Summary
Dieses Protokoll beschreibt intratrachealen Impfungen von Fischer 344 Ratten mit Francisella Tularensis. Dieses Verfahren ahmt pulmonale Exposition von Menschen gegenüber dieser potenziellen Biothreat Agent und kann zum Testen Impfstoff und therapeutische Wirksamkeit gegen pulmonale Tularämie verwendet werden.
Abstract
Pulmonale Infektion mit dem Bakterium Francisella Tularensis kann zu schwere und potenziell tödliche Krankheit, Tularämie, beim Menschen führen. Aufgrund der gegenwärtige Mangel einer genehmigten Tularämie-Impfstoff für den Menschen ist Impfstoffentwicklung unter Verwendung geeigneter Tiermodelle Forschungsschwerpunkt. Fischer 344 Ratte hat ein Modell entwickelt, die menschlichen Infektanfälligkeit F. Tularensis widerspiegelt, und somit ist ein attraktives Modell für die Impfstoffentwicklung Tularämie. Intratrachealen Inokulation der Fischer 344 Ratte mit F. Tularensis imitiert pulmonale Exposition beim Menschen. Die erfolgreiche Zustellung in der Ratte Luftröhre ist entscheidend für pulmonale Lieferung. Ein Laryngoskop mit Beleuchtung wird verwendet, um richtig die Tracheen anästhesierten Ratten Intubation; ein einfaches Gerät bestimmt die richtige Platzierung innerhalb der Luftröhre, Atmung zu erkennen. Nach Intubation wird F. Tularensis Kultur in eine gemessene Dosis per Spritze geliefert. Diese Technik standardisiert pulmonale Lieferung von F. Tularensis innerhalb der Ratte Luftröhre, Impfstoffwirksamkeit zu bewerten.
Introduction
F. Tularensis (Ft) bewirkt, dass die menschliche Krankheit, Tularämie. Wenn die Bakterien durch die pulmonale Route gekauft werden, führt dies zu Lungenpest Tularämie, die hohe Morbidität und Mortalität1hat. F. Tularensis gilt einen Biothreat Agent wegen der Gefahr Aerosol Formen zugeordnet, und gibt es derzeit keinen Impfstoff für den menschlichen Gebrauch in den USA zugelassen Eine intensive Anstrengung wird derzeit an der Entwicklung von Impfstoffen und therapeutische Maßnahmen gegen Lungenpest Tularämie, zum Schutz der menschlichen Bevölkerung gegen die unerlaubte Nutzung von dieser bakteriellen Biothreat.
Großteil der Tularämie Forschung konzentriert sich auf die Maus-Modell, aufgrund der extremen Empfindlichkeit der Mäuse, F. Tularensis Infektion und der Prävalenz von Reagenzien. Aber erwiesen Mäuse sich ein schwer Modell für die Impfstoffentwicklung, wegen der Schwierigkeit der Impfstoff Wirksamkeit in diesem Modell2. Vor kurzem wurde die Fischer 344 Ratte als Modell für die Tularämie Impfstoff Entwicklung3entwickelt. Die Empfindlichkeit der Fischer 344 Ratte zu verschiedenen F. Tularensis Unterarten imitiert menschliche Sensibilität4, und Ratten geschützt werden können gegen F. Tularensis pulmonale Herausforderung durch Impfung mit einem Lebendimpfstoff Stamm bekannt, um zu schützen Menschen5,6,7. Da die Fischer 344 Ratte einige Features von F. Tularensis Infektion des Menschen modelliert, es möglicherweise ein äußerst nützliches Modell für die Entwicklung eines Impfstoffs, der gegen pulmonale F. Tularensis schützt Exposition.
Ein wirksamer Impfstoff muss zum Schutz der Menschen gegen pulmonale Exposition gegenüber F. Tularensis. Die wahrscheinlichste pulmonale Belichtung von weaponized F. Tularensis wäre Aerosol Bakterien in der Lunge8eingeatmet. Allerdings Aerosolerzeugung von F. Tularensis ist gefährlich und mühsam und erfordert eine spezielle Ausrüstung und Containment. Eine Alternative Route der pulmonalen Exposition bei der Ratte, das vielleicht mehr anpassungsfähig für mehrere Labore spezialisierten Ausrüstung fehlt über intratrachealen Impfung6. Diese Technik nutzt ein Laryngoskop für die korrekte Platzierung des Katheters in die Luftröhre von einem narkotisierten Ratte. Platzierung in der Trachea, anstatt der Speiseröhre wird durch ein einfaches Gerät überprüft, das Luftstrom aus der Lunge visualisiert. F. Tularensis erfolgt anschließend in die Lunge durch den Katheter durch Verwaltung mit einer Spritze, gefolgt von der Einführung der Luft in den Katheter, pulmonale Lieferung der Bakterien zu gewährleisten. Hingegen wird Jemski5 zuvor berichtet, dass F. Tularensis geimpft in Fischer 344 Ratten über die intranasale Route nicht von der Lunge bis 3 Tage nach dem Beimpfen kultiviert werden könnte, darauf hinweist, dass intranasale Impfung bei Ratten kein Resultat in Direktlieferung von Bakterien in die Lunge.
