Summary
このプロトコルを記述する Fischer 344 ラット気管内接種野兎病菌。この手順は、この潜在的な生物脅威エージェントに人間の肺の露出を模倣し、ワクチンと肺野兎病に対する治療の有効性テストに使用することができます。
Abstract
野兎病菌菌と呼吸器感染症は、野兎病は、人間の深刻な潜在的に致命的な病気につながることができます。人間のための承認された野兎病ワクチンの現在の不足は、適切な動物モデルを利用したワクチンの開発を中心に研究。Fischer 344 ラットは、 F. へい死感染に対するヒトの感受性を反映し、したがって野兎病ワクチン開発のための魅力的なモデルは、モデルとして登場しました。F. へい死Fischer 344 ラットの気管内の接種は、人間の肺の露出を模倣します。ラット気管内に正常に配信は肺にとって重要です。麻酔下ラットの気管を正しく挿管する照明と喉頭鏡を使用します。気管内で適切な配置は、呼吸を検出する単純なデバイスによって決まります。挿管、に従ってF. へい死文化は注射器で測定された線量で配信されます。この手法は、ワクチンの有効性を評価するラット気管内・ f ・へい死の肺の配信を標準化します。
Introduction
F. へい死(Ft) は、人間の病気を引き起こす野兎病。細菌は肺のルートを通じて取得した、これは高い罹患率と死亡率1のある肺の野兎病につながります。F. へい死は噴霧のフォームに関連付けられた危険のための生物脅威エージェントをみなされており、米国の人間の使用が承認されたワクチンは現在ありません。ワクチンと治療肺野兎病、この細菌の生物脅威の不正な使用に対する人間の人口を保護するために対策を開発する、集中的な努力が現在進行中。
F. へい死感染マウスの極度な感度と試薬の有病率が原因でマウス モデル、野兎病の研究の多く集中しています。ただし、マウスはこのモデル2ではワクチンの有効性を示すことの難しさのためのワクチン開発のための困難なモデルであると証明しました。最近では、Fischer 344 ラットは野兎病ワクチン開発3のモデルとしました。F. へい死のさまざまな亜種の Fischer 344 ラットの感受性を模倣人間感度4、ラット保護可能なF. へい死肺挑戦に対して予防接種によって保護するために知られている生ワクチン株人間5,6,7。肺F. へい死を防ぐワクチンの開発のための非常に有用なモデルがありますので Fischer 344 ラットのモデル人間のF. へい死感染症のいくつかの機能は、露出。
効果的なワクチンは、 F. へい死する肺の露出から人間を守る必要があります。8肺に吸い込んだ噴霧の細菌兵器F. へい死から最も可能性の高い肺の露出。しかし、 F. へい死のエアロゾル生成危険で面倒なは、専用の装置と封じ込めが必要です。代替ルートはおそらくもっとラット肺の露出の複数の研究所に適応できる特殊な装置に欠けているが気管内接種6を介して。この方法は、麻酔したラットの気管内カテーテルの正しい配置のため喉頭鏡を利用しています。食道ではなく気管内への配置は、肺から空気の流れを可視化する単純なデバイスによって検証されます。その後、管理によっては、注射器で細菌の肺の配信を確保するためのカテーテルに空気の導入が続いてのカテーテルを通して肺に配信F. へい死が使用されます。Jemski5 3 日後接種までにF. へい死経鼻ルート経由で Fischer 344 ラットに接種し, 肺から培養されなかったことを報告した、ラットの鼻腔内接種を示すは対照的に、肺に細菌の直接配信でない結果。
F. へい死(F. へい死したへい死、 F. へい死したholarctica) の選択のエージェントのフォームでは、バイオ セーフティ レベル 3 (BSL3) 封じ込めプロシージャは、ビデオ撮影を妨げる必要があります。ただし、 f. novicida (Fn) は健康な人間にその非病原性による選択エージェントの状態から免除されている、バイオ セーフティ レベル 2 (BSL2) 条件9,10の下で安全に利用することができます。また、Fn は弱毒生ワクチン気管内接種11,12,13を介して配信F. へい死肺露出に対して守ることができるための基礎として機能します。ここで示した手法は、人間のためのモデルとしてラットを用いた肺のルートによって発生する感染症の研究のためことができます。この手法は、専門のエアロゾルを生成する装置を必要とせず実行できます。Fn は、ここで撮影テクニックに使われました。
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Protocol
ケアと国立衛生研究所の実験動物の使用のためのガイドの推奨事項に従い、本研究が行われました。齧歯動物を含む動物のプロトコルがプロトコル MU009(RA) の下で承認されたテキサス大学サンアントニオ機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC).
