Summary
Questo protocollo descrive intratracheale inoculazioni di Fischer 344 ratti con Francisella tularensis. Questa procedura imita polmonare dell'esposizione degli esseri umani a questo potenziale agente di biothreat e può essere utilizzato per testare il vaccino ed efficacia terapeutica contro tularemia polmonare.
Abstract
Infezione polmonare con il batterio Francisella tularensis può condurre alla malattia grave e potenzialmente mortale, tularemia, negli esseri umani. Dovuto la mancanza attuale di un vaccino di tularemia approvati per gli esseri umani, la ricerca è focalizzata sullo sviluppo del vaccino utilizzando appropriati modelli animali. Il ratto di Fischer 344 è emerso come un modello che riflette umana suscettibilità all'infezione di F. tularensis e quindi è un modello interessante per lo sviluppo di vaccini di tularemia. Intratracheale inoculazione del ratto Fischer 344 con F. tularensis imita l'esposizione polmonare in esseri umani. La consegna di successo nella trachea del ratto è critica per la consegna polmonare. Viene utilizzato un laringoscopio con illuminazione a intubate correttamente le trachee di ratti anestetizzati; il corretto posizionamento all'interno della trachea è determinato da un semplice dispositivo per rilevare la respirazione. A seguito di intubazione, la cultura di F. tularensis viene consegnata in una dose misurata tramite siringa. Questa tecnica consente di standardizzare consegna polmonare di F. tularensis entro la trachea di ratto per valutare l'efficacia del vaccino.
Introduction
F. tularensis (Ft) causa la malattia umana, tularemia. Quando i batteri vengono acquisiti attraverso la via polmonare, questo porta alla tularemia polmonare, che ha un'elevata morbilità e mortalità1. F. tularensis è considerato un agente biothreat dovuto il pericolo associato con forme aerosolizzate e non esiste attualmente un vaccino approvato per uso umano negli Stati Uniti Un intenso sforzo è attualmente in corso per sviluppare vaccini e misure terapeutiche contro tularemia polmonare, per proteggere la popolazione umana contro l'uso illecito di questa biothreat batterica.
Gran parte della ricerca di tularemia è concentrata sul modello del mouse, a causa della estrema sensibilità dei topi all'infezione di F. tularensis e la prevalenza dei reagenti. Tuttavia, i topi hanno dimostrato di essere un modello difficile per lo sviluppo di vaccini, a causa della difficoltà di dimostrare l'efficacia del vaccino in questo modello2. Recentemente, il ratto di Fischer 344 è stato sviluppato come un modello per lo sviluppo di tularemia vaccino3. La sensibilità del ratto Fischer 344 a varie sottospecie di F. tularensis imita sensibilità umana4e ratti possono essere protetti contro F. tularensis polmonare sfida dalla vaccinazione con un ceppo del vaccino vivo conosciuto per proteggere gli esseri umani5,6,7. Perché il ratto di Fischer 344 modelli alcune caratteristiche di F. tularensis infezione degli esseri umani, può essere un modello estremamente utile per lo sviluppo di un vaccino che protegge contro polmonare F. tularensis esposizione.
Ha bisogno di un vaccino efficace proteggere l'uomo contro l'esposizione polmonare di F. tularensis. Il più probabile esposizione polmonare da weaponized F. tularensis sarebbe aerosolized batteri inalati nei polmoni8. Tuttavia, generazione di aerosol di F. tularensis è pericoloso e ingombrante e richiede attrezzature specializzate e contenimento. Un percorso alternativo di esposizione polmonare nel ratto che è forse più adattabile per i laboratori più carente di attrezzature specializzate è via intratracheale inoculazione6. Questa tecnica utilizza un laringoscopio per il corretto posizionamento di un catetere all'interno della trachea di un ratto anestetizzato. Posizionamento all'interno della trachea, piuttosto che l'esofago, è verificato da un dispositivo semplice che Visualizza il flusso d'aria dai polmoni. F. tularensis viene successivamente recapitato nei polmoni attraverso il catetere dall'amministrazione con una siringa, seguita dall'introduzione di aria nel catetere per garantire una consegna polmonare dei batteri. Al contrario, che indica che l'inoculazione intranasale in ratti fa Jemski5 precedentemente segnalato che F. tularensis inoculato nei ratti Fischer 344 per via intranasale non poteva essere coltivato dai polmoni fino al post-inoculazione 3 giorni, non risultato in consegna diretta di batteri nei polmoni.
