Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

انتشار وتمايز السلائف النقوي موريني 32D/ز-CSF-R الخلايا

Published: February 21, 2018 doi: 10.3791/57033
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1,2
1Department of Hemato-Oncology, Institute of Molecular Genetics of the ASCR, 2Childhood Leukaemia Investigation Prague, Department of Paediatric Haematology and Oncology, 2nd Faculty of Medicine, Charles University
* These authors contributed equally

Summary

وترد هنا بروتوكولات مفصلة لاستزراع خط الخلية 32D/ز-CSF آر السلائف النقوي مورين وأداء العدوى الفيروسية، والقيام بفحوصات الانتشار والتفرقة. هذا الخط خلية مناسبة لدراسة التنمية الخلية النقوي، ودور جينات فائدة في نمو الخلايا النقوي والتمايز بيضاء.

Abstract

فهم بيولوجيا الخلايا الجذعية والسلف المكونة للدم على آثار هامة للطب التجديدي، وعلاج أمراض الدم. على الرغم من البيانات الأكثر أهمية التي يمكن الحصول عليها باستخدام النماذج في فيفو أو الثقافات الأولية، يقيد وفرة منخفضة للخلايا الجذعية والسلف المكونة للدم إلى حد كبير مجموعة تقنيات مناسبة للتحقيق فيها. ولذلك، يسمح استخدام خطوط الخلايا يكفي إنتاج المواد البيولوجية لأداء عروض أو الاختبارات التي تتطلب إعداد كبيرة من الخلايا. وهنا يقدم وصفاً مفصلاً، وقراءات، وتفسير لفحوصات الانتشار والتفرقة التي تستخدم لتحقيق العمليات التي ينطوي عليها ميلوبويسيس والتمايز بالعدلات. وتستخدم هذه التجارب خط الخلية النقوي مورين التابعة سيتوكين 32D/ز-CSF آر، التي تمتلك القدرة على تكاثر حضور إيل-3 والتفريق في ز-CSF. نحن نقدم الأمثل بروتوكولات للتعامل مع الخلايا 32D/ز-CSF آر ومناقشة المزالق الرئيسية والسلبيات التي قد تضر بوصف فحوصات والنتائج المتوقعة. بالإضافة إلى ذلك، تحتوي هذه المقالة على بروتوكولات لإنتاج لينتيفيرال والفيروسات التراجعية، والمعايرة، وتوصيل الخلايا 32D/ز-CSF-R. علينا أن نظهر أن التلاعب الوراثي لهذه الخلايا يمكن أن تستخدم لإجراء الدراسات الفنية والجزيئية، التي يمكن أن تكمل النتائج التي تم الحصول عليها مع الأولية المكونة للدم الخلايا الجذعية والسلف أو نماذج في فيفو بنجاح.

Introduction

إمدادات السكان المكونة للدم الجذعية والسلف الكائن مع مجموعة كبيرة من الخلايا الناضجة، بما في ذلك الخلايا من نسب النقوي (العَدلات، الحمضات، الاسسه، ووحيدات). العملية التي تقود إنتاج خلايا النقوي من الخلايا الجذعية المكونة للدم يعرف باسم ميلوبويسيس، ويكفي إنتاج خلايا النقوي ناضجة في الاستجابة للمتطلبات المتغيرة شرط مسبق للتعامل السليم في الحي مع الإجهاد الشروط، مثل الالتهابات وفقدان الدم. قد يؤدي عدم كفاية إنتاج خلايا النقوي ناضجة للتمكن من القضاء على مسببات الأمراض وتخثر الدم المخفضة، وأخرى تهدد الحياة ظروف1،2. وبالإضافة إلى ذلك، تعديلات في نسب النقوي التنمية قد يكون مرتبطاً أيضا بالأورام الخبيثة الدموية، مثل سرطان الدم النقوي الحاد (AML)3. قد تحدث تغييرات في ميلوبويسيس لأسباب مختلفة، مثل عيوب في خلايا المستقبلات السطحية4، تعبيرات غيرت من عوامل النسخ5، ضعف مسارات الإشارات6، الطفرات أسفر عن تشكيل/ تفعيل المسرطنة7، أو المنظمة من ورم المكثف الجينات8.

وقد وضعت أساليب مختلفة لدراسة التنمية النقوي، وتقييم أثر التعديلات الوراثية المحددة في هذه العملية. ينطوي النهج المشتركة المستخدمة لدراسة ميلوبويسيس الخلايا الأولية والفئران المعدلة وراثيا. على الرغم من أن هذه النماذج تسمح الحصول على البيانات ذات الصلة بيولوجيا، لديهم بعض القيود. واجه استخدام الخلايا الأولية على عدد محدود من الخلايا وفترة مقيدة للثقافة، وتضييق إمكانيات لتغيير التعبير الجيني وتحليل البيولوجية أو الكيميائية الحيوية اللاحقة. الفئران المعدلة وراثيا هي مكلفة وتتطلب درجة معقولة من التبرير البيولوجي. وبالإضافة إلى ذلك، يضيف العامل مع نماذج في فيفو على درجة من التعقيد في فهم دور الجينات للاهتمام بعملية معينة. ولذلك، يلزم نهج بديلة للتحايل على هذه القيود. خطوط الخلية لها مزايا لا جدال فيه: (1) أنها تمتلك قدرة الانتشار غير المحدود الذي يسمح لتوليد ما يكفي من المواد للدراسات البيوكيميائية والبيولوجية، (2) فعرضه للتلاعب الوراثي (ضربة قاضية، خروج المغلوب، overexpression)، (3) التكلفة منخفضة نسبيا، و (4) أنها تسمح بقدر من التبسيط البيولوجية المطلوبة في بعض النهج التجريبي.

