Summary
Este protocolo describe intratraqueal inoculaciones de ratas Fischer 344 con tularensis de francisella. Este procedimiento simula la exposición pulmonar de los seres humanos a este agente potencial de biothreat y puede utilizarse para probar la vacuna y la eficacia terapéutica contra la tularemia pulmonar.
Abstract
Infección pulmonar con la bacteria Francisella tularensis puede conducir a la enfermedad grave y potencialmente mortal, la tularemia, en seres humanos. Debido a la falta de una vacuna contra la tularemia aprobado para los seres humanos, la investigación se centra en el desarrollo de una vacuna utilizando modelos animales apropiados. Las ratas Fischer 344 ha emergido como un modelo que refleja la susceptibilidad humana a la infección de F. tularensis y por lo tanto es un modelo atractivo para el desarrollo de vacuna contra la tularemia. La inoculación intratraqueal de las ratas Fischer 344 con F. tularensis imita la exposición pulmonar en seres humanos. La entrega exitosa en la tráquea de rata es crítica para la entrega pulmonar. Laringoscopio con iluminación se utiliza para intubar correctamente las tráqueas de las ratas anestesiadas; la colocación correcta dentro de la tráquea está determinada por un simple dispositivo para detectar la respiración. Después de la intubación, la cultura de F. tularensis se entrega en una dosis medida mediante jeringa. Esta técnica normaliza entrega pulmonar de F. tularensis dentro de la tráquea de rata para evaluar la eficacia de la vacuna.
Introduction
F. tularensis (Ft) causa la enfermedad humana, tularemia. Cuando las bacterias se adquieren por vía pulmonar, esto conduce a la tularemia neumónica, que tiene alta morbilidad y mortalidad1. F. tularensis se considera a un agente biothreat debido al peligro asociado con las formas aerosol y no existe ninguna vacuna aprobada para uso humano en los Estados Unidos Actualmente está en marcha un esfuerzo intensivo desarrollar vacunas y medidas terapéuticas contra la tularemia neumónica, para proteger a la población humana contra el uso ilícito de este biothreat bacteriana.
Gran parte de la investigación de tularemia se ha centrado en el modelo de ratón, debido a la extrema sensibilidad de los ratones a la infección por F. tularensis y la prevalencia de los reactivos. Sin embargo, ratones han demostrado para ser un modelo difícil para el desarrollo de una vacuna, debido a la dificultad de demostrar la eficacia de la vacuna en este modelo2. Recientemente, las ratas Fischer 344 se ha desarrollado como un modelo para desarrollo de vacuna contra la tularemia3. La sensibilidad de la ratas Fischer 344 a varias subespecies de F. tularensis imita sensibilidad humana4y ratas pueden ser protegidas contra F. tularensis desafío pulmonar por la vacunación con una cepa de vacuna de virus vivos conocida para proteger los seres humanos5,6,7. Porque las ratas Fischer 344 modelos algunas de las características de la infección de F. tularensis de seres humanos, puede ser un modelo muy útil para el desarrollo de una vacuna que protege contra pulmonar F. tularensis exposición.
Una vacuna eficaz debe proteger a los seres humanos contra la exposición pulmonar F. tularensis. La exposición pulmonar probablemente de arma de F. tularensis sería bacterias aerosol inhaladas en los pulmones8. Sin embargo, la generación de aerosol de F. tularensis es peligroso y engorroso y requiere contención y equipo especializado. Una ruta alternativa de la exposición pulmonar en la rata que es tal vez más adaptable para varios laboratorios falta de equipo especializado es a través de inoculación intratraqueal6. Esta técnica utiliza un laringoscopio para la correcta colocación de un catéter dentro de la tráquea de una rata anestesiado. Colocación dentro de la tráquea, en lugar de esófago, es verificada por un dispositivo simple que visualiza el flujo de aire de los pulmones. F. tularensis se entrega posteriormente a los pulmones a través del catéter por la administración con una jeringa, seguida por la introducción de aire en el catéter para asegurar la entrega pulmonar de las bacterias. Por el contrario, lo que indica la inoculación intranasal en ratas hace Jemski5 divulgado previamente que inoculados en ratas Fischer 344 la vía intranasal de F. tularensis no podría cultivarse desde los pulmones hasta la inoculación después de 3 días, no resultado en la entrega directa de las bacterias en los pulmones.