Moduli selezionare agente di F. tularensis (F. tularensis subsp. tularensis, F. tularensis subsp. holarctica) richiedono procedure di contenimento di biosicurezza di livello 3 (BSL3), che impedirebbero la videografia. Tuttavia, F. novicida (Fn) è esente dallo status di agente selezionare a causa sua avirulenza nell'uomo sano e può essere utilizzato in sicurezza in condizioni di livello 2 di biosicurezza (BSL2)9,10. Inoltre, Fn serve come base per vaccini vivi attenuati in grado di proteggere contro l'esposizione polmonare di F. tularensis quando consegnato via intratracheale inoculazione11,12,13. La tecnica presentata qui consente lo studio delle infezioni che si verificano attraverso la via polmonare utilizzando ratti come un modello per gli esseri umani. Questa tecnica può essere eseguita senza la necessità di attrezzature specializzate generatori di aerosol. FN è stato usato per le tecniche girate qui.
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Protocol
quest'opera è stata eseguita in stretta conformità con le raccomandazioni della Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health. Protocolli degli animali che coinvolgono roditori sono stati approvati dall'Università del Texas a San Antonio istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC) sotto protocollo MU009(RA).
1. preparazione del catetere, indicatore di Trachea e F. tularensis inoculo
- Preparare il catetere (20 x 2 pollici)
- tagliare il 20 x 2 in ago e macinare la punta dell'ago un Blunt e liscia finitura con un utensile rotante.
Nota: La lunghezza dell'ago smussato dovrebbe consentire la punta di metallo di recedere circa 3 mm nel manicotto del catetere quando completamente inserito sull'ago smussato. L'ago blunted dà la rigidità strutturale del catetere per consentire il posizionamento del catetere nella trachea, e l'assenza della punta dell'ago blunted sporgenti dal manicotto del catetere evita la lesione alla trachea. - Pulire il blunted aghi e cateteri con etanolo al 70% e sterilizzare per 15 minuti alla luce UV
- tagliare il 20 x 2 in ago e macinare la punta dell'ago un Blunt e liscia finitura con un utensile rotante.
- Preparare Trachea indicatore
- tagliare la punta di una pipetta di 1.000 µ l per permettere che la punta per sedersi in un'apertura di catetere e formare una guarnizione ermetica.
- Rimuovere un filtro da un 200 µ l aerosol barriera pipetta suggerimento e posto dentro la punta della pipetta precedentemente tagliati e 1.000 µ l.
- Garantire il filtro possa muoversi liberamente all'interno la punta della pipetta 1.000 µ l quando la punta è puntata punta a.
- F. tularensis inoculo
- Grow F. tularensis ceppo durante la notte sulla piastra di agar appropriato a 37 ° C. raschiare circa 100 µ l del prato batterico dalla piastra di agar con una sterile inoculando ciclo e utilizzare per inoculare un matraccio di Erlenmeyer contenente 250 mL di terreno di coltura liquido appropriato da 500 mL (per Fn: brodo di soia triptico (TSB) completato con 0,1% L-cisteina cloridrato monoidrato) e incubare agitazione durante la notte a 37 ° C.
Nota: F. novicida utilizzato nel video era cresciuta su una piastra di agar (TSA) di soia triptico completata con 0,1% L-cisteina cloridrato monoidrato. - Centrifugare la coltura liquida coltivata durante la notte a 4.221 x g a temperatura ambiente per 10 min e rimuovere il supernatante senza interrompere il pellet batteri.
