Summary
이 프로토콜 설명으로 Fischer 344 쥐의 예방 접종 intratracheal Francisella tularensis. 이 이렇게 모방이 잠재적인 biothreat 에이전트에 인간의 폐 노출 백신과 폐 tularemia에 대 한 치료 효능을 테스트 하는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
폐 감염 박테리아 Francisella tularensis 심각 하 고 잠재적으로 치명적인 질병, tularemia, 인간에서 발생할 수 있습니다. 인 간에 대 한 승인된 tularemia 백신의 현재 부족, 연구는 적절 한 동물 모델을 활용 하 여 백신 개발에 집중 된다. Fischer 344 쥐 인간의 F. tularensis 감염 민감성을 반영 하 고 따라서 tularemia 백신 개발을 위한 매력적인 모델 하는 모델로 떠오르고 있다. F. tularensis 와 Fischer 344 쥐의 Intratracheal 접종 모방 인간에서 폐 노출 합니다. 쥐 기관지에 성공적인 배달 폐 배달을 위해 중요 하다. 조명으로 후 두 경 제대로 마 취 쥐;의 기관을 넣어야 하는 데 사용 됩니다. 기관 내에서 정확한 위치 호흡을 감지 하는 간단한 장치에 의해 결정 됩니다. 삽 관 법, 따라 F. tularensis 문화는 주사기를 통해 측정 된 복용량에 전달 됩니다. 이 기술은 표준화 백신 효능 평가 하 쥐 기관지 내 F. tularensis 의 폐 전달 합니다.
Introduction
F. tularensis (피트) 인간의 질병의 원인 tularemia. 박테리아는 폐 경로 통해 획득 하는 경우는 높은 사망률 및 사망1폐 렴 성 tularemia을이 끈다. F. tularensis aerosolized 형태와 관련 된 위험으로 인해 biothreat 에이전트 간주 됩니다 그리고 현재 미국에서 인간 사용을 위해 승인 없는 백신 집중 노력 백신 및 치료 대책이 세균성 biothreat의 불법 사용에 대 한 인간의 인구를 보호 하기 위해 폐 렴 성 tularemia 개발 진행 현재입니다.
Tularemia 연구의 많은 마우스 모델의 F. tularensis 감염, 생쥐의 극단적인 감도 및 시 약의 보급에 집중 했다. 그러나, 쥐가 모델2백신 효능을 입증의 어려움으로 인해 백신 개발에 대 한 어려운 모델을 입증 했다. 최근, Fischer 344 쥐 tularemia 백신 개발3모델로 개발 되었습니다. 다양 한 F. tularensis 종에 Fischer 344 쥐의 감도 인간의 감도4, 모방 및 쥐 보호 될 수 있다 F. tularensis 폐 문제에 대 한 예방 접종에 의해 보호 하기 위해 알려진 라이브 백신 긴장으로 인간5,,67. Fischer 344 쥐 인간의 F. tularensis 감염의 일부 기능 모델, 폐 F. tularensis 으로부터 보호 하는 백신의 개발에 대 한 매우 유용한 모델 수 있습니다 노출.
효과적인 백신 F. tularensis폐 노출에 대 한 인간을 보호 하기 위해 필요 합니다. 무기 F. tularensis 에서 대부분 폐 노출 aerosolized 박테리아 폐8에 흡입 될 것 이다. 그러나, F. tularensis 의 어로 졸 생성 위험 하 고 복잡 하며 전문된 장비 및 포함. 대체 경로 아마도 더 쥐에서 폐 노출의 여러 실험실에 대 한 적응력이 부족 한 전문된 장비는 intratracheal 접종6통해. 이 기술은 마 취 쥐의 기관지 내 카 테 터의 올바른 배치에 대 한 후 두 경을 사용합니다. 기도, 식도, 보다는 오히려 내의 배치는 폐에서 공기를 시각화 하는 간단한 장치에 의해 확인 됩니다. F. tularensis 는 이후 주사기, 카 테 터는 박테리아의 폐 전달 되도록에 공기의 도입 선행으로 관리 하 여 카 테 터를 통해 폐로 전달. Jemski5 이전 그 F. tularensis intranasal 노선을 통해 Fischer 344 쥐에 주사 수 없습니다 수 교양 폐에서 3 일 후 접종까지 보고, 쥐에서 그 intranasal 접종을 나타내는지 않습니다 하는 반면, 하지 직접 전달에서의 결과 폐에 박테리아.
