Summary
Многие видение угрожая глазные заболевания связаны с неблагополучной сетчатки микрососудов. Таким образом измерение артериолы сетчатки ответов имеет важное значение для расследования основные патофизиологические механизмы. Эта статья описывает подробный протокол для мыши артериолы сетчатки изоляции и подготовке для оценки воздействия вазоактивных веществ на сосудистой диаметра.
Abstract
Сосудистая недостаточность и изменения в нормального кровоснабжения сетчатки являются одним из основных факторов патогенеза различных зрение угрожая глазных заболеваний, таких как диабетическая ретинопатия, гипертоническая ретинопатия и, возможно, глаукома. Таким образом сетчатки микрососудистой препараты являются ключевой инструменты для физиологических и фармакологических исследований очертить основные патофизиологические механизмы и дизайн терапии для лечения заболеваний. Несмотря на широкое использование мыши модели в офтальмологических исследований исследования сетчатки сосудистой реактивности не хватает в этой породы. Основной причиной этого несоответствия является сложной процедуры изоляции вследствие небольшого размера этих сетчатки кровеносных сосудов, которая является ~ ≤ 30 мкм в диаметре Люминал. Чтобы обойти эту проблему прямого изоляции этих сетчатки микрососудов для функциональных исследований, мы создали изоляции и подготовка техника, позволяющая ex vivo исследования сетчатки вазоактивных мыши вблизи физиологических условиях . Хотя настоящий экспериментальных препаратов будет специально ссылаются на артериолы сетчатки мыши, эта методология легко могут быть использованы микрососудов от крыс.
Introduction
Беспорядки в сетчатки перфузии замешаны в патогенезе различных глазных заболеваний, таких как диабетическая ретинопатия, гипертонической ретинопатии и глаукома1,2,3. Таким образом исследования, направленные на измерение сосудистой реактивности в сетчатке важно понимать патофизиологию этих заболеваний и разрабатывать новые методы лечения подходов.
Благодаря возможности манипулирования генов в геноме мышиных мышь стала широко используемых животных модели для исследования сердечно-сосудистой системы4. Однако из-за малого размера сетчатки сосудов (≤ 30 мкм), измерение сосудистой реактивности в сетчатке мыши является сложной задачей. Например stereomicroscopic методы для измерения в vivo ограничены в их оптической резолюции и поэтому только позволяют точно определять изменения диаметра или крови поток в малой кровью диаметром ≤ 30 мкм при оснащении с менее Дополнительные сложных устройств, таких как конфокального микроскопа с помощью флуоресцентных красителей или Адаптивная оптика сканирование свет офтальмоскоп5,6. Кроме того толкование в естественных условиях измерений, направленных на выявление местных сигнальные механизмы в сетчатки сосудов может быть confounded с анестетиками, изменения системного артериального давления и влияния ретробульбарная кровеносных сосудов.
Поэтому мы разработали метод измерения реакции мыши сетчатки сосудов с высокой оптической резолюции ex vivo. Техника, представленная в настоящем документе позволяет визуализировать артериол сетчатки через передачи световой микроскопии. Этот метод, который может также использоваться в крыс, обеспечивает доступ к преимущества гена ориентации технологии в глазной сосудистых исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Экспериментальные методы исследования были утверждены на животное уход Комитет из Рейнланд-Пфальц, Германия. Уход за животными соответствует институциональных руководящих принципов и ассоциации исследований в видение и офтальмологии (Арво) инструкции для использования животных в офтальмологических и видение исследования. Животные были обработаны согласно директиве ЕС 2010/63/ЕС для экспериментов на животных. Самцов мышей C57BL/6J (Лаборатория Джексон, Бар Харбор, ME, США) в возрасте 3-4 месяцев были использованы для экспериментов. Животные были размещены в стандартных условиях (температура 23 ± 2 ° C, влажность диапазона 55 ± 10% и 12 h свет/темно циклов) и имел доступ к стандартной мыши вода и Чоу ad libitum.
1. изоляция мыши сетчатки
- Место рассечение инструменты для подготовки таблицы и проверьте, если все документы полная возможность быстрого приготовления.
- Пожертвуйте мыши CO2 ингаляции.
