Summary
Dit protocol beschrijft intratracheale inentingen van Fischer 344 ratten met Francisella tularensis. Deze procedure bootst pulmonaire blootstelling van mensen aan deze potentiële biothreat agent en kan worden gebruikt voor het testen van vaccins en de therapeutische werkzaamheid tegen pulmonale tularemie.
Abstract
Pulmonaire infectie met de bacterie Francisella tularensis kan leiden tot de ernstige en potentieel dodelijke ziekte, tularemie, bij de mens. Als gevolg van het huidige gebrek aan een goedgekeurde tularemie vaccin voor de mens, is onderzoek gericht op de ontwikkeling van een vaccin met behulp van passende diermodellen. De Fischer 344 rat heeft ontpopt als een model dat menselijke gevoeligheid voor infectie van F. tularensis weerspiegelt, en daarom een aantrekkelijk model voor de ontwikkeling van een vaccin tularemie. Intratracheale inoculatie van de Fischer 344 rat met F. tularensis bootst pulmonaire blootstelling bij de mens. De succesvolle levering in de luchtpijp rat is essentieel voor de pulmonaire levering. Een Laryngoscoop met verlichting wordt gebruikt voor het correct intubate de tracheae van narcose ratten; de juiste plaatsing binnen de luchtpijp wordt bepaald door een simpel apparaat te detecteren ademhaling. Na intubatie, de cultuur van F. tularensis wordt geleverd in een gemeten dosis via spuit. Deze techniek standaardiseert pulmonaire levering van F. tularensis binnen de rat luchtpijp te evalueren van de werkzaamheid van het vaccin.
Introduction
F. tularensis (Ft) veroorzaakt de ziekte bij de mens, tularemie. Wanneer de bacteriën worden overgenomen door de pulmonaire route, leidt dit tot de tularemie, die hoge morbiditeit en mortaliteit1 heeft. F. tularensis wordt beschouwd als een agent van de biothreat als gevolg van het gevaar aërosol vormen is gekoppeld, en er is momenteel geen vaccin goedgekeurd voor menselijk gebruik in de VS Een intensieve inspanning wordt momenteel gewerkt aan het ontwikkelen van vaccins en therapeutische maatregelen tegen de tularemie, ter bescherming van de menselijke bevolking tegen het illegale gebruik van deze bacteriële biothreat.
Veel van de tularemie onderzoek heeft zich gericht op het muismodel, als gevolg van de extreme gevoeligheid van muizen tot F. tularensis infectie en de prevalentie van reagentia. Echter, muizen hebben bewezen een moeilijk model voor de ontwikkeling van een vaccin, als gevolg van de moeilijkheid van het aantonen van de werkzaamheid van het vaccin in dit model2. Onlangs, de Fischer 344 rat is ontwikkeld als een model voor tularemie vaccin ontwikkeling3. De gevoeligheid van de Fischer 344 rat naar verschillende ondersoort van F. tularensis bootst menselijke gevoeligheid4, en ratten kunnen worden beschermd tegen F. tularensis pulmonaire uitdaging door vaccinatie met een levende vaccinstam bekend om te beschermen mens5,6,7. Omdat de Fischer 344 rat voor sommige functies van F. tularensis infectie van de mens modellen, is het mogelijk een nuttig model voor de ontwikkeling van een vaccin dat tegen pulmonale F. tularensis beschermt blootstelling.
