Summary
Plusieurs maladies oculaires vision sont associés à des microvaisseaux rétiniennes dysfonctionnels. La mesure des réponses de l’artériole rétinienne est donc importante d’étudier les mécanismes physiopathologiques sous-jacents. Cet article décrit un protocole détaillé pour souris arteriole rétinienne isolement et préparation pour évaluer les effets des substances vasoactives sur diamètre vasculaire.
Abstract
L’insuffisance vasculaire et des altérations perfusion rétinienne normale sont parmi les principaux facteurs de la pathogenèse de diverses vue oculaires maladies mortelles, telles que la rétinopathie diabétique, rétinopathie hypertensive et éventuellement le glaucome. Préparations microvasculaires rétiniennes sont donc des outils pivots pour les études physiologiques et pharmacologiques délimiter les mécanismes physiopathologiques sous-jacents et à la conception des thérapies pour les maladies. Malgré l’utilisation de modèles de souris dans la recherche ophtalmologique, études sur la réactivité vasculaire rétinienne sont rares chez cette espèce. Des principales raisons de cette divergence sont les procédures d’isolement difficile en raison de la petite taille de ces vaisseaux sanguins rétiniens, c'est-à-dire ~ ≤ 30 µm de diamètre luminal. Pour contourner le problème de l’isolement direct de ces microvaisseaux rétiniennes pour des études fonctionnelles, nous avons mis en place une technique d’isolation et de préparation qui permet des études ex vivo vasoactivité rétine de souris dans des conditions physiologiques près . Bien que la préparation expérimentale actuelle fera expressément référence à des artérioles rétiniennes de souris, cette méthode peut facilement servir à microvaisseaux des rats.
Introduction
Troubles de perfusion rétinienne ont été impliqués dans la pathogenèse des maladies oculaires diverses, telles que la rétinopathie diabétique, rétinopathie hypertensive et glaucome1,2,3. Ainsi, les études visant à mesurer la réactivité vasculaire de la rétine sont importantes pour comprendre la physiopathologie de ces maladies et pour développer de nouveaux traitements s’approche.
En raison de la possibilité de manipulation génétique dans le génome murin, la souris est devenu un modèle animal largement utilisé pour les études du système cardiovasculaire4. Toutefois, en raison de la petite taille des vaisseaux sanguins rétiniens (≤ 30 µm), mesure de la réactivité vasculaire dans la rétine de souris est un défi. Par exemple, des techniques pour la mesure in vivo sont limités dans leur résolution optique et par conséquent ne permettent de détecter exactement les changements de débit diamètre ou de sang dans le petit sang inférieure à ≤ 30 µm de diamètre lorsqu’il est équipé avec autres appareils sophistiqués, comme un microscope confocal à l’aide de colorants fluorescents ou l’Adaptive Optics balayage lumière ophtalmoscope5,6. En outre, l’interprétation de in vivo les mesures visant à identifier les mécanismes dans les vaisseaux sanguins rétiniens peuvent être confondus par les anesthésiques, de signalisation modifie la pression artérielle systémique et l’influence des vaisseaux sanguins rétrooculaire.
Par conséquent, nous avons développé une méthode pour mesurer les réponses des vaisseaux sanguins rétiniens de souris avec haute résolution optique ex vivo. La technique présentée ici permet de visualiser des artérioles rétiniennes via transmis en microscopie photonique. Cette méthode, qui peut également être utilisée chez les rats, permet d’accéder aux avantages de la technologie en recherche vasculaire oculaire de ciblage génique.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Les procédures expérimentales de cette étude ont été approuvées par l’Animal Care Comité de Rhénanie-Palatinat, Allemagne. Soins aux animaux conforme aux directives institutionnelles et l’Association pour Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) instruction pour l’utilisation des animaux en ophtalmologie et de la recherche de vision. Les animaux ont été traités conformément à la Directive européenne 2010/63/UE pour l’expérimentation animale. Mâles souris C57BL/6J (The Jackson Laboratory, Bar Harbour, ME, é.-u.) âgés de 3-4 mois ont été utilisés pour les expériences. Les animaux étaient logés dans des conditions normales (température de 23 ± 2 ° C, humidité gamme 55 ± 10 % et 12 h cycles de lumière/obscurité) et avaient accès à la souris standard chow et eau ad libitum.
1. isolement de la rétine de souris
- Placer les instruments de dissection sur la table de préparation et vérifier si tous les instruments sont faites pour permettre une préparation rapide.
- Sacrifier la souris par inhalation de CO2 .