1 準備カテーテル、気管のインジケーター、および f. へい死 接種
- (20 x 2 の) 準備カテーテル
- カット 20 × 2 針で鈍いし、滑らかな針の先端の仕上げ研磨、。ロータリー ツール
。 注: 鈍い針の長さは、カテーテル スリーブ鈍い針に完全に装着されているときに約 3 mm の取消しの金属チップをようにします。鈍い針気管内カテーテルの配置を許可するカテーテルの構造剛性を与えるし、カテーテル スリーブから突き出ている鈍い針先の不在気管の損傷を防止します 。
- 鈍い針、70% エタノールを使用してカテーテルをきれいにし 15 分の紫外光下で滅菌
- カット 20 × 2 針で鈍いし、滑らかな針の先端の仕上げ研磨、。ロータリー ツール
- 気管インジケーターの準備
- カテーテルの開口部に座るし、気密シールを形成するヒントを許可する 1,000 μ L ピペット チップをトリムします 。
- 200 μ L エアゾール バリア ピペット チップと以前トリミング 1,000 μ L ピペット チップ内からフィルターを削除します 。
- 先端は先端ダウンを指摘したとき、1,000 μ L ピペット チップ内自由にフィルターが移動できることを確認します 。
- F. へい死 菌
- 37 で適切な寒天プレート上で一晩成長 F. へい死 ひずみ ° C. こすり約 100 μ L から、寒天培地を滅菌の細菌の芝生のループ再接種および接種 500 mL 三角フラスコ 250 mL 適切な液体の成長媒体を含む使用 (fn: トリプシン大豆スープ (TSB) 0.1 %l-システイン塩酸塩一水和物添加) 37 で一晩中揺れを孵化と ° C
注: f. novicida ビデオで使用される 0.1 %l-システイン塩酸塩一水和物と補われるトリプシン大豆寒天 (TSA) 版で育った 。
- 4,221 x g で 10 分間室温で一晩かけて栽培液体培養を遠心し、細菌ペレットを中断せず、上澄みを削除します
。 注意: 機関に従ってください ' 上澄みを廃棄するバイオ セーフティ推奨値 。
- 優しく適切な液体培地を 25 mL の細菌の餌を再停止 (Fn: 0.1 %l-システイン塩酸塩一水和物と補われた TSB) 25 mL のピペットを使用して 10% グリセロールを含んでいます 。
- 1 mL ピペット、バイアル、500 μ 因数に再懸濁培養の約数を使用してドライアイス/エタノールお風呂に凍結し、-80 デパート ° C 冷凍文化バイアルの価を決定する
- -80 ° C で保存されている 2 つの凍結バイアルを削除、氷の上を解凍、実行のシリアル希薄でリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 適切な成長媒体でめっきが続く (Fn: 0.1% を含む TSA L-システイン塩酸塩)。プレートは 37 ° C で培養 24-48 h、冷凍文化バイアル (2 つのバイアルの平均) 内の細菌のセルの数を計算するコロニー形成単位 (CFU) を列挙します 。
- は、氷の上の凍結バイアルを融解して、菌を準備し、最終濃度 10 7 CFU/100 μ L の PBS の文化を希釈しています。接種は 100 μ L の目的 CFU をもたらす濃度にする必要があります (最終接種内グリセロール濃度ラットの窒息を防ぐために 3% 以上にすることはできません)。-80 ° C で保存冷凍文化バイアル調製後 6 ヶ月間使用できます 。
- 37 で適切な寒天プレート上で一晩成長 F. へい死 ひずみ ° C. こすり約 100 μ L から、寒天培地を滅菌の細菌の芝生のループ再接種および接種 500 mL 三角フラスコ 250 mL 適切な液体の成長媒体を含む使用 (fn: トリプシン大豆スープ (TSB) 0.1 %l-システイン塩酸塩一水和物添加) 37 で一晩中揺れを孵化と ° C
2。麻酔ラット
- 麻酔器の正常に動作のイソフルラン気化器に麻酔室を接続します 。
- ガス清掃清掃システム ガス麻酔室にチューブを接続します 。
- 4 L/分に麻酔器に酸素の流れを開く
- イソフルラン気化器を 5% に設定します 。
- 麻酔室にネズミを配置します
。 メモ: 我々 は通常 8-10 週齢 (130-180 g); 間ラットを利用します。若いラットは、口腔内の小さなサイズのためこの手法で接種することは困難です 。
- 麻酔導入が行われたときは、5% イソフルランのラット、効果を 2 L/分の酸素を維持します。これが約 3 ~ 10 分かかります