Een effectief vaccin moet beschermen van mensen tegen pulmonale blootstelling aan F. tularensis. De meest waarschijnlijke pulmonaire blootstelling van bewapende F. tularensis zou aërosol bacteriën door inademing in de longen8. Aërosol generatie van F. tularensis is echter zowel gevaarlijk en omslachtige, en vereist speciale apparatuur en insluiting. Een alternatieve route van pulmonaire blootstelling in de rat thats misschien meer aanpasbaar voor meerdere laboratoria gespecialiseerde apparatuur ontbreekt via intratracheale inenting6. Deze techniek maakt gebruik van een Laryngoscoop voor de juiste plaatsing van een katheter in de luchtpijp van een narcose rat. Plaatsing in de luchtpijp, in plaats van de slokdarm, wordt gecontroleerd door een eenvoudig apparaat dat luchtstroom uit de longen visualiseert. F. tularensis wordt vervolgens geleverd in de longen door middel van de katheter door administratie met een injectiespuit, gevolgd door de invoering van lucht in de katheter om de pulmonaire levering van de bacteriën. In tegenstelling, Jemski5 eerder gemeld dat F. tularensis geënt in Fischer 344 ratten via de intranasale route niet uit de longen tot 3 dagen na inoculatie kunnen worden gekweekt, die aangeeft dat intranasale inoculatie bij ratten doet niet leiden tot directe levering van bacteriën naar de longen.
Selecteer agent vormen van F. tularensis (F. tularensis subsp. tularensis, F. tularensis subsp. holarctica) vereisen Biosafety Level 3 (BSL3) insluiting procedures, waardoor videografie zou. F. novicida (Fn) is echter vrijgesteld van select agent status als gevolg van de avirulentie bij de gezonde mens, en kan veilig worden gebruikt onder Biosafety Level 2 (BSL2) voorwaarden9,10. Bovendien, Fn dient als basis voor levende verzwakte vaccins die tegen F. tularensis pulmonaire blootstelling beschermen kunnen wanneer geleverd via intratracheale inoculatie11,12,13. De hier gepresenteerde techniek zorgt voor de studie van infecties, die optreden via de pulmonaire route met behulp van ratten als een model voor de mens. Deze techniek kan worden uitgevoerd zonder de behoefte aan gespecialiseerde aërosol genererende apparatuur. FN werd gebruikt voor de technieken hier gefilmd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
dit werk werd uitgevoerd in strikte overeenstemming met de aanbevelingen in de gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren van het National Institutes of Health. Dierlijke protocollen waarbij knaagdieren zijn goedgekeurd door de Universiteit van Texas in San Antonio institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) onder protocol MU009(RA).
1. voorbereiden katheter, luchtpijp Indicator en F. tularensis entmateriaal
- Bereiden katheter (20 G x 2 inch)
- Knip de 20 G x 2 in naald en sleur het puntje van de naald aan een bot en gladde afwerking met een roterende gereedschap.
Opmerking: De lengte van de afgestompte naald mag de metalen tip te ontbinden van ongeveer 3 mm in de mouw van de katheter volledig zittende op de afgestompte naald. De afgestompte naald geeft de structurele rigiditeit van de katheter dat plaatsing van de katheter in de luchtpijp en het ontbreken van het uiteinde van de afgestompte naald uitsteken van de katheter mouw voorkomt schade aan de luchtpijp. - Reinig de afgestompte naalden en katheters met 70% ethanol en onder UV-licht gedurende 15 minuten steriliseren
- Knip de 20 G x 2 in naald en sleur het puntje van de naald aan een bot en gladde afwerking met een roterende gereedschap.
- Bereiden luchtpijp Indicator
- een 1.000 µL Pipetteer tip om de tip om te zitten in een opening van de katheter en vormen een luchtdichte zegel Trim.
- Een filter verwijderen uit een 200 µL aërosol barrière pipette uiteinde en plaats binnen de eerder bijgesneden 1.000 µL Pipetteer tip.
- Zorgen voor het filter zich vrij kan verplaatsen binnen de 1.000 µL Pipetteer tip wanneer de tip tip-down wordt gewezen.
- F. tularensis entmateriaal
- Grow F. tularensis druk 's nachts op passende agarplaat bij 37 ° C. Scrape ongeveer 100 µL van de bacteriële gazon van de agarplaat met een steriele enten lus en gebruiken om te enten een 500 mL conische kolf met 250 mL passende vloeibare groeimedium (voor Fn: al soja Bouillon (TSB) aangevuld met 0,1% L-cysteïne hydrochloride monohydraat) en incubeer schudden 's nachts bij 37 ° C.
