Summary
Molte malattie oculare visione-minacciose sono associata con disfunzionali microvasi retinici. Pertanto, la misura delle risposte arteriola retinica è importante approfondire i meccanismi fisiopatologici sottostanti. Questo articolo descrive un protocollo dettagliato per mouse arteriola retinica isolamento e la preparazione per valutare gli effetti di sostanze vasoattive il diametro vascolare.
Abstract
Insufficienza vascolare e alterazioni nel normale perfusione retinica sono tra i fattori più importanti per la patogenesi di varie malattie oculari avvistare-minaccioso, quali retinopatia diabetica, retinopatia ipertensiva ed eventualmente il glaucoma. Di conseguenza, retiniche microvascolari preparazioni sono strumenti cardine per studi fisiologici e farmacologici delineare i meccanismi fisiopatologici sottostanti e di progettazione terapie per le malattie. Nonostante l'ampio uso di modelli murini in Ricerca oftalmica, gli studi sulla reattività vascolare retinica sono scarsi in questa specie. Delle ragioni principali per questa discrepanza è le procedure di isolamento impegnativo a causa le piccole dimensioni di questi vasi sanguigni della retina, che è ~ ≤ 30 µm di diametro luminal. Per aggirare il problema di isolamento diretto di questi microvasi retinici per studi funzionali, abbiamo stabilito una tecnica di isolamento e la preparazione che permette studi ex vivo di vasoattività retinica del mouse in condizioni di quasi-fisiologiche . Anche se i preparati sperimentali presenti in particolare farà riferimento alle arteriole retiniche del mouse, questa metodologia prontamente può essere impiegata per microvasi dai ratti.
Introduction
Disturbi della perfusione retinica sono stati implicati nella patogenesi di varie malattie oculari, quali la retinopatia diabetica, retinopatia ipertensiva e glaucoma1,2,3. Così, gli studi volti a misurare la reattività vascolare della retina sono importanti per comprendere la fisiopatologia di queste malattie e per sviluppare il nuovo trattamento si avvicina.
Grazie alla possibilità di manipolazione del gene nel genoma murino, il mouse è diventato un modello animale ampiamente usato per gli studi del sistema cardiovascolare4. Tuttavia, a causa delle piccole dimensioni dei vasi sanguigni retinici (≤ 30 µm), misura della reattività vascolare nella retina di topo è complessa. Ad esempio, stereomicroscopia tecniche per la misurazione in vivo sono limitati nella loro risoluzione ottica e quindi solo consentono di rilevare esattamente i cambiamenti nel flusso di diametro o di sangue nel sangue piccolo inferiore a ≤ 30 µm di diametro quando equipaggiato con sofisticati dispositivi aggiuntivi, come un microscopio confocale utilizzando coloranti fluorescenti o l'ottica adattiva che scansione oftalmoscopio luce5,6. Inoltre, l'interpretazione di in vivo misure volte ad individuare locali segnalazione meccanismi in vasi sanguigni retinici possono essere confuse di anestetici, cambiamenti nella pressione arteriosa sistemica e l'influenza dei vasi sanguigni retrobulbar.
Di conseguenza, abbiamo sviluppato un metodo per misurare le risposte dei vasi sanguigni retinici del mouse con alta risoluzione ottica ex vivo. La tecnica qui presentata permette la visualizzazione delle arteriole retiniche tramite trasmissione microscopia chiara. Questo metodo, che può essere utilizzato anche in ratti, fornisce l'accesso ai vantaggi del gene targeting tecnologia nella ricerca vascolare oculare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Le procedure sperimentali di questo studio sono state approvate da animale cura Comitato della Renania-Palatinato, Germania. Cura degli animali e conforme alle linee guida istituzionali e l'associazione ricerca in visione e Oftalmologia (ARVO) istruzione per l'uso di animali in oftalmica o visione. Gli animali sono stati trattati secondo la direttiva europea 2010/63/UE per gli esperimenti sugli animali. Per gli esperimenti sono stati utilizzati topi C57BL/6J maschii (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, Stati Uniti d'America) di età compresa tra 3-4 mesi. Gli animali sono stati alloggiati in condizioni standard (temperatura 23 ± 2 ° C, umidità gamma 55 ± 10% e 12 h cicli di luce/buio) e ha avuto accesso al mouse standard chow e acqua ad libitum.
1. isolamento di Retina di topo
- Collocare gli strumenti di dissezione sul piano di preparazione e verifica se tutti gli strumenti sono completi per consentire una rapida preparazione.
- Sacrificare il mouse da inalazione di CO2 .