Formas de seleccionar agente de F. tularensis (subsp. deF. tularensis tularensis, F. tularensis subsp. holarctica) requieren procedimientos de contención de bioseguridad nivel 3 (BSL3), que impedirían la videografía. Sin embargo, F. novicida (Fn) está exento de estado seleccione agente debido a su avirulencia en seres humanos sanos y puede ser utilizado con seguridad bajo condiciones de bioseguridad nivel 2 (BSL2)9,10. Por otra parte, Fn sirve como base para vacunas vivas atenuadas que puede proteger contra F. tularensis exposición pulmonar cuando entregado vía intratraqueal inoculación11,12,13. La técnica presentada aquí permite el estudio de las infecciones que ocurren a través de la vía pulmonar utilizando ratas como un modelo para los seres humanos. Esta técnica se puede realizar sin necesidad de equipos especializados de generación de aerosoles. FN fue utilizado para las técnicas filmadas aquí.
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Protocol
este trabajo se realizó en estricta conformidad con las recomendaciones de la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los institutos nacionales de salud. Protocolos animales con roedores fueron aprobados por la Universidad de Texas en San Antonio institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC) bajo protocolo MU009(RA).
1. inóculo de F. tularensis, preparar catéter y tráquea indicador
- Preparar catéter (20 x 2)
- corta el 20 x 2 en aguja y la rutina de la punta de la aguja a un blunt y suave acabado con una herramienta giratoria.
Nota: La longitud de la aguja blunted debe permitir que la punta metálica rescindir aproximadamente 3 mm en el manguito del catéter cuando se asiente completamente sobre la aguja blunted. La aguja blunted da la rigidez estructural del catéter para permitir la colocación del catéter en la tráquea, y la ausencia de la punta de la aguja blunted que sobresalen del manguito del catéter previene lesiones a la tráquea. - Limpiar las agujas romas y catéteres con etanol al 70% y esterilizar bajo luz UV de 15 min.
- corta el 20 x 2 en aguja y la rutina de la punta de la aguja a un blunt y suave acabado con una herramienta giratoria.
- Preparar tráquea indicador
- cortar una punta de pipeta de 1000 μL para permitir que la punta para sentarse en una abertura del catéter y formar un sello hermético.
- Quitar un filtro de un lugar dentro de la punta de pipeta de 1000 μl previamente recortada y pipeta μl aerosol barrera 200.
- Asegurar el filtro puede moverse libremente dentro de la punta de la pipeta de 1000 μl cuando el extremo es puntiagudo punta abajo.
- Inóculo de F. tularensis
- cepa crece F. tularensis durante la noche en placa de agar adecuado a 37 ° C. rascado aproximadamente 100 μl del césped bacteriano de la placa de agar con un estéril inoculación del lazo y utilizar para inocular un 500 mL matraz Erlenmeyer que contenga 250 mL del medio de crecimiento líquido apropiado (para Fn: caldo de soja tríptica (TSB) suplementado con 0,1% L-Cisteína clorhidrato monohidrato) e incubar en agitación toda la noche a 37 ° C.
Nota: F. novicida utilizado en el video se cultivaba en una placa de agar (TSA) de soya peptona suplementada con 0,1% L-Cisteína clorhidrato monohidrato. - Centrifugar el cultivo líquido crecido durante la noche a 4.221 x g a temperatura ambiente durante 10 min y retirar el sobrenadante sin perturbar el pellet de bacterias.
PRECAUCIÓN: Por favor, siga la institución ' las recomendaciones de bioseguridad s descartar sobrenadante. - Suavemente Resuspenda el precipitado bacteriano con 25 mL de medio líquido apropiado (Fn: TSB complementado con 0.1% L-Cisteína clorhidrato monohidrato) conteniendo glicerol al 10%, utilizando una pipeta de 25 mL.
- Con una pipeta de 1 mL, alícuota del cultivo bacteriano resuspendido en alícuotas de μl 500 en viales, congelar en un baño de hielo seco/etanol y almacenar a -80 ° C.
- Para determinar la concentración de los frascos de cultivo congelado, sacar dos viales congelados almacenados a-80 ° C, descongelar el hielo y realizar diluciones seriadas en tampón fosfato salino (PBS) seguido de placas en el medio de crecimiento apropiado (Fn: TSA que contiene 0.1% L-cisteína clorhidrato de). Las placas son incubada 24-48 h a 37 ° C, y unidades formadoras de colonias (UFC) se enumeran para calcular el número de células bacterianas dentro de los frascos de cultivo congelado (promedio de dos viales).
- Preparar el inóculo bacteriano por descongelar un vial congelado en el hielo y luego diluir la cultura con PBS a la concentración final de 10 7 CFU/100 μl. El inóculo debe estar en una concentración que producirá la deseada UFC en 100 μl (concentración final de glicerol en el inóculo no puede ser más del 3%, para evitar la asfixia de la rata). Frascos de cultivo congelado almacenados-80 ° C se pueden utilizar hasta seis meses después de la preparación.