Opmerking: F. novicida gebruikt in de video werd gekweekt op een al soja agar (TSA) plaat aangevuld met 0,1% L-cysteïne hydrochloride monohydraat. - Centrifugeren van de overnachting geteelde vloeibare cultuur bij 4221 x g bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten en de bovendrijvende vloeistof verwijderen zonder het verstoren van de bacteriën pellet.
Let op: Volg instelling ' s bioveiligheid aanbevelingen aan vloeistof wordt weggeworpen. - Voorzichtig resuspendeer de bacteriële pellet met 25 mL van de passende vloeistof (Fn: TSB aangevuld met 0,1% L-cysteïne hydrochloride monohydraat) met 10% glycerol, met behulp van een precisiepipet 25 mL.
- Met behulp van een precisiepipet van 1 mL, aliquot de geresuspendeerde bacteriecultuur in 500 µL aliquots in flesjes, bevriezen in een bad van droogijs/ethanol en bewaren bij -80 ° C.
- Om te bepalen van de titer van de bevroren cultuur flesjes, verwijderen van twee bevroren flesjes opgeslagen bij-80 ° C, ontdooien op ijs en uitvoeren van seriële verdunningen in-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) gevolgd door beplating op passende groeimedium (Fn: TSA met 0,1% L-cysteïne waterstofchloride). Platen zijn bebroede 24-48 h bij 37 ° C, en kolonie vormende eenheden (kve) worden geïnventariseerd voor het berekenen van het aantal bacteriële cellen binnen de bevroren cultuur flesjes (gemiddelde van twee flesjes).
- De bacteriële entmateriaal door het ontdooien van een bevroren flesje op ijs bereiden en vervolgens verdund de cultuur met PBS de eindconcentratie van 10 7 CFU/100 µL. Het entmateriaal dient bij een concentratie die de gewenste CFU in 100 µL opleveren (de uiteindelijke concentratie van glycerol binnen het entmateriaal mag niet meer dan 3%, om te voorkomen dat verstikking van de rat). Bevroren cultuur flesjes opgeslagen bij-80 ° C kunnen worden gebruikt voor maximaal zes maanden na voorbereiding.
- Grow F. tularensis druk 's nachts op passende agarplaat bij 37 ° C. Scrape ongeveer 100 µL van de bacteriële gazon van de agarplaat met een steriele enten lus en gebruiken om te enten een 500 mL conische kolf met 250 mL passende vloeibare groeimedium (voor Fn: al soja Bouillon (TSB) aangevuld met 0,1% L-cysteïne hydrochloride monohydraat) en incubeer schudden 's nachts bij 37 ° C.
2. Rat verdoving
- de verdoving zaal verbinden met de goed werkende Isofluraan vaporizer van een machine anesthesie.
- Sluit het gas buis op de anesthesie zaal aan het gas systeem opruiming opruiming.
- Open de zuurstof stroom op de machine van de verdoving om 4 L/min.
- De vaporizer Isofluraan ingesteld op 5%.
- Plaatst de rat in de anesthesie-zaal.
Opmerking: We gebruiken meestal ratten tussen 8-10 weken oud (130-180 g); jonge ratten zijn moeilijk om te enten via deze techniek als gevolg van de geringe omvang van de mond holte. - Bij de inductie van de anesthesie heeft plaatsgevonden, handhaven de rat op 5% Isofluraan, 2 L/min zuurstof daartoe. Dit duurt ongeveer 3 tot 10 minuten
- Bepalen de diepte van de verdoving door de kwaliteit en de snelheid van de ademhaling en hartslag, en reactie op de stimulatie van de reflex net als in de teen snuifje test. Ideale diepte van verdoving wordt aangegeven door 1-1.5 s graaf tussen elke ademhaling.