- Décapiter la souris avec des ciseaux en acier, coupez le crâne sagitally en deux moitiés à l’aide de la même paire de ciseaux et enlever la peau et le cerveau à l’aide de ciseaux de l’oeil (Figure 1).
- Couper l’OS crânien de laisser seulement l’OS orbital à l’aide de ciseaux de le œil.
- Transférer l’orbite dans une boite de dissection contenant un tampon de Krebs-Henseleit glacé.
- Gardez le plat de dissection sur glace ou changer le tampon toutes les 10 min.
- Couper l’OS orbital à l’aide de ciseaux de le œil et retirer doucement le globe de l’oeil ainsi que le tissu orbital à l’aide de type précision 4 pinces et ciseaux de Vannas étudiant ressort (Figure 2).
- Retirez délicatement la glande, tissu conjonctif et les muscles extraoculaires, à l’aide de type précision 5 pinces et ciseaux de Vannas capsulotomie, prenant soin de ne pas pour endommager la principale branche de l’artère ophtalmique.
- Ligaturer les branches orbitales de l’artère ophtalmique et finalement l’extrémité proximale de la branche principale de l’artère ophtalmique à l’aide de sutures de Nylon de 10-0 (Figure 3).
- Transvaser le globe de l’oeil dans une boîte de Pétri contenant de l’éthanol à 70 % pour 10 s en utilisant type 4 brucelles de précision. Replacez le globe oculaire dans le plat de dissection et remplacer le tampon avec la nouvelle solution de Krebs. La cornée apparaît blanchâtre après l’exposition de l’éthanol.
- La perforation de la cornée périphérique avec une aiguille de 30 calibre et disséquer la cornée à l’aide de ciseaux de Vannas capsulotomie. Doucement coupé le tissu de l’iris, placer une pointe acérée des Ciseaux Vannas capsulotomie entre la choroïde et la rétine et coupée de la choroïde et de la sclérotique. Laisser certains tissu scléral autour du nerf optique (Figure 4).
2. montage de la rétine dans la chambre de Perfusion
Remarque : La chambre de perfusion utilisée pour des expériences de l’artériole rétinienne est artisanale. Il se compose d’un réservoir transparent avec un tube d’entrées et sorties (Figure 5). Une extrémité d’un tube de silicone est collée sur le fond de la chambre avec histoacryl adhésif et l’autre extrémité attachée à un robinet à trois voies. Connecter une seringue contenant un tampon de Krebs fraîche pour le robinet à trois voies et remplir le tube avec du tampon.
- Prenez une micropipette de verre avec un porte-aiguille et poussez-le dans l’extrémité du tube au fond de la chambre de perfusion. Ensuite, briser la pointe de la micropipette avec des ciseaux de type 4 pour obtenir une pointe de 100 µm de diamètre.
- Mettre l’accent sur la pointe de la micropipette et rincez-la via la seringue reliée au tube. Veiller à ce que le capillaire n’est pas obstrué par des débris. En cas d’occlusion, le retirer, rincer la tubulure et insérer un autre micropipette.
- Remplir la chambre de perfusion avec tampon Krebs froid et mettre la chambre sous un microscope stéréo.
- Place une plate-forme en plastique transparente dans la chambre de perfusion. Cette plateforme a une mise en retrait de 1,8 mm de largeur pour le nerf optique et l’artère ophtalmique et est placée sur deux câbles acier de 1,6 mm de diamètre. Ensuite, placer un anneau en acier inoxydable de 2,8 mm de diamètre intérieur et le diamètre extérieur de 4,0 mm sur la plate-forme.
- Transférer la rétine avec le nerf optique et l’artère ophtalmique ci-joint de la chambre de dissection dans la chambre de perfusion avec un soin extrême à l’aide d’une cuillère. Cette étape est importante pour prévenir étirement des tissus, car il peut être nuisible à l’expérience.
- Coupez la partie suturée de l’extrémité proximale de l’artère ophtalmique, placez deux boucles préformés de suture nylon 10-0 sur une micropipette et canule dans l’artère ophtalmique avec une micropipette. Attachez l’artère à la micropipette (Figure 6) et placez la rétine sur la plate-forme transparente à l’aide d’amende-point-pince à épiler.
- Doucement déchirer la capsula anterior lentille avec deux pointe fine pince à épiler, retirez la lentille et couper la capsula lentille entière à l’aide de microciseaux.
- Par la suite, faire quatre incisions radiales dans la rétine de moitié de la distance de la pars plana au nerf optique et placer un anneau en acier inoxydable sur la rétine à fixer sur le fond. La rétine est maintenant prête pour l’expérience (Figure 7).
