Summary
Det här protokollet beskriver intratrakeal vaccinationer av Fischer 344 råttor med Francisella tularensis. Detta förfarande härmar pulmonell exponering för denna potentiella biothreat agent och kan användas för att testa vaccin och terapeutisk effekt mot pulmonell tularemi.
Abstract
Pulmonell infektion med bakterien Francisella tularensis kan leda till allvarliga och potentiellt dödliga sjukdomen, tularemi, hos människor. På grund av den nuvarande bristen en godkänd tularemi vaccin för människor, är forskning inriktad på utveckling av vaccin utnyttja lämpliga djurmodeller. Fischer 344 råtta har vuxit fram som en modell som återspeglar mänskliga F. tularensis infektionskänslighet, och därmed är en attraktiv modell för tularemi vaccinutveckling. Intratrakeal inokulering av Fischer 344 råtta med F. tularensis härmar pulmonell exponeringen hos människa. Framgångsrik leverans till råtta luftstrupen är kritisk för pulmonell leverans. En laryngoskopet med belysning används för att korrekt intubation luftstrupar sövda råttor; korrekt placering inom luftstrupen bestäms av en enkel anordning för att upptäcka andning. Efter intubation, F. tularensis kulturen levereras i en uppmätt dos via spruta. Denna teknik standardiserar pulmonell leverans av F. tularensis inom råtta luftstrupen att utvärdera vaccinets effekt.
Introduction
F. tularensis (Ft) orsakar den mänskliga sjukdomen, tularemi. När bakterierna är anskaffade genom pulmonell rutten, leder detta till pneumonic tularemi, som har hög sjuklighet och dödlighet1. F. tularensis anses en biothreat agent på grund av den fara som är associerad med aerosolized former, och det finns för närvarande inget vaccin godkänd för humant bruk i USA Ett intensivt arbete pågår för närvarande att utveckla vacciner och terapeutiska åtgärder mot pneumonic tularemi, att skydda den mänskliga befolkningen mot olaglig användning av denna bakterie biothreat.
Mycket av tularemi forskningen har fokuserat på musmodell, på grund av den extrema känsligheten möss till F. tularensis infektion, och prevalensen av reagenser. Möss har dock visat sig vara en svår modell för utveckling av vaccin, på grund av svårigheten att demonstrera vaccinets effekt i denna modell2. Fischer 344 råtta har nyligen utvecklats som en modell för tularemi vaccin utveckling3. Känsligheten hos Fischer 344 råttan att olika F. tularensis underart härmar mänskliga känslighet4, och råttor kan skyddas mot F. tularensis pulmonell utmaning av vaccination med en levande vaccinstam känt att skydda människor5,6,7. Eftersom Fischer 344 råtta modeller vissa funktioner av F. tularensis infektion av människor, det kan vara en extremt användbar modell för utveckling av ett vaccin som skyddar mot pulmonell F. tularensis exponering.
Ett effektivt vaccin behöver skydda människor mot pulmonell exponering för F. tularensis. Den mest sannolika pulmonell exponeringen från weaponized F. tularensis vore aerosolized bakterier inhaleras i lungorna8. Dock aerosolbildning av F. tularensis är både farligt och besvärligt, och kräver specialutrustning och inneslutning. En alternativ rutt av pulmonell exponering hos råtta som kanske är mer anpassningsbar för flera laboratorier saknas specialutrustning är via intratrakeal inympning6. Denna teknik använder tredjeparts en laryngoskopet för korrekt placering av en kateter i luftstrupen av en sövda råtta. Placering inom luftstrupen, i stället för matstrupen, kontrolleras genom en enkel anordning som visualiserar luftflödet i lungorna. F. tularensis levereras därefter in i lungorna via katetern genom administrering med en spruta, följt av införandet av luft in i katetern att säkerställa pulmonell leverans av bakterier. Däremot Jemski5 tidigare rapporterat att F. tularensis inokuleras i Fischer 344 råttor via intranasal rutten inte kunde vara odlade från lungorna fram till 3 dagar efter ympning, som anger att intranasalt inympningen i råttor gör inte leda till direkt leverans av bakterier i lungorna.