Attenzione: Si prega di seguire istituzione ' consigli di biosicurezza s per eliminare il surnatante. - Delicatamente risospendere il pellet batterico con 25 mL di terreno liquido appropriato (Fn: TSB completati con 0,1% L-cisteina cloridrato monoidrato) contenente 10% glicerolo, utilizzando una pipetta da mL 25.
- Utilizzando una pipetta da 1 mL, aliquota la coltura batterica sedimento in 500 aliquote µ l in fiale, congelare in un bagno di ghiaccio secco/etanolo e conservare a -80 ° C.
- Per determinarne il titolo dei flaconi di coltura congelata, rimuovere due flaconcini congelati conservati a-80 ° C, scongelare su ghiaccio ed eseguire diluizioni in tampone fosfato salino (PBS) seguita da placcatura su terreno di coltura appropriato (Fn: TSA contenente 0,1% L-cisteina cloridrato). Le piastre sono incubate 24-48 h a 37 ° C e unità formanti colonie (CFU) vengono enumerate per calcolare il numero di cellule batteriche all'interno i flaconi di coltura congelata (media di due flaconcini).
- Preparare l'inoculo batterico dallo scioglimento di un flaconcino congelato sul ghiaccio e poi diluire la cultura con PBS alla concentrazione finale di 10 7 CFU/100 µ l. L'inoculo deve essere ad una concentrazione che consentiranno di ottenere il desiderato CFU in 100 µ l (la concentrazione finale di glicerolo all'interno dell'inoculo non può essere superiore al 3%, per evitare asfissia del ratto). Flaconi di coltura congelati conservati a-80 ° C possono essere utilizzati per fino a sei mesi dopo la preparazione.
- Grow F. tularensis ceppo durante la notte sulla piastra di agar appropriato a 37 ° C. raschiare circa 100 µ l del prato batterico dalla piastra di agar con una sterile inoculando ciclo e utilizzare per inoculare un matraccio di Erlenmeyer contenente 250 mL di terreno di coltura liquido appropriato da 500 mL (per Fn: brodo di soia triptico (TSB) completato con 0,1% L-cisteina cloridrato monoidrato) e incubare agitazione durante la notte a 37 ° C.
2. Anestesia di ratto
- collegare la camera di anestesia per il vaporizzatore di isoflurane correttamente operativo di una macchina di anestesia.
- Collegare il tubo sulla camera di anestesia per il sistema di evacuazione dei gas di evacuazione dei gas.
- Aprire il flusso di ossigeno sulla macchina di anestesia a 4 L/min.
- Impostare il vaporizzatore di isoflurane al 5%.
- Porre il ratto nella camera anestesia.
Nota: In genere utilizziamo ratti tra 8-10 settimane di età (130-180 g); più giovani ratti sono difficili da inoculare tramite questa tecnica a causa delle piccole dimensioni della cavità di bocca. - Quando l'induzione dell'anestesia ha avuto luogo, mantenere il ratto al 5% isoflurane, 2 L/min di ossigeno per effetto. Questa operazione richiede circa 3-10 min
- Determinare la profondità dell'anestesia per la qualità e il tasso di respirazione e battito cardiaco e la reazione alla stimolazione riflessa come nella prova di pizzico di punta. Ideale profondità dell'anestesia è indicato da 1-1.5 s totali tra ogni respiro.
3. Intratracheale inoculazione
- rimuovere il ratto dalla camera di anestesia e posiziona il ratto dorsalmente sul cavalletto intubazione del roditore. Allegare i denti anteriori del ratto al titolare per mantenere ratto sul posto.
Nota: Se il topo comincia a risvegliarsi durante la procedura, il catetere può essere rimosso e il ratto restituito alla camera di anestesia per raggiungere un piano più profondo dell'anestesia. - Utilizzare mano dominante per muovere la lingua stesso lato come mano di sostegno con forcipe punto ampia medicazione pollice.
