Summary
Denne protokollen beskriver intratracheal vaksiner Fischer 344 rotter med Francisella tularensis. Denne prosedyren etterligner lunge eksponering av mennesker til denne potensielle biothreat agent og kan brukes til å teste vaksine og terapeutisk effekt mot lunge tularemia.
Abstract
Lunge smitte med bakterien Francisella tularensis kan føre til alvorlige og potensielt dødelige sykdommen, tularemia, hos mennesker. På grunn av gjeldende mangel av en godkjent tularemia vaksine for mennesker fokuserer forskning på vaksineutvikling utnytte riktig dyremodeller. Fischer 344 rotta har dukket opp som en modell som gjenspeiler menneskelige mottakelighet for F. tularensis infeksjon, og dermed er en attraktiv modell for tularemia vaksineutvikling. Intratracheal vaksinasjon av Fischer 344 rotte med F. tularensis etterligner lunge eksponering i mennesker. Vellykket levering i rotte luftrøret er avgjørende for lunge levering. Et laryngoskop med belysning brukes til riktig intubate tracheae bedøvet rotter; den riktige plasseringen i luftrøret bestemmes av en enkel enhet å oppdage puste. Etter intubasjon F. tularensis kulturen leveres i en målt dose via sprøyte. Denne teknikken standardiserer lunge levering av F. tularensis i rotte luftrøret evaluere vaksinen.
Introduction
F. tularensis (Ft) forårsaker menneskelig sykdommen, tularemia. Når bakterier er ervervet gjennom lunge ruten, fører dette til pneumonic tularemia, som har høy sykelighet og dødelighet1. F. tularensis regnes et biothreat agent på grunn av fare forbundet med aerosolized former, og det finnes for øyeblikket ingen vaksine godkjent for menneskelig bruk i USA Et intenst arbeid pågår å utvikle vaksiner og terapeutiske tiltak mot pneumonic tularemia, å beskytte befolkningen mot ulovlig bruk av denne bakteriell biothreat.
Alle tularemia undersøkelser har fokusert på musemodell, ekstreme følsomhet for mus til F. tularensis infeksjon og utbredelsen av reagenser. Imidlertid mus har vist seg for å være en vanskelig modell for vaksineutvikling, på grunn av vanskelighetene med å demonstrere vaksinen i denne modell2. Nylig er Fischer 344 rotta utviklet som en modell for tularemia vaksine utvikling3. Følsomheten av Fischer 344 rotta å forskjellige F. tularensis underarter etterligner menneskelige følsomhet4og rotter kan beskyttes mot F. tularensis lunge utfordring ved vaksinasjon med en live vaksine belastning kjent for å beskytte mennesker5,6,7. Fordi Fischer 344 rotte modeller noen funksjoner i F. tularensis infeksjon av mennesker, kan det være en svært nyttig modell for utvikling av en vaksine som beskytter mot lunge F. tularensis eksponering.
En effektiv vaksine må beskytte mennesker mot lunge eksponering for F. tularensis. Mest sannsynlig pulmonal eksponeringen fra weaponized F. tularensis ville være aerosolized bakterier inhalert i lungene8. Imidlertid aerosol generasjon av F. tularensis er både farlig og tungvint, og krever spesialisert utstyr og forvaring. En alternativ rute lunge eksponering i rotte som er kanskje mer tilpasningsdyktige for flere laboratorier mangler spesialisert utstyr er via intratracheal inoculation6. Denne teknikken bruker et laryngoskop for den riktige plasseringen av et kateter i luftrøret av en bedøvet rotte. Plassering i luftrøret, i stedet for spiserøret, kontrolleres av en enkel enhet som visualiserer luftstrøm fra lungene. F. tularensis leveres deretter inn i lungene gjennom kateter av administrasjonen med en sprøyte, etterfulgt av innføringen av luft i kateter å sikre lunge levering av bakterier. Derimot Jemski5 tidligere rapportert at F. tularensis inokulert i Fischer 344 rotter via intranasal-ruten ikke kan bli kultivert fra lungene til 3 dager etter vaksinasjon, som angir at intranasal vaksinasjon i rotter gjør ikke resulterer i direkte levering av bakterier inn i lungene.