Välj ombud former av F. tularensis (F. tularensis subsp. tularensis, F. tularensis subsp. holarctica) kräver biosäkerhet nivå 3 (BSL3) inneslutning förfaranden, vilket skulle förhindra videography. Dock F. novicida (Fn) är undantagna från Välj Agentstatus på grund av dess avirulence i friska människor, och kan utnyttjas på ett säkert sätt enligt biosäkerhetsnivå 2 (BSL2) villkor9,10. Fn ligger dessutom till grund för levande försvagat vaccin som kan skydda mot F. tularensis pulmonell exponering när de levereras via intratrakeal inympning11,12,13. Tekniken presenteras här gör för studien av infektioner som uppstår genom pulmonell rutten utnyttja råttor som modell för människor. Denna teknik kan utföras utan behov av specialutrustning för aerosol-generera. FN användes för de tekniker som filmade här.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
detta arbete utfördes i strikt överensstämmelse med rekommendationerna i Guide för skötsel och användning av laboratoriedjur av National Institutes of Health. Djur protokoll som rör gnagare godkändes av vid University of Texas i San Antonio institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) enligt protokollet MU009(RA).
1. förbereda katetern, luftstrupen indikator och F. tularensis inokulum
- Förbereda katetern (20 G x 2 i)
- skär den 20 G x 2 i nålen och slipa spetsen på nålen till en trubbig och mjuk finish med ett roterande verktyg.
NOTE: Längden på trubbiga nålen bör tillåta metall spets att häva cirka 3 mm in katetern hylsan när sitter på trubbiga nålen. Trubbiga nålen ger katetern strukturella styvhet att möjliggöra placering av katetern i luftstrupen, och avsaknad av trubbiga nålspetsen utskjutande från katetern hylsan förhindrar skada på luftstrupen. - Rengör trubbiga nålar och katetrar med 70% etanol och sterilisera i UV-belysning för 15 min.
- skär den 20 G x 2 i nålen och slipa spetsen på nålen till en trubbig och mjuk finish med ett roterande verktyg.
- Förbereda luftstrupen indikator
- trimma en 1000 µL pipettspetsen att låta spetsen att sitta in en kateter öppning och bilda en lufttät tätning.
- Ta bort ett filter från en 200 µL aerosol barriär pipettspetsen och plats inuti tidigare putsade 1000 µL pipettspetsen.
- Se till att filtret kan röra sig fritt inuti 1000 µL pipettspetsen när spetsen pekar tip-down.
- F. tularensis inokulum
- växa F. tularensis stam övernattning på lämpliga agarplatta vid 37 ° C. skrapa ungefär 100 µL av bakteriella gräsmattan från agarplattan med en steril ympning slinga och använda att Inokulera en 500 mL Erlenmeyerkolv, innehållande 250 mL lämplig flytande odlingsmedium (för Fn: tryptic soy buljong (TSB) kompletteras med 0,1% L-cystein hydrokloridmonohydrat) och inkubera skakas över natten vid 37 ° C.
Obs: F. novicida används i videon odlades på en tryptic soy agar (TSA) plattan kompletteras med 0,1% L-cystein hydrokloridmonohydrat. - Centrifugera övernattning odlade flytande kulturen vid 4,221 x g i rumstemperatur i 10 min och avlägsna supernatanten utan att störa pelleten bakterier.
Varning: Följ institution ' s biosäkerhet rekommendationer att Kassera supernatanten. - Försiktigt åter centrifugerade bakteriell med 25 mL av lämpliga flytande medium (Fn: TSB kompletteras med 0,1% L-cystein hydrokloridmonohydrat) innehållande 10% glycerol, med 25 mL pipett.
- Med 1 mL pipett alikvot den återsuspenderade bakteriekulturen i 500 µL portioner i injektionsflaskor, frysa i badkar torris/etanol och lagra vid -80 ° C.
- Att fastställa antikroppnivåns på frysta kultur injektionsflaskorna, ta bort två frysta injektionsflaskor lagras vid-80 ° C, Tina på is och utföra seriespädningar i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) följt av plätering på lämpligt odlingsmedium (Fn: TSA som innehåller 0,1% L-cystein hydroklorid). Plattorna är ruvade 24-48 timmar vid 37 ° C, och kolonin bildar enheter (CFU) räknas för att beräkna antalet bakterieceller inom frysta kultur injektionsflaskorna (medelvärde av två injektionsflaskor).
