque o criotubo com um bastão de metal e colocá-lo no recipiente do cryobank mais rápido possível. Armazenar as amostras em um armazenamento de cilindro dewar até utilização posterior.
4. procedimento de aquecimento
- Cada agulha quente separadamente. Todas as soluções de aquecimento devem ser a 25 ° C.
- Desanexe o criotubo da cana-de-metal e mergulhá-lo no nitrogênio líquido armazenado em uma caixa de isopor.
- Abra o criotubo no vapor de nitrogênio líquido (usando fórceps) e liberar a agulha para o nitrogênio líquido.
- Transferir a agulha muito rápido para a primeira solução de aquecimento e incubar durante 1 min (a 25 ° C). Certifique-se de transferir a agulha rapidamente para evitar o seu aquecimento no ar durante a transferência.
- Transferir a agulha para a segunda solução de aquecimento e incube por 3 min (a 25 ° C).
- Transferir a agulha para a terceira solução de aquecimento e incubar durante 5 min (a 25 ° C).
- Libere os testículos da agulha deslizando-as para baixo com uma pinça curvada. Lugar cada testículo aquecido individualmente em um poço separado (placa de 96 poços) repleto de 250 µ l de L-15 suplementado com 10% FBS. Certifique-se que os poços são rotulados de acordo com a amostra. Manter a placa bem no gelo até que todas as amostras são aquecidas e até trabalhos futuros.
5. tecido digestão
- Prepare-se para cada amostra em tubos separados 2 mL 500 µ l da solução de dissociação. Etiquete os tubos de acordo com o código da amostra. Incube a solução preparada de dissociação por 5 min à temperatura ambiente.
- Adicione o tecido aquecido para a solução de digestão e corte em pedaços pequenos pelo menos 30 movimentos de tesoura pequena.
- Incube o tecido cortado em uma placa de agitação durante 90 minutos a 25 ˚ c.
- Parar o processo de digestão, adicionando a 400 µ l de L-15 e 100 µ l de FBS (FBS 10% v/v). Brevemente, agitar a solução e incubar durante 1 min à temperatura ambiente.
- Filtre a solução obtida através de 50 µm de filtros em um tubo de 1,5 mL. Rotule os tubos em conformidade.
- Centrifugue a solução filtrada em 200 × g por 10 min a 25 ˚ c.
- Retire o sobrenadante cuidadosamente e resuspenda o pellet em 20 µ l de L15 suplementado com 10% FBS. Manualmente, agite o tubo até a pelota é completamente dissolvida. Manter a suspensão de células no gelo ou no 4 ˚ c até nova utilização.
6. viabilidade avaliação e contagem de células
- Mistura de 5 µ l de suspensão de células e 5 µ l de solução de azul de Tripan 0,4% em um tubo PCR apropriadamente rotulado 0,2 mL. Se forem usados diferentes volumes, certifique-se de que a razão de diluição de 1:1 permanece.
- Incube a esta suspensão para 1 a 3 min à temperatura ambiente (25 ° C).
- Verifica a viabilidade de cada amostra em um hemocytometer sob o microscópio.
- Conte o número de células vivas (inocente por trypan blue) em 15 campos. Calcule o número total de células em 20 µm da suspensão celular. A suspensão está agora pronta para qualquer aplicação a jusante.
Nota: Ao otimizar o procedimento para as outras espécies com maior tamanho corporal, use fragmentos de testículo de peso igual. Use os testículos de um indivíduo para todos os grupos experimentais a fim de evitar a variabilidade individual nos resultados. No caso de zebrafish, tiramos proveito do fato de que esquerda e direito testículo deve conter um número igual (ou muito semelhante) de células germinativas13 (Ver os resultados do representante). O testículo esquerdo foi mantido como um controle enquanto o testículo direito foi vitrificados/aquecido. Porcentagem de viabilidade foi calculada o número de células isoladas de testículo vitrificados/aquecido em relação ao número de células isoladas de testículos frescos.
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Representative Results
Em média, o número de células germinativas de fase inicial isolado de um testículo único zebrafish fresca variou entre 40.000 e 200.000 células dependendo do tamanho do peixe. Quando digerindo testículos zebrafish fresco em todas as 5 estirpes, células germinativas-início não eram as única células presentes nas suspensões celulares (Figura 2). Ao lado as células germinativas de estágio inicial, numerosos espermatozoides foram encontrados também. Por outro lado, havia muito menos espermatozoides após digestão dos testículos criopreservados. Isto indicou que espermatozoides não sobrevivem a este protocolo de arrefecimento ultra rápido, e que eles são mais propensos eliminada durante o processo de digestão, o que produz uma suspensão muito mais limpa de células germinativas de fase inicial.
