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Biology

Cryopreservation Zebrafish Spermatogonia के पूरे testes सुई द्वारा अल्ट्रा तेजी से ठंडा डूबे

Published: March 4, 2018 doi: 10.3791/56118
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Aquaculture, Szent István University

Summary

इस अध्ययन का मुख्य उद्देश्य सुई डूबकर vitrification (एनआईवी) प्रक्रिया को cryopreserve पूरे zebrafish tests को ढालने का था. इसके अतिरिक्त, पांच अलग zebrafish उपभेदों में विधि की पुनरावृत्ति का परीक्षण किया गया ।

Abstract

विज्ञान और जैव प्रौद्योगिकी के वर्तमान रुझानों मॉडल जीवों में नई लाइनों के हजारों के निर्माण के लिए सीसा जिससे प्रजनन कालोनियों रखने के आम प्रथाओं से परे आनुवंशिक संसाधनों के सुरक्षित भंडारण के लिए नए तरीकों के लिए आवश्यकता के लिए अग्रणी । इस अध्ययन का मुख्य उद्देश्य सुई डूबकर vitrification (एनआईवी) प्रक्रिया को cryopreserve पूरे zebrafish tests को ढालने का था. Cryopreservation पूरे testes एनआईवी द्वारा प्रारंभिक चरण रोगाणु कोशिकाओं के zebrafish आनुवंशिक संसाधनों के भंडारण के लिए संभावनाएं प्रदान करता है, विशेष रूप से प्रत्यारोपण के बाद से वे दोनों पुरुष और महिला gametes में परिपक्व कर सकते हैं । testes, एक एक्यूपंक्चर सुई पर टिकी थी, दो cryoprotective मीडिया में equilibrated (equilibration समाधान युक्त १.५ एम मेथनॉल और १.५ एम propylene ग्लाइकोल; और vitrification समाधान युक्त 3 एम dimethyl sulfoxide और 3 एम propylene ग्लाइकोल) और तरल नाइट्रोजन में डूब गया । नमूने तीन फलस्वरूप वार्मिंग समाधान की एक श्रृंखला में गर्म थे । इस तकनीक का मुख्य लाभ कर रहे है (1) गर्म परीक्षण के पाचन के बाद शुक्राणु की कमी इस प्रकार बहाव जोड़तोड़ की सुविधा; (2) अल्ट्रा तेजी से ठंडा ऊतकों के इष्टतम जोखिम को सक्षम करने तरल नाइट्रोजन इसलिए अधिकतम ठंडा और cryoprotectants की आवश्यकता एकाग्रता को कम करने, जिससे उनके विषाक्तता को कम करने; (3) cryoprotectants और तरल नाइट्रोजन के लिए कई परीक्षण के तुल्यकालिक एक्सपोजर; और (4) पांच अलग zebrafish उपभेदों में ५०% से ऊपर की व्यवहार्यता प्राप्त करने के द्वारा प्रदर्शन दोहराया ।

Introduction

उपंयास विज्ञान और जैव प्रौद्योगिकी के रुझान में चूहों के नए उत्परिवर्ती लाइनों के हजारों के निर्माण के लिए नेतृत्व किया है, Drosophila, zebrafish और अंय जैव चिकित्सा और अंय विज्ञान में मॉडल जीवों के रूप में इस्तेमाल किया प्रजातियों1। इसके अलावा, नई प्रौद्योगिकियों के रूप में विकसित कर रहे है और उपलब्ध हो, उत्परिवर्ती लाइनों की संख्या में तेजी से2वृद्धि हुई है । इससे प्रजनन कॉलोनियों को रखने की आम पद्धतियों से परे आनुवांशिक संसाधनों के सुरक्षित भंडारण की आवश्यकता होती है. एक विधि है जो समय की एक अनिश्चित अवधि के लिए आनुवंशिक संसाधनों के सुरक्षित भंडारण में सक्षम बनाता है के रूप में, cryopreservation प्रजनन के मौसम के विस्तार के रूप में कई फायदे प्रदान करता है, ब्रुडस् टॉक का के सतत रखरखाव के लिए की जरूरत को दरकिनार, और यह अधिक लागत है और श्रम-कुशल2.

पिछले कई वर्षों के दौरान विकसित शुक्राणु cryopreservation के लिए प्रोटोकॉल2,3,4 zebrafish पुरुष आनुवंशिक सामग्री के सफल भंडारण के लिए अवसर प्रदान करते हैं । हालांकि, अंडे या मछलियों में भ्रूण की cryopreservation उनकी जटिल संरचना और बड़ी मात्रा में जर्दी सामग्री के कारण अभी तक संभव नहीं है । हाल ही में, मौलिक रोगाणु कोशिकाओं (PGCs) या spermatogonial स्टेम सेल (एसएससी) के प्रत्यारोपण के अभ्यास कार्यात्मक शुक्राणु और प्रत्यारोपण के बाद अंडे में विकसित करके इस बाधा को बाईपास5प्रदान करता है । इसलिए, एसएससी के cryopreservation दुर्लभ और मूल्यवान आनुवंशिक संसाधनों के संरक्षण में एक नई सीमा प्रदान करता है ।

