Summary
Vizyon tehdit eden birçok oküler hastalıklar işlevsel olmayan retina yüzdeki ile ilişkilidir. Bu nedenle, retina arteriyol yanıt ölçümü temel patofizyolojik mekanizmaları araştırmak önemlidir. Bu makalede fare retina arteriyol yalıtım ve damar çapı vazoaktif maddelerin etkilerini değerlendirmek için hazırlık için detaylı bir iletişim kuralı.
Abstract
Vasküler yetmezlik ve normal retina perfüzyon değişiklikler için çeşitli görme tehdit oküler hastalıklar, Diyabetik retinopati, hipertansif retinopati ve muhtemelen glokom gibi patogenezinde önemli faktörler arasındadır. Bu nedenle, retina mikrovasküler hazırlıklar önemli fizyolojik ve farmakolojik araştırmalar temel patofizyolojik mekanizmaları betimlemek ve hastalıklar için tasarım terapiler için araçlardır. Oftalmik araştırma fare modellerinde geniş kullanılmasına rağmen retinal vasküler reaktivite çalışmaları bu tür azdır. Bu retina kan damarları olan küçük boyutu sayesinde zorlu yalıtım yordamlar büyük sebebi bu tutarsızlık ~ ≤ 30 µm luminal çapındadır. Fare retina vasoactivity-fizyolojik koşullar altında ex vivo çalışmalar sağlar bir yalıtım ve hazırlama tekniği kurduk bu retina yüzdeki fonksiyonel çalışmalar için doğrudan yalıtım sorunu aşmak için . Her ne kadar mevcut deneysel hazırlıklar özellikle fare retina arteriyoller sevk edecektir, bu metodoloji kolayca yüzdeki için sıçanlarından emir istihdam edilebilir.
Introduction
Retina perfüzyon bozukluğu diabetik retinopati, hipertansif retinopati ve glokom1,2,3gibi çeşitli oküler hastalıkların patogenezinde karıştığı olmuştur. Böylece, retinanın vasküler reaktivite ölçme amaçlı çalışmalar bu hastalıklar Patofizyoloji anlamak önemlidir ve yeni tedavi geliştirmek için yaklaşımlar.
Fare genom gen manipülasyon olasılığı nedeniyle, fare kardiyovasküler sistem4çalışmaları için yaygın olarak kullanılan bir hayvan modeli haline gelmiştir. Ancak, retina kan damarları (≤ 30 µm) küçük boyutu nedeniyle, fare retinanın vasküler reaktivite ölçümü zordur. Örneğin, in vivo ölçüm için stereomicroscopic teknikleri onların optik çözünürlük sınırlı olduğunu ve bu nedenle tam olarak çapı veya kan akışı ile donatılmış ≤ 30 µm çapı az küçük kan değişiklikleri algılamak için yalnızca izin ver Floresan boyalar veya uyarlamalı optik tarama ışık Ophthalmoscope5,6kullanarak confocal mikroskop gibi ek sofistike aygıtlar. Ayrıca, yerel tanımlama amaçlı vivo içinde ölçümleri yorumlanması mekanizmaları retina kan damarlarında Anesteziyoloji, şaşırmış sinyal sistemik kan basıncı ve etkisi retrobulbar kan damarlarının değiştirir.