- Förbereda det bakteriella inokulatet av Tina upp en frusen injektionsflaska på is, och späd sedan kulturen med PBS till slutliga koncentration 10 7 CFU/100 µL. Inokulatet bör vara i en koncentration som kommer att ge den önskade CFU i 100 µL (glycerol inom inokulatet slutliga koncentration kan inte vara mer än 3%, att förhindra kvävning av tjalla). Fryst kultur injektionsflaskor lagras vid-80 ° C kan användas för upp till sex månader efter förberedelse.
- växa F. tularensis stam övernattning på lämpliga agarplatta vid 37 ° C. skrapa ungefär 100 µL av bakteriella gräsmattan från agarplattan med en steril ympning slinga och använda att Inokulera en 500 mL Erlenmeyerkolv, innehållande 250 mL lämplig flytande odlingsmedium (för Fn: tryptic soy buljong (TSB) kompletteras med 0,1% L-cystein hydrokloridmonohydrat) och inkubera skakas över natten vid 37 ° C.
2. Råtta anestesi
- ansluta anestesi kammaren till den ordentligt operativa isofluran spridare av en anestesi maskin.
- Ansluta gasen rensning röret på anestesi kammaren med gasen rensning system.
- Öppna den syre flöden på anestesi maskin till 4 L/min.
- Ange den isofluran spridare till 5%.
- Placera råtta i anestesi kammaren.
Obs: Vi använder vanligtvis råttor mellan 8-10 veckor gamla (130-180 g); yngre råttor är svåra att Inokulera via denna teknik på grund av den lilla storleken på munnen kaviteten. - Vid induktion av anestesi har ägt rum, bibehålla råtta vid 5% isofluran, 2 L/min syre till effekt. Detta tar ca 3-10 min.
- Bestämma djupet av anestesi av kvalitet och hastighet av andning och hjärtslag och reaktion på reflex stimulering som det tå nypa testet. Perfekt djup anestesi är indicerat vid 1-1.5 s räkning mellan varje andetag.
3. Intratrakeal inympning
- ta bort råttan från anestesi kammaren och placera råtta dorsalt på gnagare intubation stativet. Bifoga de främsta tänderna av råtta till innehavaren att hålla råtta på plats.
Obs: Om råttan börjar vakna under förfarandet, katetern avlägsnas och råttan återvände till anestesi kammaren att nå ett djupare plan av anestesi. - Använda dominerande hand flytta tungan till samma sida som stöd handen med bred punkt dressing tummen pincett.
- Användning stödja hand och säkra tungan med laryngoskopet mot råttan ' s lägre käken och visualisera luftstrupen och matstrupen av djuret. Luftstrupen öppnar och stänger som råtta andas.
- Infoga katetern som innehåller 20 gauge trubbiga-nål, bereddes i steg 1.1, in i luftstrupen. Det kan finnas lätt motstånd, och insättningspunkten i luftstrupen kan vara " krokig " på grund av katetern gnugga de luftrör brosken. På grund av fukt eller ytlig andning, kan luftstrupen täckas av struplocket som förhindrar visualisering av luftstrupen. Att försiktigt röra kanten av struplocket brosk kommer att orsaka brosk luckan att öppna och avslöja luftstrupen.
- Ta bort trubbiga-nålen från katetern samtidigt katetern förblir i luftstrupen.
- Tillåta några sekunder passera för råtta för att kunna andas runt katetern in i luftstrupen.
- Sits fast luftstrupen indikatorn på katetern öppning. Rörelse av aerosol barriären indikerar katetern är korrekt insatt luftstrupen.
- Se till att råttan är handpåläggning intubation stativet så att bröstet av djuret riktas vinkelrätt mot planet av intubation stand.
- Ta bort indikatorn luftstrupen och leverera 100 µL (10 7 CFU) av den inokulatet som innehåller F. tularensis använder en 200 µL pipettspetsen, fast sittplatser spetsen mot kateter öppningen.
- Fäst en 1 mL slip tip tuberkulin spruta fylld med luft och leverera 300 µL av luft att säkerställa inokulum når lungorna råttans.
- Ta bort katetern från luftstrupen och råttan från kirurgiska plattformen.