F. tularensis (F. tularensis subsp. tularensis, F. tularensis subsp. holarctica) 형태의 선택 에이전트 Biosafety 수준 3 (BSL3) 견제 절차, videography 방지 하는 필요 합니다. 그러나, F. novicida (Fn) 선택 에이전트 상태 건강 한 인간, 그것의 avirulence 때문에 면제 이며 Biosafety 수준 2 (BSL2) 조건9,10에서 안전 하 게 이용 될 수 있다. 또한, Fn F. tularensis 폐 노출 intratracheal 접종11,,1213를 통해 전달 하는 경우에 대하여 보호할 수 있는 라이브 감쇠 백신에 대 한 기준 역할을 합니다. 여기에 제시 된 기술은 인간을 위한 모델 쥐를 이용 하 여 폐 경로 통해 발생 하는 감염의 연구에 대 한 수 있습니다. 이 기술은 특수에 어로 졸 생성 장비에 대 한 필요 없이 수행할 수 있습니다. Fn는 여기 촬영 기술을 위해 사용 되었다.
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Protocol
이 작업 치료와 국립 보건원의 실험 동물의 사용에 대 한 가이드에서 권장에 따라 수행 되었다. 설치류와 관련 된 동물 프로토콜 프로토콜 MU009(RA) 텍사스 대학 샌 안토니오 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 했다.
1. 카 테 터 준비, 기도 표시기와 F. tularensis Inoculum
- 준비 테 (20 G x 2에서)
- 잘라 바늘에 무딘 하 고 부드러운 바늘의 팁으로 마무리 갈기 20 G x 2는 로타리 도구.
참고: 무딘된 바늘의 길이 완전히 무딘된 바늘에 장착 하는 경우 카 테 터 소매에 약 3 mm를 폐지 하는 금속 팁을 허용 해야 합니다. 무딘된 바늘 카 테 터 구조 강성 기도에 카 테 테 르의 배치 허용을 제공 하 고 카 테 테 르 소매에서 튀어나와 무딘된 바늘 팁의 부재 기도에 부상 방지. - 무딘된 바늘과 70% 에탄올을 사용 하 여 카 테 터를 청소 하 고 15 분의 자외선 아래 소독
- 잘라 바늘에 무딘 하 고 부드러운 바늘의 팁으로 마무리 갈기 20 G x 2는 로타리 도구.
- 준비 기도 표시기
- 트림 테 오프닝에 앉아서는 공기 단단한 물개를 형성 하는 팁을 수 있도록 1000 µ L 피 펫 팁.
- 200 µ L 졸 장벽 피 펫 팁 및 장소 이전 트림된 1000 µ L 피 펫 팁 내부에서 필터 제거.
- 팁 팁 다운 지적 이다 때 필터 1000 µ L 피 펫 팁 안에 자유롭게 이동할 수 있도록.
- F. tularensis Inoculum
- 37에 적절 한 천 배지에서 하룻밤 성장 F. tularensis 스트레인 ° C. 다쳤어요 약 100 µ L로는 살 균 한 천 배지에서 세균성 잔디의 접종 루프를 사용 하 여 포함 하는 적절 한 액체 성장 매체의 250 mL 삼각 플라스 크 500ml 접종 (Fn에 대 한: tryptic 간장 국물 (TSB) 0.1 %L-시스테인 염 산 일 수화물 보충)와 37에서 밤새 흔들어 품 어 ° c.
참고: F. novicida는 비디오에 사용 되는 0.1 %L-시스테인 염 산 일 수화물 보충 tryptic 간장 agar (TSA) 접시에 성장 했다. - 하룻밤 성장된 액체 문화 10 분 동안 실 온에서 4,221 x g에서 원심 및 박테리아 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한 제거.