Bu nedenle, yüksek optik çözünürlük ex vivoile fare retina kan damarlarının yanıtları ölçmek için bir yöntem geliştirdi. Burada sunulan teknik retinal arteriyoller üzerinden iletilen ışık mikroskobu görselleştirme sağlar. Fareler de kullanılabilir, bu yöntem gen teknolojisi oküler vasküler araştırma hedefleme avantajları erişim sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışmada deneysel prosedürler hayvan bakımı Komitesi, Rheinland-Pfalz tarafından Almanya kabul edildi. Hayvan bakımı hayvan oftalmik kullanımı için vizyon ve Oftalmoloji (ARVO) deyiminde araştırma ve vizyon araştırma için kurumsal yönergeleri ve dernek için standartlarla uyumlu. Hayvanlar göre Avrupa Birliği yönetmeliği uyarınca 2010/63/AB hayvan deneyleri için tedavi edildi. 3-4 ay yaşlı erkek C57BL/6J fareler (Jackson laboratuvar, Bar Harbour, bana, ABD) deneyler için kullanılmıştır. Hayvanlar (sıcaklık 23 ± 2 ° C, nem aralığı 55 ± %10 ve 12 h açık/koyu döngüleri) standart koşullar altında yer alan ve standart fare chow ve su ad libitumyetkisi vardı.
1. yalıtım fare Retina
- Diseksiyon aletleri hazırlık masaya koyun ve tüm araçları hızlı bir hazırlık etkinleştirmek için tam olup olmadığını kontrol edin.
- Fare CO2 inhalasyon tarafından kurban.
- Fare ile çelik makas başını kesmek, kafatası sagitally makas aynı çifti kullanarak iki yarısı kesilmiş ve çıkarmak belgili tanımlık deri ve göz makas (şekil 1) kullanarak beyin.
- Sadece orbital kemik göz makası kullanarak terk etmek kafatası kemik kesti.
- Yörünge buz gibi Krebs-Henseleit arabellek içeren bir diseksiyon kabına aktarın.
- Buzda diseksiyon çanak tutmak veya arabellek her 10 min değiştirin.
- Göz makas kullanarak orbital kemik kesme ve yavaşça göz küre ile birlikte orbital doku tipi 4 hassas cımbız ve öğrenci kenasen bahar makas (Şekil 2) kullanarak çıkarın.
- Yavaşça Harderian bezi, bağ dokusu ve Ekstraoküler kaslar türü 5 hassas cımbız ve oftalmik arter Ana dalı zarar vermemeye dikkat çekici kenasen capsulotomy makas kullanarak çıkarın.
- Yörünge oftalmik arter dalları ve sonunda 10-0 naylon dikiş (şekil 3) kullanarak oftalmik arter Ana dalı proksimal sonuna ligate.
- Göz dünyanın 10 s kullanarak türü için 4 hassas cımbız % 70 etanol içeren bir Petri kabına aktarın. Göz dünyanın geri diseksiyon çanak yerleştirin ve arabellek taze Krebs çözüm ile değiştirin. Kornea etanol maruz kaldıktan sonra beyazımsı görünür.
- Periferik kornea ile 30 gauge iğne ponksiyon ve kenasen capsulotomy makas kullanarak kornea incelemek. Yavaşça Iris doku kesmek, bir sivri kenasen capsulotomy makas koroid ve retina arasında yerleştirin ve kestim koroid ve sklera. Optik siniri (şekil 4) etrafında scleral bazı doku bırakın.
2. montaj perfüzyon odası retinada
Not: Retina arteriyol deneyler için kullanılan perfüzyon dolu bir ev yapımı yer. Şeffaf bir rezervuar bir giriş ve çıkış tüp (şekil 5) ile oluşur. Bir silikon tüp bir ucunu histoacryl yapıştırıcı ve üç yollu stopcock bağlı diğer ucunu ile odası altına yapıştırılmış olan. Üçlü stopcock taze Krebs arabelleğe içeren bir şırınga bağlanmak ve tüp arabellek ile doldurun.
- İğne bağı ile bir cam micropipette al ve tüp perfüzyon odası alt sonu içine itin. Sonra micropipette ucu 100 µm çapı bir ipucu elde etmek için tip 4 makasla bölün.
- Micropipette ucunda odak ve şırınga tüp bağlı yolu ile yıkayın. Kılcal enkaz tarafından tıkandı değil iyi bak. Durumunda tıkanıklığı, kaldırmak, tüp Temizleme ve başka bir micropipette ekleyin.