3. Intratracheale inoculatie
- de rat uit de narcose kamer verwijderen en plaatsen van de rat dorsally op de knaagdier intubatie stand. De voorste tanden van rat hechten aan de houder rat in plaats te houden.
Opmerking: Als de rat begint te ontwaken tijdens de procedure, de katheter kan worden verwijderd en de rat keerde terug naar de kamer van de anesthesie te bereiken een dieper vlak van anesthesie. - Dominante hand gebruiken om de tong naar dezelfde zijde als de ondersteunende hand met brede punt dressing duim pincet.
- Gebruik steunen van hand en veilig van de tong met de Laryngoscoop tegen de rat ' s lager kaak en visualiseren van de luchtpijp en de slokdarm van het dier. De luchtpijp zal openen en sluiten als de rat ademt.
- Invoegen de katheter met een 20-gauge afgerond-naald, bereid in stap 1.1, in de luchtpijp. Er kunnen lichte weerstand, en opneming in de luchtpijp mag " hobbelige " als gevolg van de katheter wrijven de tracheale kraakbeen. Als gevolg van vocht of ondiepe ademhaling, kan de luchtpijp door het strotklepje waardoor de visualisatie van de luchtpijp worden gedekt. Zachtjes aanraken van de rand van het strotklepje kraakbeen zal leiden tot de klep van het kraakbeen te openen en het ontdekken van de luchtpijp.
- Verwijderen de afgerond-naald uit de katheter en tegelijkertijd de katheter in de luchtpijp blijft.
- Sta een paar seconden te geven voor de rat te kunnen ademen rond katheter ingevoegd in de luchtpijp toe.
- Zetel stevig de luchtpijp indicator op de katheter openen. Beweging van het aërosol blok geeft de katheter is correct ingevoegd in de luchtpijp.
- Zorgen ervoor dat de rat is opleggen van de intubatie stand zodanig dat de borst van het dier wordt geconfronteerd met loodrecht op het vlak van de stand van de intubatie.
- Verwijderen van de indicator van de luchtpijp en het leveren van 100 µL (10 7 CFU) van de entmateriaal met F. tularensis met behulp van een pipet tip van 200 µL, stevig zitplaatsen het uiteinde tegen de opening van de katheter.
- Plak een 1 mL slip tip tuberculine spuit gevuld met lucht en lever van 300 µL van lucht te zorgen entmateriaal bereikt de longen van de rat.
- De katheter uit de luchtpijp verwijderen en verwijder de rat van het chirurgische platform.
- Laat de rat te ontwaken en terug te keren naar de kooi. Ervoor te zorgen dat de ademhaling normaal teruggekeerd.
- Bepalen de CFU in de F. tularensis entmateriaal zoals beschreven in stap 1.3.5 te bevestigen de CFU geleverd in de luchtpijp.
- Herhaal stap 3.1-3.9 op niet-gevaccineerde (naïeve) dieren met 100 µL PBS in plaats van het entmateriaal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De humorale respons op intratracheale inoculatie van F. tularensis in de rat kan worden bepaald door de enzym-verbonden immunosorbent analyse (ELISA) tegen UV-geïnactiveerde bacteriën, zoals eerder beschreven11. Totale immunoglobuline G (IgG) reactie van Fischer 344 ratten op geïnactiveerd, hele cel bacteriën was beoordeeld post-intratracheale inoculatie met een verzwakte stam van Fn (107 CFU entmateriaal) op dag 14 en dag 28 (Figuur 1). Mock-gevaccineerde ratten ontvangen PBS intratracheally. Een toename van de serum antilichamen titers tegen Fn na inoculatie ten opzichte van de naïeve mock-gevaccineerde dieren wijst erop dat de doeltreffendheid van de vaccinatie intratracheale. Lage serum reactiviteit kan duiden op onjuiste intratracheale plaatsing.