주의: 따르십시오 기관 ' s biosafety 권장 사항 폐기 상쾌한. - 부드럽게 다시 일시 중지 적절 한 액체 매체의 25 mL와 함께 세균 펠 릿 (Fn: 0.1 %L-시스테인 염 산 일 수화물 보충 하는 TSB) 25 mL 피 펫을 사용 하 여 10% 글리세롤을 포함.
- 1 mL 피 펫, 약 병에 500 µ L aliquots에 resuspended 세균성 문화 수를 사용 하 여 드라이 아이스 또는 에타 놀 목욕에서 동결 하 고-80에서 저장 ° c.
- 언된 문화 튜브의 titer를 확인 하려면 두 언된 튜브-80 ° C에 저장 된 제거, 얼음에 녹여 및 직렬 희석에 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 적절 한 성장 매체에 도금 하 여 다음을 수행 (Fn: 0.1%를 포함 하는 TSA L-시스테인 염 산 염)입니다. 격판덮개는 37 ° C에서 incubated 24-48 h 및 콜로 니 형성 단위 (CFU) 냉동된 문화 튜브 (두 병의 평균) 내의 세균 세포의 수를 계산 하려면 열거 됩니다.
- 녹고 얼음, 냉동된 유리병으로 세균 inoculum을 준비 하 고 10 7 CFU/100 µ L의 최종 농도에 PBS 가진 문화를 희석. inoculum 100 µ L에서 원하는 CFU 보장할 농도에 있어야 한다 (는 inoculum 내 글리세롤의 최종 농도 쥐의 질을 방지 하기 위해 이상 3%, 수 없습니다). -80 ° C에 저장 하는 냉동된 문화 튜브 준비 후 최대 6 개월까지 사용할 수 있습니다.
- 37에 적절 한 천 배지에서 하룻밤 성장 F. tularensis 스트레인 ° C. 다쳤어요 약 100 µ L로는 살 균 한 천 배지에서 세균성 잔디의 접종 루프를 사용 하 여 포함 하는 적절 한 액체 성장 매체의 250 mL 삼각 플라스 크 500ml 접종 (Fn에 대 한: tryptic 간장 국물 (TSB) 0.1 %L-시스테인 염 산 일 수화물 보충)와 37에서 밤새 흔들어 품 어 ° c.
2. 마 취를 쥐
- 제대로 운영 isoflurane 기화 기는 마 취 기계 마 취 실 연결.
- 연결 시스템을 청소 하는 가스 마 취 챔버에 튜브를 청소 하는 가스.
- 4 L/분에 마 취 기계에 산소 흐름을 엽니다
- Isoflurane 기화 기 5%로 설정.
- 마 취 약 실에 있는 쥐를 놓습니다.
참고: 우리는 일반적으로 8-10 주 오래 된 (130-180 g); 사이 쥐 활용 젊은 쥐는 입 구멍의 작은 크기 때문에이 기술을 통해 접종 어렵다. - 마 취의 유도, 자리를 차지 하는 경우 5 %isoflurane 쥐, 2 L/min에 산소 효과를 유지 합니다. 이 대해 3-10 분 걸립니다
- 품질 및 호흡 및 심장 박동, 그리고 발가락 꼬 집 음 시험에서 반사 자극에 반응의 속도 의해 마 취의 깊이 결정합니다. 마 취의 이상적인 깊이 각 호흡 사이 1-1.5의 수로 표시 됩니다.
3. Intratracheal 접종
- 마 취 약 실에서 쥐를 제거 하 고 쥐 삽 관 법에는 쥐를 dorsally 장소. 쥐의 앞 니 자리에 쥐를 잡으려고 홀더 연결.
참고: 쥐 절차 동안 자각을 시작, 카 테 터를 제거할 수 있습니다 고 쥐에 마 취의 깊이 비행기를 도달 하는 마 취 챔버. - 지배적인 손을 지원 손 같은 쪽에 넓은 포인트 드레싱 집게 손가락으로 혀를 사용 하 여.