3 إيل الأبوية (انترلوكين-3) 32D تعتمد خط الخلية أنشئت في عام 1983 جرينبيرجير وزملاؤه بعدوى خلايا نخاع العظام من الفئران C3H/HeJ مع صديق اللوكيميا مورين الفيروسات9. ووصفت استنساخ 32D عدة في الأدب: cl-239و cl-310و cl-1011. وعرضت 32D cl-3 الخلايا تتكاثر في إيل-3 والخضوع للتمايز بيضاء على المعاملة مع مستعمرة المحببات التحفيز عامل (ز-CSF)10. على العكس من ذلك، 32D cl-10 خلايا، حين أنها تعتمد على 3 إيل، أصلاً كانت لا التفريق في الاستجابة للعلاج ز-CSF. وفي عام 1995 ترانسدوسيد مجموعة الدكتور إيفو تو ريتروفيرالي 32D cl-10 خلايا مع نوع البرية وأشكال المسخ من مستقبلات ز-CSF (ز-CSF آر)، بغية تحديد المناطق الهامة وظيفيا لهذا مستقبلات11. وأسفرت هذه الدراسة جيل الخلايا 32D/ز-CSF آر، التي تعتمد على نحو مماثل في إيل-3، ولكن في غضون 6 إلى 10 يوما بعد استبدال إيل-3 مع ز-CSF، تتوقف الخلايا تتكاثر وتفرق بلا رجعة في العَدلات الناضجة. هذه الخصائص تجعل 32D cl-3 والخلايا 32D/ز-CSF آر نماذج مبسطة من التمايز بالعدلات مورين التي يمكن أن تكون عن طريق اثنين من نمو محددة تحديداً جيدا وعوامل التمايز-إيل-3 وز-CSF التضمين. خلال العقود الماضية قد استخدمت مجموعات متعددة الخلايا 32D/ز-CSF آر لدراسة دور الجينات خاصة في الانتشار وتمايز الخلايا النقوي في الثقافة12،13،،من1415 , 16، ودراسة ز-CSF مما يشير إلى17،18. الأهم من ذلك، النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام هذا الخط خلية ترتبط مع البيانات التي تم الحصول عليها مع الخلايا الأولية والفئران المعدلة وراثيا16،19،،من2021. ونتيجة لذلك، نعتقد أن الخلايا 32D/ز-CSF آر، يجري نموذج الراسخة والمستخدمة على نطاق واسع، تمثل نظاما قيماً لدراسة النقوي التمايز التي يمكن استخدامها بالتوازي مع نهج أخرى التصدي لهذه المسألة.

هنا، يرد بروتوكولات مفصلة تصف التعامل مع خط الخلية 32D/ز-CSF آر، التي توسع الغطاء والتمايز وتقييم الانتشار والتفريق بين هذه الخلايا. للتعديل الوراثي للخلايا 32D/ز-CSF آر، أما عن طريق توصيل النسخ العكسي أو لينتيفيرال، فضلا عن البروتوكولات لمعايرة الفيروس هي معلومات تفصيلية. وبالإضافة إلى ذلك، يتم توفير العديد من النتائج التمثيلية التي تثبت التطبيقات المحتملة للخلايا 32D/ز-CSF آر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: الخطوات تصف التوسع، التمايز، وتوصيل الخلايا 32D/ز-CSF آر ترد أدناه.