- Låt råttan att vakna upp och gå tillbaka till buren. Kontrollera att andningen har återgått till det normala.
- Bestämma CFU i den F. tularensis inokulum som beskrivs i steg 1.3.5 att bekräfta CFU levereras i luftstrupen.
- Upprepa steg 3.1-3.9 på ovaccinerade (naiva) djur med 100 µL PBS i stället för inokulatet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den humorala Svaren till intratrakeal inympning av F. tularensis hos råtta kan bestämmas genom enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) mot UV-inaktiverat bakterier, som tidigare beskrivits11. Totala immunglobulin G (IgG) svar av Fischer 344 råttor inaktiverade hela cellen bakterier var bedömda post-intratrakeal inympning med en försvagad stam av Fn (107 CFU inokulum) på dag 14 och dag 28 (figur 1). Mock-vaccinerade råttor fick PBS intratracheally. En ökning av serum antikroppsnivåerna var mot Fn efter inympningen jämfört naiv mock-vaccinerade djur anger intratrakeal vaccination effekten. Låga serum reaktivitet kan tyda på felaktig intratrakeal placering.
Figur 1: totalt IgG Svaren till levande försvagat Fn intratrakeal inympning F344 råttor. Sera från F344 råttor (n = 5) inokulerade intratracheally med ett levande, försvagat Fn stam (107 CFU) analyserades för totalt IgG-nivåer som är reaktiva med helcellsvaccin Fn på dag 14 och dag 28 efter inympningen. Mock-vaccinerade (naiva) råttor (n = 5) var inokulerade intratracheally med PBS. Röda området betecknar Reaktiviteten hos naiva sera (F344 råttor mock-vaccinerade med PBS). Felstaplar representera SEM. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fischer 344 råttan blir ett viktigt modellerar för tularemi vaccin utveckling3. Exponering för F. tularensis genom pulmonell rutten är kritisk för att demonstrera effekten mot weaponized former av F. tularensis, eftersom dessa levereras som aerosoler. Intratrakeal inokulering av råtta underlättar exponering av råtta lungorna till F. tularensis utan behov av stora, dyra och komplicerade aerosol genererar utrustning. Alla experiment utnyttja Välj agent former av F. tularensis dessutom kräva BSL3 inneslutning, som uppstår vanligtvis i allvarligt begränsat utrymme. Således, denna teknik minimerar mängden ytterligare utrustning som måste inrymmas inom den arbetsmiljön.
Eftersom Fn var F. tularensis stammen utnyttjas för videography, utfördes alla tekniker under BSL2 inneslutning. Anpassning av denna teknik i BSL3 miljön innehåller alla procedurer utförs inom en biosäkerhet skåp med personal bära biosäkerhet redskap (full huva, drivs luft renande respirator (PAPR), skyddande täcka alla med huva, dubbla handskar, tossor), och dessa anpassningar minska rörlighet, fingerfärdighet och synlighet. Indikatorn för luftstrupen är en viktig komponent som gör att bekräftelsen att katetern var placerade i luftstrupen, med tanke på det är ofta svårt att annars göra denna bestämning när arbetar under BSL3 villkor.
Det finns anatomiskt korrekt råtta ”simulatorer” som har luftstrupen och matstrupen, och dessa är användbara att finslipa tekniken innan du arbetar med levande djur. Arbeta med simulatorn är dock inte identiska att arbeta med en levande råtta. Ett sätt att avgöra om denna teknik utförs korrekt i det levande djuret är att utnyttja Trypan blått färgämne som inokulatet på en sövda råtta, och efter ingreppet omedelbart avliva djuret. Dissektion av lungvävnad och magen kommer att avslöja om färgämnet levererades in i lungorna och inte i matstrupen. En råtta som har vaccinerats med Fn/Ft genom denna teknik kan även bli euthanized strax efter inympningen och lungvävnad klädd för att fastställa faktiska nedfall inom lungan.