- Обезглавить мыши стальной ножницами, вырезать череп sagitally на две половинки, используя же пару ножниц и удалить кожу и мозг, используя ножницы глаз (рис. 1).
- Отрежьте кости черепа оставить только орбитальной кости с помощью ножниц глаз.
- Перенесите орбиты в блюдо рассечение, содержащие ледяной Кребса-Henseleit буфера.
- Держите рассечение блюдо на льду или изменить буфера каждые 10 мин.
- Вырезать орбитальной кости с помощью ножниц глаз и аккуратно удалить глаз глобус вместе с орбитальных тканей, используя пинцет тип 4 точности и беззаботными Студенческая весна ножницы (рис. 2).
- Аккуратно удалите Harderian железы, соединительной ткани и наружных мышц, используя пинцет тип 5 точность и беззаботными Капсулотомия ножницы, стараясь не повредить основные ветви глазной артерии.
- Перевязать Орбитальные ветви глазной артерии и в конечном итоге проксимальный конец основной ветви глазной артерии, с использованием 10-0 нейлон швы (рис. 3).
- Перевести глаза глобус в чашку Петри, содержащие этанол 70% за 10 s с помощью типа 4 пинцеты прецизионные. Место земного шара глаз обратно в блюдо диссекции и замените буфер свежий раствор Кребс. Роговицы появится беловатые после воздействия этанола.
- Прокол периферийных роговицы с 30 иглы и вскрыть роговицы с помощью беззаботными Капсулотомия ножницы. Аккуратно отрезать ткани радужки, место одним острием беззаботными Капсулотомия ножницами между сосудистой оболочки и сетчатки и отрезали хориоидеи и склеры. Оставьте несколько склеры ткани вокруг зрительного нерва (рис. 4).
2. Монтаж сетчатки в зале перфузии
Примечание: Перфузии камеры, используемые для экспериментов артериолы сетчатки, домашний. Он состоит из прозрачной водохранилища с в - и отток трубки (рис. 5). Один конец трубки силиконовые приклеивается к нижней части камеры с histoacryl клей и другой конец придает трехходовой кран. Подключите шприц, содержащий свежие Кребс буфер трехходовой кран и заполнить трубу с буфером.
- Взять стакан микропипеткой с иглодержатель и задвиньте его в конце трубки в нижней части камеры перфузии. Затем разделите кончик микропипеткой с ножницы типа 4 для получения наконечник диаметром 100 мкм.
- Фокус на кончике микропипеткой и смыть через шприц подключен к трубе. Позаботьтесь, что капилляр не закрыта от мусора. В случае окклюзии удалите его, промойте трубы и вставить другой микропипеткой.
- Заполните перфузии камеры с холодной Кребс буфера и поставить камеру под микроскопом стерео.
- Место прозрачной пластиковой платформы в камеру перфузии. Эта платформа имеет отступ шириной 1,8 мм для зрительного нерва и глазной артерии и помещается на два стальных проволок диаметром 1,6 мм. Затем поместите кольцо из нержавеющей стали внутренний диаметр 2,8 мм и наружным диаметром 4.0 мм на платформу.
- Передача сетчатки, зрительного нерва и прилагаемый глазной артерии от вскрытия камеры в камеру перфузии с крайней осторожностью, с помощью ложки. Этот шаг имеет важное значение для предотвращения возможности растяжения тканей, как это может быть пагубным для эксперимента.
- Отрезать зашивается частью проксимальный конец глазной артерии, место два преформированных петель 10-0 нейлон шва на микропипеткой и иглу глазной артерии с микропипеткой. Галстук артерии к микропипеткой (рис. 6) и место сетчатки на прозрачной платформу с помощью штраф точка пинцет.
- Аккуратно слезу открытой передней линзы отолярингология пинцетом две прекрасные точки, вытяните объектив и отрезали отолярингология весь объектива, с помощью microscissors.
- Впоследствии сделать четыре радиальные надрезы в сетчатке половину расстояния от Парс plana зрительного нерва и поместите кольцо из нержавеющей стали на сетчатку исправить его на дно. Сетчатка теперь готов для эксперимента (рис. 7).
3. Подготовка артериол сетчатки для эксперимента
- Место перфузии камеры под микроскопом света. Цель – 100 X объектив погружения в воду.
