Summary
多くのビジョンを脅かす眼疾患は、網膜血管の機能不全に関連付けられます。したがって、網膜血管応答の測定は、根本的な病態生理学的メカニズムを調査することが重要です。この記事では、マウスの網膜細動脈の分離と血管作動性物質の血管径に及ぼす影響を評価するために準備のための詳しいプロトコルについて説明します。
Abstract
血管不全と通常の網膜血流の変化、様々 な視力を脅かす眼疾患、糖尿病網膜症、高血圧性網膜症と緑内障などの発症の主な要因です。したがって、網膜微小血管の準備、基本的な病態生理学的メカニズムを記述する生理学的および薬理学的研究とデザイン疾患の治療に極めて重要なツールです。眼科研究マウス モデルの普及にもかかわらず網膜血管反応性に関する研究がこの種の不足しています。この矛盾の主な理由はであるこれらの網膜血管のサイズが小さいため挑戦的な分離のプロシージャ 〜 ≤ 内腔の直径 30 μ m。前のヴィヴォ近く生理条件下でマウス網膜血管反応の研究をできる分離および準備の技術を設けてこれらの網膜微小血管の機能研究のための直接分離の問題を回避するために.現在実験準備は特にマウス網膜細動脈を参照、ただしこの方法容易にラットから微小血管を利用します。
Introduction
網膜の血流障害は、糖尿病網膜症、高血圧性網膜症、緑内障1,2,3などの様々 な眼疾患の病態に関与しています。したがって、網膜の血管反応性の測定を目的とした研究がこれらの疾患の病態を理解することが重要、新しい治療法を開発するために近づきます。
マウスのゲノムに遺伝子操作の可能性があるためマウス心血管系4研究の広く使用されている動物モデルとなっています。しかし、網膜血管 (≤ 30 μ m) のサイズが小さいためマウス網膜における血管反応性の測定は難しい。たとえば、生体内計測表面技術の光学解像度で限られている、まさに搭載時 ≤ 30 μ m 径未満の少量の血液で直径または血の流れの変化を検出することがのみできます。蛍光染料または適応光学スキャン ・光検眼鏡5,6を使用して共焦点顕微鏡など、追加の高度なデバイスまた、ローカルの識別を目的とした体内測定の解釈は網膜血管のメカニズムは、麻酔薬、によって混同することができますシグナリング全身血圧と球後血管の影響で変更します。
したがって前のヴィヴォ高光学解像度とマウスの網膜の血管の反応を測定する方法を開発しました。ここに記載した技術光顕微鏡を介して送信される網膜細動脈の描出が可能します。ラットにも使用することができます、この方法は、眼血管研究の技術をターゲット遺伝子の利点へのアクセスを提供します。
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Protocol
本研究の実験プロシージャによって、動物ケア委員会のラインラント = プファルツ州、ドイツが承認されました。動物の世話は、眼科における動物の使用のためのビジョンと眼科 (ARVO) ステートメントで研究・ ビジョン研究制度のガイドラインと協会に適合。動物は、動物実験のための EU 指令 2010年/63/EU によると扱われました。生後 3-4 ヶ月男性の c57bl/6 j マウス (のジャクソンの実験室、バー ハーバー、私、米国) は、実験に使われました。動物は、標準条件 (温度 23 ± 2 ° C、湿度範囲 55 ± 10%、12 時間の明暗サイクル) の下で収容された、標準的なマウスの食事と水広告自由にアクセスしていた。
1. マウス網膜の分離
- 準備テーブルに解剖器具を置き、すべての楽器がクイック準備を有効にするかどうかはチェックします。
- CO2吸入によるマウスを犠牲に。
- スチールはさみとマウスの首をはねる、頭蓋骨 sagitally をはさみの同じ組み合わせを使用して 2 つの半分に切る、皮膚と脳目はさみ (図 1) を使用して取り外します。
- 目はさみを使って軌道の骨だけを残して頭蓋骨骨を断ちます。
- 冷たい促進バッファーを含んでいる解剖皿に軌道を転送します。
- 氷上解剖皿を維持または 10 分ごとのバッファーを変更します。
- 目はさみを使用して軌道の骨を切り取って、タイプ 4 の精密ピンセットと学生 Vannas 春はさみ (図 2) を使用して眼窩組織とともに眼球を慎重に取り外します。
- タイプ 5 の精密ピンセットと眼動脈の主な枝を損傷しないように注意を取って、Vannas capsulotomy はさみを使用して外眼筋、結合組織、ハーダー腺を慎重に取り外します。
- 眼動脈眼窩枝は、最終的に 10-0 ナイロン縫合糸 (図 3) を使用して眼動脈の主な枝の近位端を縛る。
- 4 精密ピンセット 10 s を使用して入力の 70% のエタノールを含むペトリ皿に目グローブを転送します。目グローブ解剖皿に戻し、新鮮なクレブス ソリューションでバッファーを置き換えます。角膜が白っぽいエタノール曝露後表示されます。
- 30 ゲージ針周辺の角膜を穿刺そして Vannas capsulotomy はさみを使用して角膜を解剖します。優しく虹彩組織を切断、Vannas capsulotomy はさみ脈絡膜と網膜の間の 1 つの鋭い点を配置し、脈絡膜と強膜を切断します。(図 4) 視神経の周りいくつかの強膜の組織を残します。
2. 灌流チェンバで網膜の取付