3. préparation des artérioles rétiniennes pour l’expérience
- Placer la chambre de perfusion sous un microscope optique. L’objectif est un objectif 100 X-immersion dans l’eau.
- Relier les deux tubes pour dans - et out - débordement vers une pompe péricyclique et faire circuler la chambre avec le tampon de Krebs oxygénée avec 95 % d’O2 et gazeuses avec 5 % de CO2 à 37 ° C. Utiliser un débit entre 100 et 120 mL/min.
- Connecter le tuyau de silicone, qui est relié à la micropipette, à un réservoir silicone flexible via un robinet à trois voies. Ensuite, remplir le réservoir avec du tampon de Krebs à une hauteur correspondant à 50 mm Hg, mais ne pas ouvrir le robinet à trois voies encore.
- Regarder à travers les objectifs du microscope et mettant l’accent sur la surface rétinienne. Recherche de vaisseaux sanguins ou de globules rouges. Il est possible que les vaisseaux sanguins sont complètement effondrés, parfois seulement que quelques globules rouges sont visibles.
- Lorsqu’un vaisseau sanguin se trouve, se concentrer là-dessus et ouvrir le robinet à trois voies. Le diamètre du navire devrait augmenter immédiatement et les globules rouges bougent soit par centrifugation, si c’est une artériole ou centripète dans le cas d’une veinule. Les artérioles sont plus petites en diamètre par rapport aux veinules du même ordre.
- Une fois trouvé un vaisseau sanguin avec un mur bien visible, il peut être utilisé pour des expériences après une période d’équilibration de 30 min (Figure 8). Au cours de la période d’équilibration, les artérioles développent seulement faible tonus intrinsèque, ce qui entraîne moins de 10 % de réduction de diamètre luminal.
4. effectuer l’expérience
- Tester la viabilité de navires avec le thromboxane mimétique 9, 11-didésoxy-9α, 11α-methanoepoxy prostaglandine F2α (U46619) en l’ajoutant à la solution du bain. Cet agent resserre les artérioles rétiniennes souris d’environ 50 % du diamètre de repos à des concentrations de ≥ 10-6 M.
- Une fois que le navire est confirmé viable, l’agoniste sortant du bain de lavage de la pompe de circulation et approvisionnement mémoire tampon Krebs fraîche dans le bain.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
U-46619 produit des réponses de concentration-dépendante vasoconstricteur en artérioles rétiniennes de souris de type sauvage de l’arrière-plan de C57Bl/6J. À une concentration de 10-6 M, réduction du diamètre luminal était ≈50 % du diamètre au repos. Figure 9 a montre une courbe de concentration-réponse représentatif d’une artériole rétinienne. En artérioles pré-comprimés avec U46619, administration cumulative d’acétylcholine évoquée par des augmentations de concentration-dépendante de diamètre luminal ≈25 % du diamètre précontracté à 10-5 M, indicative de l’endothélium vasculaire ( Figure 9 b).
Figure 1 : Dissection du crâne souris. La peau sur la tête décapitée de la souris est retirée pour exposer les yeux et la cavité orbitale. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : isolement de tissu orbitale et de globe oculaire. L’OS orbital a été coupé avec des ciseaux de le œil et le globe de l’oeil ainsi que les tissus rétrooculaire et nerf optique ont été soigneusement isolés. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : le globe oculaire et la préparation de l’artère ophtalmique. Une fois que les tissus environnants orbitales ont été disséqués avec fine microciseaux, l’artère ophtalmique a été soigneusement exposé et leurs petites branches ligaturé avec suture de monofilament en nylon 10-0. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Dissection des structures oculaires. Afin de visualiser la rétine, la sclérotique et uvea ont été disséqués avec des ciseaux de Vannas capsulotomie. Certains tissu scléral autour du nerf optique a été laissé pour éviter tout endommagement de l’artère ophtalmique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : chambre d’orgue pour la microscopie vidéo en temps réel. La chambre était faite maison. Elle consiste en une boîte de Pétri de 100 mm de diamètre avec un tube de débordement dans et dehors. Les tubes ont été collées avec de la colle histoacryl. Tampon de Krebs-Henseleit extérieurement oxygéné et gazéifiée a été distribué par une pompe péristaltique, par l’intermédiaire de ces tubes. Une extrémité d’un tube de silicone a été collée au fond de la chambre et l’autre extrémité attachée à un robinet à trois voies. À la fin du tube, a été insérée une micropipette de verre avec une pointe de 100 µm, qui a servi pour la canulation de l’artère ophtalmique. Via le tube de silicone, la circulation ophtalmique a été sous pression en remplissant un tube de silicone avec le tampon de Krebs à un niveau correspondant à 50 mm Hg. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : canulation de l’artère ophtalmique. L’artère ophtalmique a été canulé avec verre de micropipette et suturé par une suture en nylon de 10-0. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : canulation de l’artère ophtalmique. Après avoir placé la rétine sur la plate-forme transparente, la lentille avec le sac capsulaire a été supprimée, quatre incisions radiales ont été faites dans la rétine et un acier inoxydable de l’anneau de 2,8 mm de diamètre intérieur et 4,0 mm de diamètre extérieur a été placé sur la rétine pour le fixer au b ottom. La rétine est alors prête pour l’expérience. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 8 : visualisation des vaisseaux sanguins rétiniens. Une artériole rétinienne exemplaire avec les globules rouges à l’intérieur.