- Подключите два трубки для в - и вне - flow с pericyclic насосом и распространяет камеры с буфером Кребс кислородом с 95% O2 и с 5% CO2 при 37 ° C. Используйте скорость потока между 100 и 120 мл/мин.
- Соединить Трубки силиконовые, который подключен к микропипеткой, водохранилище Силиконовый шланг через трехходовой кран. Затем заполните резервуар с буфером Кребс на высоту, соответствующую 50 мм Hg, но не открыть кран трехходовой еще.
- Просмотрите задачи микроскопа и сосредоточиться на поверхности сетчатки. Поиск для кровеносных сосудов или красные кровяные клетки. Вполне возможно, что кровеносные сосуды являются полностью рухнула, иногда только некоторые красные кровяные клетки являются видимыми.
- Когда найден кровеносный сосуд, сосредоточиться на нем и открыть кран трехходовой. Следует незамедлительно увеличить диаметр сосуда и красные кровяные клетки двигаться либо центробежно, если это артериолы, или centripetally в случае венулы. Артериолы, меньше в диаметре, по сравнению с венулы того же порядка.
- Найдя кровеносный сосуд с хорошо видны стены, он может быть использован для экспериментов после уравновешивания периода 30 мин (рис. 8). В период уравновешивания артериолы развиваются только слабые встроенные тон, что приводит к менее чем 10% сокращения Люминал диаметр.
4. Выполнение эксперимента
- Проверьте жизнеспособность судов с тромбоксана подражательный 9,11-катализированные 9α, 11α-methanoepoxy простагландина Ф2α (U46619), добавив его в раствор для ванн. Этот агент сужает артериол сетчатки мышь примерно 50% от отдыха диаметр в концентрациях ≥ 10-6 М.
- После того, как судно подтверждается жизнеспособным, мыть агонист из бани, циркуляционный насос и поставлять свежие Кребс буфера в ванну.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
U-46619 производства зависит от концентрации вазоконстриктора ответы в артериолы сетчатки от дикого типа мышей C57Bl/6J фона. В концентрации 10-6 М снижение Люминал диаметр был ≈50% от диаметра, отдыха. Рис. 9A показывает кривой представитель концентрации ответ один артериолы сетчатки. В артериол, preconstricted с U46619 накопительное администрации ацетилхолина вызвала увеличение концентрации зависимых Люминал диаметром до 25% от preconstricted диаметром в 10-5 М, свидетельствует о неизменной эндотелия ( Рисунок 9B).
Рисунок 1: вскрытие черепа мыши. Кожа на голове обезглавленное мыши удаляется раскрыть глаза и орбитальной полости. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: изоляция глобус и орбитальных тканей глаза. Орбитальной кости было резать с ножницами глаз и глаз глобус вместе с ретробульбарная тканей и зрительного нерва были тщательно изолированы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: глаз глобус и подготовка глазной артерии. После того, как окружающие орбитальных тканей были расчленены с тонкой microscissors, глазной артерии тщательно был разоблачен и их веточек лигируют с 10-0 нейлон Мононить швами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: рассечение глазной структур. Чтобы визуализировать сетчатки, склера и сосудистая оболочка глаза были расчленены беззаботными Капсулотомия ножницами. Некоторые склеры ткани вокруг зрительного нерва остался во избежание повреждения глазной артерии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: орган палаты для реального времени видео микроскопии. Палата была домашняя. Она состояла из Петри диаметром 100 мм с в и вне flow трубки. Трубы были склеены клеем histoacryl. Перистальтический насос через эти трубы был распространен внешне кислородом и газированные Кребса-Henseleit буфер. Один конец трубки силиконовые был приклеен к нижней палаты и другой конец придает трехходовой кран. В конце трубки было вставлено стекло микропипеткой с наконечником, 100 мкм, который служил для катетеризации глазной артерии. Через силиконовые трубки, офтальмологический тираж был под давлением, заполнив силиконовые трубки с Кребс буфера до уровня, соответствующего 50 мм Hg. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: катетеризации глазной артерии. Глазной артерии канюлированной с микропипеткой стекла и зашивается с швом нейлона 10-0. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7: катетеризации глазной артерии. После размещения сетчатки на платформу прозрачной, объектив с капсульного мешка был удален, четыре Радиальные разрезы были сделаны в сетчатке и нержавеющей стали кольца внутренний диаметр 2,8 мм и наружным диаметром 4.0 мм был помещен на сетчатку это исправить на b нижней. Сетчатки была готова для эксперимента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 8: Визуализация кровеносных сосудов сетчатки. Образцовое артериолы сетчатки с красные кровяные клетки внутри.