- Perfüzyon odası soğuk Krebs arabellek ile doldurun ve stereo mikroskopla odası koymak.
- Şeffaf plastik platformu perfüzyon odasına koyun. Bu platform için optik sinir ve oftalmik arter 1.8 mm genişlikte bir girinti vardır ve 1.6 mm çapı iki çelik teller üzerinde yer alıyor. Sonra bir paslanmaz çelik yüzük 2.8 mm iç çap ve 4.0 mm dış çap platformu üzerine yerleştirin.
- Optik sinir ve ekli oftalmik arter ile retina diseksiyon odasından perfüzyon odanın içine bir kaşık kullanarak aşırı dikkatli aktarın. Bu adım potansiyel önlemek önemlidir bu deney için zararlı olabilir gibi dokuların germe.
- Oftalmik arter proksimal sonu dikilmiş kısmı kapalı kesmek, iki ön şekillendirilmesi döngüler 10-0 naylon sütür micropipette üzerine yerleştirin ve oftalmik arter micropipette ile cannulate. Arter micropipette (şekil 6) ile kravat ve retina fine-nokta-cımbız kullanarak şeffaf platform üzerine yerleştirin.
- Yavaşça ön lens capsula iki ince nokta cımbız ile açık gözyaşı, lens çekin ve microscissors kullanarak tüm objektif capsula kesti.
- Daha sonra dört Radyal insizyon retina pars plana-Optik siniri yarım uzaklık yapmak ve paslanmaz çelik yüzük altına düzeltmek için retina üzerine yerleştirin. Retina şimdi deneme (Şekil 7) için hazırdır.
3. deney için retina arteriyoller hazırlanması
- Perfüzyon odası ışık mikroskop altında yerleştirin. 100 X su-daldırma objektif lens hedefidir.
- İki makaronlar için içinde - ve çıkış - flow pericyclic pompa için bağlanmak ve % 95'i O2 ile oksijenli ve 37 ° C'de % 5 CO2 gazlı Krebs arabelleği ile odası dolaşımda Bir akış hızı 100 ile 120 mL/dk arasında kullanın.
- Bir rezervuar silikon hortum aracılığıyla için üç yollu stopcock için micropipette bağlı, silikon tüp takın. O zaman, 50 mm Hg için karşılık gelen bir yükseklik Krebs arabelleğe ile rezervuar doldurun ama üçlü stopcock henüz açmayın.
- Mikroskop ve odak retina yüzeyinde amaçlarını bakın. Kan damarları veya kırmızı kan hücreleri için arama. Bu kan damarları tamamen, bazen sadece bazı kırmızı kan hücreleri görülebilir daraltıldığını mümkündür.
- Bir kan damarı bulduğumuzda, üzerinde durulması ve üç yollu stopcock açın. Gemi çapını hemen yükseltmeniz gerekir ve kırmızı kan hücreleri de sentirifüjlü, bir arteriyol ise veya centripetally bir venule durumunda taşıyın. Arteriyoller çapı aynı sırada venüller için karşılaştırıldığında küçüktür.
- İyi görünür bir duvar ile bir kan damarı bulunduktan sonra bir denge döneminden sonra bir 30 dk (şekil 8) deneyler için istihdam edilebilir. Denge döneminde arteriyoller luminal çap küçültme az % 10 kaynaklanan sadece zayıf iç sesi geliştirmek.
4. deneme gerçekleştirme
- Gemi thromboxane mimetic 9,11-dideoxy-9α, 11α-methanoepoxy prostaglandin F2α (U46619) ile canlılık banyo çözüm ekleyerek test. Bu Ajan yaklaşık % 50 oranında çapı ≥ 10 konsantrasyonları dinlenme--dan fare retina arteriyoller bitiminde-6 M.