Wählen Sie Agent erfordern F. Tularensis (F. Tularensis Subspecies Tularensis, F. Tularensis Subspecies Holarctica) Biosafety Level 3 (BSL3) Containment Verfahren, die Videografie verhindern würde. F. Novicida (Fn) ist jedoch von select Agent-Status aufgrund seiner Avirulenz bei gesunden Menschen befreit, und sicher unter Biosafety Level 2 (BSL2) Bedingungen9,10genutzt werden. Darüber hinaus dient die Fn als Grundlage für die abgeschwächte Lebendimpfstoffe, die gegen F. Tularensis pulmonale Exposition im Auslieferungszustand über intratrachealen Impfung11,12,13schützen können. Die hier vorgestellten Technik ermöglicht die Studie von Infektionen, die durch die pulmonale Route nutzen Ratten als ein Modell für den Menschen auftreten. Diese Technik kann ohne die Notwendigkeit für Aerosol erzeugen Spezialgerät durchgeführt werden. FN diente die Techniken, die hier gedreht.
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Protocol
diese Arbeit erfolgte in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen in der Anleitung für die Pflege und Verwendung von Labortieren von den National Institutes of Health. Tierische Protokolle mit Nagetieren wurden genehmigt von der University of Texas at San Antonio institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) unter Protokoll MU009(RA).
1. bereiten Katheter, Luftröhre Indikator und F. Tularensis Inokulum
- Bereiten Katheter (20 x 2 Zoll)
- Cut 20 x 2 Zoll Nadel und Schleifen die Nadelspitze zu einem stumpfen und glatten finish mit einem Drehwerkzeug.
Hinweis: Die Länge der abgestumpften Nadel dürfen die Metallspitze, ca. 3 mm in die Katheter-Hülse bei vollständigem Aufliegen auf die abgestumpften Nadel zurückzutreten. Die abgestumpften Nadel gibt die Katheter strukturelle Steifigkeit zur Platzierung des Katheters in der Luftröhre zu ermöglichen, und das Fehlen der abgestumpften Nadelspitze ragen aus dem Katheter Ärmel verhindert Verletzungen zur Trachea. - Stumpfen Nadeln und Katheter mit 70 % Ethanol reinigen und sterilisieren unter UV-Licht für 15 min.
- Cut 20 x 2 Zoll Nadel und Schleifen die Nadelspitze zu einem stumpfen und glatten finish mit einem Drehwerkzeug.
- Bereiten Luftröhre Indikator
- trimmen eine 1.000 µL Pipettenspitze erlauben die Spitze zu sitzen in einer Katheter-Öffnung und eine luftdichte Abdichtung.
- Entfernen Sie einen Filter aus einer 200 µL Aerosol Barriere Pipettenspitze und innerhalb der zuvor zugeschnittenen 1.000 µL Pipettenspitze.
- Gewährleisten der Filter kann sich frei bewegen in die 1.000 µL Pipettenspitze wenn die Spitze Spitze nach unten gerichtet ist.
- F. Tularensis Inokulum
- wachsen F. Tularensis Belastung über Nacht auf entsprechende Nährbodenplatte bei 37 ° C. Kratzen ca. 100 µL der bakteriellen Rasen von der Agarplatte mit einer sterilen Schleife und verwenden, um eine 500 mL Erlenmeyerkolben mit 250 mL des entsprechenden flüssigen Wachstumsmedium impfen impfen (FN: tryptic Soy Bouillon (TSB) ergänzt mit 0,1 % L-Cystein Hydrochlorid Monohydrat) und inkubieren Sie schütteln über Nacht bei 37 ° c
Hinweis: F. Novicida in dem Video verwendet wurde angebaut, auf einer tryptic Soy Agar (TSA) Platte ergänzt mit 0,1 % L-Cystein Hydrochlorid Monohydrat. - Über Nacht gewachsenen Flüssigkultur 4.221 x g bei Raumtemperatur für 10 min Zentrifugieren und entfernen den Überstand ohne Unterbrechung der Bakterien-Pellet.