1-إعداد

  1. إعداد الوسائط
    1. تحضير 250 مل من الثقافة المتوسطة: المتوسطة 1640 RPMI (معهد ميموريال بارك روزويل) تستكمل مع الحرارة 10% إبطال FBS (الجنين المصل البقري)، وايل-3 مورين (10 نانوغرام/مل).
      1. وبدلاً من ذلك، استخدم الصنع IL-3. لإنتاج إيل-3 الصنع، ترانسدوسي الخلايا HEK293 مع إيل-3 ناقلات وإذ تعرب عن وجمع إيل-3 تتضمن طافية22.
        ملاحظة: المضادات الحيوية، مثل البنسلين ز (100 وحدة/مل)، ستربتوميسين (100 ميكروغرام/مل) ومن الجنتاميسين (40 ميكروغرام/مل)، يمكن لاستزراع الخلايا في أي خطوة للبروتوكول ما لم يذكر خلاف ذلك.
    2. إعداد 50 مل متوسطة التمايز: المتوسط RPMI 1640 تستكمل مع 10% FBS، والبشرية ز-CSF (100 نانوغرام/ملليلتر).
      ملاحظة: (مهم) ليس كل مصل دفعات دعم التمايز للخلايا 32D/ز-CSF آر. قبل بدء التجربة اختبار مجموعات مختلفة من المصل. من المستحسن اختبار دفعات مختلفة على الأقل 4 وحدد الأمثل استناداً إلى قدرة الخلايا 32D/ز-CSF آر على التفريق. انظر البروتوكول التمايز 32D/ز-CSF آر أدناه.
    3. إعداد 10 مل من تجميد المتوسطة: المتوسطة RPMI 1640 تستكمل مع 40% FBS، و 10% [دمس] (ثنائي ميثيل سلفوكسيد).
  2. الإنتاج لفي
    1. لوحة تعليق خلية واحدة من الخلايا Bosc23 (6 × 106) في طبق بتري 16 سم وزراعتها في 18 مل دميم (المتوسطة "تعديل النسر" دولبيكو) التي تحتوي على 10% FBS حتى كونفلوينسي للثقافة تصل إلى 80% (24 ساعة).
      ملاحظة: يجب أن تنمو الخلايا في كتل أحادي الطبقة ولا من النموذج في الثقافة. عد الخلايا يمكن أن يؤديها باستخدام أساليب مختلفة (صالحة لبقية البروتوكولات المقدمة هنا). في حالة انخفاض عدد العينات، ينصح العد اليدوي تحت المجهر باستخدام الدائرة Bürker. في هذه الحالة، استخدم تريبان الأزرق لاستبعاد خلايا الميتة. مزيج من الخلايا 1:1 مع 0.4% تريبان الأزرق في برنامج تلفزيوني. لإجراء عد لعدد كبير من العينات، يمكن أن تستخدم عداد تلقائي خلية.
    2. الجمع بين 40 ميكروغرام لبناء النسخ العكسي (مثل مسكف)، 20 ميكروغرام pCL-إيكو (ناقل التعبئة والتغليف)23، 80 ميليلتر من بي (بولييثيلينيميني)، و 2 مل من المصل خفض المتوسطة (مثل غروب-الفنزويلية) متوسطة (بدون المضادات الحيوية). احتضان هذا الخليط لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
    3. استبدال Bosc23 الخلايا المتوسطة بعناية مع 16 مل دميم وتستكمل مع 2% FBS. قبل الحارة المتوسط إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
      ملاحظة: لا تستخدم المضادات الحيوية خلال تعداء، نظراً لأنها قد تقلل من كفاءة تعداء.
    4. إضافة خليط أعدت في 1.2.2. دروبويسي وعناية Bosc23 الثقافة، واحتضان ح 4 في 37 درجة مئوية. الحد من الحضانة إلى أقل من 6 ح سبب سمية بي.
    5. بعد الحضانة، تغيير Bosc23 المتوسطة لمل 18 قبل استعد دميم التي تحتوي على 10% FBS، وزراعة الخلايا ل 48 ساعة عند 37 درجة مئوية. ضع الأطباق في مختبر مستوى 2 للسلامة الأحيائية وتبقى هنا من هذه الخطوة على اتباع إجراءات السلامة القياسية.
    6. جمع Bosc23 المتوسطة (التي تحتوي على جزيئات اكوتروبيك الفيروسات التراجعية) استخدام ماصة 25 مل مصلية في أنبوب 50 مل مخروطية، وتخزينها في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: ينبغي التوصل إلى كفاءة تعداء (هام) 90% لإنتاج فيروس عيار عالية.
    7. إضافة مل 18 قبل استعد دميم 10% FBS إلى Bosc23 الخلايا وزراعتها ح 24.
    8. كرر الخطوة 1.2.6.
      ملاحظة: يمكن تجميع supernatants الفيروسات التراجعية من 1.2.6 و 1.2.8 بمجرد أن تصل إلى نفس درجة الحرارة المحافظة على سلامة الفيروسية (4 درجات مئوية).
    9. لتجنب التلوث Bosc23 في supernatants الفيروسية، تدور الفيروسات التي تم جمعها في ز 1500 × لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. فيروس الكوة، التقط تجميد استخدام النتروجين الثلج الجاف أو السائل، وتخزين في-80 درجة مئوية. ومع ذلك، ملاحظة أن الفيروس الطازجة جودة أعلى من حيث الكفاءة العدوى من الأرصدة المجمدة.
      ملاحظة: (هام) تجنب تكرار تجميد/ذوبان الجليد للفيروس، نظراً لأنه يؤدي إلى تدهور الفيروسية.
  3. إنتاج لينتيفيروس
    1. لوحة تعليق خلية واحدة من الخلايا (الكلي الجنينية البشرية 293T) HEK293T (6 × 106) في طبق بتري 16 سم وزراعتها في 18 مل دميم التي تحتوي على 10% FBS حتى كونفلوينسي للثقافة تصل إلى 80% (24 ساعة).
      ملاحظة: يجب أن تنمو الخلايا في كتل أحادي الطبقة ولا من النموذج في الثقافة.
    2. الجمع بين 15 ميكروغرام لبناء لينتيفيرال (مثل pGhU6)، التعبئة والتغليف pCMVdR8.74 البلازميدات (ترميز لهفوة/بول، 12 ميكروغرام) و pMD2.VSVG (ترميز لمنظمة-ز، 1.4 ميكروغرام)، ميليلتر 85.2 بي، و 2 مل من المصل خفض متوسط (بدون المضادات الحيوية). احتضان هذا الخليط لمدة 20 دقيقة في الرايت