- Decapitare il mouse con le forbici in acciaio, tagliate il sagitally del cranio in due metà usando lo stesso paio di forbici e rimuovere la pelle e il cervello con le forbici dell'occhio (Figura 1).
- Tagliare l'osso del cranio di lasciare solo l'osso orbitale utilizzando forbici occhio.
- Trasferire l'orbita in un piatto di dissezione contenente tampone Krebs-Henseleit ghiacciata.
- Mantenere il piatto di dissezione su ghiaccio o modificare il buffer ogni 10 min.
- Tagliare l'osso orbitale usando le forbici occhio e rimuovere delicatamente il globo oculare insieme il tessuto orbitale usando tipo 4 precisione pinzette e forbici di primavera studente Allerød (Figura 2).
- Rimuovere delicatamente la ghiandola di Harder, tessuto connettivo e muscoli extraocular utilizzando pinzette di precisione 5 tipo e Allerød capsulotomy forbici, facendo attenzione a non per danneggiare il ramo principale dell'arteria oftalmica.
- Lega i orbitale rami dell'arteria oftalmica e, infine, l'estremità prossimale del ramo principale dell'arteria oftalmica usando i suturare di Nylon 10-0 (Figura 3).
- Trasferire il globo oculare in una capsula di Petri contenente etanolo al 70% per 10 s con tipo 4 pinzette di precisione. Inserire nuovamente il globo oculare il piatto di dissezione e sostituire il buffer con soluzione di Krebs fresca. La cornea appare biancastra dopo esposizione all'etanolo.
- La cornea periferica di puntura con un ago da 30 gauge e sezionare la cornea utilizzando forbici capsulotomy Allerød. Delicatamente tagliare il tessuto dell'iride, posizionare un punto tagliente delle forbici capsulotomy Allerød tra la coroide e della retina e tagliare la coroide e sclera. Lasciare qualche tessuto sclerale intorno al nervo ottico (Figura 4).
2. montaggio della Retina nella camera di perfusione
Nota: La camera di aspersione utilizzata per esperimenti di arteriola retinica è fatta in casa. Si compone di un serbatoio trasparente con un tubo di ingresso e di uscita (Figura 5). Un'estremità di un tubo di silicone è incollata alla parte inferiore dell'alloggiamento con histoacryl adesivo e l'altra estremità collegata ad un rubinetto a tre vie. Collegare una siringa contenente tampone di Krebs fresca al rubinetto a tre vie e riempire il tubo con il tampone.
- Prendere una micropipetta di vetro con un porta-aghi e spingere l'estremità del tubo nella parte inferiore della camera di aspersione. Poi rompere la punta della micropipetta con forbici tipo 4 per ottenere una punta di 100 µm di diametro.
- Concentrarsi sulla punta della micropipetta e buttare via la siringa collegata al tubo. Fare attenzione che il capillare non è occluso da detriti. In caso di occlusione, rimuoverlo, svuotare il tubo e inserire un'altra micropipetta.
- Riempire la camera di aspersione con tampone Krebs refrigerato e mettere la vaschetta sotto un microscopio stereo.
- Posto una piattaforma di plastica trasparente nella camera di aspersione. Questa piattaforma ha un rientro di 1,8 mm di larghezza per il nervo ottico e l'arteria oftalmica e posti su due fili di acciaio di diametro 1,6 mm. Quindi, inserire un anello di acciaio di diametro interno 2,8 mm e 4,0 mm di diametro esterno sulla piattaforma.
- Trasferire la retina con il nervo ottico e dell'arteria oftalmica allegata dalla camera di dissezione nella camera di aspersione con estrema cura, utilizzando un cucchiaio. Questo passaggio è importante per prevenire potenziali stiramento dei tessuti in quanto può essere dannoso per l'esperimento.
- Tagliare la parte suturata dell'estremità prossimale dell'arteria oftalmica, posizionare due anelli preformati di sutura in nylon 10-0 sulla micropipetta e incannulare l'arteria oftalmica con la micropipetta. Legare l'arteria per la micropipetta (Figura 6) e posizionare la retina sulla piattaforma trasparente con belle-punto-pinzette.
- Delicatamente strappare aperto il capsula lenticolare anteriore con due pinzette a punta fine, tirare fuori la lente e tagliare il capsula intera lente utilizzando microforbici.
- Successivamente, fare quattro incisioni radiali nella retina metà della distanza dalla pars plana al nervo ottico e posizionare un anello di acciaio sulla retina per risolvere il problema di fondo. La retina è ora pronta per l'esperimento (Figura 7).