- cepa crece F. tularensis durante la noche en placa de agar adecuado a 37 ° C. rascado aproximadamente 100 μl del césped bacteriano de la placa de agar con un estéril inoculación del lazo y utilizar para inocular un 500 mL matraz Erlenmeyer que contenga 250 mL del medio de crecimiento líquido apropiado (para Fn: caldo de soja tríptica (TSB) suplementado con 0,1% L-Cisteína clorhidrato monohidrato) e incubar en agitación toda la noche a 37 ° C.
2. Anestesia de la rata
- Conecte la cámara de anestesia para el vaporizador de isoflurano funcionamiento de una máquina de anestesia.
- Conectar el gas de barrido del tubo en la cámara de anestesia al gas de barrido sistema.
- Abrir el flujo de oxígeno en la máquina de anestesia a 4 L/min
- Ajustar el vaporizador de isoflurano al 5%.
- Colocar la rata en la cámara de anestesia.
Nota: Normalmente utilizamos ratas entre 8-10 semanas de edad (130-180 g); las ratas jóvenes son difíciles de inocular a través de esta técnica debido al pequeño tamaño de la cavidad de la boca. - Cuando la inducción de la anestesia ha producido, mantener la rata en el 5% isoflurano, 2 L/min de oxígeno al efecto. Esto toma unos 3-10 minutos
- Determinar la profundidad de la anestesia por la calidad y la tasa de respiración y latidos del corazón y la reacción a la estimulación refleja como en la prueba del pellizco del dedo del pie. Profundidad ideal de la anestesia está indicada por la cuenta de 1-1.5 s entre cada respiración.
3. La inoculación intratraqueal
- Quite la rata de la cámara de anestesia y colocar la rata dorsal en el stand de roedores de la intubación. Coloque los dientes de rata al titular para mantener la rata en su lugar.
Nota: Si la rata empieza a despertar durante el procedimiento, el catéter puede ser quitado y la rata volvió a la cámara de anestesia para llegar a un plano más profundo de anestesia. - Utilizar la mano dominante para mover la lengua al mismo lado que la mano de apoyo con fórceps pulgar amplio punto.
- Uso mano y fijar la lengua con el laringoscopio contra la rata ' s más bajo quijada y visualizar la tráquea y el esófago del animal. La tráquea se abren y cierran como la rata respira.
- Insertar el catéter con una calibre 20 blunted aguja, preparado en el paso 1.1, en la tráquea. Puede haber ligera resistencia, y la inserción en la tráquea puede ser " lleno de baches " debido al catéter frotando los cartílagos traqueales. Debido a humedad o respiración poco profunda, la tráquea puede ser cubierta por la epiglotis, que impide la visualización de la tráquea. Tocar suavemente el borde del cartílago epiglotis hará que la aleta de cartílago abrir y descubrir la tráquea.
- Quitar la aguja blunted el catéter garantizando el catéter permanece en la tráquea.
- Unos segundos pasar de rata poder respirar por catéter insertado en la tráquea.
- Firmemente Coloque el indicador de la tráquea en el catéter de apertura. Movimiento de la barrera aerosol indicará que el catéter se inserta correctamente en la tráquea.
- Asegurar que la rata está sentando en el stand de intubación que el pecho del animal quede perpendicular al plano del stand intubación.
- Quitar el indicador de tráquea y entregar 100 μl (10 7 UFC) del inóculo con F. tularensis utilizando una pipeta de 200 μL, estar firmemente la punta contra la abertura del catéter.
- Acople una jeringa de tuberculina de punta slip 1 mL llenada de aire y entregar 300 μL de aire para inóculo llegue a los pulmones de la rata.
- Retire el catéter de la tráquea y quitar la rata de la plataforma quirúrgica.
- Permite la rata despertar y volver a la jaula. Asegúrese de que la respiración ha vuelto a la normalidad.
- Determinar la UFC en la F. tularensis entrega de inóculo como se describe en el paso 1.3.5 para confirmar la UFC en la tráquea.
- Repita los pasos 3.1-3.9 en animales no vacunados (ingenuo) con 100 μl PBS en lugar del inóculo.
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Representative Results
La respuesta humoral a la inoculación intratraqueal de F. tularensis en la rata puede determinarse por análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) contra las bacterias inactivadas por UV, como se describió anteriormente11. Respuesta total de la inmunoglobulina G (IgG) de las ratas Fischer 344 a células enteras inactivadas de bacterias fue evaluado post-intratraqueal inoculación con una cepa atenuada de Fn (inóculo de UFC7 10) en el día 14 y el día 28 (figura 1). Las ratas vacunadas Mock recibieron PBS PCSC. Un aumento en títulos del anticuerpo del suero contra la inoculación posterior de Fn en relación con animales vacunados falsa ingenua indica la eficacia de la vacunación intratraqueal. Reactividad baja del suero puede indicar la colocación endotraqueal incorrecta.