Рисунок 9: функциональные исследования с использованием видео микроскопии. Кривые ответ представителя концентрации от одного артериолы сетчатки. (A) концентрация реакция кривой для сосудосуживающие, U46619 (10-9 до 10-6 М) и (B) для зависящих от эндотелия сосудорасширяющим, ацетилхолин (10-8 -10-5 М). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Измерение сосудистых реакций в сетчатке мыши является сложной задачей из-за небольшого размера кровеносных сосудов сетчатки. С представленной техникой артериолы сетчатки визуализируются путем передачи световой микроскопии. Это возможно, потому, что изолированные сетчатки полупрозрачные. Преимуществом метода является высокое оптическое разрешение. Вычисляемые пространственное разрешение составляет 11 px/мкм. Однако реальные разрешения для этой оптической системы, которая использует белый свет находится между 200 и 300 Нм, что объясняется Аббе дифракционного предела. Поскольку первый филиал артериол сетчатки мышь имеет внутренний диаметр 20-30 мкм, диаметр изменения приблизительно 1% обнаруживаются с помощью этой системы. Существует не нужно визуализировать мелких артериол сетчатки5,6,7дополнительных технических устройств или флуоресцентными красителями, как сообщалось в других исследованиях. Недостатком метода является время длительную подготовку, которая составляет от 90 до 120 мин на подготовленных следователей. Если время приготовления превышает 180 мин, Эндотелиальная функция начинает ослаблять.
Есть несколько основных критических шагов в этой технике. Во-первых важно тщательно перевязать все ретробульбарная артериальной ветви. Если лигирование является неполной, артериолы сетчатки будет не под давлением из-за утечки. Во-вторых, погружение в этанол 10 s перед открытием глаз Глобус имеет важное значение для отключения гладких мышц реактивности глазной артерии. Ранее мы показали, что погружение для 10 s на 70% этиловом спирте полностью отключает глазной артерии гладких мышц8. В отличие от артериол сетчатки вряд ли непосредственно затронуты этанола, поскольку они находятся под защитой бульбарной стены. Если этот шаг указан, изменения диаметра в глазной артерии может повлиять кровоснабжения сетчатки. Следует отметить реактивность глазной артерии может заметно отличаться от сетчатки артериол в ответ же агонист9,10. В-третьих Избегайте кручения глазной артерии. Особенно во время монтажа сетчатки подготовки на платформу, могут стать витой глазной артерии, что приводит к окклюзии просвета. Кроме того тщательно проверьте, что кончик стекла капилляров не закрыта для включения наддув артериол сетчатки. Мы предлагаем не выполнять более трех последовательных концентрация реакция кривых в том же подготовке сетчатки, потому что мы наблюдали, что ответы на ацетилхолин стал слабее, когда повторение концентрация реакция кривых для более чем в три раза. Однако могут существовать разногласия в отношении повторяемость концентрация реакция кривых в зависимости от агента применяется и, таким образом, должны быть проверены индивидуально.