Figuur 1: totaal IgG reacties op levende verzwakte Fn intratracheale inoculatie bij F344 ratten. Sera van F344 ratten (n = 5) geënte intratracheally met een levend verzwakt Fn stam (107 CFU) werden geanalyseerd voor totale IgG niveaus reactief met hele cel Fn op dag 14 en dag 28 na inoculatie. Mock-gevaccineerde (naïeve) ratten (n = 5) werden geënte intratracheally met PBS. Rode gebied duidt reactiviteit van naïeve sera (F344 ratten mock-gevaccineerde met PBS). De foutbalken vertegenwoordigen de SEM. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De Fischer 344 rat is steeds een belangrijk model voor tularemie vaccin ontwikkeling3. Blootstelling aan F. tularensis via de pulmonaire route is van cruciaal belang voor het aantonen van de werkzaamheid tegen bewapende vormen van F. tularensis, omdat deze vorm van aërosolen zijn geleverd. Intratracheale inoculatie van de rat vergemakkelijkt Gasbedwelming met behulp van de rat longen F. tularensis zonder de behoefte aan grote, dure en ingewikkelde aërosol genereren van apparatuur. Alle experimenten met behulp van select agent vormen van F. tularensis Bovendien vereisen BSL3 insluiting, die meestal in beperkt ruimte optreedt. Dus, deze techniek minimaliseert u de hoeveelheid extra apparatuur die moet worden gehuisvest in dat werkomgeving.
Omdat Fn de stam van de F. tularensis gebruikt voor videografie was, werden alle technieken uitgevoerd onder inperking van de BSL2. Aanpassing van deze techniek voor het BSL3 milieu omvat alle procedures binnen een kabinet bioveiligheid uitgevoerd door personeel dragen van bioveiligheid versnelling (volledige kap, aangedreven lucht zuiverende gasmasker (PAPR), beschermhoes met kap, dubbele handschoenen, laarsjes) en deze aanpassingen verminderen mobiliteit, beweeglijkheid en zichtbaarheid. De luchtpijp indicator is een belangrijk onderdeel waarmee de bevestiging dat de katheter correct was geplaatst in de luchtpijp, overweegt dat het is vaak moeilijk om anders dit te bepalen bij het werken onder BSL3 voorwaarden.
Er zijn anatomisch correcte rat "simulatoren" die een luchtpijp en de slokdarm, en deze zijn nuttig om te perfectioneren van de techniek voor het werken met levende dieren. Werken met de simulator is echter niet identiek is aan het werken met een levende rat. Een middel om te bepalen als deze techniek correct is uitgevoerd in het levende dier is om te Trypan blauwe kleurstof gebruiken als het entmateriaal op een narcose rat, en na de ingreep euthanaseren onmiddellijk het dier. Dissectie van het longweefsel en maag zal openbaren als de kleurstof werd geleverd in de longen en niet de slokdarm. Een rat die zijn ingeënt met Fn/Ft door deze techniek kan ook worden euthanized kort na inoculatie en het longweefsel VERGULD om te bepalen van de werkelijke depositie in de longen.