    3. استبدال المتوسطة HEK293T بعناية مع 16 مل دميم وتستكمل مع 2% FBS. قبل الحارة المتوسط إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام. عدم استخدام المضادات الحيوية خلال تعداء، نظراً لأنها قد تقلل من كفاءة تعداء.
    4. إسقاط الخليط أعدت في 1.3.2 لثقافة الخلية HEK293T بعناية واحتضانها ح 4 في 37 درجة مئوية. تحديد مدة الحضانة إلى داخل ح 6 لمنع التسمم بي.
    5. متوسط التغير لمل 18 قبل استعد دميم 10% FBS وزراعة الخلايا ل 48 ساعة عند 37 درجة مئوية. ضع الأطباق في مختبر مستوى 2 للسلامة الأحيائية وتبقى هنا من هذه الخطوة على اتباع إجراءات السلامة القياسية.
    6. جمع HEK293T المتوسطة (التي تحتوي على جزيئات أمفوتروبيك لينتيفيرال) باستخدام ماصة 25 مل مصلية في أنبوب 50 مل مخروطية وتخزينها في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: ينبغي التوصل إلى كفاءة تعداء (هام) 90% لإنتاج فيروس عيار عالية.
    7. عناية إضافة 18 مل دميم دافئة قبل 10% FBS للخلايا HEK293T. زراعة عن 24 ساعة عند 37 درجة مئوية.
    8. كرر الخطوة 1.3.6.
      ملاحظة: يمكن تجميع سوبيرناتانتس لينتيفيرال من 1.3.6 و 1.3.8 بمجرد أن تصل إلى نفس درجة الحرارة المحافظة على سلامة الفيروسية (4 درجات مئوية).
    9. لتجنب التلوث من المادة طافية الفيروسية مع الخلايا HEK293T، تدور الفيروسات التي تم جمعها في ز 1500 × لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. فيروس الكوة، التقط تجميد استخدام النتروجين الثلج الجاف أو السائل، وتخزينها في-80 درجة مئوية. ومع ذلك، لاحظ أن طازج الفيروس جودة أعلى من حيث الكفاءة العدوى من الأرصدة المجمدة.
      ملاحظة: (هام) تجنب تكرار تجميد/ذوبان الجليد للفيروس، نظراً لأنه يؤدي إلى تدهور الفيروسية.
  4. معايرة للفيروس التي تحتوي على بروتينات فلورية خضراء مراسل
    1. البذور 1 × 105 المعاهد الوطنية للصحة/3T3 الخلايا في 300 ميليلتر من دميم 10% FBS الواحدة وكذلك في لوحة 24-جيدا. سوف تستخدم الآبار 7 لفيروس عيار واحد.
    2. ذوبان الجليد الفيروس عند 37 درجة مئوية وإضافة 1، 5، 10، 50، 100 و 500 ميليلتر الفيروس إلى المعاهد الوطنية للصحة/3T3 الثقافات. لا تقم بإضافة أي فيروس في مراقبة سلبية أيضا. زراعة الخلايا حضور الفيروس عن 48 ساعة عند 37 درجة مئوية.
    3. حصاد المعاهد الوطنية للصحة/3T3 الخلايا باستخدام 30 ميليلتر التربسين/يدتا (حمض الإيثيلين) (0.25% التربسين، يدتا 0.01 ٪ في برنامج تلفزيوني) ووضع الخلايا في برنامج تلفزيوني ميليلتر 250 في أنبوب نظام مراقبة الأصول الميدانية (الأسفار تنشيط الخلية الفرز).
    4. تحديد وتيرة التجارة والنقل+ الخلايا بالتدفق الخلوي في كل عينة24. استبعاد الخلايا الميتة عن طريق إضافة صبغة الجدوى، مثل هويشت 33258.
    5. حساب إجمالي عدد الخلايا بروتينات فلورية خضراء+ (استناداً إلى عدد الخلايا مطلي والنسبة المئوية للخلايا بروتينات فلورية خضراء+ )، وارسم لهم ضد وحدة التخزين المستخدمة للإصابة بالفيروس.
      ملاحظة: تصل الكفاءة (هام) الإصابة بهضبة عند تطبيق جرعات كبيرة الفيروسية. ولذلك، من المهم تقدير عيار استناداً إلى التركيزات الفيروسية في العدوى التي تحدث الكفاءة في مجموعة خطية (على سبيل المثال في الجدول 1). عدد الخلايا بروتينات فلورية خضراء+ يشير إلى عدد الجسيمات الفيروسية الوظيفية (تو-تحويل الوحدات) في وحدة تخزين فيروس معين. حساب عدد تو كل مل.
  5. معايرة للفيروس التي تحتوي على مراسل بوروميسين
    1. البذور 5 × 104 خلايا المعاهد الوطنية للصحة/3T3 في 3 مل دميم 10% FBS كل بئر في لوحة 6-جيدا؛ توظيف 6 آبار لفيروس عيار واحد. الثقافة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
    2. وفي اليوم التالي يضعف الفيروس كما هو مبين في الجدول 2. لتمييع الفيروسات، استخدم دميم دافئة قبل 10% FBS. عدم دوامة.
    3. إزالة الثقافة المتوسطة من المعاهد الوطنية للصحة/3T3 الخلايا وإضافة 1 مل فيروس المخفف.
    4. تبني بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
    5. استبدال بلطف المتوسطة المحتوية على الفيروس مع 2 مل دميم دافئة قبل 10% FBS، واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
    6. استبدال المتوسطة المعاهد الوطنية للصحة/3T3 برفق مع 2 مل من قبل حرارة دميم 10% FBS المحتوية على بوروميسين (2 ميكروغرام/مل).
    7. الثقافة في 37 درجة مئوية والتحديث في المتوسط بعناية مع بوروميسين كل 3 أيام أو عندما يتحول إلى اللون الأصفر المتوسطة.
    8. 10-12 يوما بعد الإصابة، نضح المتوسطة من كل بئر وتغسل برفق مع برنامج تلفزيوني.
    9. وصمة عار مع 1 مل من محلول الكريستال البنفسجي (0.5% الكريستال البنفسجي في 20% من الإيثانول و dH2س)، 2 دقيقة في RT، وتغسل بعناية مع برنامج تلفزيوني مرتين.
    10. عد المستعمرات الزرقاء الموجودة في كل بئر تحت مجهر (التكبير X4). ينبغي أن يراعي لا مستعمرات في مراقبة سلبية أيضا.
    11. حساب العدد الإجمالي لتو/مل النظر في معامل التخفيف.