3. preparazione delle arteriole retiniche per l'esperimento
- Posizionare la camera di aspersione sotto un microscopio chiaro. L'obiettivo è una lente di obiettivo di immersione in acqua X 100.
- Collegare i due tubi per in - e out - flow a una pompa periciclica e circolare della camera con tampone Krebs ossigenata con 95% O2 e gassata con 5% CO2 a 37 ° C. Utilizzare una velocità di flusso tra 100 e 120 mL/min.
- Collegare il tubo di silicone, che è collegato alla micropipetta, di un serbatoio in silicone tubo tramite un rubinetto a tre vie. Poi, riempire il serbatoio con buffer di Krebs per un'altezza corrispondente a 50 mm Hg, ma non ancora aprire il rubinetto a tre vie.
- Guardare attraverso gli obiettivi del microscopio e concentrarsi sulla superficie della retina. Ricerca di vasi sanguigni o globuli rossi. È possibile che i vasi sanguigni sono completamente crollati, a volte solo che alcuni globuli rossi sono visibili.
- Quando viene trovato un vaso sanguigno, concentrarsi su di esso e aprire il rubinetto a tre vie. Il diametro del vaso dovrebbe aumentare immediatamente e i globuli rossi si sposteranno mediante centrifugazione, se si tratta di un'arteriola, o centripeto in caso di una venula. Le arteriole sono più piccole di diametro rispetto alle venule dello stesso ordine.
- Una volta trovato un vaso sanguigno con una parete ben visibile, può essere impiegato per esperimenti dopo un periodo di equilibrazione di 30 min (Figura 8). Durante il periodo di equilibrazione, le arteriole sviluppano solo debole tono intrinseco con conseguente meno il 10% di riduzione di diametro luminal.
4. esecuzione dell'esperimento
- Testare la redditività delle navi con il trombossano mimetico 9,11-dideoxy-9α, 11α-methanoepoxy della prostaglandina F2α (U46619) aggiungendo la soluzione del bagno. Questo agente constricts arteriole retiniche del mouse circa il 50% dal diametro di riposo alle concentrazioni di ≥ 10-6 M.
- Una volta che la nave è confermata praticabile, lavare l'agonista dal bagno, la pompa di circolazione e fornire fresco Krebs buffer nel bagno.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
U-46619 prodotto risposte vasocostrittori di concentrazione-dipendente in arteriole retiniche da topi wild-type dello sfondo C57Bl/6J. Ad una concentrazione di 10-6 M, riduzione del diametro luminal era ≈50% dal diametro di riposo. Figura 9A Mostra una curva di concentrazione-risposta rappresentativo di un'arteriola retinica. In arteriole preconstricted con U46619, amministrazione cumulativo di acetilcolina evocato aumenti di concentrazione-dipendente di diametro luminal ≈ 25% da a 10-5 M, indicativo di un endotelio vascolare intatto (il diametro di preconstricted Figura 9B).
Figura 1: dissezione del cranio mouse. Pelle sulla testa decapitata del mouse viene rimosso per esporre gli occhi e la cavità orbitale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: isolamento del tessuto orbitale e globo dell'occhio. L'osso orbitale è stato tagliato con le forbici dell'occhio ed il globo oculare insieme i tessuti retrobulbar e del nervo ottico sono stati accuratamente isolati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: il globo oculare e la preparazione dell'arteria oftalmica. Una volta che i tessuti circostanti orbitali sono stati sezionati con microforbici bene, l'arteria oftalmica è stata accuratamente esposti e loro piccoli rami legati con le suture monofilamento di nylon 10-0. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: dissezione delle strutture oculari. Per visualizzare la retina, la sclera e la coroide sono stati sezionati con le forbici di capsulotomia Allerød. Alcuni tessuto sclerale intorno al nervo ottico è stato lasciato per evitare danni dell'arteria oftalmica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: camera di organo per Real-Time video microscopia. La camera era fatto in casa. Ha consistito di una capsula di Petri del diametro di 100 mm con un tubo in e out flow. I tubi sono stati incollati con adesivo di histoacryl. Buffer di Krebs-Henseleit esternamente ossigenato e gassate è stato distribuito da una pompa peristaltica tramite questi tubi. Un'estremità di un tubo di silicone è stata incollata sul fondo della camera di scoppio e l'altra estremità collegata ad un rubinetto a tre vie. All'estremità del tubo, è stata inserita una micropipetta di vetro con una punta di 100 µm, che hanno servito per l'incannulamento dell'arteria oftalmica. Tramite il tubo di silicone, la circolazione oftalmica è stata pressurizzata da un tubo in silicone di riempimento con buffer di Krebs a un livello corrispondente a 50 mm Hg. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: inserimento di una canula dell'arteria oftalmica. Arteria oftalmica era cannulato con micropipetta di vetro e suturato con una sutura in nylon 10-0. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: inserimento di una canula dell'arteria oftalmica. Dopo aver posizionato la retina sulla piattaforma trasparente, la lente con il sacchetto capsulare è stato rimosso, quattro incisioni radiali sono state fatte nella retina e un acciaio inossidabile dell'anello di 2,8 mm di diametro interno e diametro esterno mm 4,0 è stato disposto sulla retina per fissarlo al b Ottom. La retina era quindi pronta per l'esperimento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: visualizzazione dei vasi sanguigni retinici. Un'esemplare arteriola retinica con globuli rossi all'interno.