हालांकि cryopreservation कई फायदे प्रदान करता है, धीमी गति से दर ठंड प्रक्रिया कई स्थितियों है कि कोशिका क्षति के लिए नेतृत्व कर सकते है उत्पंन करता है2। इनमें intracellular और extracellular बर्फ गठन, निर्जलीकरण, cryoprotectant विषाक्तता और अन्य शामिल हैं । Intracellular बर्फ नुकसान कोशिकाओं, extracellular बर्फ कोशिकाओं के यांत्रिक कुचलने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, जबकि धीमी दर ठंड के दौरान कोशिकाओं से पानी प्रसार निर्जलीकरण6के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. हाल ही में, एक तकनीक है जो बर्फ गठन के नकारात्मक प्रभाव को रोकता है के रूप में vitrification मछली gametes7,8,9के cryopreservation में लागू किया गया है । यह एक अल्ट्रा तेजी से ठंडा तकनीक प्रस्तुत करता है जिसके माध्यम से आंतरिक और बाहरी मीडिया बर्फ7,10में crystalizing बिना एक अमली/ वृषण और डिंबग्रंथि के ऊतकों के सफल vitrification एवियन और स्तनधारी प्रजातियों में सबूत दिया गया है10,11,12, इस प्रकार मछली में अपने आवेदन के लिए संभावनाओं को खोलने, के रूप में अच्छी तरह से ।

इस अध्ययन में, हम पूरे zebrafish testes के cryopreservation के लिए सुई डूबे vitrification (एनआईवी) प्रक्रिया प्रस्तुत करते हैं । हम संदूषण के बिना zebrafish प्रारंभिक चरण रोगाणु कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक विश्वसनीय तरीका है और एक cryopreservation प्रक्रिया है कि अंय कोशिकाओं, विशेष रूप से शुक्राणु की एक कम उपस्थिति के साथ प्रारंभिक चरण रोगाणु कोशिकाओं के अपेक्षाकृत उच्च मात्रा में पैदावार का प्रदर्शन । हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, यह पहली अध्ययन है अल्ट्रा के लिए एक विस्तृत visualized प्रोटोकॉल प्रदर्शित करने के लिए मछली जननांगों ऊतक और zebrafish germline कोशिकाओं के तेजी से ठंडा । इसके अतिरिक्त, विधि की पुनरावृत्ति पांच अलग zebrafish उपभेदों में प्रदर्शन किया है: अब जंगली प्रकार, कैस्पर (रॉय-/ nacre-/-), तेंदुआ (लियोt1/t1), वासा [टीजी (वॉज:: eGFP)] और Wilms ट्यूमर [टीजी (wt1b:: eGFP 1)] ट्रांसजेनिक लाइन ।