- Gemi uygun onaylandıktan sonra pompa dolaşan by agonist banyo dışarı yıkama ve banyo içine taze Krebs arabellek kaynağı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
U-46619 retina arteriyoller konsantrasyon bağımlı vasoconstrictor yanıtlarında vahşi tipi fareler C57Bl/6J arka plan üzerinden üretti. 10-6 M konsantrasyon istirahat çapı ≈50% luminal çapı azalma oldu. Þekil 9A bir retina arteriyol bir temsilcisi konsantrasyon-yanıt eğrisini gösterir. U46619 ile preconstricted arteriyoller içinde asetilkolin toplu yönetim luminal çapı artışlar konsantrasyon bağımlı ≈25% preconstricted çapı 10-5 M, bir bozulmamış vasküler endotel () gösterge, üzerinden uyarılmış Şekil 9B).
Şekil 1: fare kafatası diseksiyon. Deri kesik fare kafasına gözleri ve orbital boşluğu ortaya çıkarmak için kaldırılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: yalıtım göz Küre ve orbital doku. Orbital kemik göz makas ve göz küre ile birlikte retrobulbar dokular ile kesilmiş ve optik sinir dikkatli bir şekilde izole edildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: göz Küre ve oftalmik arter hazırlanması. Çevre yörünge dokular ile iyi microscissors disseke, oftalmik arter dikkatle maruz kalmış ve 10-0 naylon monofilament dikiş ile küçük şubeleri bakmaksızın. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: oküler yapıları diseksiyon. Retina görselleştirmek için sklera ve uvea kenasen capsulotomy makas ile disseke. Optik siniri etrafında scleral bazı doku zarar oftalmik arter önlemek zorunda kalmıştı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: Organ odası için gerçek zamanlı video mikroskobu. Odası ev yapıldı. Bir petri 100 mm çapında bir içinde - ve çıkış - flow tüp ile oluşuyordu. Tüpler histoacryl yapıştırıcı ile yapıştırılmış. Dışarıdan oksijenli ve gazlı Krebs-Henseleit arabellek Peristaltik pompa bu tüpler aracılığıyla dağıtılan. Bir silikon tüp bir ucunu odası ve üç yollu stopcock bağlı diğer ucunu altına yapıştırılmış. Tüp sonunda hangi oftalmik arter cannulation için devam eder bir cam micropipette 100 µm ucu ile eklenmiştir. Silikon tüp Krebs arabelleği için 50 mm Hg. karşılık gelen bir seviyeye ile bir silikon tüp doldurarak oftalmik dolaşım basınç altında Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: Cannulation oftalmik arter. Oftalmik arter cam micropipette ile cannulated ve 10-0 naylon dikiş ile dikmiş. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7: Cannulation oftalmik arter. Retina şeffaf platform üzerine yerleştirerek sonra kapsüler çanta ile objektif kaldırıldı, dört Radyal insizyon retina yapılan ve yüzük 2.8 mm iç çap ve 4.0 mm dış çaplı paslanmaz çelikten b düzeltmek için retina üzerine yerleştirildi alttan. Retina sonra deneme için hazır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 8: görselleştirme retina kan damarlarının. Bir örnek retina arteriyol ile kırmızı kan hücreleri içinde.
Şekil 9: fonksiyonel çalışmalar kullanarak video mikroskobu. Tek bir retina arteriyol gelen temsilcisi konsantrasyon yanıt eğrileri. (A) konsantrasyon-yanıt eğrisi vasoconstrictor, U46619 için (10-9 10-6 M için), (B) ve endotel bağımlı vazodilatör, asetilkolin (10-8 10-5 M için). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vasküler fare retina yanıt-e doğru ölçü retina damarları küçük boyutu nedeniyle meydan okuyor. Sunulan tekniği ile retina arteriyoller tarafından iletilen ışık mikroskobu görüntülenir. İzole retina yarı saydam olduğundan bu mümkündür. Teknik yüksek optik çözünürlük avantajdır. Hesaplanan Uzaysal çözünürlük 11 px/µm var. Ancak, beyaz ışık kullanır bu optik sistemi için gerçek çözünürlüğünü Abbe kırınım sınırına göre açıkladı 200 ve 300 nm arasındadır. Fare retina arteriyoller ilk Şubesi 20-30 µm bir iç çapı olduğundan, çapı yaklaşık % 1'lik bu sistemi ile tespit değişikliklerdir. Küçük retina arteriyoller5,6,7görselleştirmek için ek teknik cihazlar veya floresan boyalar olarak bildirilen diğer çalışmalarda gerek yoktur. Teknik eğitilmiş müfettişler tarafından 90-120 dakika arasında uzun hazırlık süresi dezavantajdır. Hazırlık süresi 180 dk aşarsa, endotel fonksiyonları zayıflatılmış başlar.