Figura 9: studi funzionali mediante videomicroscopia. Curve di risposta di concentrazione rappresentativo da un singolo arteriola retinica. (A) curva di concentrazione-risposta per il vasocostrittore, U46619 (10-9 al 10-6 M) e (B) per il vasodilatatore dipendente dall'endotelio, acetilcolina (10-8 a 10-5 M). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La misurazione delle risposte vascolari nella retina di topo è impegnativo a causa delle piccole dimensioni dei vasi sanguigni retinici. Con la tecnica presentata, arteriole retiniche sono visualizzate da microscopia chiara trasmessa. Questo è possibile, perché la retina isolata è traslucida. Il vantaggio della tecnica è l'alta risoluzione ottica. La risoluzione spaziale calcolata è 11 px/µm. Tuttavia, la risoluzione reale per questo sistema ottico che utilizza la luce bianca è fra 200 e 300 nm, che si spiega con il limite di diffrazione di Abbe. Poiché il primo ramo delle arteriole retiniche del mouse ha un diametro interno di 20-30 µm, cambiamenti di diametro di circa l'1% sono rilevabili con questo sistema. Non c'è nessuna necessità di ulteriori dispositivi tecnici o tinture fluorescenti come riportato in altri studi di visualizzare piccole arteriole retiniche5,6,7. Uno svantaggio della tecnica è il tempo di lunga preparazione, che è compresa tra 90-120 min dagli investigatori addestrati. Se il tempo di preparazione supera 180 min, la funzione endoteliale inizia a essere attenuato.
Ci sono diversi passaggi critici principali in questa tecnica. In primo luogo, è importante legare accuratamente tutti i rami arteriosi retrobulbar. Se la legatura è incompleta, arteriole retiniche non verranno pressurizzati a causa di perdite. In secondo luogo, l'immersione in etanolo per 10 s prima di aprire il globo oculare è importante disattivare la reattività del muscolo liscio dell'arteria oftalmica. Abbiamo precedentemente dimostrato che immergendo per 10 s in etanolo al 70% disattiva completamente la muscolatura liscia dell'arteria oftalmica8. Al contrario, arteriole retiniche rischiano di essere direttamente colpiti da etanolo, poiché sono protetti da parete bulbare. Se viene omesso questo passaggio, cambiamenti di diametro nell'arteria oftalmica possono influenzare la perfusione della retina. Della nota, la reattività dell'arteria oftalmica contrassegnato potrebbe differire da quello delle arteriole retiniche in risposta alla stessa agonista9,10. In terzo luogo, evitare la torsione dell'arteria oftalmica. Soprattutto durante la preparazione della retina sulla piattaforma di montaggio, l'arteria oftalmica può diventare contorta, con conseguente occlusione del lume. Inoltre, controllare con attenzione che la punta del capillare di vetro non è occlusa per abilitare la pressurizzazione delle arteriole retiniche. Suggeriamo per non eseguire più di tre curve di concentrazione-risposta consecutivi nella stessa preparazione retinica, perché abbiamo osservato che le risposte alla acetilcolina è diventato più debole quando si ripete le curve concentrazione-risposta per più di tre volte. Tuttavia, ci possono essere differenze per quanto riguarda la ripetibilità delle curve concentrazione-risposta a seconda dell'agente applicato e, quindi, devono essere testate individualmente.