注: 網膜細動脈実験用灌流チェンバは自家製です。透明な貯水池で、流出管 (図 5) で構成されています。シリコン チューブの一方の端は histoacryl 接着剤と三方活栓に接続されているもう一方の端の部屋の下に釘付けに。三方活栓に新鮮なクレブス バッファーを含む注射器を接続し、バッファーで管を埋めます。
- ニードル ホルダーとガラス ピペットを取るし、灌流チャンバーの下部に管の端にそれをプッシュします。100 μ m 径の先端を取得する 4 型ハサミ、ピペットの先端を破る。
- マイクロ ピペットの先端に焦点を当てるし、経由で注射器をチューブに接続されているフラッシュします。毛細血管が残骸によって妨げられていません注意してください。閉塞の場合に、削除し、フラッシュ チューブ別マイクロ ピペットを挿入します。
- 冷たいクレブス バッファーと灌流チャンバーし、ステレオ顕微鏡室を置きます。
- 灌流チェンバに透明なプラスチックのプラットフォームを配置します。このプラットフォームは、視神経と眼動脈の幅 1.8 mm のインデントを持って、直径 1.6 mm の 2 つの鋼線が配置されます。次に、プラットフォームに 4.0 mm 外径内径 2.8 mm のステンレス製リングを配置します。
- スプーンを使用して細心の注意で、視神経と眼動脈の接続されている網膜を解剖室から灌流チェンバに転送します。この手順は、潜在的なを防ぐために重要な組織のストレッチとして、実験に支障をきたすことがあります。
- 眼動脈の近位端の縫合部分を切断、マイクロ ピペットに 10-0 ナイロン縫合糸の前もって形成された 2 つのループを配置、ピペットと眼動脈を cannulate します。マイクロ ピペット (図 6) に動脈を結ぶ、罰金ポイント ピンセットを使用して透明なプラットフォーム上に網膜を配置します。
- 優しく 2 つの細かい点ピンセットで前方レンズ被膜を開いて涙、レンズを抜くし、刀を使用して全体のレンズの被膜を断ちます。
- その後、網膜の視神経にパルス プラナから半分の距離に 4 つの放射状切開を作るし、下部にそれを修正する網膜上にステンレス製のリングを配置します。網膜は、(図 7) 実験の準備が整いました。
3. 網膜細動脈の実験のための準備
- 光学顕微鏡の下で灌流チェンバを配置します。目的は 100 X 水浸対物レンズです。
- 2 つビデのために- とアウト-flow をペリ ポンプに接続し、商工会議所でクレブス バッファー 95% O2と酸素し、37 ° C で 5% CO2炭酸循環100 と 120 mL/min の流量を使用します。
- 貯留層シリコン ホースを介して三方活栓にピペットへ接続すると、シリコン チューブを接続します。それから、リザーバーは 50 mm Hg に対応する高さにクレブス バッファーがまだ三方活栓を開いていません。
- 顕微鏡、網膜面に焦点を当てるの目標に目を通します。血管や赤血球を検索します。血管が完全に折りたたまれていること、時々 だけいくつかの赤血球は表示可能です。
- 血管が見つかったら、それに焦点を当てるし、三方活栓を開きます。容器の直径がすぐに増やす必要があります、場合は、細動脈や小静脈の場合 centripetally、赤の血液細胞のいずれかを遠心に移動します。細動脈は直径同じ順序の静脈に比べて小さいです。
- よく見える壁と血管が見つかったら、次の 30 分 (図 8) の平衡期間の実験のためにも流用できます。平衡期間中に細動脈の弱い本質的な緊張の結果内腔の直径の減少の 10% 未満で開発します。
4. 実験を実行します。
- お風呂のソリューションに追加することによって、トロンボキサン擬態 9,11-dideoxy-9α 11α methanoepoxy プロスタグランジン F2α (U46619) と船の生存率をテストします。このエージェントは、≥ 10 の濃度で直径を休んでから約 50% によってマウス網膜細動脈を収縮-6 M。
- 一度船を実行可能な確認は、ポンプを循環させることにより風呂からアゴニストを洗浄し、お風呂に新鮮なクレブス バッファーを供給します。
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Representative Results
U-46619 は、c57bl/6 j 背景の野生型マウスから網膜細動脈の濃度依存性血管収縮反応を生産しました。10-6 M の濃度で内腔の直径の減少安静時直径から ≈50% であった。図 9 aは、1 つの網膜細動脈の代表的な濃度応答曲線を示します。細動脈 U46619 と preconstricted、累積アセチルコリン投与誘発濃度依存性内腔の直径上昇 ≈ 25 %10-5 M、そのまま血管内皮細胞 (の説法で preconstricted の直径から図 9 b)。