- 사용 손 지원 하 고 쥐에 대 한 후 두 경으로 혀를 보안 ' s 낮은 턱 및 기관지와 식도 동물의 시각화. 기도 열리고 쥐 통풍으로 닫습니다.
- 삽입 카 테 테 르 바늘-20 게이지 무딘를 포함 하는 단계 1.1, 기관에서에서 준비 하 고. 약간의 저항이 있을 수 있습니다 및 기관지로 삽입 될 수 있습니다 " 울 퉁 불 퉁 " 테 바르고 tracheal 연골 때문. 습기 또는 얕은 호흡, 기도 기도의 시각화를 방지 하는 후두개에 의해 덮여 수 있습니다. 열고 기도 밝히기 연골 플랩 하면 후두개 연골의 가장자리를 부드럽게 만지고.
- 제거 하면서 테 테에서 무딘 바늘 기도에 남아 있다.
- 쥐를 기관지에 삽입 된 카 테 터 주위 호흡 수를 전달 하는 몇 초 수.
- 단단히 여 카 테 터에 기관 표시기 좌석. 졸 방 벽의 운동 테 기도에 올바르게 삽입 하는 것을 나타냅니다.
- 동물의 가슴 삽 관 법의 평면에 수직으로 직면 하 고 그런 쥐 삽 관 법 대에 누워 있다 확인 하십시오.
- 기관 표시기를 제거 하 고 100 µ L를 제공 (10 7 CFU) F. tularensis 200 µ L 피 펫 팁을 사용 하 여 포함 된 inoculum의 단단히 석 카 테 터 오프닝에 대 한 팁.
- 공기 가득한 1 mL 슬립 팁 투베르쿨린 주사기를 연결 하 고 inoculum 쥐의 폐에 도달 되도록 공기의 300 µ L 제공.
- 기도에서 카 테 터를 제거 하 고 수술 플랫폼에서 쥐를 제거.
- 자각 하는 감 금 소도 돌아갑니다 쥐를 수 있습니다. 호흡이 정상으로 돌아왔다는 있는지 확인 하십시오.
- 결정에 F. tularensis CFU 기도에 inoculum 1.3.5 CFU 확인 단계에서 설명한 대로 배달.
- 는 inoculum 대신 100 µ L PBS 가진 unvaccinated (순 진) 동물에 3.1 3.9 단계를 반복.
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Representative Results
쥐에 F. tularensis 의 intratracheal 접종에 체액 반응 UV 활동 되지 않 ㄴ 박테리아에 대 한 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA)에 의해 결정 될 수 있다11위에서 설명한 대로. 사 전체 셀 박테리아 Fischer 344 쥐의 총 면역 글로불린 G (IgG) 응답은 Fn의 감쇠 긴장 평가 게시물-intratracheal 접종 (107 CFU inoculum) 14 일과 하루 28 (그림 1)에서. Mock 접종 쥐 PBS intratracheally를 받았다. 순진한 모의 예방 접종 동물 기준으로 Fn 후 접종에 대 한 혈 청 항 체 titers 증가 intratracheal 백신 효능을 나타냅니다. 낮은 혈 청 반응 잘못 된 intratracheal 배치를 나타낼 수 있습니다.
그림 1: 총 IgG F344 쥐에 살고 있는 감쇠 Fn Intratracheal 접종에 대 한 응답. F344 쥐에서 세라 (n = 5) 라이브와 함께 접종된 intratracheally 감쇠 Fn 스트레인 (107 CFU) 14 일과 28 일 후 접종에서 총 IgG 레벨 전체 셀 Fn과 반응성에 대 한 분석 했다. Mock 예방 접종 (순) 쥐 (n = 5) PBS와 접종된 intratracheally 했다. 빨간 지역 순 세라 (F344 쥐 PBS와 모의 예방 접종)의 반응성을 나타냅니다. 오차 막대는 SEM. 대표 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
Fischer 344 쥐 tularemia 백신 개발3에 대 한 중요 한 모델이 되 고 있다. F. tularensis 폐 경로 통해 노출은 이러한에 어로 졸으로 전달 하는 때문에 F. tularensis의 무기 형태에 대 한 효능을 보여주는 중요 합니다. 쥐의 Intratracheal 접종 생성 장비, 비싼, 크고 복잡 한에 어로 졸에 대 한 필요 없이 F. tularensis 쥐 폐의 노출을 수 있습니다. 또한 F. tularensis 형태의 선택 에이전트를 활용 하 여 모든 실험 BSL3 제약, 일반적으로 심각 하 게 제한 된 공간에서 발생 하는 필요 합니다. 따라서,이 기술은 그 작업 환경 내에서 유 숙 하는 추가 장비의 양을 최소화 합니다.