2-توسيع وصيانة خلايا 32D/ز-CSF-R

  1. إذا كان يتم تجميد الخلايا 32D/ز-CSF آر، تأخذ قاسمة وذوبان الخلايا في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة وتصب الخلايا من القنينة مباشرة في 10 مل من قبل حرارة متوسطة RPMI 1640 تستكمل مع 10% FBS في أنبوب 15 مل. إزالة المادة طافية عكس أنبوب 3 مرات وتدور الخلايا لأسفل في 400 × زاي وريسوسبيند الخلايا في إيل-3 تتضمن الثقافة المتوسطة بتركيز 0.3 × 106 خلايا/مل.
  2. تركز النمو الأمثل الخلية هي 0.25-0.5 × 106 خلايا/مل. تقسيم الخلايا كل يومين تقديمهم إلى تركيز 0.1-0.2 × 106 خلايا/مل.
    ملاحظة: الخلايا 32D/ز-CSF-R (هام) قد جزئيا تفقد قدرتها على التفريق إذا نما إلى تركيزات أعلى من 1 × 106 خلايا/مل. ولذلك من المهم جداً تقسيم الخلايا 32D/ز-CSF آر في الوقت المناسب.
  3. حسب الحاجة، تجميد وتخزين الخلية مختبرين لفترات طويلة من الزمن في-80 درجة مئوية أو في نيتروجين سائل. تدور أسفل 3 × 106 خلايا وإزالة المادة طافية، وريسوسبيند في 1 مل من تجميد المتوسطة. ضع الأنبوبة في حاوية تجميد في-80 درجة مئوية. للتخزين على المدى الطويل، قم بتغيير موضع الخلايا للنتروجين السائل.

3-توصيل الخلايا 32D/ز-CSF-R

  1. لوحة خلايا 32D/ز-CSF-R في لوحة 6-جيدا بتركيز 0.3 × 106 خلايا/مل.
  2. إضافة كمية مناسبة من الفيروس للوصول إلى موي (تعدد العدوى) بين 10 و 40.
    ملاحظة: سيؤدي موي أعلى في زيادة النسبة المئوية للخلايا بروتينات فلورية خضراء+ ، فضلا عن مستويات أعلى من التعبير عن الجينات للفائدة. على سبيل المثال: لتصيب 0.3 × 106 خلايا مع موي 10؛ سوف تحتاج إلى 3 × 106 تو المراد إضافتها إلى الخلايا 32D/ز-CSF-R.
  3. إضافة بوليبريني إلى التركيز النهائي 8 ميكروغرام/مل واحتضانها ح 6 عند 37 درجة مئوية. وبدلاً من ذلك، تنفيذ إجراء تلقيح تدور: الطرد المركزي في ز 1200 × لمدة 90 دقيقة في 30 درجة مئوية في صفيحة تثقيف استخدام دوار سوينغ-دلو، واحتضان ح 3 في 37 درجة مئوية.
  4. جمع الخلايا، نقل إلى أنبوب 15 مل، وتدور في 450 × ز لمدة 5 دقائق (4 درجات مئوية).
  5. تجاهل المادة طافية، ريسوسبيند الخلايا الأعلاف في 6 مل من الثقافة المتوسطة، ووضع في قارورة ثقافة الخلية T25، والثقافة في 37 درجة مئوية.
  6. 48 ساعة في وقت لاحق، حصاد الخلايا وتدور لهم في 450 × ز لمدة 5 دقائق (4 درجات مئوية). تجاهل المادة طافية.
  7. في حالة مراسل التجارة والنقل: وضع الخلايا في 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني وفرز الخلايا بروتينات فلورية خضراء+ باستخدام أرز تدفق الخلوي. في حالة مراسل بوروميسين التي تحتوي على ناقل: وضع الخلايا في الثقافة المتوسطة التي تحتوي على 2 ميكروغرام/مل من بوروميسين.
  8. توسيع نطاق الخلايا حسب الحاجة لمزيد من التحليل والتجارب.
    ملاحظة: الخلايا ترانسدوسيد (اختياري) يمكن المجمدة في تجميد وسائل الإعلام في حاوية تجميد في-80 درجة مئوية، وكذلك تخزينها في نيتروجين سائل.