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Protocol

यहां वर्णित सभी विधियां हंगेरियन पशु कल्याण कानून द्वारा अनुमोदित की गई हैं ।

1. रिएजेंट तैयारी

  1. स्टॉक समाधान
    1. 1 मीटर trehalose को trehalose डाईहाइड्रेट के 1 एमएल डीएच2O में जोड़कर तैयार करें । अच्छी तरह मिक्स जब तक यह पूरी तरह से घुल ।
    2. 1 मीटर सुक्रोज को सुक्रोज की 1 मिलीलीटर डीएच2O में जोड़कर तैयार करें । अच्छी तरह मिक्स जब तक यह पूरी तरह से घुल ।
    3. 1 मीटर HEPES को HEPES के ०.२३८ g को जोड़कर तैयार करें डीएच2O का 1 मि. लि. अच्छी तरह से मिक्स जब तक यह पूरी तरह से घुल ।
    4. 20 मिलीग्राम/एमएल collagenase (२९० U/मिलीग्राम) जोड़कर १०० मिलीग्राम पंजाब के 5 मिलीलीटर के लिए तैयार । अच्छी तरह से मिश्रण जब तक यह घुल । ०.२ µm फिल्टर के माध्यम से बाँझ फिल्टर. Aliquot ५० µ एल में ०.२ मिलीलीटर पीसीआर ट्यूबों और फ्रीज में-20 डिग्री सेल्सियस ।
    5. 15 मिलीग्राम/एमएल trypsin (~ १०००० U/mg) को जोड़कर ७५ mg के 5 मिलीलीटर तक तैयार करें । अच्छी तरह से मिश्रण जब तक यह घुल । ०.२ µm फिल्टर के माध्यम से बाँझ फिल्टर. Aliquot ५० µ एल में ०.२ मिलीलीटर पीसीआर ट्यूबों और फ्रीज में-20 डिग्री सेल्सियस ।
    6. 1 मिलीग्राम/एमएल DNase मैं (~ ३००० U/mg) 5 मिलीग्राम जोड़कर पंजाब के 5 मिलीलीटर के लिए तैयार करें । अच्छी तरह से मिश्रण जब तक यह घुल । ०.२ µm फिल्टर के माध्यम से बाँझ फिल्टर. Aliquot ५० µ एल में ०.२ मिलीलीटर पीसीआर ट्यूबों और फ्रीज में-20 डिग्री सेल्सियस ।
    7. trypan नीले रंग की 10 मिलीलीटर के लिए ४० मिलीग्राम जोड़कर ०.४% trypan ब्लू तैयार करें । ०.२ µm फिल्टर के माध्यम से बाँझ फिल्टर. Aliquot 1 मिलीलीटर में १.५ मिलीलीटर ट्यूबों ।
    8. तैयार २०० मिलीग्राम/l ms-२२२ (Tricaine मीथेन sulfonate) जोड़कर २०० मिलीग्राम MS-२२२ के 1 L में डीएच2. अच्छी तरह से मिश्रण जब तक यह पूरी तरह से घुल । इसके अतिरिक्त, ७.० के एक तटस्थ पीएच के लिए सोडियम बिकारबोनिट के साथ MS-२२२ समाधान बफर ।
  2. vitrification के लिए समाधान
    1. तैयार Equilibration समाधान (es): मिश्रण से es के 2 मिलीलीटर तैयार १२१.५ µ L of मेथनॉल (MeOH; १.५ M), २२० µ l के propylene ग्लाइकोल (PG; १.५ मीटर), २०० µ l के FBS (10%), २०० µ l के trehalose स्टॉक सॉल्यूशन (०.१ M), ५० µ l के HEPES शेयर सॉल्यूशन (25 मि.) और १२०८.५ µ l के l-15 में एक 2 एमएल ट्यूब ।
    2. तैयार Vitrification समाधान (बनाम): (3 एम) स्नातकोत्तर के ४३९ µ एल मिश्रण से बनाम के 2 मिलीलीटर तैयार, ४२६ µ l के dimethyl sulfoxide (मुझे2सू; 3 M), २०० µ l के FBS (10%), २०० µ l के trehalose स्टॉक सॉल्यूशन (०.१ M), ५० µ l के HEPES शेयर सॉल्यूशन (25 मि.) और ६८५ µ एल के एल-15 ए में 2 मिलीलीटर ट्यूब ।
  3. वार्मिंग के लिए समाधान
    1. वार्मिंग समाधान तैयार करें 1 (WS1): १.५ मिलीलीटर की WS1 को 2 मिलीलीटर ट्यूब में मिलाकर तैयार कर लें १५० µ l के FBS (10%), ४५० µ l के सुक्रोज स्टॉक सॉल्यूशन (3 M) और l-15 के ९०० µ l
    2. तैयार वार्मिंग समाधान 2 (WS2): १.५ मिलीलीटर की एक 2 मिलीलीटर ट्यूब में WS2 के १५० µ एल मिश्रण द्वारा तैयार FBS (10%), १५० µ एल के सुक्रोज स्टॉक समाधान (1 एम) और एल के १२०० µ l-15 ।
    3. तैयार वार्मिंग समाधान 3 (WS3): एक 2 मिलीलीटर ट्यूब में WS2 के १.५ मिलीलीटर को मिलाकर तैयार १५० µ l FBS (10%) और l-15 के १३५० µ l ।
  4. पाचन समाधान तैयार करें: प्रत्येक नमूने के लिए तैयार ५०० µ एल मिश्रण द्वारा पाचन समाधान के ५० µ l के collagenase स्टॉक समाधान (2 mg/५० µ l के trypsin स्टॉक समाधान (१.५ mg/एमएल), 10 µ l की DNase I (20 µ g/एमएल) और ३९० µ l के एल-15 ए 2 एमएल ट्यूब में ।
  5. विच्छेदन उपकरण प्राप्त करें: कैंची, microscissors, चिमटी, घुमावदार चिमटी, और एक्यूपंक्चर सुइयों ।