図 1: マウス頭蓋骨の解剖します。首のないマウスの頭の皮膚は目と眼窩を公開する削除されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 目のグローブと軌道の組織の分離します。眼窩の骨目はさみと球後組織とともに眼球切られ、視神経が慎重に分離されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 眼球と眼動脈の準備。周囲の軌道の組織は微細刀で解剖され、眼動脈の慎重に公開、彼らの小さな枝が 10-0 ナイロン モノフィラメント縫合糸で結紮します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 眼の構造の郭清。網膜を視覚化するには、強膜、ブドウは Vannas capsulotomy ハサミで切除しました。視神経乳頭周囲のいくつかの強膜組織は、眼動脈の損傷を避けるために残っていた。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: リアルタイム ビデオ顕微鏡用オルガン室。商工会議所に使った。- とアウト-flow チューブ直径 100 mm のペトリ皿それ成っていた。チューブは、histoacryl 接着剤で接着されました。外部から酸素と炭酸の促進バッファーは、これらのチューブを介して蠕動ポンプによって循環されました。シリコン チューブの一方の端、商工会議所、三方活栓に接続されているもう一方の端の下に釘付けになった。管の端に眼動脈カニュレーションの役立ったガラス マイクロ ピペット 100 μ m の先端では挿入されました。シリコン チューブを介して眼循環が 50 mm hg に対応するレベルにクレブス バッファーとシリコン チューブを充填で加圧したこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: 眼動脈カニュレーション。眼動脈だったガラス ピペットで cannulated、10-0 ナイロン縫合糸で縫合します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7: 眼動脈カニュレーション。透明なプラットフォーム上に網膜を配置した後被膜のバッグとレンズが削除された、4 つの放射状切開、網膜に作られた、リング内径 2.8 mm、外径 4.0 mm のステンレス鋼は、b にそれを修正する網膜上に置かれました。ottom。網膜して実験の準備ができていた。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 8: 網膜血管の可視化します。赤血球内で模範的な網膜細動脈。
図 9: ビデオ顕微鏡を用いた機能解析します。単一の網膜細動脈から代表的な濃度反応曲線。(血管収縮薬、U46619 A) 濃度反応曲線 (10-9 10-6 M に)、および (B) の内皮依存性血管拡張、アセチルコリン (10-8 10-5 M から)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
マウス網膜における血管反応の測定は、網膜血管のサイズが小さいため困難です。紹介したテクニックを持つ網膜細動脈は透過光顕微鏡による可視化します。これは、孤立した網膜は半透明なので可能です。テクニックの利点は、高光学解像度です。計算された空間分解能は 11 px/μ m です。ただし、白色光を使用する光学系の実際の解像度は 200 と 300 nm、アッベの回折限界で説明されている間です。マウス網膜細動脈の最初の枝は 20 に 30 μ m の内部の直径は、約 1% の直径変化はこのシステムで検出。その他の技術的な装置または他の研究報告として蛍光染料の小さな網膜細動脈5,6,7を視覚化する必要はありません。技術の欠点は、訓練を受けた捜査によって 90 〜 120 分間は長い準備の時間です。準備時間は、180 分を超えた場合、血管内皮機能が減衰を開始します。
この手法ではいくつかの主要な重要なステップがあります。まず、徹底的にすべての球動脈枝を結紮することが重要です。結紮術が完了したら場合、網膜細動脈は漏出による加圧しません。第二に、10 のためのエタノールに浸漬目グローブを開く前に s は眼動脈の平滑筋の反応性を非アクティブ化することが重要です。以前示した 10 その浸漬我々 70% エタノールで s は完全に眼動脈平滑筋8を非アクティブ化します。対照的に、網膜細動脈は、眼球の壁によって保護されているので、直接エタノールによって影響を受ける可能性は。この手順を省略すると、眼動脈の直径変化網膜の血流に影響を与える可能性があります。注記のうち、眼動脈の反応性著しく同じアゴニスト9,10に応えて網膜細動脈のそれと異なる場合があります。第三に、眼動脈のねじれを避けます。プラットフォームに網膜の準備を搭載している間特に眼動脈がツイストになる、内腔の閉塞の結果します。また、ガラス管の先端が網膜細動脈の加圧を有効にオクルードされていないチェック慎重に。3 倍以上の濃度-反応曲線を繰り返し応答アセチルコリンになった弱いを見ましたので同じ網膜準備のために 3 つ以上の連続した濃度応答曲線を実行しないようにお勧めします。ただし、エージェントによって濃度応答曲線の再現性に関する違いは適用し、したがって、個別にテストする必要がありますがあるかもしれません。
腔内灌流サーボ制御ポンプを使用しても可能ですが、私たちの研究の薬理学的エージェント イレウスを適用しました。遺伝子組換え動物を用いた遺伝子ターゲティング技術の利点をこの方法でアクセスできるローカル メカニズム実験小動物のマウスやラットなどの網膜の血管の反応性のために測定する手法なので、.
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Disclosures
著者は競合する金融興味を持ってないです。
Acknowledgments