Não havia diferenças significativas no número de células germinativas de estágio inicial entre os testículos direito e esquerdos (1 ± 0,5 × 105 vs 1,1 ± 0,7 × 105) de um único indivíduo demonstrado por digestão de testículos frescos de três machos de zebrafish AB (ANOVA One-Way ; F (1,4) = 0.04, p = 0,85). Em todas as linhas de zebrafish utilizadas neste estudo, o protocolo atual de resfriamento ultra rápido resultou em taxas de viabilidade média superior a 50% (tabela 1).
| Tipo AB | Casper | Leopard | Vasa transgênico | Tumor de Wilms transgênico | ||
| Número de células vivas (× 104) | Testículo fresco | 14.5 ± 3,9 | 9,5 ± 2,3 | 12,7 ± 2,4 | 14.5 ± 5,6 | 4,8 ± 1,8 |
| Testículo vitrificado | 8.7 ± 2,8 | 7.2 ± 3.0 | 8,8 ± 1,7 | 7,6 ± 3,7 | 2.4 ± 0,7 | |
| Viabilidade (%) | 58 ± 9 | 72 ± 13 | 69 ± 1 | 50 ± 6 | 53 ± 13 |
Tabela 1. Número de células vivas e percentagens de viabilidade (média ± DP) obtidas de testículo de zebrafish fresco ou vitrificados/aquecido. Os resultados são apresentados para as cinco linhas de zebrafish testado: AB tipo selvagem, casper (roy- / -; nácar- / -), leopardo (leo,t1/t1), vasa [Tg (vas::eGFP)] e linha de transgénicos Wilms tumor [Tg (wt1b::eGFP 1)].
Figura 1. Dissecado zebrafish adulto demonstrando a posição de várias estruturas anatômicas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Células suspensões preparadas a partir de tecido testicular zebrafish fresco e vitrificados/aquecido de cinco linhas de zebrafish testado (AB tipo selvagem, casper (roy- / -; nácar- / -), leopardo (leo,t1/t1), vasa [Tg (vas::eGFP)] e linha de transgénicos Wilms tumor [Tg (wt1b::eGFP 1)]) fotografada com microscopia de contraste de fase. Barra de escala: 40 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O principal objetivo deste estudo foi adaptar-se a agulha imerso ultra rápido refrigeração procedimento desenvolvido para espécies de mamíferos e aviária10,11,12 para a criopreservação do testículo de peixe (zebrafish como modelo organismo). A maioria dos estudos anteriores sobre criopreservação dos recursos genéticos de zebrafish concentraram-se principalmente na criopreservação de esperma de zebrafish2,3,4. No entanto, não foram desenvolvidos protocolos para criopreservação de oócitos maduros e embriões ainda, apesar de alguns estudos recentes demonstram que criopreservação de ovócitos de estágio inicial é plausível14,15. Neste estudo, temos demonstrado sucesso criopreservação de zebrafish espermatogónias, que oferece novas possibilidades para o armazenamento dos valiosos recursos genéticos, especialmente desde que após transplante eles podem amadurecer em gâmetas masculinas e femininas5 .
O melhor de nosso conhecimento, este é o primeiro estudo a lidar com a refrigeração ultra rápida de zebrafish tecido pelo método NVI. Estudos semelhantes incluíam vitrificação de zebrafish testículos em 0,25 mL canudos de plástico16 e vitrificação de zebrafish ovários em recipientes fechados de metal14. A principal vantagem da NVI, em comparação com os dois recipientes mencionados é a exposição direta de testículos de nitrogênio líquido com volumes mínimos de crioprotectores sendo anexados a eles, portanto, maximizar a taxa refrigerando10. O aumento na taxa de resfriamento reduz a concentração necessária de crioprotectores, reduzindo assim a sua toxicidade. Além disso, todas as peças de tecido podem ser expostas ao crioprotectores e nitrogênio líquido sincronicamente. No entanto, a exposição direta de nitrogênio líquido pode ter uma desvantagem no que se refere a contaminação cruzada. É possível que bactérias ou vírus estão presentes no nitrogênio líquido, e que a exposição direta do tecido pode levar à contaminação. Portanto, sugerimos que se abstenham de reutilização nitrogênio líquido quando conduzindo NIV e para descartar o nitrogênio líquido utilizado após resfriamento. Proposto recipientes de metal oferecem vantagens a este respeito14, no entanto, eram personalizadas feitas e não são facilmente acessíveis a todos os laboratórios.