Juiste intratracheale inoculatie zullen belangrijk zijn voor de evaluatie van tularemie vaccin werkzaamheid in de Fischer 344 rat, maar het kan ook nuttig zijn voor andere vaccin en/of therapeutische toepassingen bij ratten ook, met inbegrip van biodefense. Dus, deze techniek kan worden aangepast aan een verscheidenheid van pulmonaire toepassingen met behulp van het model van de rat. Hoewel levering door een aërosol genereert apparaat meer vergelijkbaar met een biothreat-scenario wellicht, vertegenwoordigt de intratracheale inoculatie van F. tularensis een relatief eenvoudige en voordelige alternatief voor tularemie vaccinontwikkeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door de verdediging bedreiging vermindering Agentschap (DTRA) onder contract HDTRA1-14-C-0116, en het Center for Excellence in infectie genomica (DOD #W911NF-11-1-0136).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GreenLine fiber optic blade size 0 | Carefusion | 5-5231-00 | Macintosh American profile |
| GreenLight system laryngoscope handle | Carefusion | 4559GSP | |
| Exel International Safelet I.V. Catheter | EXEL INTERNATIONAL | 26743 | |
| Slip Tip Sterile Syringes 1mL | BD | 309659 | |
| Broad Point Dressing Thumb Forceps | Thermo Scientific | 76-302 | |
| 200 μL barrier tip | GeneseeScientific | 24-142 | |
| 1,000 μL pipette tip | Olympus Plastics | 24-173 | |
| Dremel 3000-2/28 Rotary tool kit | Dremel | 3000228 | |
| Rodent Intubation Stand | Braintree Scientific | RIS 200 | |
| Isoflurane | Butler Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| Rodent anesthesia machine | Surgivet | VTC302 Classic T3 | |
| Rodent Anesthesia chamber | Braintree Scientific | AB 1 |
References
- Ellis, J., Oyston, P. C. F., Green, M., Titball, R. Tularemia. Clin Microbiol Rev. 15 (4), 631-646 (2002).
- Lyons, C. R., Wu, T. H. Animal models of Francisella tularensis infection. Ann N Y Acad Sci. 1105, (2007).
- Hutt, J. A., Lovchik, J. A., Dekonenko, A., Hahn, A. C., Wu, T. H. The Natural History of Pneumonic Tularemia in Female Fischer 344 Rats after Inhalational Exposure to Aerosolized Francisella tularensis subspecies tularensis Strain Schu S4. Am J Pathol. 187 (2), 252-267 (2017).
- Ray, H. J., et al. The Fischer 344 rat reflects human susceptibility to Francisella pulmonary challenge and provides a new platform for virulence and protection studies. PloS one. 5, e9952 (2010).
- Jemski, J. V. Respiratory tularemia: comparison of selected routes of vaccination in Fischer 344 rats. Infect Immun. 34 (3), 766-772 (1981).
- Wu, T. H., et al. Vaccination of Fischer 344 rats against pulmonary infections by Francisella tularensis type A strains. Vaccine. 27 (34), 4684-4693 (2009).
- Mara-Koosham, G., Hutt, J. A., Lyons, C. R., Wu, T. H. Antibodies contribute to effective vaccination against respiratory infection by type A Francisella tularensis strains. Infect Immun. 79 (4), 1770-1778 (2011).
- Oyston, P. C., Sjostedt, A., Titball, R. W. Tularaemia: bioterrorism defence renews interest in Francisella tularensis. Nat Rev Microbiol. 2 (12), 967-978 (2004).
- Kingry, L. C., Petersen, J. M. Comparative review of Francisella tularensis and Francisella novicida. Front Cell Infect Microbiol. 4, 35 (2014).
- Rohmer, L., et al. Comparison of Francisella tularensis genomes reveals evolutionary events associated with the emergence of human pathogenic strains. Genome Biol. 8 (6), R102 (2007).
- Chu, P., et al. Live attenuated Francisella novicida vaccine protects against Francisella tularensis pulmonary challenge in rats and non-human primates. PLoS Pathog. 10 (10), e1004439 (2014).
- Signarovitz, A. L., et al. Mucosal Immunization with Live Attenuated Francisella novicida U112ΔiglB Protects against Pulmonary F. tularensis SCHU S4 in the Fischer 344 Rat Model. PloS one. 7 (10), e47639 (2012).
- Cunningham, A. L., et al. Enhancement of vaccine efficacy by expression of a TLR5 ligand in the defined live attenuated Francisella tularensis subsp. novicida strain U112DiglB::fljB. Vaccine. 32 (40), 5234-5240 (2014).