- Uso mano di supporto e fissare la linguetta con il laringoscopio contro il ratto ' s mandibola e visualizzare la trachea e l'esofago dell'animale. La trachea si aprirà o chiuderà come ratto respira.
- Inserire il catetere contenente un ottuso calibro 20-ago, preparata al punto 1.1, nella trachea. Potrebbe esserci una leggera resistenza e inserimento nella trachea può essere " su strada sconnessa " dovuto il catetere strofinando le cartilagini tracheale. Dovuti a umidità o respirazione superficiale, la trachea può essere coperto dall'epiglottide che impedisce la visualizzazione della trachea. Toccando delicatamente il bordo della cartilagine epiglottide causerà il lembo di cartilagine aprire e scoprire la trachea.
- Rimuovere l'ago smussato dal catetere, garantendo nel contempo il catetere rimane nella trachea.
- Attendere alcuni secondi passare per ratto per poter respirare intorno catetere inserito nella trachea.
- Saldamente l'indicatore di trachea sul catetere di apertura. Movimento della barriera aerosol indicherà il catetere è inserito correttamente nella trachea.
- Garantire che il ratto è posa nello stand di intubazione tale che il petto dell'animale si trova di fronte perpendicolare al piano dello stand intubazione.
- Rimuovere l'indicatore di trachea e 100 µ l (10 7 CFU) dell'inoculo contenente utilizzando una punta di pipetta 200 µ l di F. tularensis, posti a sedere saldamente la punta contro l'apertura di catetere.
- Applicare una siringa per tubercolina 1ml antiscivolo punta riempita d'aria e consegnare 300 µ l di aria per garantire l'inoculo raggiunge i polmoni del ratto.
- Rimuovere il catetere dalla trachea e rimuovere il ratto dalla piattaforma chirurgica.
- Consentire il topo a risvegliare e tornare alla gabbia. Assicurarsi che la respirazione è tornato alla normalità.
- Determinare il CFU in F. tularensis inoculo come descritto al punto 1.3.5 per confermare il CFU consegnato nella trachea.
- Ripetere i passaggi da 3.1-3.9 su animali non vaccinati (ingenuo) con 100 µ l PBS al posto dell'inoculo.
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Representative Results
La risposta umorale ad inoculazione intratracheale di F. tularensis nel ratto può essere determinata da enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA) contro batteri inattivati UV, come descritto in precedenza11. Risposta di immunoglobulina G (IgG) totale dei ratti Fischer 344 ai batteri inattivati a cellula intera era valutato post-intratracheale inoculazione con un ceppo attenuato di Fn (10 inoculo di7 CFU) al giorno 14 e giorno 28 (Figura 1). Mock-vaccinati ratti hanno ricevuto vari di PBS. Un aumento nei titoli dell'anticorpo del siero contro il post-inoculazione Fn rispetto gli animali vaccinati mock ingenuo indica l'efficacia di vaccinazione intratracheale. Reattività del siero basso può indicare intratracheale non corretto posizionamento.
Figura 1: totale IgG Responses to Live attenuato Fn intratracheale inoculazione in ratti F344. I sieri da ratti F344 (n = 5) vari inoculato con un vivo attenuato ceppo Fn (107 CFU) sono stati analizzati per i livelli totali di IgG reattivi con cellula intera Fn al giorno 14 e 28 ° giorno post-inoculazione. Mock-vaccinati (ingenuo) ratti (n = 5) sono stati inoculati vari con PBS. Zona rossa denota la reattività dei sieri ingenuo (ratti F344 mock-vaccinati con PBS). Le barre di errore rappresentano SEM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il ratto di Fischer 344 sta diventando un importante modello per tularemia vaccino sviluppo3. L'esposizione a F. tularensis attraverso la via polmonare è fondamentale per dimostrare l'efficacia contro weaponized forme di F. tularensis, perché questi sono trasportati sotto forma di aerosol. Intratracheale inoculazione del ratto facilita l'esposizione dei polmoni del ratto di F. tularensis senza la necessità di aerosol grande, costoso e complicato dispositivo di generazione. Tutti gli esperimenti che utilizzano moduli selezionare agente di F. tularensis inoltre richiedono BSL3 contenimento, che in genere si verifica nello spazio limitato severamente. Quindi, questa tecnica riduce al minimo la quantità di apparecchiature aggiuntive che deve essere ospitato all'interno di tale ambiente di lavoro.