2. testes संग्रह

  1. यह एक डिश में रखकर मछली Euthanize से युक्त २०० मिलीग्राम/L MS-२२२ (pH = 7) । विच्छेदन के साथ जारी रखने से पहले, सुनिश्चित करें कि गिल चलती बंद कर दिया है और कि कम से कम 10 मिनट है कि पल के बाद से हाइपोक्सिया द्वारा मौत सुनिश्चित करने के लिए पारित कर दिया है ।
  2. यह एक कागज तौलिया पर ठोक और यह एक विच्छेदन चटाई पर अपने पृष्ठीय पक्ष पर जगह से मछली सूखी ।
    1. सबसे पहले आसान विच्छेदन के लिए श्रोणि और कवच पंख काट ।
    2. क्षैतिज कवच पंख के बीच मछली के पेट पर त्वचा गोली चलाना और गुदा पंख तक पेट के साथ त्वचा और अंतर्निहित मांसपेशी में कटौती ।
    3. मछली के शरीर गुहा खोलें और सुई के साथ विच्छेदन चटाई को छोड़ दिया और सही शरीर की दीवार पिन ।
      नोट: परीक्षण के ऊपर स्थित है जठरांत्र अंगों के दोनों किनारों पर तैराकी मूत्राशय (चित्र 1) ।
  3. संक्रमण को रोकने के लिए, बाहर जठरांत्र अंगों ले नहीं है, लेकिन धीरे उंहें एक तरफ धक्का और विरोध पक्ष से वृषण हटा दें । testes शरीर की दीवार से जुड़े हुए है तो उंहें ध्यान से हटाने और microscissors द्वारा जोड़ने के लिए आँख काट रहे हैं ।
  4. इसके अतिरिक्त, आदेश में संक्रमण को रोकने के लिए, सबसे पहले उंहें 2 एस के लिए ७०% इथेनॉल में डाल द्वारा परीक्षण निष्फल, और फिर उंहें एल में एक ९६-बर्फ पर अच्छी तरह से थाली में जगह 15 ।
    नोट: यह आवश्यक है, तो stereomicroscope के तहत ठीक फैटी ऊतक और बड़े रक्त वाहिकाओं से साफ परीक्षण

3. अल्ट्रा-वृषण ऊतक के तेजी से ठंडा

  1. नमूना प्रकार के आधार पर उचित लेबल के साथ सुइयों को चिह्नित करें और equilibration (ES) और vitrification समाधान (VS) तैयार करें ।
  2. एक बड़ी अच्छी तरह से थाली या पकवान और पिन करने के लिए परीक्षण हस्तांतरण दो तीन परीक्षण (या सुई के आकार पर निर्भर करता है) एक बाँझ एक्यूपंक्चर सुई पर.
    1. सबसे पहले घुमावदार चिमटी के शीर्ष पर वृषण की स्थिति । वृषण के बीच में सुई की बात रखें और ध्यान से चिमटी के साथ ऊपर की ओर वृषण खींच ।
    2. वृषण puncturing के बाद, धीरे सुई के शीर्ष की ओर ऊपर की तरफ खींच । सुनिश्चित करें कि परीक्षण एक दूसरे से अलग कर रहे है और कि वे गिर नहीं कर रहे है या नीचे फिसलने ।
    3. vitrification (25 ˚ सी पर, भंडारण समय 1 एच से अधिक नहीं होना चाहिए) L-15 से भर में एक 2 मिलीलीटर ट्यूब में टिकी testes के साथ सुई प्लेस ।
      नोट: सुई पर परीक्षण लगाए तेजी से बाहर सुखाने से परीक्षण को रोकने के लिए किया जाना चाहिए ।
  3. equilibration समाधान में परीक्षण के साथ सुई हस्तांतरण और 5 मिनट के लिए 25 ˚ सी में मशीन ।
  4. vitrification समाधान में सुई हस्तांतरण और 30 एस के लिए 25 ˚ सी में मशीन ।
  5. vitrification समाधान से सुई निकालें, जल्दी और धीरे से एक बाँझ कागज तौलिया द्वारा ऊतक से शेष समाधान को अवशोषित. सावधानी का प्रयोग करें परीक्षण कागज तौलिया से चिपके या गिरने से बचने के लिए ।
  6. जल्दी से एक स्टायरोफोम बॉक्स में रखा तरल नाइट्रोजन में सुई जगह है ।
    नोट: तरल नाइट्रोजन वाष्प के लिए ऊतक के जोखिम से बचने के लिए जल्दी से इस कदम है । तरल नाइट्रोजन की कम मात्रा का उपयोग करने के लिए नमूने के पार संदूषण को रोकने के ।
  7. एक बंद स्टायरोफोम बॉक्स में तरल नाइट्रोजन में सुई 5-10 मिनट के लिए रखें ।
  8. एक ही बॉक्स में एक खोला ४.५ मिलीलीटर cryotube और इसकी टोपी शांत ।
  9. 5-10 मिनट के बाद, तरल नाइट्रोजन की सतह के नीचे एक अलग cryotube में प्रत्येक सुई हस्तांतरण और cryotube बंद करो ।
    चेतावनी: हमेशा सुरक्षात्मक कपड़ों (जैसे अछूता दस्ताने के रूप में) का उपयोग करें जब जोखिम के रूप में तरल नाइट्रोजन के साथ काम कर गंभीर शीतदंश के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।
  10. एक धातु बेंत पर cryotube प्लेस और यह cryobank कनस्तर में जितनी जल्दी हो सके जगह है । आगे उपयोग तक एक कनस्तर भंडारण देवर में नमूनों की दुकान ।