Figure 9 : des études fonctionnelles, à l’aide de la microscopie vidéo. Courbes de réponse de concentration représentatifs d’une artériole rétinienne unique. (A) courbe concentration-réponse pour le vasoconstricteur, U46619 (10-9 à 10-6 M) et (B) pour le vasodilatateur endothélium-dépendante, l’acétylcholine (10-8 à 10-5 M). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La mesure des réponses vasculaires de la rétine de souris est difficile en raison de la petite taille des vaisseaux sanguins rétiniens. Avec la technique présentée, artérioles rétiniennes sont visualisées par microscopie à lumière transmise. Cela est possible, parce que la rétine isolée est translucide. L’avantage de la technique est la résolution optique élevée. La résolution spatiale calculée est 11 px/µm. Cependant, la résolution réelle de ce système optique qui utilise la lumière blanche est entre 200 et 300 nm, ce qui s’explique par la limite de diffraction d’Abbe. Le premier volet des artérioles rétiniennes de souris ayant un diamètre intérieur de 20 à 30 µm, changements de diamètre d’environ 1 % sont détectables avec ce système. Il n’y a pas besoin de dispositifs techniques supplémentaires ou des colorants fluorescents tel que rapporté dans d’autres études afin de visualiser les petites artérioles rétiniennes5,6,7. Un inconvénient de cette technique est le temps de préparation long, qui se situe entre 90 et 120 min par des enquêteurs formés. Si le temps de préparation est supérieure à 180 min, la fonction endothéliale commence à être atténuée.
Il y a plusieurs étapes critiques majeurs dans cette technique. Tout d’abord, il est important de bien ligaturer toutes les branches artérielles rétrooculaire. Si la ligature est incomplète, les artérioles rétiniennes ne seront pas sous pression en raison de la fuite. Deuxièmement, l’immersion dans de l’éthanol pour 10 s avant l’ouverture du globe oculaire est important de désactiver la réactivité du muscle lisse de l’artère ophtalmique. Nous avons démontré précédemment qu’immersion pendant 10 s dans l’éthanol à 70 % désactive complètement le muscle lisse de l’artère ophtalmique8. En revanche, artérioles rétiniennes sont peu susceptibles d’être touchées directement par l’éthanol, car ils sont protégés par le mur bulbaire. Si cette étape est omise, les changements de diamètre de l’artère ophtalmique peuvent influencer la perfusion de la rétine. À noter, réactivité de l’artère ophtalmique peut-être sensiblement différer de celle des artérioles rétiniennes en réponse à l’agoniste même9,10. En troisième lieu, éviter la torsion de l’artère ophtalmique. En particulier lors de la préparation rétinienne sur la plate-forme de montage, l’artère ophtalmique peut-être devenir tordu, aboutissant à une occlusion de la lumière. En outre, vérifiez soigneusement que l’extrémité du capillaire de verre n’est pas obstruée pour permettre la pressurisation des artérioles rétiniennes. Nous suggère de ne pas pour effectuer plus de trois courbes concentration-réponse consécutives dans la même préparation rétinienne, parce que nous avons observé que les réponses à l’acétylcholine est devenu plus faibles quand on répète les courbes concentration-réponse pendant plus de trois fois. Toutefois, il peuvent y avoir des différences concernant la reproductibilité des courbes concentration-réponse selon l’agent appliquent et, ainsi, devraient être testés individuellement.