Perché Fn è stato il ceppo di F. tularensis utilizzato per videografia, tutte le tecniche sono state eseguite sotto BSL2 contenimento. Adattamento di questa tecnica all'ambiente BSL3 include tutte le procedure eseguite all'interno di una cappa di biosicurezza da personale indossando l'attrezzatura di biosicurezza (cappuccio completo, respiratore alimentato aria (PAPR), coperchio di protezione con cappuccio, guanti, stivaletti), e questi adattamenti riducono la mobilità, la destrezza e la visibilità. L'indicatore della trachea è una componente importante che permette la conferma che il catetere è stato correttamente posizionato all'interno della trachea, considerando che è spesso difficile fare altrimenti questa determinazione quando si lavora in condizioni BSL3.
Ci sono anatomicamente corretto ratto "simulatori" che hanno una trachea e l'esofago, e questi sono utili per perfezionare la tecnica prima di lavorare con gli animali vivi. Tuttavia, lavorare con il simulatore non è identico a lavorare con un ratto dal vivo. Un mezzo per determinare se questa tecnica viene eseguita correttamente nell'animale vivo è di utilizzare il colorante Trypan blu come inoculo su un ratto anestetizzato e dopo la procedura immediatamente eutanasia animale. Dissezione del tessuto del polmone e dello stomaco rivelerà se il colorante è stato consegnato in polmoni e non l'esofago. Un topo che è stato vaccinato con Fn/Ft da questa tecnica può anche essere euthanized poco dopo l'inoculazione e tessuto polmonare placcato per determinare la reale deposizione all'interno del polmone.
L'inoculazione intratracheale corretta sarà importante per la valutazione dell'efficacia del vaccino di tularemia nel ratto Fischer 344, ma può anche essere utile per altri vaccini e/o applicazioni terapeutiche in ratti pure, compreso biodifesa. Quindi, questa tecnica può essere adattabile a svariate applicazioni polmonare che utilizzano il modello di ratto. Mentre la consegna di un aerosol elettromagnetico può essere più simile a uno scenario di biothreat, l'inoculazione di intratracheale di F. tularensis rappresenta un'alternativa relativamente semplice ed economica per lo sviluppo di vaccini di tularemia.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto dall'agenzia di riduzione di minaccia di difesa (DTRA) sotto contratto HDTRA1-14-C-0116 e il centro di eccellenza nel campo della genomica di infezione (DOD n #W911NF-11-1-0136).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GreenLine fiber optic blade size 0 | Carefusion | 5-5231-00 | Macintosh American profile |
| GreenLight system laryngoscope handle | Carefusion | 4559GSP | |
| Exel International Safelet I.V. Catheter | EXEL INTERNATIONAL | 26743 | |
| Slip Tip Sterile Syringes 1mL | BD | 309659 | |
| Broad Point Dressing Thumb Forceps | Thermo Scientific | 76-302 | |
| 200 μL barrier tip | GeneseeScientific | 24-142 | |
| 1,000 μL pipette tip | Olympus Plastics | 24-173 | |
| Dremel 3000-2/28 Rotary tool kit | Dremel | 3000228 | |
| Rodent Intubation Stand | Braintree Scientific | RIS 200 | |
| Isoflurane | Butler Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| Rodent anesthesia machine | Surgivet | VTC302 Classic T3 | |
| Rodent Anesthesia chamber | Braintree Scientific | AB 1 |
References
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