Bu teknikte çeşitli büyük kritik adımlar vardır. İlk olarak, iyice tüm retrobulbar arter dalları ligate önemlidir. Tüp ligasyonu Eksik ise, retina arteriyoller sızıntı nedeniyle basınçlı değil. İkincisi, 10 için etanol içinde daldırma göz dünya açmadan önce s düz kas reaktivite oftalmik arter devre dışı bırakmak önemlidir. Biz daha önce 10 çeker gösterdi s % 70 etanol içinde tamamen devre dışı bırakır oftalmik arter düz kas8. Buna ek olarak, retina arteriyoller bulber duvar tarafından korunan bu yana doğrudan etanol tarafından etkilenen için olası değildir. Bu adımı ihmal edilirse, çapı değişiklikleri oftalmik arter perfüzyon retina etkileyebilir. Not, oftalmik arter reaktivite belirgin yanıt aynı agonist9,10olarak retina arteriyoller, farklı olabilir. Üçüncü olarak, burulma oftalmik arter kaçının. Özellikle retina hazırlık platformu üzerine montaj sırasında oftalmik arter, Lümen tıkanıklığı içinde kaynaklanan bükülmüş haline. Ayrıca, dikkatle cam kılcal ucu retina arteriyoller basınçlandırma etkinleştirmek için tıkandı değil kontrol edin. Çünkü biz asetilkolin yanıtlarını konsantrasyon-yanıt eğrileri için fazla üç kez tekrar ne zaman zayıf oldu gözlenen aynı retina hazırlık olarak, fazla üç ardışık konsantrasyon-yanıt eğrileri yapmak değil öneririz. Ancak, konsantrasyon-yanıt eğrileri bağlı olarak aracı tekrarlanabilirlik ile ilgili farklılıklar uygulanan ve olabilir, böylece, tek tek test edilmelidir.
Ancak bir servo kontrol pompa kullanarak intraluminal perfüzyon da olabilir biz çalışmalarımız, farmakolojik extraluminally uygulanır. Fare ve sıçanlar da dahil olmak üzere küçük laboratuvar hayvanlarının retinanın vasküler reaktivite yerel mekanizmaları için ölçmek için teknik sağlar beri genetiği değiştirilmiş hayvanlar kullanarak gen hedefleme teknolojisinin avantajı-ebilmek var olmak giriş ile bu yöntem .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali ilgi alanlarına sahip.