Achtung: Befolgen Sie Institution ' s Biosafety Empfehlungen überstand verwerfen. - Sanft wieder aussetzen der bakterielle Pellet mit 25 mL des entsprechenden flüssigen Medium (Fn: TSB ergänzt mit 0,1 % L-Cystein Hydrochlorid Monohydrat) mit 10 % Glycerin, mit einer Pipette 25 mL.
- Mit einer 1-mL-Pipette, aliquoten die resuspendierte Bakterienkultur in 500 µL-Aliquots in Fläschchen, Einfrieren in einem Trockeneis/Ethanol-Bad und Lagern bei-80 ° c
- Zu bestimmen, die Titer der gefrorenen Kultur Durchstechflaschen, entfernen Sie zwei gefrorenen Fläschchen bei-80 ° C gelagert, auf Eis auftauen und durchführen Verdünnungsreihen in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) gefolgt von Beschichtung auf geeigneten Wachstumsmedium (Fn: TSA mit 0,1 % L-Cystein Hydrochlorid). Sind die Platten inkubierten 24-48 h bei 37 ° C und Kolonie bildende Einheiten (KBE) werden zur Berechnung der Anzahl von bakteriellen Zellen innerhalb der gefrorenen Kultur Fläschchen (Durchschnitt von zwei Fläschchen) aufgezählt.
- Bereiten das bakterielle Inokulum von einem gefrorenen Fläschchen auf Eis auftauen und dann verdünnen die Kultur mit PBS auf die Endkonzentration von 10 7 KBE/100 µL. Das Inokulum sollte in einer Konzentration, die die gewünschte KBE in 100 µL erbringt (Endkonzentration von Glycerin in das Inokulum kann nicht mehr als 3 % sein, Erstickung der Ratte zu verhindern). Gefrorene Kultur Fläschchen bei-80 ° C gelagert können für bis zu sechs Monate nach der Zubereitung verwendet werden.
- wachsen F. Tularensis Belastung über Nacht auf entsprechende Nährbodenplatte bei 37 ° C. Kratzen ca. 100 µL der bakteriellen Rasen von der Agarplatte mit einer sterilen Schleife und verwenden, um eine 500 mL Erlenmeyerkolben mit 250 mL des entsprechenden flüssigen Wachstumsmedium impfen impfen (FN: tryptic Soy Bouillon (TSB) ergänzt mit 0,1 % L-Cystein Hydrochlorid Monohydrat) und inkubieren Sie schütteln über Nacht bei 37 ° c
2. Ratte Narkose
- verbinden die Anästhesie-Kammer zum richtig operative Isofluran Verdampfer von einem Anästhesiegerät.
- Verbinden das Gas Schlauch auf die Anästhesie-Kammer mit dem Gas System aufräumen aufräumen.
- Öffnen Sie die Sauerstoffzufuhr auf Anästhesiegerät, 4 L/min.
- Den Verdampfer Isoflurane auf 5 % festgelegt.
- Legen Sie die Ratte in der Anästhesie Kammer.
Hinweis: Wir nutzen in der Regel Ratten zwischen 8-10 Wochen alt (130-180 g); jüngere Ratten sind schwierig, über diese Technik aufgrund der geringen Größe der Mundhöhle impfen. - Wenn die Induktion der Anästhesie stattgefunden hat, pflegen die Ratte bei 5 % Isofluran, 2 L/min Sauerstoff zur Wirkung. Dieser Vorgang dauert ca. 3-10 min.
- Bestimmen Sie die Tiefe der Narkose durch die Qualität und die Rate von Atmung und Herzschlag und Reaktion auf reflex Stimulation wie die Zehe Kneiftest. Ideale Tiefe der Narkose wird durch 1-1,5 s Graf zwischen jedem Atemzug angezeigt.
3. Intratrachealen Impfung
- die Ratte aus der Anästhesie-Kammer und die Ratte dorsal am Nagetier Intubation Stand. Befestigen Sie die vorderen Zähnen der Ratte an den Halter Ratte in Position zu halten.