Velg agent former for F. tularensis (F. tularensis subsp. tularensis, F. tularensis subsp. holarctica) krever biosikkerhet nivå 3 (BSL3) containment prosedyrer, som ville hindre videography. Imidlertid F. novicida (Fn) er unntatt fra Velg agent status på grunn av sin avirulence hos friske mennesker, og kan brukes trygt under grad 2 (BSL2) forhold9,10. Videre fungerer Fn som grunnlaget for live dempes vaksiner som kan beskytte mot F. tularensis lunge eksponeringen når levert via intratracheal inoculation11,12,13. Teknikken presenteres her muliggjør studiet av infeksjoner som oppstår gjennom lunge ruten utnytte rotter som modell for mennesker. Denne teknikken kan utføres uten behov for spesialisert aerosol-generering utstyr. FN ble brukt teknikker filmet her.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
dette arbeidet ble utført i strengt samsvar med anbefalingene i Guide og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Dyr protokoller som omfatter Red ble godkjent av University of Texas i San Antonio institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) under protokollen MU009(RA).
1. klargjør kateter, Trachea indikator og F. tularensis Inoculum
- Forberede kateter (20 G x 2 i)
- kutte 20 G x 2 p og grind spissen av nålen en stump og glatt finish med en roterende verktøy.
Merk: Lengden på avstumpet nålen bør tillate metall spissen for å heve ca 3 mm i kateter ermet når sitter på avstumpet pinnen. Avstumpet nålen gir kateter strukturelle stivhet som tillater plassering av kateter i luftrøret og fravær av avstumpet pinne-spissen stikker fra kateter ermet forhindrer skade luftrøret. - Rengjør avstumpet nåler og katetre med 70% etanol og sterilisere under UV-lys for 15 min.
- kutte 20 G x 2 p og grind spissen av nålen en stump og glatt finish med en roterende verktøy.
- Forberede luftrøret indikator
- Trim et 1000 µL pipette tips å tillate spissen å sitte i et kateter åpningen og danne en lufttett forsegling.
- Fjerner et filter fra en 200 µL aerosol barriere pipette tips og sted inne tidligere trimmet 1000 µL pipette spissen.
- Sikre filteret kan flytte fritt i 1000 µL pipette spissen når spissen peker tips ned.
- F. tularensis Inoculum
- vokse F. tularensis belastning overnatter på riktig agar plate på 37 ° C. skrape ca 100 µL av bakteriell plenen fra agar platen med et sterilt vaksinere loop og bruk å vaksinere en 500 mL Erlenmeyer kolbe som inneholder 250 mL passer flytende vekstmediet (for Fn: tryptic soya kjøttkraft (TSB) med 0,1% L-cystein hydrochloride monohydrate) og Inkuber risting natten på 37 ° C.
Merk: F. novicida brukes i videoen ble dyrket på en tryptic soya agar (TSA) plate med 0,1% L-cystein hydrochloride monohydrate. - Sentrifuge overnatting vokst flytende kulturen 4,221 x g ved romtemperatur for 10 min og fjerne nedbryting uten å forstyrre bakterier pellet.
FORSIKTIG: Følg institusjon ' s biosikkerhet anbefalinger forkaste nedbryting. - Forsiktig å suspendere det bakterielle pellet med 25 mL passer flytende medium (Fn: TSB supplert med 0,1% L-cystein hydrochloride monohydrate) som inneholder 10% glyserol, med en 25 mL pipette.
- Bruker en 1 mL pipette, aliquot resuspended bakteriell kultur i 500 µL dele i ampuller, fryse i tørris/etanol badekar, og lagre på-80 ° C.
- å bestemme titer av frosne kultur hetteglass, fjerne to frosne ampullene lagres ved-80 ° C, tine på is og utføre føljetong fortynninger i fosfat-bufret saltvann (PBS) etterfulgt av plating på riktig oppblomstringen medium (Fn: TSA med 0,1% L-cystein hydroklorid). Platene er inkubert 24-48 h på 37 ° C og kolonien danner enheter (CFU) er nummerert beregner antall bakterieceller i frosne kultur hetteglass (gjennomsnitt av to flasker).