4-32D/ز-CSF آر خلية تحليل انتشار

  1. لتقييم انتشار معدل مكان 0.2 × 106 خلايا في 1 مل من الثقافة المتوسطة واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
  2. وفي اليوم التالي عد عدد الخلايا وتمييع لهم العودة إلى تركيز من 0.2 × 106 خلايا/مل تستخدم الثقافة المتوسطة. تبني بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. الاحتفاظ بسجلات لتركيزات الخلية وتخفيف المطبقة على ثقافات اليومية باستخدام الجدول 3.
  3. كرر الخطوة 4، 2 لعدد الأيام الانتشار يحتاج إلى تقييم.
    ملاحظة: طول فحوصات انتشار سيتوقف على تأثير الجينات للفائدة. في حالة النمط الظاهري قوية، 8-9 أيام قد تكون كافية لمراقبة تأثير كبير (انظر الشكل 3A). ومع ذلك، في حالة النمط الظاهري معتدل، فترات أطول من الزمن قد تكون لازمة.
  4. تقييم نمو الخلايا بجعل منحنى انتشار كما هو مبين في الجدول 3.

5-32D/ز-CSF آر خلية تحليل التمايز

  1. أغسل 0.2 × 106 خلايا 32D/ز-CSF آر مرتين مع المتوسطة ربمي دون السيتوكينات.
    ملاحظة: الخطوات الغسيل قبل إضافة ز-CSF في الثقافة هامة، نظراً لوجود بقايا إيل-3 قد تحول دون تفرقة.
  2. وضع الخلايا في 1 مل التمايز المتوسطة (التي تحتوي على 100 نانوغرام/مليلتر ز-CSF) في بئر 24/لوحة، أدى إلى تركيز خلية من 0.2 × 106 خلايا/مل (يوم 0). الثقافة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
  3. حساب عدد الخلايا/مل كما هو مبين أعلاه (الخطوة 1.2.1).
  4. سيتوسبين 2-5 × 104 خلايا على شريحة زجاج (76 مم × 26 مم) باستخدام أجهزة الطرد مركزي مع محولات اللازمة في 20 × ز.
  5. تحديث تمايز الخلايا المتوسطة ولوح بتركيز 0.2 × 105 خلايا/مل في بئر 24/لوحة (1 يوم). تجاهل لوحة قديمة، والمضي قدما في اليوم التالي مع الخطوة 5.6 مع لوحة جديدة.
  6. في يوم 2 إلى 7، كرر الخطوات من 5.3 إلى 5.5. تقييم انتشار الخلايا حضور ز-CSF كما هو موضح في الخطوة 4.
    ملاحظة: (هام) خلال التمايز، يبطئ انتشار الخلايا، ولذلك بعد 3 إلى 4 أيام حضور ز-الخدمات القطرية أنها كافية لثقافة الخلايا بتركيزات أعلى.
  7. تقييم حالة تمايز الخلايا 32D/ز-CSF آر استناداً إلى مورفولوجيا الخلايا.
    1. إصلاح الخلايا من الخطوة 5.4 في الميثانول لمدة 5 دقائق في الرايت وتترك الشرائح أيردري.
      ملاحظة: الشرائح من 0 إلى 7 يوم يمكن تخزينها في الرايت، وثابتة في نفس الوقت. وبالمثل، يمكن أن توضع أيضا في RT لفترات أطول بعد التثبيت.
    2. وصمة عار الخلايا باستخدام Giemsa Grünwald أيار تلطيخ بروتوكول الشركة المصنعة التالية.
    3. تصور الملون الخلايا باستخدام مجهر والتكبير X40.
    4. التحديد الكمي لعدد من الانفجارات وخلايا متمايزة العولم المحببة الناضجة باستخدام صور توضيحية في الشكل 1 ووصف في الجدول 4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