Hinweis: Wenn die Ratte anfängt, während des Verfahrens zu wecken, der Katheter entfernt werden und die Ratte nach der Anästhesie-Kammer, eine tiefere Ebene der Narkose zu erreichen. - Dominante Hand zu verwenden, um die Zunge auf derselben Seite wie Unterstützung Hand mit breiten Punkt Dressing Daumen Zange bewegen.
- Einsatz Hand zu unterstützen und sichern die Zunge mit dem Laryngoskop gegen die Ratte ' s Unterkiefer und visualisieren die Luftröhre und Speiseröhre des Tieres. Die Luftröhre öffnen und schließen, wie die Ratte atmet.
- Legen Sie der Katheter mit einem 20-stumpf-Nadel, im Schritt 1.1, in der Luftröhre vorbereitet. Möglicherweise gibt es leichter Widerstand, und Einfügen in Luftröhre möglicherweise " holprigen " aufgrund der Katheter die trachealen Knorpel reiben. Aufgrund von Feuchtigkeit oder flache Atmung kann die Luftröhre durch den Kehldeckel abgedeckt werden, die Visualisierung der Luftröhre verhindert. Sanft berühren den Rand des Knorpels Kehldeckel wird dazu führen, dass die Knorpel-Klappe öffnen und entdecken Sie die Luftröhre.
- Entfernen die stumpf-Nadel vom Katheter und gleichzeitig des Katheters in der Luftröhre bleibt.
- Warten Sie ein paar Sekunden übergeben für Ratte, um Katheter in Luftröhre atmen zu können.
- Sitz fest den Luftröhre Indikator auf den Katheter zu öffnen. Bewegung der Aerosol-Schranke zeigt der Katheter korrekt in die Luftröhre eingefügt wird.
- Sorgen dafür, dass die Ratte auf die Intubation Stand verlegen, so dass die Brust des Tieres senkrecht zur Ebene der Intubation Stand steht.
- Entfernen den Luftröhre-Indikator und liefern 100 µL (10 7 KBE) des Inokulums mit F. Tularensis mit einer 200 µL Pipettenspitze, fest sitzen die Spitze gegen den Katheter öffnen.
- Legen eine 1 mL Slip Tipp-Tuberkulin-Spritze mit Luft gefüllt und liefern 300 µL der Luft darauf Inokulum erreicht die Lungen der Ratte.
- Den Katheter aus der Luftröhre entfernen, und entfernen Sie die Ratte von der chirurgischen Plattform.
- Ermöglichen die Ratte zu wecken und zurück in den Käfig. Stellen Sie sicher, dass die Atmung normalisiert hat.
- Bestimmen die KBE in F. tularensis Inokulum wie in Schritt 1.3.5 bestätigen die KBE beschrieben geliefert in der Luftröhre.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.1-3.9 auf ungeimpfte (naive) Tiere mit 100 µL PBS anstelle das Inokulum.
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Representative Results
Die humorale Antwort auf intratrachealen Inokulation von F. Tularensis bei der Ratte durch Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA) gegen UV-inaktiviert Bakterien ermittelt werden wie oben beschrieben11. Insgesamt Immunglobulin G (IgG) Fischer 344 Ratten, inaktiviert, ganze Zelle Bakterien reagierten bewerteten Post-intratrachealen Impfung mit einem abgeschwächten Stamm von Fn (107 KBE Inokulum) an Tag 14 und Tag 28 (Abbildung 1). Mock-geimpft Ratten erhielten PBS Intratracheally. Ein Anstieg der Serum-Antikörper-Titer gegen Fn nach Inokulation relativ naiv Mock-geimpfte Tiere zeigt die intratracheale Impfung Wirksamkeit. Niedrige Reaktivität deutet auf falsche intratrachealen Platzierung.
Abbildung 1: Gesamt IgG Reaktionen auf abgeschwächte Fn intratrachealen Inokulation in F344 Ratten Leben. Seren von F344 Ratten (n = 5) inokulierten Intratracheally mit live abgeschwächt Fn Belastung (107 KBE) wurden für die Gesamt-IgG-Werte reaktiv mit ganze Zelle Fn an Tag 14 und Tag 28 nach Inokulation analysiert. Mock-geimpft (naive) Ratten (n = 5) waren beimpften Intratracheally mit PBS. Roter Bereich kennzeichnet Reaktivität des naiven Sera (F344 Ratten Mock-geimpft mit PBS). Die Fehlerbalken darzustellen SEM Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Die Fischer 344 Ratte gewinnt ein wichtiges Modell für Tularämie Impfstoff Entwicklung3. Exposition gegenüber F. Tularensis durch die pulmonale Route ist entscheidend für den Nachweis der Wirksamkeit gegen weaponized Form von F. Tularensis, da diese als Aerosole geliefert werden. Intratrachealen Inokulation der Ratte erleichtert gegenüber F. Tularensis ohne die Notwendigkeit für große, teure und komplizierte Aerosol erzeugt Ausrüstung der Ratte Lunge. Alle Versuche, die Nutzung ausgewählter Agent Formen der F. Tularensis zusätzlich erfordern BSL3 Containment, die in der Regel stark eingeschränkt Raum auftritt. Diese Technik minimiert somit die Zusatzgeräte, die in diesem Arbeitsumfeld untergebracht werden muss.