- Forberede bakteriell inoculum ved tiner frossen ampuller på is, og deretter fortynne kulturen med PBS til siste konsentrasjonen av 10 7 CFU/100 µL. Inoculum bør være i en konsentrasjon som vil gi den ønskede CFU i 100 µL (siste konsentrasjonen av glyserol innen inoculum kan ikke være mer enn 3%, å forhindre kvelning av rotte). Frosne kultur ampullene lagres ved-80 ° C kan brukes opptil seks måneder etter forberedelse.
- vokse F. tularensis belastning overnatter på riktig agar plate på 37 ° C. skrape ca 100 µL av bakteriell plenen fra agar platen med et sterilt vaksinere loop og bruk å vaksinere en 500 mL Erlenmeyer kolbe som inneholder 250 mL passer flytende vekstmediet (for Fn: tryptic soya kjøttkraft (TSB) med 0,1% L-cystein hydrochloride monohydrate) og Inkuber risting natten på 37 ° C.
2. Rotte anestesi
- Koble anestesi kammeret til riktig drift isoflurane vaporizer av anestesi maskin av.
- Koble gassen scavenging tube på anestesi kammeret gassen scavenging systemet.
- Åpne oksygen flyten på anestesi maskinen til 4 L/min.
- Angir isoflurane vaporizer 5%.
- Sett rotta i anestesi kammeret.
Merk: Vi vanligvis bruker rotter mellom 8-10 uker gammel (130-180 g); yngre rotter er vanskelig å vaksinere via denne teknikken på grunn av den lille størrelsen på munnhule. - Når induksjon av anestesi har funnet sted, opprettholde rotte på 5% isoflurane, 2 L/min oksygen til effekten. Dette tar omtrent 3-10 min.
- Fastsette anestesi kvalitet og respirasjon og hjerteslag og reaksjon på refleks stimulering som tå knipe testen. Ideell dybdeskarphet anestesi angis av 1-1,5 s antall mellom hvert åndedrag.
3. Intratracheal Inoculation
- fjerne rotta fra anestesi kammeret og plassere rotta ytterst på gnager intubasjon stativ. Feste foran tennene av rotte for innehaveren å holde rotten på plass.
Merk: Hvis rotta begynner å vekke under prosedyren, kateter kan fjernes og rotta tilbake til anestesi chamber å nå et dypere plan for anestesi. - Bruke dominante hånd for å flytte tungen til samme side som support hånd med bred punkt dressing tommelen tang.
- Bruk støtte hånd og sikre tungen med laryngoskop mot rotta ' s lavere kjeve og visualisere trachea og spiserøret av dyret. Luftrøret åpnes og lukkes som rotta puster.
- Sett inn kateter som inneholder en 20-gauge avstumpet nål forberedt trinn 1.1, inn i luftrøret. Det kan være liten motstand, og innsetting i luftrøret kan være " humpete " på grunn av kateter gni tracheal cartilages. Følge av fukt eller grunt åndedrett, kan luftrøret være dekket av at epiglottis som hindrer visualisering av trachea. Forsiktig berører kanten av epiglottis brusk, vil det føre til at brusken klaffen åpne og avdekke luftrøret.
- Fjern avstumpet-nålen fra kateter samtidig sikre kateter forblir i luftrøret.
- Tillate noen sekunder å gå for rotten kunne puste rundt kateter settes inn i luftrøret.
- Sete fast luftrøret indikatoren på kateter åpning. Bevegelsen av aerosol barrieren vil indikere kateter settes riktig inn i luftrøret.
- Sikrer at rotta er legging på intubasjon stativ slik at brystet av dyret står vinkelrett på Planet av intubasjon stativet.
- Fjerne indikatoren trachea og levere 100 µL (10 7 CFU) av inoculum som inneholder F. tularensis bruker en 200 µL pipette tips, fast sitteplasser spissen mot kateter åpningen.
- Fest 1 mL slip tips tuberkulin sprøyte fylt med luft og levere 300 µL av luft å sikre inoculum når lungene til rotta.
- Fjern kateter fra luftrøret og fjerne rotta fra kirurgisk plattformen.