この作品は、エルンスト ・ ウント ベルタ Grimmke 財団とドイツの Ophthalmologische 協会 (犬) からの助成金によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Steel Scissors | Carl Roth GmbH | 3576.1 | 1x 140 mm |
| Eye Scissors | Geuder | G-19390 | 1x straight, 10.5 cm |
| Precision tweezers, straight with fine tips | Carl Roth GmbH | LH68.1 | 2x type 4 |
| Precision tweezers, straight with extra fine tips | Carl Roth GmbH | LH53.1 | 2x type 5 |
| Vannas capsulotomy scissors | Geuder | 19760 | 1x straight, 77 mm |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91501-09 | 1x curved, |
| Barraquer Needle Holder | Geuder | G-17500 | 1x curved, 120 mm |
| Needle | Becton, Dickinson and Company | 305128 | 1x 30 G |
| Glass Capillaries (for producing micropipettes) | Drummond Scientific Company | 9-000-1211 | 1x (1.2 x 0.8 mm; outer/inner diameter) |
| Nylon Suture | Alcon | 198001 | 1x 10-0 |
| Nunclon cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 153066 | 1x 35 mm diameter |
| Nunclon cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 172931 | 1x 100 mm diameter |
| Discofix C | Braun | 16500C | 10 cm |
| Histoacryl adhesive | B. Braun Surgical, S.A. | 1050052 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Pericyclic pump (CYCLO II) | Carl Roth GmbH | EP76.1 | 1x |
| Vertical Pipette Puller Model 700C | David Kopf Instruments | 1x | |
| Microscope (Vanox-T AH-2) | Olympus | 1x | |
| Water immersion objective LUMPlanFL, 1.0 NA | Olympus | 1x | |
| Digital camera (TK-C1381) | JVC | 1x | |
| Perfusion chamber | self-made | 1x | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drugs and Solutions | |||
| Ethanol | Carl Roth GmbH | K928.4 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Carl Roth GmbH | 5239.1 | |
| Kalium chloride (KCl) | Carl Roth GmbH | 6781.1 | |
| Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth GmbH | 3904.2 | |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | Carl Roth GmbH | 261.2 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth GmbH | 9265.2 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Carl Roth GmbH | 0965.3 | |
| α-(D)-(+)- Glucose monohydrate | Carl Roth GmbH | 6780.1 | |
| 9,11-dideoxy-9α,11α-methanoepoxy prostaglandin F2α (U-46619) | Cayman Chemical | 16450 | |
| Acetylcholine chloride | Sigma-Aldrich | A6625-25G |
References
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