Ao comparar a refrigeração ultra rápida para lenta taxa de congelação, uma vantagem crucial de refrigeração ultra rápida é a ausência de espermatozoides após a digestão. Métodos de congelação lenta-taxa demonstraram em algumas espécies de peixes de carpa que protocolos semelhantes rendem comparável viabilidade de células germinativas de estágio inicial e espermatozoides17 resultando em número elevado de espermatozoides após a digestão do shipper tecido. Nossos resultados no zebrafish (presente estudo), carpa comum e peixinho (resultados não publicados) indicam que existem muito poucos espermatozoides após a digestão dos tecidos aquecidos e que eles não sobreviver a este procedimento e ficar digerido que simplifica a jusante aplicações, desde que não há procedimentos de enriquecimento adicionais são necessários.
Existem várias etapas críticas no âmbito do presente protocolo. O primeiro é para evitar qualquer contaminação durante o processo de isolamento, uma vez que pode levar a uma diminuição do número de células obtidas e pode impedir qualquer aplicações a jusante. Um dos passos cruciais é a excisão dos testículos onde a contaminação bacteriana pode ocorrer de danificado coragem (portanto é melhor para não ferir ou remover completamente os intestinos) ou da pele se usando a mesma ferramenta de dissecação para cortar a pele e remover a testículos. Em segundo lugar, cuide quando fixando testículos para a agulha de acupuntura, já que é possível que os testículos caiam ou escorregar. Atualmente, estamos testando diferentes métodos para impedir que os testículos do deslizamento durante o processo de vitrificação (temperaturas de nitrogênio líquido). Em terceiro lugar, preste atenção para o período de exposição para os crioprotectores. Exposição dos testículos (e, portanto, células) para altas concentrações crioprotetoras (especialmente na solução de vitrificação) por muito tempo pode levar a morte celular, devido à toxicidade crioprotetoras. Além disso, tome cuidado ao mergulhar as agulhas no nitrogênio líquido; Limpe o excesso de VS, uma vez que pode afetar o processo de arrefecimento e espetar as agulhas rapidamente para evitar a exposição ao vapor de nitrogênio líquido. Por último, transferi os testículos de nitrogênio líquido para a mídia aquecimento rapidamente para evitar aquecimento prematuro no ar durante a transferência.
No presente trabalho, apresentamos o procedimento para a criopreservação de testículos pertencentes a cinco estirpes de zebrafish usando MeOH, PG e Me2assim como permeando crioprotectores. O método produz resultados confiáveis para todas as cepas testadas zebrafish com uma viabilidade celular de acima de 50%. É possível usar esse método com modificações para as outras espécies, também. Em primeiro lugar, cada protocolo de criopreservação é espécie específica, e crioprotectores diferentes produzem diferentes eficiências em espécies diferentes (ou seja, o glicol de etileno rendeu a maior viabilidade em acipenserids18 enquanto Me2então rendeu a maior viabilidade em salmonídeos19 e ciprinídeos17). Além disso deve-se prestar atenção para as concentrações utilizadas também. O presente estudo e o estudo realizado com trutas Salmo trutta ovários15 demonstram que os melhores resultados são obtidos usando a mesma concentração de dois crioprotectores, porém isto pode variar em outras espécies. Por último, zebrafish testículos são muito pequenos, e é até possível culpar vários testículos de uma agulha. Quando se trabalha com espécies com maiores testículos, o tamanho das partes nos testículos, que são usados é um fator muito importante. Nós sugerimos para aumentar os tempos de exposição para pedaços maiores de tecido levando em conta crioprotetoras toxicidade e eficiência.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este estudo foi suportado pelo nacionais de investigação, desenvolvimento e inovação escritório da Hungria (grant 116912 ÁH), o escritório de custo (alimentação e agricultura custo ação FA1205: AQUAGAMETE), o programa de bolsas do Hungaricum (grant para ZM) e o novo Húngara nacional excelência Predoctoral Fellowship (grant Para EK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leibovitz media (L-15) | Sigma-Aldrich | L1518 | Supplemented with L-glutamine |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Sucrose | Acros Organics | 57-50-1 | |
| Trehalose | Acros Organics | 99-20-7 | Dihydrate |
| Methanol | Reanal | 20740-0-08-65 | |
| Propylene glycol | Reanal | 08860-1-08-65 | |
| Dimethyl sulfoxide | Reanal | 00190-1-01-65 | |
| Collagenase | Gibco | 9001-12-1 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T8003 | |
| DNase I | Panreac AppliChem | A3778 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T6146 | |
| Phospate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | Tablets for preparation of 200 ml PBS solution |
References
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