- Tillater rotta å vekke og buret. Kontroller at pust er tilbake til det normale.
- Bestemmer CFU i F. tularensis inoculum som beskrevet i trinn 1.3.5 å bekrefte CFU levert i luftrøret.
- Gjenta trinn 3.1-3.9 unvaccinated (naiv) dyr med 100 µL PBS i stedet for inoculum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Humoral respons til intratracheal vaksinasjon av F. tularensis i rotte kan bestemmes av enzymet knyttet immunosorbent analysen (ELISA) mot UV-inaktivert bakterier, som beskrevet tidligere11. Totalt immunglobulin G (IgG) svar Fischer 344 rotter deaktivert hele cellen bakterier ble vurdert innlegg-intratracheal inoculation med en svekket stamme av Fn (107 CFU inoculum) på dag 14 og dag 28 (figur 1). Uekte-vaksinert rotter mottatt PBS intratracheally. En økning i serum antistoff titers mot Fn etter vaksinering i forhold til naiv uekte-vaksinert dyr indikerer intratracheal vaksinasjon effekten. Lav serum reaktivitet kan indikere feil intratracheal plassering.
Figur 1: totalt IgG Svar å leve dempes Fn Intratracheal Inoculation i F344 rotter. Sera fra F344 rotter (n = 5) inokulerte intratracheally med en live dempes Fn belastning (107 CFU) ble analysert for totale IgG nivåer reaktive med hele cellen Fn på dag 14 og dag 28 etter vaksinasjon. Uekte-vaksinert (naiv) rotter (n = 5) var inokulerte intratracheally med PBS. Røde området angir reaktivitet av naiv sera (F344 rotter uekte-vaksinert med PBS). Feilfeltene representerer SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fischer 344 rotta er blitt en viktig modell for tularemia vaksine utvikling3. Eksponering for F. tularensis gjennom lunge ruten er avgjørende for å demonstrere effekt mot weaponized former for F. tularensis, fordi dette er levert som aerosoler. Intratracheal vaksinering av rotte forenkler eksponering av rotte lungene til F. tularensis uten behov for store, dyrt og komplisert aerosol generere utstyr. Alle eksperimenter utnytte Velg agent former for F. tularensis i tillegg krever BSL3 forvaring, som vanligvis oppstår i sterkt begrenset plass. Derfor reduserer denne teknikken mengden av ekstra utstyr som trenger å bli plassert innenfor det arbeidsmiljøet.
Fordi Fn var F. tularensis belastningen benyttes for videography, ble alle teknikker utført under BSL2 kontroll. Tilpasning av denne teknikken for BSL3 miljøet omfatter alle prosedyrer utført innen en biosafety regjering personell bruke biosafety utstyr (full hette, drevet luft rensing respirator (PAPR), beskyttende deksel med hette, doble hansker, sokker) og disse tilpasningene reduserer mobilitet, fingerfølsomhet og synlighet. Luftrøret indikatoren er en viktig komponent som lar en bekreftelse på at kateter var riktig plassert i luftrøret, vurderer det er vanskelig å gjøre dette forsøket ellers når du arbeider under BSL3 forhold.
Det er anatomisk rotte "simulatorer" som har en trachea og spiserøret, og disse er nyttige å perfeksjonere teknikken før du arbeider med levende dyr. Arbeide med simulatoren er imidlertid ikke identisk med arbeider med rotte live. En måte å finne ut hvis denne teknikken utføres riktig i levende dyr er å benytte Trypan blå farge som inoculum på en bedøvet rotte, og etter inngrepet umiddelbart euthanize dyret. Disseksjon av lungevev og magen vil avdekke hvis fargestoff ble levert i lungene og ikke spiserøret. Rotte som har blitt vaksinert med Fn/Ft av denne teknikken kan også være euthanized kort tid etter vaksinering og lungevev belagt for å finne faktiske avsettelse i lungene.