4. वार्मिंग की प्रक्रिया

  1. प्रत्येक सुई अलग से गर्म । सभी वार्मिंग समाधान 25 डिग्री सेल्सियस पर होना चाहिए ।
  2. धातु बेंत से अलग cryotube और यह एक स्टायरोफोम बॉक्स में संग्रहीत तरल नाइट्रोजन में डुबकी ।
  3. cryotube को तरल नाइट्रोजन वाष्प (संदंश का प्रयोग करके) में खोलें और सुई को तरल नाइट्रोजन में छोड़ें ।
  4. पहले वार्मिंग समाधान में बहुत तेजी से सुई हस्तांतरण और 1 मिनट (25 डिग्री सेल्सियस से कम) के लिए मशीन । हस्तांतरण के दौरान हवा में अपनी वार्मिंग को रोकने के लिए जल्दी से सुई हस्तांतरण करने के लिए सुनिश्चित करें ।
  5. दूसरा वार्मिंग समाधान में सुई स्थानांतरण और 3 मिनट (25 डिग्री सेल्सियस से कम) के लिए मशीन ।
  6. तीसरे वार्मिंग समाधान में सुई स्थानांतरण और 5 मिनट के लिए मशीन (25 डिग्री सेल्सियस) ।
  7. उन्हें घुमावदार चिमटी के साथ नीचे फिसलने से सुई से परीक्षण जारी. प्रत्येक गरम वृषण अलग-अलग अच्छी तरह से (९६-well प्लेट) से भरा एल के २५० µ एल-15 10% FBS के साथ पूरक में जगह है । सुनिश्चित करें कि कुओं नमूने के अनुसार लेबल कर रहे हैं । बर्फ पर अच्छी तरह से प्लेट रखें जब तक सभी नमूनों गर्म और आगे काम कर रहे हैं ।

5. ऊतक पाचन

  1. अलग 2 मिलीलीटर ट्यूबों में प्रत्येक नमूने के लिए पृथक्करण समाधान के ५०० µ एल तैयार करें । लेबल ट्यूबों नमूने के कोड के अनुसार । कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए तैयार पृथक्करण समाधान मशीन ।
  2. पाचन समाधान में गर्म ऊतक जोड़ें और छोटे कैंची के कम से कम 30 आंदोलनों से छोटे टुकड़ों में कटौती ।
  3. 25 ˚ सी में ९० मिनट के लिए एक मिलाते हुए प्लेट पर कट ऊतक मशीन
  4. FBS (10% FBS v/v) के l-15 और १०० µ l के ४०० µ l को जोड़कर पाचन प्रक्रिया रोकें । संक्षेप में समाधान हिला और कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए मशीन ।
  5. प्राप्त समाधान ५० µm फ़िल्टर के माध्यम से एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में फ़िल्टर । लेबल ट्यूबों तदनुसार ।
  6. २०० पर फ़िल्टर समाधान केंद्रापसारक × 25 ˚ सी में 10 मिनट के लिए जी
  7. ध्यान से supernatant को दूर करने और 10% FBS के साथ पूरक L15 के 20 µ एल में गोली reसस्पेंड । मैंयुअल रूप से ट्यूब हिला जब तक गोली पूरी तरह से भंग है । आगे उपयोग होने तक बर्फ पर या 4 ˚ सी पर सेल सस्पेंशन रखें ।

6. व्यवहार्यता मूल्यांकन और सेल गिनती

  1. एक उचित लेबल ०.२ एमएल पीसीआर ट्यूब में ०.४% trypan ब्लू सॉल्यूशन के सेल सस्पेंशन और 5 µ l के 5 µ l को मिलाएं । यदि विभिंन संस्करणों का उपयोग किया जाता है, सुनिश्चित करें कि 1:1 के कमजोर पड़ने अनुपात रहता है ।
  2. कमरे के तापमान (25 डिग्री सेल्सियस) पर 1 से 3 मिनट के लिए इस निलंबन की मशीन ।
  3. माइक्रोस्कोप के तहत एक hemocytometer में प्रत्येक नमूने की व्यवहार्यता की जाँच करें ।
  4. 15 क्षेत्रों में जीवित कोशिकाओं की संख्या (trypan नीले रंग से दाग) की गणना । सेल निलंबन के 20 µm में कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना । निलंबन अब किसी भी बहाव आवेदन के लिए तैयार है ।
    नोट: जब बड़े शरीर के आकार के साथ अंय प्रजातियों के लिए प्रक्रिया का अनुकूलन, समान वजन के वृषण टुकड़े का उपयोग करें । परिणामों में व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता से बचने के लिए सभी प्रायोगिक समूहों के लिए एक व्यक्ति से परीक्षण का उपयोग करें । zebrafish के मामले में, हम तथ्य यह है कि वाम और सही वृषण एक बराबर (या बहुत समान) रोगाणु कोशिकाओं की संख्या13 (प्रतिनिधि परिणाम देखें) शामिल होना चाहिए का लाभ लिया । बाईं वृषण को नियंत्रण के रूप में रखा गया था जबकि सही वृषण vitrified/ व्यवहार्यता प्रतिशत vitrified/उष्ण वृषण से अलग कक्षों की संख्या ताज़ा वृषण से पृथक की गई कक्षों की तुलना में परिकलित की गई थी ।