Fn videography 활용 F. tularensis 긴장 때문에, 모든 기술 BSL2 제약에서 수행 했다. Biosafety 장비 (전체 후드, 전원된 공기 정화 호흡기 (PAPR), 보호 커버 후드 이중 장갑, 옷)을 입고 담당자 biosafety 내각 내에서 수행 하는 모든 절차를 포함 하는이 기술은 BSL3 환경에의 적응 그리고 이러한 적응 감소 이동성, 손 재주, 그리고 시정. 기도 표시기 테 기도, 그것은 종종 BSL3 조건에서 작업할 때이 결정 하 게 어려운 고려 내에서 올바르게 배치 했다 확인 수 있도록 하는 중요 한 구성 요소입니다.
해부학 적인 몸의 올바른 쥐 "시뮬레이터" 기도 식도, 있으며 이들은 살아있는 동물을 사용 하는 이전 기술을 완벽 하 게 유용한. 그러나, 시뮬레이터 사용 라이브 쥐와 함께 작동 하는 동일한 되지 않습니다. 이 기술은 살아있는 동물에서 올바르게 수행 됩니다 확인 하려면 한 방법은 마 취 쥐에 inoculum으로 Trypan blue 염료를 이용 하 여 수술 후 즉시 동물 안락사 이다. 폐 조직 및 복 부의 절 개 경우 염료 폐와 식도 하지로 전달 했다 발표할 예정 이다. 이 기술에 의해 Fn/피트와 예방 접종은 쥐도 접종과 폐 조직 결정 폐 내 실제 증 착 도금 직후 안락사 수 있습니다.
올바른 intratracheal 접종 tularemia 백신 효능 Fischer 344 쥐에서의 평가 대 한 중요 한 될 것입니다 하지만 그것은 또한 다른 백신 또는 biodefense 포함 쥐 뿐만 아니라, 치료 응용 프로그램에 대 한 유용할 수 있습니다. 따라서,이 기술은 다양 한 쥐 모델을 활용 하 여 폐 응용 프로그램에 있을 수 있습니다. 장치를 생성 하는 어로 졸에 의해 배달 수도 있지만 biothreat 시나리오와 더 비슷합니다, F. tularensis 의 intratracheal 접종 tularemia 백신 개발을 위한 비교적 간단 하 고 비용 효율적인 대안을 나타냅니다.
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Disclosures
저자 공개할 게 없다
Acknowledgments
이 연구는 계약 HDTRA1-14-C-0116, 방위 위협 감소 기관 (DTRA) 감염 유전체학 (국방부 #W911NF-11-1-0136)에 우수를 위한 센터에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GreenLine fiber optic blade size 0 | Carefusion | 5-5231-00 | Macintosh American profile |
| GreenLight system laryngoscope handle | Carefusion | 4559GSP | |
| Exel International Safelet I.V. Catheter | EXEL INTERNATIONAL | 26743 | |
| Slip Tip Sterile Syringes 1mL | BD | 309659 | |
| Broad Point Dressing Thumb Forceps | Thermo Scientific | 76-302 | |
| 200 μL barrier tip | GeneseeScientific | 24-142 | |
| 1,000 μL pipette tip | Olympus Plastics | 24-173 | |
| Dremel 3000-2/28 Rotary tool kit | Dremel | 3000228 | |
| Rodent Intubation Stand | Braintree Scientific | RIS 200 | |
| Isoflurane | Butler Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| Rodent anesthesia machine | Surgivet | VTC302 Classic T3 | |
| Rodent Anesthesia chamber | Braintree Scientific | AB 1 |
References
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