Riktig intratracheal vaksinasjon vil være viktig for evaluering av tularemia vaksinen i Fischer 344 rotte, men det kan også være nyttig for andre vaksine og/eller terapeutiske programmer i rotter, inkludert biodefense. Således, denne teknikken kan være tilpasningsdyktige til en rekke lunge applikasjoner som bruker rotte modell. Mens levering av aerosol genererer enheten kan være mer lik et biothreat scenario, representerer intratracheal vaksinasjon av F. tularensis en relativt enkel, kostnadseffektiv alternativ for tularemia vaksineutvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av forsvar trussel reduksjon Agency (DTRA) under kontrakt HDTRA1-14-C-0116 og senter for fremragende infeksjon Genomics (DOD #W911NF-11-1-0136).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GreenLine fiber optic blade size 0 | Carefusion | 5-5231-00 | Macintosh American profile |
| GreenLight system laryngoscope handle | Carefusion | 4559GSP | |
| Exel International Safelet I.V. Catheter | EXEL INTERNATIONAL | 26743 | |
| Slip Tip Sterile Syringes 1mL | BD | 309659 | |
| Broad Point Dressing Thumb Forceps | Thermo Scientific | 76-302 | |
| 200 μL barrier tip | GeneseeScientific | 24-142 | |
| 1,000 μL pipette tip | Olympus Plastics | 24-173 | |
| Dremel 3000-2/28 Rotary tool kit | Dremel | 3000228 | |
| Rodent Intubation Stand | Braintree Scientific | RIS 200 | |
| Isoflurane | Butler Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| Rodent anesthesia machine | Surgivet | VTC302 Classic T3 | |
| Rodent Anesthesia chamber | Braintree Scientific | AB 1 |
References
- Ellis, J., Oyston, P. C. F., Green, M., Titball, R. Tularemia. Clin Microbiol Rev. 15 (4), 631-646 (2002).
- Lyons, C. R., Wu, T. H. Animal models of Francisella tularensis infection. Ann N Y Acad Sci. 1105, (2007).
- Hutt, J. A., Lovchik, J. A., Dekonenko, A., Hahn, A. C., Wu, T. H. The Natural History of Pneumonic Tularemia in Female Fischer 344 Rats after Inhalational Exposure to Aerosolized Francisella tularensis subspecies tularensis Strain Schu S4. Am J Pathol. 187 (2), 252-267 (2017).
- Ray, H. J., et al. The Fischer 344 rat reflects human susceptibility to Francisella pulmonary challenge and provides a new platform for virulence and protection studies. PloS one. 5, e9952 (2010).
- Jemski, J. V. Respiratory tularemia: comparison of selected routes of vaccination in Fischer 344 rats. Infect Immun. 34 (3), 766-772 (1981).
- Wu, T. H., et al. Vaccination of Fischer 344 rats against pulmonary infections by Francisella tularensis type A strains. Vaccine. 27 (34), 4684-4693 (2009).
- Mara-Koosham, G., Hutt, J. A., Lyons, C. R., Wu, T. H. Antibodies contribute to effective vaccination against respiratory infection by type A Francisella tularensis strains. Infect Immun. 79 (4), 1770-1778 (2011).
- Oyston, P. C., Sjostedt, A., Titball, R. W. Tularaemia: bioterrorism defence renews interest in Francisella tularensis. Nat Rev Microbiol. 2 (12), 967-978 (2004).
- Kingry, L. C., Petersen, J. M. Comparative review of Francisella tularensis and Francisella novicida. Front Cell Infect Microbiol. 4, 35 (2014).
- Rohmer, L., et al. Comparison of Francisella tularensis genomes reveals evolutionary events associated with the emergence of human pathogenic strains. Genome Biol. 8 (6), R102 (2007).
- Chu, P., et al. Live attenuated Francisella novicida vaccine protects against Francisella tularensis pulmonary challenge in rats and non-human primates. PLoS Pathog. 10 (10), e1004439 (2014).
- Signarovitz, A. L., et al. Mucosal Immunization with Live Attenuated Francisella novicida U112ΔiglB Protects against Pulmonary F. tularensis SCHU S4 in the Fischer 344 Rat Model. PloS one. 7 (10), e47639 (2012).
- Cunningham, A. L., et al. Enhancement of vaccine efficacy by expression of a TLR5 ligand in the defined live attenuated Francisella tularensis subsp. novicida strain U112DiglB::fljB. Vaccine. 32 (40), 5234-5240 (2014).