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Representative Results

औसत पर, प्रारंभिक चरण रोगाणु कोशिकाओं की संख्या एक ताजा zebrafish वृषण से अलग मछली के आकार के आधार पर ४०,००० और २००,००० कोशिकाओं के बीच विविध । जब सभी 5 उपभेदों में ताजा zebrafish परीक्षण पचा, जल्दी रोगाणु कोशिकाओं को केवल सेल निलंबन में मौजूद कोशिकाओं नहीं थे (चित्रा 2) । प्रारंभिक चरण रोगाणु कोशिकाओं के बगल में, कई शुक्राणु के रूप में अच्छी तरह से पाए गए । दूसरी ओर, वहां cryopreserved testes के पाचन के बाद अब तक कम शुक्राणु थे । यह संकेत दिया कि शुक्राणु इस अल्ट्रा तेजी से ठंडा प्रोटोकॉल जीवित नहीं है, और है कि वे सबसे पाचन प्रक्रिया है, जो जल्दी चरण रोगाणु कोशिकाओं के एक बहुत क्लीनर निलंबन पैदावार के दौरान समाप्त होने की संभावना है ।

बाएं और दाएं परीक्षण के बीच प्रारंभिक चरण रोगाणु कोशिकाओं की संख्या में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं थे (1 ± ०.५ × 105 बनाम १.१ ± ०.७ × 105) एक एकल व्यक्ति के तीन एबी zebrafish नर के ताजा परीक्षण को पचाने के द्वारा प्रदर्शन किया (एक तरह से ANOVA ; च (1, 4) = ०.०४, p = ०.८५) । इस अध्ययन में प्रयुक्त सभी zebrafish लाइनों में, वर्तमान अल्ट्रा तेजी से ठंडा प्रोटोकॉल औसत व्यवहार्यता दर ५०% (तालिका 1) से अधिक उपज ।

अब जंगली प्रकार कैस्पर तेंदुए वासा ट्रांसजेनिक Wilms ट्यूमर ट्रांसजेनिक
लाइव कोशिकाओं की संख्या (× 104) ताजा वृषण १४.५ ± ३.९ ९.५ ± २.३ १२.७ ± २.४ १४.५ ± ५.६ ४.८ ± १.८
Vitrified वृषण ८.७ ± २.८ ७.२ ± ३.० ८.८ ± १.७ ७.६ ± ३.७ २.४ ± ०.७
व्यवहार्यता (%) ५८ ± 9 ७२ ± 13 ६९ ± 1 ५० ± 6 ५३ ± 13

तालिका 1. जीवित कोशिकाओं और व्यवहार्यता प्रतिशत की संख्या (मतलब ± एसडी) ताजा या vitrified/गरम zebrafish वृषण से प्राप्त की । परिणाम पांच परीक्षण zebrafish लाइनों के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं: अब जंगली प्रकार, कैस्पर (रॉय-/ nacre-/-), तेंदुआ (लियोt1/t1), वासा [टीजी (वॉज:: eGFP)] और Wilms ट्यूमर [टीजी (wt1b:: eGFP 1)] ट्रांसजेनिक लाइन ।

Figure 1
चित्र 1। विच्छेदित वयस्क zebrafish विभिंन संरचनात्मक संरचनाओं की स्थिति का प्रदर्शन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2। कोशिकाओं के निलंबन से तैयार ताजा और vitrified/गर्म zebrafish वृषण ऊतक से पांच परीक्षण zebrafish लाइनों (अब जंगली प्रकार, कैस्पर (रॉय-/ nacre-/तेंदुए (लियोt1/), वासा [टीजी (वॉज:: eGFP)] और Wilms ट्यूमर [टीजी (wt1b:: eGFP 1)] ट्रांसजेनिक रेखा) चरण-कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी के साथ imaged । स्केल बार: ४० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

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Discussion

इस अध्ययन का मुख्य उद्देश्य था सुई में डूबे अल्ट्रा तेजी से शीतलन एवियन और स्तनधारी प्रजातियों के लिए विकसित की प्रक्रिया10,11,12 मछली वृषण के cryopreservation के लिए (एक मॉडल के रूप में zebrafish जीव) । zebrafish आनुवंशिक संसाधनों के cryopreservation के बारे में पिछले अध्ययनों के अधिकांश मुख्य रूप से zebrafish शुक्राणु2,3,4के cryopreservation पर ध्यान केंद्रित किया गया । हालांकि, परिपक्व अंडाणुओं और भ्रूण के cryopreservation के लिए प्रोटोकॉल अभी तक विकसित नहीं किया गया है, हालांकि कुछ हाल के अध्ययनों का प्रदर्शन है कि प्रारंभिक चरण अंडाणुओं के cryopreservation14,15प्रशंसनीय है । इस अध्ययन में हम zebrafish spermatogonia के सफल cryopreservation जो बहुमूल्य आनुवंशिक संसाधनों के भंडारण के लिए नई संभावनाएं प्रदान करता है, विशेष रूप से ट्रांसप्लांटेशन के बाद से वे दोनों पुरुष और महिला gametes में परिपक्व कर सकते है का प्रदर्शन किया5 .

हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, इस एनआईवी विधि द्वारा zebrafish ऊतक के अल्ट्रा तेजी से ठंडा करने के साथ निपटने के पहले अध्ययन है । इसी तरह के अध्ययनों में ०.२५ एमएल प्लास्टिक स्ट्रॉस16 और बंद धातु कंटेनरों में zebrafish अंडाशय के vitrification14zebrafish testes के vitrification शामिल थे । एनआईवी का मुख्य लाभ दो उल्लेख कंटेनरों की तुलना में परीक्षण के प्रत्यक्ष जोखिम है cryoprotectants की ंयूनतम मात्रा के साथ तरल नाइट्रोजन उंहें संलग्न किया जा रहा है, इसलिए ठंडा करने की दर10अधिकतम । ठंडा करने की दर में वृद्धि cryoprotectants की आवश्यकता एकाग्रता कम कर देता है, जिससे उनके विषाक्तता को कम करने । इसके अलावा, सभी ऊतक टुकड़े cryoprotectants और तरल नाइट्रोजन तुल्यकालिक को उजागर किया जा सकता है । हालांकि, तरल नाइट्रोजन के लिए प्रत्यक्ष जोखिम पार संदूषण के संबंध में एक नुकसान हो सकता है । यह संभव है कि बैक्टीरिया या वायरस तरल नाइट्रोजन में मौजूद हैं और है कि प्रत्यक्ष ऊतक जोखिम दूषण के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. इसलिए, हम एनआईवी का आयोजन करते समय तरल नाइट्रोजन का उपयोग करने और ठंडा करने के बाद इस्तेमाल किया तरल नाइट्रोजन को त्यागने से बचना करने के लिए सुझाव देते हैं । प्रस्तावित धातु कंटेनरों इस संबंध में लाभ की पेशकश14, लेकिन वे कस्टम बनाया गया है और आसानी से सभी प्रयोगशालाओं के लिए सुलभ नहीं हैं ।

जब अल्ट्रा की तुलना तेजी से ठंडा करने की दर ठंड, अति तेजी से ठंडा करने का एक महत्वपूर्ण लाभ पाचन के बाद शुक्राणु के अभाव है । धीमी गति से दर ठंड के तरीके कुछ cyprinid मछली प्रजातियों में प्रदर्शन किया है कि इसी तरह के प्रोटोकॉल दोनों प्रारंभिक चरण रोगाणु कोशिकाओं और शुक्राणु के तुलनीय व्यवहार्यता उपज17 cryopreserved के पाचन के बाद उच्च शुक्राणु संख्या में जिसके परिणामस्वरूप ऊतक. zebrafish में हमारे परिणाम (वर्तमान अध्ययन), आम कार्प और सुनहरी (अप्रकाशित परिणाम) संकेत मिलता है कि गर्म ऊतकों के पाचन के बाद बहुत कुछ शुक्राणु हैं और वे इस प्रक्रिया को जीवित नहीं है और जो बहाव को सरल करता है पच आवेदन के बाद से कोई अतिरिक्त संवर्धन प्रक्रियाओं की जरूरत है ।

इस प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण चरण हैं । पहले यह प्राप्त कोशिकाओं की संख्या में कमी करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं और किसी भी बहाव अनुप्रयोगों बाधा हो सकती है, क्योंकि अलगाव की प्रक्रिया के दौरान किसी भी संक्रमण को रोकने के लिए है । महत्वपूर्ण कदम का एक परीक्षण के उत्पाद है जहां बैक्टीरियल संदूषण क्षतिग्रस्त हिंमत से हो सकता है (इसलिए यह सबसे अच्छा नहीं है या घायल पूरी तरह से आंतों को दूर) या त्वचा से अगर त्वचा काटने और हटाने के लिए एक ही विच्छेदन उपकरण का उपयोग वृषण. दूसरे, जब यह संभव है कि परीक्षण बंद गिर या नीचे स्लाइड के बाद से एक्यूपंक्चर सुई के लिए रख tests ध्यान रखना । वर्तमान में, हम vitrification प्रक्रिया (तरल नाइट्रोजन तापमान) के दौरान फिसलने से परीक्षण को रोकने के लिए विभिन्न तरीकों का परीक्षण कर रहे हैं । तीसरा, cryoprotectants के लिए जोखिम की अवधि के लिए ध्यान देना । परीक्षण के एक्सपोजर (और इस प्रकार कोशिकाओं) उच्च cryoprotectant सांद्रता के लिए (विशेष रूप से vitrification समाधान में) भी लंबे समय के लिए कोशिका cryoprotectant विषाक्तता के कारण मौत के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इसके अलावा, जब तरल नाइट्रोजन में सुई डूबनेवाला ध्यान रखना; के बाद से यह ठंडा करने की प्रक्रिया को प्रभावित और जल्दी सुइयों डुबकी के लिए तरल नाइट्रोजन भाप के लिए जोखिम से बचने के लिए कर सकते है बनाम से अधिक पोंछें । अंत में, तरल नाइट्रोजन से वार्मिंग मीडिया में परीक्षण जल्दी स्थानांतरण के लिए हवा में समयपूर्व वार्मिंग से बचने के लिए स्थानांतरण के दौरान ।