- は、品質と呼吸と心拍やつま先ピンチ テストのように反射の刺激への反作用の率によって麻酔の深さを決定します。理想的な麻酔深度は各呼吸間 1 1.5 s の数で示されます 。
3。気管内接種
- 外してラット麻酔室から、ラット背側上齧歯動物挿管スタンド。ネズミの前歯を付ける場所にラットを保管するホルダー
。 注: ラットはプロシージャの間に目覚めさせる起動する場合カテーテルを削除することができ、ラットの麻酔の深い面に到達する麻酔室に返されます 。
- 利き手を使用して広いポイント ドレッシング親指鉗子で舌をサポートの手と同じ側に移動します 。
- 使用の手をサポートし、ラットに対する喉頭鏡で舌を保護 ' s 下顎し、気管と動物の食道を可視化します。気管が開けて、ラット呼吸閉じます 。
- 挿入含む 20 ゲージ鈍化-針、カテーテルは気管に 1.1、ステップで準備。わずかな抵抗があるし、気管に挿入があります " でこぼこ " カテーテルを気管軟骨の摩擦が原因。水分や浅い呼吸、気管の可視化を防ぐ喉頭蓋で気管を覆うことができます。喉頭蓋軟骨の端に軽く触れるを開き明らかに気管軟骨フラップになります 。
- 気管内カテーテルを確保しながらカテーテルから鈍化針のまま削除します 。
- ラット気管に挿入されるカテーテルの周囲から呼吸することができるために渡すために数秒を許可します 。
- をしっかりと開いてカテーテルを気管インジケーター。カテーテルが気管内に正しく挿入されてエアロゾル バリアの動きがわかります 。
- 動物の胸部は挿管スタンドの平面に垂直に直面しているような挿管スタンドにラットを敷設することを確認します 。
- 気管インジケーターを削除し、100 μ L (10 7 CFU) F. へい死 200 μ L ピペット チップを使用してを含む菌の座席に対してカテーテル開口部先端がしっかりとします 。
- 空気で満たされた 1 mL スリップ チップ ツベルクリン注射器を接続し、300 μ L 接種ラットの肺に届く空気の 。
- 気管からカテーテルを外し、手術のプラットフォームからラットを削除します 。
- は、目覚めさせ、ケージに戻るラットを許可します。呼吸が正常に戻ったことを確認してください 。
- ・ f ・へい死 で CFU を決定します。1.3.5 CFU を確認するための手順の説明に従って接種気管内配信 。
- でワクチン接種 (純真な) 動物接種の代わりに 100 μ L の PBS 手順 3.1 3.9 。
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Representative Results
F. へい死のラットでの気管内接種に対する体液性応答することができます紫外線不活化細菌に対する酵素免疫測定法 (ELISA) によって決定される11を前述のよう。不活化全細胞細菌に Fischer 344 ラットの総免疫グロブリン G (IgG) の応答は Fn の弱毒株の評価記事を気管内接種 (107 CFU 接種) 14 日と日 28 (図 1)。模擬接種ラットは、PBS 気管内投与を受けた。素朴な模擬接種動物を基準にして Fn 後接種に対する血清抗体価の上昇は、気管内のワクチン接種の有効性を示します。低血清の反応性は、不正な気管内配置を可能性があります。
図 1: 総 IgG F344 ラットにおける弱毒 Fn 気管内接種レスポンス。F344 ラットの血清 (n = 5) ライブの接種気管内弱毒 Fn (107 CFU) 14 日と 28 日後の接種で総 igg 全セル Fn と反応分析を行った。模擬接種 (世間知らず) ラット (n = 5) PBS の接種気管内投与をしました。赤の領域は、素朴な血清 (PBS を模擬接種 F344 ラット) の反応性を示します。誤差範囲を表す SEMこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
Fischer 344 ラットは、野兎病ワクチン開発3重要なモデルになっています。これらはエアロゾルとして配信されるので、 F. へい死の兵器形態に対する有効性を示すため肺のルートを通じてF. へい死する露出が欠かせません。ラットの気管内投与は、大型、高価、複雑なエアロゾル発生装置を必要とせずF. へい死するラット肺の露出を促進します。F. へい死の選択エージェント フォームをさらに活用したすべての実験には、BSL3 コンテインメントでは、通常、厳しく制限された空間で発生しますが必要があります。したがって、この手法は、作業環境の内で収容される必要があります追加の機器の量を最小限に抑えます。