Abbiamo applicato extraluminally agenti farmacologici nei nostri studi, anche perfusione intraluminal utilizzando una pompa di controllo servo è possibile. Poiché la tecnica permette di misurare per meccanismi locali della reattività vascolare della retina di piccoli animali da laboratorio tra cui topi e ratti, i vantaggi della tecnologia di gene-targeting utilizzando animali geneticamente modificati è possibile accedere con questo metodo. .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nessun concorrenti interessi finanziari.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dall'Ernst und Berta Grimmke Stiftung e il Deutsche del Ophthalmologische Gesellschaft (cane).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Steel Scissors | Carl Roth GmbH | 3576.1 | 1x 140 mm |
| Eye Scissors | Geuder | G-19390 | 1x straight, 10.5 cm |
| Precision tweezers, straight with fine tips | Carl Roth GmbH | LH68.1 | 2x type 4 |
| Precision tweezers, straight with extra fine tips | Carl Roth GmbH | LH53.1 | 2x type 5 |
| Vannas capsulotomy scissors | Geuder | 19760 | 1x straight, 77 mm |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91501-09 | 1x curved, |
| Barraquer Needle Holder | Geuder | G-17500 | 1x curved, 120 mm |
| Needle | Becton, Dickinson and Company | 305128 | 1x 30 G |
| Glass Capillaries (for producing micropipettes) | Drummond Scientific Company | 9-000-1211 | 1x (1.2 x 0.8 mm; outer/inner diameter) |
| Nylon Suture | Alcon | 198001 | 1x 10-0 |
| Nunclon cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 153066 | 1x 35 mm diameter |
| Nunclon cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 172931 | 1x 100 mm diameter |
| Discofix C | Braun | 16500C | 10 cm |
| Histoacryl adhesive | B. Braun Surgical, S.A. | 1050052 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Pericyclic pump (CYCLO II) | Carl Roth GmbH | EP76.1 | 1x |
| Vertical Pipette Puller Model 700C | David Kopf Instruments | 1x | |
| Microscope (Vanox-T AH-2) | Olympus | 1x | |
| Water immersion objective LUMPlanFL, 1.0 NA | Olympus | 1x | |
| Digital camera (TK-C1381) | JVC | 1x | |
| Perfusion chamber | self-made | 1x | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drugs and Solutions | |||
| Ethanol | Carl Roth GmbH | K928.4 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Carl Roth GmbH | 5239.1 | |
| Kalium chloride (KCl) | Carl Roth GmbH | 6781.1 | |
| Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth GmbH | 3904.2 | |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | Carl Roth GmbH | 261.2 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth GmbH | 9265.2 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Carl Roth GmbH | 0965.3 | |
| α-(D)-(+)- Glucose monohydrate | Carl Roth GmbH | 6780.1 | |
| 9,11-dideoxy-9α,11α-methanoepoxy prostaglandin F2α (U-46619) | Cayman Chemical | 16450 | |
| Acetylcholine chloride | Sigma-Aldrich | A6625-25G |
References
- Toda, N., Nakanishi-Toda, M. Nitric oxide: ocular blood flow, glaucoma, and diabetic retinopathy. Prog Retin Eye Res. 26 (3), 205-238 (2007).
- Schuster, A. K., Fischer, J. E., Vossmerbaeumer, C., Vossmerbaeumer, U. Optical coherence tomography-based retinal vessel analysis for the evaluation of hypertensive vasculopathy. Acta Ophthalmol. 93 (2), e148-e153 (2015).
- Cherecheanu, A. P., Garhofer, G., Schmidl, D., Werkmeister, R., Schmetterer, L. Ocular perfusion pressure and ocular blood flow in glaucoma. Curr Opin Pharmacol. 13 (1), 36-42 (2013).
- Faraci, F. M., Sigmund, C. D. Vascular biology in genetically altered mice : smaller vessels, bigger insight. Circ Res. 85 (12), 1214-1225 (1999).
- Kornfield, T. E., Newman, E. A. Measurement of Retinal Blood Flow Using Fluorescently Labeled Red Blood Cells. eNeuro. 2 (2), (2015).
- Guevara-Torres, A., Joseph, A., Schallek, J. B. Label free measurement of retinal blood cell flux, velocity, hematocrit and capillary width in the living mouse eye. Biomed Opt Express. 7 (10), 4229-4249 (2016).
- Schallek, J., Geng, Y., Nguyen, H., Williams, D. R. Morphology and topography of retinal pericytes in the living mouse retina using in vivo adaptive optics imaging and ex vivo characterization. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8237-8250 (2013).
- Gericke, A., et al. Identification of the muscarinic acetylcholine receptor subtype mediating cholinergic vasodilation in murine retinal arterioles. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (10), 7479-7484 (2011).
- Gericke, A., et al. Functional role of alpha1-adrenoceptor subtypes in murine ophthalmic arteries. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (7), 4795-4799 (2011).
- Bohmer, T., et al. The alpha(1)B -adrenoceptor subtype mediates adrenergic vasoconstriction in mouse retinal arterioles with damaged endothelium. Br J Pharmacol. 171 (16), 3858-3867 (2014).