انتشار وتمايز الخلايا 32D/ز-CSF-R

لتقييم انتشار الخلايا 32D/ز-CSF آر تحت ظروف برو التكاثري والمؤيدة التمايز، كان مثقف خلايا 32D/ز-CSF-R في الوسائط التي تحتوي على 3 إيل وز-CSF، على التوالي. ولوحظ أن انقسام الخلايا المستزرعة في إيل-3 التي تحتوي على المتوسط (10 نانوغرام/مل) تقريبا كل 24 ساعة (الشكل 2A). عند استبدال إيل-3 مع ز-CSF (100 نانوغرام/ملليلتر) الانتشار تدريجيا قد تباطأ وتوقف بعد 4 أيام (الشكل 2A). علاوة على ذلك، تم تقييم حالة تمايز الخلايا المستزرعة حضور ز-CSF باستخدام خلايا سيتوسبون الملطخة بايار-Grünwald Giemsa. وقد تبين أن الخلايا في اليوم 0 (قبل بدء العلاج ز-CSF)، يقدم التشكل مثل مييلوبلاست غير ناضجة، تتميز بنواة كبيرة والسيتوبلازم الظلام (الشكل 2). خلال العلاج، يتم تقليل حجم النووية وشكل نواة تغييرات على شكل القمر أو دونات-الشكل. علاوة على ذلك، السيتوبلازم هو الموسع ويفقد اللون البنفسجي الداكن. بعد 6 أيام علاج مع ز-CSF، تعرض الخلايا علامات بيضاء كاملة التمايز، تتميز بنواة لوبولاتيد والسيتوبلازم بنفسجي من ضوء (الشكل 2). التفريق بين الخلايا 32D/ز-CSF آر هو عملية تدريجية، حيث لا كافة الخلايا تتطور نحو العَدلات الناضجة بالضبط نفس السرعة. ويبين الشكل 2Bالتقدير الكمي للخلايا في مراحل مختلفة على مدى التمايز (أي انفجار الخلية المتمايزة العولم والعدلات).

ضربة قاضية Evi2b موريني كتل بيضاء من التمايز في الخلايا 32D/ز-CSF-R

دوونريجوليشن EVI2B (اكوتروبيك الفيروسية التكامل الموقع 2B) في الخلايا 32D/ز-CSF آر، 3 Evi2b-وصممت استهداف (Sh2، Sh3، Sh4) و 1 عدم استهداف غير إسكات التحكم (NSC1) شرناس؛ تم استنساخ هذه إلى ناقل لينتيفيرال تحمل بروتينات فلورية خضراء مراسل16. كانت ترانسدوسيد الخلايا 32D/ز-CSF آر مع عنصر التحكم و Evi2b-إسكات شرناس استخدام موي 10. يومين بعد توصيل، الخلايا بروتينات فلورية خضراء+ (ترانسدوسيد) تم فرزها، وتوسيع لإجراء مزيد من التجارب. في حالة استنفاد EVI2B Sh3 و Sh4، بلغ 80%، غير قادر على كفاءة مستويات البروتين دوونريجولاتي EVI2B Sh2، ولذلك استخدمت كعنصر تحكم إضافية المشار إليه هنا كعنصر التحكم غير إسكات 2 (NSC2). أربعة أيام بعد توصيل، أجريت فحوصات التمايز وانتشار حضور ز-CSF، وقيمت آثار دوونريجوليشن Evi2b في هذه العمليات. ولوحظ أن Evi2b-الخلايا المنضب (Sh2, Sh3) استمرار انتشار الخلايا حضور GCSF، بينما الخلايا التحكم (NSC1 و NSC2) تخفيض انتشار حول يوم 4 (الشكل 3A). علاوة على ذلك، Evi2b-إسكات 32D/ز-CSF آر خلايا تنتج أقل العَدلات المتوسطة وناضجة بالمقارنة مع مراقبة الخلايا (الشكل 3B). خلايا ترانسدوسيد مع NSC2، مما يدل على ضعف الكفاءة ضربة قاضية Evi2b ، بشكل ملحوظ، كما أظهر انخفاض طفيف في عدد العَدلات الناضجة (الشكل 3B). وكانت تلك البيانات المنشورة مؤخرا16.

المركز-ABL الانصهار البروتين يعيق بالعدلات التمايز في الخلايا 32D/ز-CSF-R

فقد ثبت أن المركز قبل الانصهار البروتين يعيق التمايز النقوي، مما تسبب في توسيع فروعه النقوي واسعة مما يؤدي إلى فشل المكونة للدم أثناء المرحلة الحادة من سرطان الدم النقوي المزمن25،26. وأظهرت دراسات سابقة أن التعبير القسري من قبل المركز في 32D cl-3 الخلايا أدى إلى كتلة من التمايز العَدلات27،28. ولذلك، نحن التحقيق في ما إذا كان يمكن الحصول على نتائج مماثلة مع خط الخلية 32D/ز-CSF-R. كانت ترانسدوسيد الخلايا 32D/ز-CSF آر مع المركز-ABL أو مراقبة مسكف الفيروسات التراجعية ناقلات تحمل مراسل التجارة والنقل (موي = 20). 2 أيام بعد توصيل، فرز الخلايا بروتينات فلورية خضراء+ وتوسع لمدة أسبوعين في المتوسط إيل-3 التي تحتوي على. وبعد ذلك، أجريت فحوصات التمايز حضور ز-CSF. لاحظنا أن التحكم مسكف في اليوم 0 (قبل نقل الخلايا إلى المتوسطة المحتوية على ز-CSF)، وقدم المركز-قبل الإعراب عن الخلايا 32D/ز-CSF آر مورفولوجيا مماثلة، تمثل أساسا غير ناضجة النقوي انفجار الخلايا (الشكل 4). ومع ذلك، أثبتنا أن بينما متجه فارغة الخلايا التحكم ترانسدوسيد خضع للتمايز بالعدلات بعد 6 أيام علاج ز-CSF (تنتج 11.5 في المائة العَدلات الناضجة و 56.4 في المائة من الخلايا المتمايزة العولم)، لم تنضج العَدلات وقد تولدت من الخلايا 32D/ز-CSF آر المركز-ABL-ترانسدوسيد (الشكل 4). الدوام، ظلت النسبة المئوية للانفجار غير ناضجة في الخلايا وإذ تعرب عن المركز-ABL في ز-CSF مماثلة للنسبة المئوية للانفجار في ظروف إيل-3.