Figura 1: Total de IgG Responses to vivir inoculación intratraqueal de Fn atenuada en las ratas F344. Los sueros de ratas F344 (n = 5) PCSC inoculado con un vivo atenuado cepa Fn (107 UFC) se analizaron para total niveles de IgG reactivos con células enteras Fn en el día 14 y día 28 post inoculación. Vacunados de Mock (ingenuo) ratas (n = 5) fueron inoculado PCSC con PBS. Área roja indica reactividad de sueros de ingenuo (ratas F344 mock-vacunados con PBS). Las barras de error representan el SEM. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Las ratas Fischer 344 se está convirtiendo en un importante modelo para tularemia vacuna desarrollo3. Exposición a F. tularensis por vía pulmonar es fundamental para demostrar la eficacia contra las formas arma de F. tularensis, porque éstos son entregados como aerosoles. La inoculación intratraqueal de la rata facilita la exposición de los pulmones de ratas para F. tularensis sin necesidad de aerosoles grandes, costosos y complicados equipos generadores. Todos los experimentos utilizando además formas seleccione agente de F. tularensis requieren contención BSL3, que ocurre típicamente en el espacio muy limitado. Por lo tanto, esta técnica reduce al mínimo la cantidad de equipo adicional que debe ser ubicado dentro de ese ambiente de trabajo.
Porque Fn fue la cepa de F. tularensis utilizada para la grabación, todas las técnicas se realizaron bajo contención BSL2. Adaptación de esta técnica en el entorno de BSL3 incluye todos los procedimientos realizados dentro de un gabinete de bioseguridad por personal con equipo de bioseguridad (campana completa, respirador purificador de aire con alimentación (PAPR), tapa de protección con capucha, doble guantes, botines) y estas adaptaciones reducen visibilidad, movilidad y destreza. El indicador de la tráquea es un componente importante que permite la confirmación de que el catéter fue colocado correctamente dentro de la tráquea, teniendo en cuenta a menudo es difícil que de lo contrario esta determinación cuando se trabaja bajo condiciones de BSL3.
Hay rata anatómicamente correcta "simuladores" que tienen una tráquea y esófago, y son útiles para perfeccionar la técnica antes de trabajar con animales vivos. Sin embargo, trabajar con el simulador no es idéntico a trabajar con una rata viva. Un medio para determinar si esta técnica se realiza correctamente en el animal vivo es utilizar colorante azul de Trypan inocular en una rata anestesiado, y después del procedimiento inmediatamente eutanasia del animal. Disección del tejido pulmonar y estómago revelará si el tinte fue entregado en los pulmones y no el esófago. Una rata que ha sido vacunada con Fn/Ft por esta técnica también puede ser sacrificada poco después de la inoculación y el tejido pulmonar plateado para determinar real deposición en el pulmón.
La inoculación intratraqueal correcta será importante para la evaluación de la eficacia de la vacuna de la tularemia en ratas Fischer 344, pero también puede ser útil para otras vacunas o aplicaciones terapéuticas en ratas, incluyendo biodefense. Así, esta técnica puede ser adaptable a una variedad de aplicaciones pulmonares utilizando el modelo de la rata. Entrega por un aerosol generación de dispositivo puede ser más similar a un escenario de biothreat, la inoculación intratraqueal de F. tularensis representa una alternativa relativamente simple y rentable para el desarrollo de vacuna contra la tularemia.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por la Agencia de reducción de amenaza de defensa (DTRA) bajo contrato HDTRA1-14-C-0116 y el centro de excelencia en genómica de la infección (DOD #W911NF-11-1-0136).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GreenLine fiber optic blade size 0 | Carefusion | 5-5231-00 | Macintosh American profile |
| GreenLight system laryngoscope handle | Carefusion | 4559GSP | |
| Exel International Safelet I.V. Catheter | EXEL INTERNATIONAL | 26743 | |
| Slip Tip Sterile Syringes 1mL | BD | 309659 | |
| Broad Point Dressing Thumb Forceps | Thermo Scientific | 76-302 | |
| 200 μL barrier tip | GeneseeScientific | 24-142 | |
| 1,000 μL pipette tip | Olympus Plastics | 24-173 | |
| Dremel 3000-2/28 Rotary tool kit | Dremel | 3000228 | |
| Rodent Intubation Stand | Braintree Scientific | RIS 200 | |
| Isoflurane | Butler Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| Rodent anesthesia machine | Surgivet | VTC302 Classic T3 | |
| Rodent Anesthesia chamber | Braintree Scientific | AB 1 |
References
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