Acknowledgments
Bu eser hibe Ernst und Berta Grimmke Stiftung ve Deutsche Ophthalmologische Gesellschaft (köpek) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Steel Scissors | Carl Roth GmbH | 3576.1 | 1x 140 mm |
| Eye Scissors | Geuder | G-19390 | 1x straight, 10.5 cm |
| Precision tweezers, straight with fine tips | Carl Roth GmbH | LH68.1 | 2x type 4 |
| Precision tweezers, straight with extra fine tips | Carl Roth GmbH | LH53.1 | 2x type 5 |
| Vannas capsulotomy scissors | Geuder | 19760 | 1x straight, 77 mm |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91501-09 | 1x curved, |
| Barraquer Needle Holder | Geuder | G-17500 | 1x curved, 120 mm |
| Needle | Becton, Dickinson and Company | 305128 | 1x 30 G |
| Glass Capillaries (for producing micropipettes) | Drummond Scientific Company | 9-000-1211 | 1x (1.2 x 0.8 mm; outer/inner diameter) |
| Nylon Suture | Alcon | 198001 | 1x 10-0 |
| Nunclon cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 153066 | 1x 35 mm diameter |
| Nunclon cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 172931 | 1x 100 mm diameter |
| Discofix C | Braun | 16500C | 10 cm |
| Histoacryl adhesive | B. Braun Surgical, S.A. | 1050052 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Pericyclic pump (CYCLO II) | Carl Roth GmbH | EP76.1 | 1x |
| Vertical Pipette Puller Model 700C | David Kopf Instruments | 1x | |
| Microscope (Vanox-T AH-2) | Olympus | 1x | |
| Water immersion objective LUMPlanFL, 1.0 NA | Olympus | 1x | |
| Digital camera (TK-C1381) | JVC | 1x | |
| Perfusion chamber | self-made | 1x | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drugs and Solutions | |||
| Ethanol | Carl Roth GmbH | K928.4 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Carl Roth GmbH | 5239.1 | |
| Kalium chloride (KCl) | Carl Roth GmbH | 6781.1 | |
| Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth GmbH | 3904.2 | |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | Carl Roth GmbH | 261.2 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth GmbH | 9265.2 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Carl Roth GmbH | 0965.3 | |
| α-(D)-(+)- Glucose monohydrate | Carl Roth GmbH | 6780.1 | |
| 9,11-dideoxy-9α,11α-methanoepoxy prostaglandin F2α (U-46619) | Cayman Chemical | 16450 | |
| Acetylcholine chloride | Sigma-Aldrich | A6625-25G |
References
- Toda, N., Nakanishi-Toda, M. Nitric oxide: ocular blood flow, glaucoma, and diabetic retinopathy. Prog Retin Eye Res. 26 (3), 205-238 (2007).
- Schuster, A. K., Fischer, J. E., Vossmerbaeumer, C., Vossmerbaeumer, U. Optical coherence tomography-based retinal vessel analysis for the evaluation of hypertensive vasculopathy. Acta Ophthalmol. 93 (2), e148-e153 (2015).
- Cherecheanu, A. P., Garhofer, G., Schmidl, D., Werkmeister, R., Schmetterer, L. Ocular perfusion pressure and ocular blood flow in glaucoma. Curr Opin Pharmacol. 13 (1), 36-42 (2013).
- Faraci, F. M., Sigmund, C. D. Vascular biology in genetically altered mice : smaller vessels, bigger insight. Circ Res. 85 (12), 1214-1225 (1999).
- Kornfield, T. E., Newman, E. A. Measurement of Retinal Blood Flow Using Fluorescently Labeled Red Blood Cells. eNeuro. 2 (2), (2015).
- Guevara-Torres, A., Joseph, A., Schallek, J. B. Label free measurement of retinal blood cell flux, velocity, hematocrit and capillary width in the living mouse eye. Biomed Opt Express. 7 (10), 4229-4249 (2016).
- Schallek, J., Geng, Y., Nguyen, H., Williams, D. R. Morphology and topography of retinal pericytes in the living mouse retina using in vivo adaptive optics imaging and ex vivo characterization. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8237-8250 (2013).
- Gericke, A., et al. Identification of the muscarinic acetylcholine receptor subtype mediating cholinergic vasodilation in murine retinal arterioles. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (10), 7479-7484 (2011).
- Gericke, A., et al. Functional role of alpha1-adrenoceptor subtypes in murine ophthalmic arteries. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (7), 4795-4799 (2011).
- Bohmer, T., et al. The alpha(1)B -adrenoceptor subtype mediates adrenergic vasoconstriction in mouse retinal arterioles with damaged endothelium. Br J Pharmacol. 171 (16), 3858-3867 (2014).