Da Fn der F. Tularensis Stamm für die Videografie genutzt wurde, wurden alle Techniken unter BSL2 Containment durchgeführt. Anpassung dieser Technik für die Umwelt BSL3 umfasst alle Verfahren, die innerhalb eines Biosafety Kabinett von Personal tragen Biosafety Getriebe (volle Haube, powered Luft reinigende Maske (PAPR), Schutzhülle mit Haube, Handschuhe, Booties), durchgeführt und diese Anpassungen reduzieren, Beweglichkeit, Geschicklichkeit und Sichtbarkeit. Die Luftröhre-Indikator ist ein wichtiger Bestandteil, der die Bestätigung erlaubt, dass der Katheter richtig, innerhalb der Luftröhre platziert wurde, wenn man bedenkt, dass es oft schwierig, sonst diese Entschlossenheit, wenn BSL3 Bedingungen arbeiten.
Es gibt anatomisch korrekte Ratte "Simulatoren", die eine Luftröhre und Speiseröhre, und diese sind nützlich, um die Technik vor der Arbeit mit lebenden Tieren zu perfektionieren. Arbeiten mit dem Simulator ist jedoch nicht identisch mit einer live Ratte zu arbeiten. Ein Mittel, um festzustellen, ob diese Technik im lebenden Tier korrekt durchgeführt wird ist, verwenden Trypan blau Farbstoff als Inokulum auf einem narkotisierten Ratte, und nach dem Eingriff sofort einschläfern des Tieres. Dissektion des Lungengewebes und Magen wird zeigen, ob der Farbstoff in der Lunge und nicht der Speiseröhre geliefert wurde. Eine Ratte, die mit Fn/Ft ist, durch diese Technik geimpft worden kann auch kurz nach der Impfung und das Lungengewebe vergoldet um tatsächliche Ablagerung innerhalb der Lunge festzustellen eingeschläfert werden.
Richtige intratrachealen Inokulation werden wichtig für die Bewertung der Tularämie Impfstoffwirksamkeit bei Fischer 344 Ratten, aber es kann auch nützlich sein für andere Impfstoff und/oder therapeutische Anwendungen bei Ratten, einschließlich Biodefense. So kann diese Technik anpassbar an eine Vielzahl von pulmonalen Anwendungen unter Verwendung der Rattenmodell sein. Während Lieferung durch Aerosol erzeugt Gerät ähnelt mehr einem Biothreat Szenario sein kann, stellt die intratracheale Impfung von F. Tularensis eine relativ einfache und kostengünstige Alternative für die Impfstoffentwicklung Tularämie.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben
Acknowledgments
Diese Studie wurde unterstützt durch die Verteidigung Bedrohung Reduktion Agency (DTRA) unter Vertrag HDTRA1-14-C-0116 und Center for Excellence in der Infektion Genomik (DOD #W911NF-11-1-0136).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GreenLine fiber optic blade size 0 | Carefusion | 5-5231-00 | Macintosh American profile |
| GreenLight system laryngoscope handle | Carefusion | 4559GSP | |
| Exel International Safelet I.V. Catheter | EXEL INTERNATIONAL | 26743 | |
| Slip Tip Sterile Syringes 1mL | BD | 309659 | |
| Broad Point Dressing Thumb Forceps | Thermo Scientific | 76-302 | |
| 200 μL barrier tip | GeneseeScientific | 24-142 | |
| 1,000 μL pipette tip | Olympus Plastics | 24-173 | |
| Dremel 3000-2/28 Rotary tool kit | Dremel | 3000228 | |
| Rodent Intubation Stand | Braintree Scientific | RIS 200 | |
| Isoflurane | Butler Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| Rodent anesthesia machine | Surgivet | VTC302 Classic T3 | |
| Rodent Anesthesia chamber | Braintree Scientific | AB 1 |
References
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