Rätt intratrakeal inympningen blir viktigt för utvärdering av tularemi vaccinets effekt på Fischer 344 råtta, men det kan också vara användbar för andra vaccin och/eller terapeutiska tillämpningar i råttor samt, inklusive biodefense. Denna teknik kan således vara anpassningsbar till en mängd pulmonell tillämpningar utnyttja råtta modellen. Leverans av en aerosol som genererar enheten kan vara mer lik ett biothreat scenario, representerar intratrakeal inympning av F. tularensis ett relativt enkelt och kostnadseffektivt alternativ för tularemi vaccinutveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja
Acknowledgments
Denna studie stöddes av den försvar hot minskning byrån (DTRA) kontrakterade HDTRA1-14-C-0116 och Center for Excellence i infektion genomik (DOD #W911NF-11-1-0136).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GreenLine fiber optic blade size 0 | Carefusion | 5-5231-00 | Macintosh American profile |
| GreenLight system laryngoscope handle | Carefusion | 4559GSP | |
| Exel International Safelet I.V. Catheter | EXEL INTERNATIONAL | 26743 | |
| Slip Tip Sterile Syringes 1mL | BD | 309659 | |
| Broad Point Dressing Thumb Forceps | Thermo Scientific | 76-302 | |
| 200 μL barrier tip | GeneseeScientific | 24-142 | |
| 1,000 μL pipette tip | Olympus Plastics | 24-173 | |
| Dremel 3000-2/28 Rotary tool kit | Dremel | 3000228 | |
| Rodent Intubation Stand | Braintree Scientific | RIS 200 | |
| Isoflurane | Butler Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| Rodent anesthesia machine | Surgivet | VTC302 Classic T3 | |
| Rodent Anesthesia chamber | Braintree Scientific | AB 1 |
References
- Ellis, J., Oyston, P. C. F., Green, M., Titball, R. Tularemia. Clin Microbiol Rev. 15 (4), 631-646 (2002).
- Lyons, C. R., Wu, T. H. Animal models of Francisella tularensis infection. Ann N Y Acad Sci. 1105, (2007).
- Hutt, J. A., Lovchik, J. A., Dekonenko, A., Hahn, A. C., Wu, T. H. The Natural History of Pneumonic Tularemia in Female Fischer 344 Rats after Inhalational Exposure to Aerosolized Francisella tularensis subspecies tularensis Strain Schu S4. Am J Pathol. 187 (2), 252-267 (2017).
- Ray, H. J., et al. The Fischer 344 rat reflects human susceptibility to Francisella pulmonary challenge and provides a new platform for virulence and protection studies. PloS one. 5, e9952 (2010).
- Jemski, J. V. Respiratory tularemia: comparison of selected routes of vaccination in Fischer 344 rats. Infect Immun. 34 (3), 766-772 (1981).
- Wu, T. H., et al. Vaccination of Fischer 344 rats against pulmonary infections by Francisella tularensis type A strains. Vaccine. 27 (34), 4684-4693 (2009).
- Mara-Koosham, G., Hutt, J. A., Lyons, C. R., Wu, T. H. Antibodies contribute to effective vaccination against respiratory infection by type A Francisella tularensis strains. Infect Immun. 79 (4), 1770-1778 (2011).
- Oyston, P. C., Sjostedt, A., Titball, R. W. Tularaemia: bioterrorism defence renews interest in Francisella tularensis. Nat Rev Microbiol. 2 (12), 967-978 (2004).
- Kingry, L. C., Petersen, J. M. Comparative review of Francisella tularensis and Francisella novicida. Front Cell Infect Microbiol. 4, 35 (2014).
- Rohmer, L., et al. Comparison of Francisella tularensis genomes reveals evolutionary events associated with the emergence of human pathogenic strains. Genome Biol. 8 (6), R102 (2007).
- Chu, P., et al. Live attenuated Francisella novicida vaccine protects against Francisella tularensis pulmonary challenge in rats and non-human primates. PLoS Pathog. 10 (10), e1004439 (2014).
- Signarovitz, A. L., et al. Mucosal Immunization with Live Attenuated Francisella novicida U112ΔiglB Protects against Pulmonary F. tularensis SCHU S4 in the Fischer 344 Rat Model. PloS one. 7 (10), e47639 (2012).
- Cunningham, A. L., et al. Enhancement of vaccine efficacy by expression of a TLR5 ligand in the defined live attenuated Francisella tularensis subsp. novicida strain U112DiglB::fljB. Vaccine. 32 (40), 5234-5240 (2014).