Fn はビデオ撮影のために利用・ f ・へい死ひずみは、すべてのテクニックを BSL2 包含の下で行った。BSL3 環境にこの技術のにはバイオ セーフティ キャビネット内バイオ ギア (完全フード、セルフパ ワード空気浄化呼吸 (PAPR)、フード, 手袋, ブーツとすべて保護カバー)、身に着けている担当者によって実行されるすべてのプロシージャが含まれていますこれらの適応は、モビリティ、敏捷、そして視認性を減らします。気管マークは BSL3 条件下で作業する場合それ以外の場合この決定をすることは困難、多くの場合を検討して、気管内カテーテルが正しく格納されたことの確認を可能にする重要なコンポーネントです。
解剖学的に正しいラット「シミュレータ」、気管と食道があり、これらは、生きている動物を操作する前に技術を完璧に便利。ただし、シミュレータの操作はライブのラットでの作業と同じではありません。かどうかこの手法は生きている動物で正しく実行されますを決定する一つの手段は、麻酔したラットの感染源としてトリパン ブルー色素を利用し、手順の後すぐに、動物を安楽死させるです。肺と胃の解剖は、肺に食道ではなく染料が配信されたかどうかは明らかになります。Fn/フィートでこの手法によりワクチンを接種されているラットは、接種と肺組織の肺内沈着を実際に決定するメッキ直後も安楽死することができます。
正しい気管内接種は Fischer 344 ラットにおける野兎病ワクチンの有効性の評価に重要になりますが、他のワクチンや生物兵器防衛を含むだけでなく、ラットの治療への応用に有用なもあります。したがって、この手法は様々 な肺を利用したラットのモデルに適応できます。デバイスの生成、エアロゾルによる配信より生物脅威シナリオのようかもしれないが、 F. へい死の気管内投与は野兎病ワクチン開発のための比較的簡単で、コスト効率の高い代替を表します。
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Disclosures
著者がある何も開示するには
Acknowledgments
本研究は、契約 HDTRA1-14-C-0116 防衛脅威削減局 (DTRA) と感染症ゲノム (国防総省 #W911NF-11-1-0136) の卓越性のための中心によって支持されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GreenLine fiber optic blade size 0 | Carefusion | 5-5231-00 | Macintosh American profile |
| GreenLight system laryngoscope handle | Carefusion | 4559GSP | |
| Exel International Safelet I.V. Catheter | EXEL INTERNATIONAL | 26743 | |
| Slip Tip Sterile Syringes 1mL | BD | 309659 | |
| Broad Point Dressing Thumb Forceps | Thermo Scientific | 76-302 | |
| 200 μL barrier tip | GeneseeScientific | 24-142 | |
| 1,000 μL pipette tip | Olympus Plastics | 24-173 | |
| Dremel 3000-2/28 Rotary tool kit | Dremel | 3000228 | |
| Rodent Intubation Stand | Braintree Scientific | RIS 200 | |
| Isoflurane | Butler Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| Rodent anesthesia machine | Surgivet | VTC302 Classic T3 | |
| Rodent Anesthesia chamber | Braintree Scientific | AB 1 |
References
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