वर्तमान समाचार पत्र में हम MeOH, स्नातकोत्तर और मुझे2के रूप में तो permeating cryoprotectants का उपयोग करके पांच zebrafish उपभेदों से परीक्षण के cryopreservation के लिए प्रक्रिया प्रस्तुत करते हैं । विधि ५०% से ऊपर के एक सेल व्यवहार्यता के साथ सभी परीक्षण zebrafish उपभेदों के लिए विश्वसनीय परिणाम पैदावार । यह अन्य प्रजातियों के लिए संशोधनों के साथ इस विधि का उपयोग करने के लिए संभव है, के रूप में अच्छी तरह से. सबसे पहले, प्रत्येक cryopreservation प्रोटोकॉल प्रजातियों विशिष्ट है, और विभिंन cryoprotectants विभिंन प्रजातियों में अलग क्षमता उपज (यानी ईथीलीन ग्लाइकोल acipenserids में उच्चतम व्यवहार्यता18 झुकेंगे, जबकि मुझे2तो salmonids19 और cyprinids17) में उच्चतम व्यवहार्यता उपज । इसके अलावा ध्यान के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया सांद्रता के लिए दिया जाना चाहिए । वर्तमान अध्ययन और ब्राउन ट्राउट Salmo trutta अंडाशय15 पर किए गए अध्ययन का प्रदर्शन है कि सबसे अच्छा परिणाम दो cryoprotectants की एक ही एकाग्रता का उपयोग करके प्राप्त कर रहे हैं, लेकिन यह अन्य प्रजातियों में भिन्न हो सकते हैं. अंत में, zebrafish testes बहुत छोटे हैं, और यह भी एक सुई पर कई परीक्षण पिन करने के लिए संभव है. बड़ा परीक्षण के साथ प्रजातियों के साथ काम करते हैं, इस्तेमाल किया जाता है जो वृषण टुकड़े का आकार एक बहुत ही महत्वपूर्ण कारक है । हम बड़े ऊतक cryoprotectant विषाक्तता और दक्षता खाते में लेने के टुकड़े के लिए जोखिम समय बढ़ाने के लिए सुझाव देते हैं ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह अध्ययन राष्ट्रीय अनुसंधान, विकास और नवाचार हंगरी के कार्यालय (अनुदान ११६९१२ करने के लिए ÁH), लागत कार्यालय (खाद्य और कृषि लागत कार्ययोजना FA1205: AQUAGAMETE), Stipendium Hungaricum छात्रवृत्ति कार्यक्रम (अनुदान के लिए ZM) और नए द्वारा समर्थित किया गया था हंगेरियन राष्ट्रीय उत्कृष्टता डॉक्टरेट फैलोशिप (EK करने के लिए अनुदान).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Leibovitz media (L-15) Sigma-Aldrich L1518 Supplemented with L-glutamine
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F9665
Tricaine methanesulfonate (MS-222) Sigma-Aldrich E10521
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Sucrose Acros Organics 57-50-1
Trehalose Acros Organics 99-20-7 Dihydrate
Methanol Reanal 20740-0-08-65
Propylene glycol Reanal 08860-1-08-65
Dimethyl sulfoxide Reanal 00190-1-01-65
Collagenase Gibco 9001-12-1
Trypsin Sigma-Aldrich T8003
DNase I Panreac AppliChem A3778
Trypan blue Sigma-Aldrich T6146
Phospate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich P4417 Tablets for preparation of 200 ml PBS solution

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References

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सेल्यूलर बायोलॉजी इश्यू १३३ Spermatogonia ढाणियो rerio cryopreservation vitrification वृषण ट्रांसप्लांटेशन
Cryopreservation Zebrafish Spermatogonia के पूरे testes सुई द्वारा अल्ट्रा तेजी से ठंडा डूबे
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Marinović, Z., Lujić, J., Kása, E., Csenki, Z., Urbányi, B., Horváth, Á. Cryopreservation of Zebrafish Spermatogonia by Whole Testes Needle Immersed Ultra-Rapid Cooling. J. Vis. Exp. (133), e56118, doi:10.3791/56118 (2018).

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