Мы применили фармакологических агентов extraluminally в наших исследованиях, хотя возможен и внутрипросветная перфузии, с помощью насоса сервопривод управления. Поскольку метод позволяет измерять для местных механизмов сосудистой реактивности в сетчатке мелких лабораторных животных, включая мышей и крыс, преимущества ген ориентация технологии с использованием генетически модифицированных животных могут быть доступны с помощью этого метода .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы имеют без финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантов от Эрнст und Berta Grimmke Stiftung и Deutsche Gesellschaft офтальмологические (собака).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Steel Scissors | Carl Roth GmbH | 3576.1 | 1x 140 mm |
| Eye Scissors | Geuder | G-19390 | 1x straight, 10.5 cm |
| Precision tweezers, straight with fine tips | Carl Roth GmbH | LH68.1 | 2x type 4 |
| Precision tweezers, straight with extra fine tips | Carl Roth GmbH | LH53.1 | 2x type 5 |
| Vannas capsulotomy scissors | Geuder | 19760 | 1x straight, 77 mm |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91501-09 | 1x curved, |
| Barraquer Needle Holder | Geuder | G-17500 | 1x curved, 120 mm |
| Needle | Becton, Dickinson and Company | 305128 | 1x 30 G |
| Glass Capillaries (for producing micropipettes) | Drummond Scientific Company | 9-000-1211 | 1x (1.2 x 0.8 mm; outer/inner diameter) |
| Nylon Suture | Alcon | 198001 | 1x 10-0 |
| Nunclon cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 153066 | 1x 35 mm diameter |
| Nunclon cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 172931 | 1x 100 mm diameter |
| Discofix C | Braun | 16500C | 10 cm |
| Histoacryl adhesive | B. Braun Surgical, S.A. | 1050052 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Pericyclic pump (CYCLO II) | Carl Roth GmbH | EP76.1 | 1x |
| Vertical Pipette Puller Model 700C | David Kopf Instruments | 1x | |
| Microscope (Vanox-T AH-2) | Olympus | 1x | |
| Water immersion objective LUMPlanFL, 1.0 NA | Olympus | 1x | |
| Digital camera (TK-C1381) | JVC | 1x | |
| Perfusion chamber | self-made | 1x | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drugs and Solutions | |||
| Ethanol | Carl Roth GmbH | K928.4 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Carl Roth GmbH | 5239.1 | |
| Kalium chloride (KCl) | Carl Roth GmbH | 6781.1 | |
| Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth GmbH | 3904.2 | |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | Carl Roth GmbH | 261.2 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth GmbH | 9265.2 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Carl Roth GmbH | 0965.3 | |
| α-(D)-(+)- Glucose monohydrate | Carl Roth GmbH | 6780.1 | |
| 9,11-dideoxy-9α,11α-methanoepoxy prostaglandin F2α (U-46619) | Cayman Chemical | 16450 | |
| Acetylcholine chloride | Sigma-Aldrich | A6625-25G |
References
- Toda, N., Nakanishi-Toda, M. Nitric oxide: ocular blood flow, glaucoma, and diabetic retinopathy. Prog Retin Eye Res. 26 (3), 205-238 (2007).
- Schuster, A. K., Fischer, J. E., Vossmerbaeumer, C., Vossmerbaeumer, U. Optical coherence tomography-based retinal vessel analysis for the evaluation of hypertensive vasculopathy. Acta Ophthalmol. 93 (2), e148-e153 (2015).
- Cherecheanu, A. P., Garhofer, G., Schmidl, D., Werkmeister, R., Schmetterer, L. Ocular perfusion pressure and ocular blood flow in glaucoma. Curr Opin Pharmacol. 13 (1), 36-42 (2013).
- Faraci, F. M., Sigmund, C. D. Vascular biology in genetically altered mice : smaller vessels, bigger insight. Circ Res. 85 (12), 1214-1225 (1999).
- Kornfield, T. E., Newman, E. A. Measurement of Retinal Blood Flow Using Fluorescently Labeled Red Blood Cells. eNeuro. 2 (2), (2015).
- Guevara-Torres, A., Joseph, A., Schallek, J. B. Label free measurement of retinal blood cell flux, velocity, hematocrit and capillary width in the living mouse eye. Biomed Opt Express. 7 (10), 4229-4249 (2016).
- Schallek, J., Geng, Y., Nguyen, H., Williams, D. R. Morphology and topography of retinal pericytes in the living mouse retina using in vivo adaptive optics imaging and ex vivo characterization. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8237-8250 (2013).
- Gericke, A., et al. Identification of the muscarinic acetylcholine receptor subtype mediating cholinergic vasodilation in murine retinal arterioles. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (10), 7479-7484 (2011).
- Gericke, A., et al. Functional role of alpha1-adrenoceptor subtypes in murine ophthalmic arteries. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (7), 4795-4799 (2011).
- Bohmer, T., et al. The alpha(1)B -adrenoceptor subtype mediates adrenergic vasoconstriction in mouse retinal arterioles with damaged endothelium. Br J Pharmacol. 171 (16), 3858-3867 (2014).