Nous avons appliqué des agents pharmacologiques extraluminairernent dans nos études, bien qu’intraluminale perfusion à l’aide d’une pompe de commande du servo est également possible. Étant donné que la technique permet de mesurer des mécanismes locaux de la réactivité vasculaire de la rétine de petits animaux de laboratoire dont les souris et les rats, les avantages de la technologie ciblage de gène par l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés sont accessibles avec cette méthode .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont aucun intérêt financier concurrentes.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions de l’Ernst und Berta Grimmke Stiftung et la Deutsche Ophthalmologische Gesellschaft (le chien).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Steel Scissors | Carl Roth GmbH | 3576.1 | 1x 140 mm |
| Eye Scissors | Geuder | G-19390 | 1x straight, 10.5 cm |
| Precision tweezers, straight with fine tips | Carl Roth GmbH | LH68.1 | 2x type 4 |
| Precision tweezers, straight with extra fine tips | Carl Roth GmbH | LH53.1 | 2x type 5 |
| Vannas capsulotomy scissors | Geuder | 19760 | 1x straight, 77 mm |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91501-09 | 1x curved, |
| Barraquer Needle Holder | Geuder | G-17500 | 1x curved, 120 mm |
| Needle | Becton, Dickinson and Company | 305128 | 1x 30 G |
| Glass Capillaries (for producing micropipettes) | Drummond Scientific Company | 9-000-1211 | 1x (1.2 x 0.8 mm; outer/inner diameter) |
| Nylon Suture | Alcon | 198001 | 1x 10-0 |
| Nunclon cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 153066 | 1x 35 mm diameter |
| Nunclon cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 172931 | 1x 100 mm diameter |
| Discofix C | Braun | 16500C | 10 cm |
| Histoacryl adhesive | B. Braun Surgical, S.A. | 1050052 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Pericyclic pump (CYCLO II) | Carl Roth GmbH | EP76.1 | 1x |
| Vertical Pipette Puller Model 700C | David Kopf Instruments | 1x | |
| Microscope (Vanox-T AH-2) | Olympus | 1x | |
| Water immersion objective LUMPlanFL, 1.0 NA | Olympus | 1x | |
| Digital camera (TK-C1381) | JVC | 1x | |
| Perfusion chamber | self-made | 1x | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drugs and Solutions | |||
| Ethanol | Carl Roth GmbH | K928.4 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Carl Roth GmbH | 5239.1 | |
| Kalium chloride (KCl) | Carl Roth GmbH | 6781.1 | |
| Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth GmbH | 3904.2 | |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | Carl Roth GmbH | 261.2 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth GmbH | 9265.2 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Carl Roth GmbH | 0965.3 | |
| α-(D)-(+)- Glucose monohydrate | Carl Roth GmbH | 6780.1 | |
| 9,11-dideoxy-9α,11α-methanoepoxy prostaglandin F2α (U-46619) | Cayman Chemical | 16450 | |
| Acetylcholine chloride | Sigma-Aldrich | A6625-25G |
References
- Toda, N., Nakanishi-Toda, M. Nitric oxide: ocular blood flow, glaucoma, and diabetic retinopathy. Prog Retin Eye Res. 26 (3), 205-238 (2007).
- Schuster, A. K., Fischer, J. E., Vossmerbaeumer, C., Vossmerbaeumer, U. Optical coherence tomography-based retinal vessel analysis for the evaluation of hypertensive vasculopathy. Acta Ophthalmol. 93 (2), e148-e153 (2015).
- Cherecheanu, A. P., Garhofer, G., Schmidl, D., Werkmeister, R., Schmetterer, L. Ocular perfusion pressure and ocular blood flow in glaucoma. Curr Opin Pharmacol. 13 (1), 36-42 (2013).
- Faraci, F. M., Sigmund, C. D. Vascular biology in genetically altered mice : smaller vessels, bigger insight. Circ Res. 85 (12), 1214-1225 (1999).
- Kornfield, T. E., Newman, E. A. Measurement of Retinal Blood Flow Using Fluorescently Labeled Red Blood Cells. eNeuro. 2 (2), (2015).
- Guevara-Torres, A., Joseph, A., Schallek, J. B. Label free measurement of retinal blood cell flux, velocity, hematocrit and capillary width in the living mouse eye. Biomed Opt Express. 7 (10), 4229-4249 (2016).
- Schallek, J., Geng, Y., Nguyen, H., Williams, D. R. Morphology and topography of retinal pericytes in the living mouse retina using in vivo adaptive optics imaging and ex vivo characterization. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8237-8250 (2013).
- Gericke, A., et al. Identification of the muscarinic acetylcholine receptor subtype mediating cholinergic vasodilation in murine retinal arterioles. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (10), 7479-7484 (2011).
- Gericke, A., et al. Functional role of alpha1-adrenoceptor subtypes in murine ophthalmic arteries. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (7), 4795-4799 (2011).
- Bohmer, T., et al. The alpha(1)B -adrenoceptor subtype mediates adrenergic vasoconstriction in mouse retinal arterioles with damaged endothelium. Br J Pharmacol. 171 (16), 3858-3867 (2014).