Figure 1
رقم 1. صور الممثل متميزة 32D/ز-CSF آر الخلية مورفولوجيا. يمكن تصنيف شكلياً كانفجار الخلايا 32D/ز-CSF آر، العولم متباينة من الخلايا، والعدلات الناضجة. انظر الجدول 4 للوصف.

Figure 2
رقم 2. انتشار وتمايز الخلايا 32D/ز-CSF-R- (أ) انتشار الخلايا 32D/جكسفر في 10 نانوغرام/مل إيل-3 (الخط الأسود) أو 100 نانوغرام/مليلتر ز-CSF (الخط الأزرق) التي تحتوي على المتوسط. ويمثل المحور X يوما من العلاج. المحور Y في مقياس لوغاريتمي (سجل2) ويشير إلى العدد من الخلايا × 105. وتمثل النتائج في المتوسط 3 تجارب مستقلة. أشرطة الخطأ تشير إلى الانحراف المعياري. (ب) التفريق بين الخلايا 32D/ز-CSF-R في المتوسطة التي تحتوي على السائل الدماغي النخاعي ز (100 نانوغرام/ملليلتر). في اللوحة العليا، الدائري-القطع تبين النسبة المئوية لانفجارات (أسود)، العولم الخلايا (الوردي)، ومتباينة العَدلات (أحمر) في الثقافة بعد 0، 2، 4، وأيام 6 ز-CSF في المعاملة. الفريق السفلي يحتوي على صور الممثل من الخلايا سيتوسبون كل مرة نقطة ملطخة بايار-Grünwald "جيمسا". وقيمت حد أدنى من 100 خلية لكل نقطة في الوقت.

Figure 3
الشكل 3. Evi2b إسكات كتل بيضاء من التمايز في الخلايا 32D-ز-CSF-R. (أ) انتشار Evi2b-إسكات (خطوط أورانج) والتحكم (خطوط سوداء) 32D/ز-CSF آر خلايا في 100 نانوغرام/مليلتر ز-CSF المتوسطة التي تحتوي على. ويمثل المحور X يوما من العلاج. المحور Y في مقياس لوغاريتمي (سجل2) ويشير إلى العدد من الخلايا × 105. وتبين النتائج نتيجة ممثل 3 التجارب المستقلة. (ب) تقييم للتفريق بين الخلايا 32D/ز-CSF آر ترانسدوسيد مع Evi2b-شرناس إسكات والتحكم في المتوسطة التي تحتوي على السائل الدماغي النخاعي ز (100 نانوغرام/ملليلتر) باستخدام Giemsa Grünwald أيار تلطيخ الخلايا سيتوسبون. في اللوحة العلوية، الدائري-القطع تبين النسبة المئوية لانفجارات (أسود)، العولم متمايزة خلايا (الوردي)، والعدلات (أحمر) في الثقافة. لوحات السفلي تحتوي على صور الممثل من الخلايا سيتوسبون. وقيمت التمايز في يوم 7 من التفريق. وتم تقييم الخلايا على الأقل 100 لكل حالة.

Figure 4
الشكل 4. Overexpression من قبل بنك الانصهار البروتين يعيق تمايز الخلايا 32D/ز-CSF-R- تقييم للتفريق بين الخلايا 32D/ز-CSF آر ترانسدوسيد أما مع التحكم مسكف أو المركز-ABL الانصهار الجينات في المتوسطة التي تحتوي على السائل الدماغي النخاعي ز (100 نانوغرام/ملليلتر). المؤامرات الفطيرة العليا تثبت نسبة الانفجارات (أسود)، العولم متمايزة خلايا (الوردي)، والعدلات (أحمر) في يوم 6 من التفريق. لوحات أقل إظهار الصور التمثيلية من الخلايا سيتوسبون ملطخة بايار-Grünwald "جيمسا". وتم تقييم الخلايا على الأقل 100 لكل نقطة في الوقت.

الفيروس الخامس [ميليلتر] عدد الخلايا مطلي % التجارة والنقل+ عدد الخلايا بروتينات فلورية خضراء+ الخطية؟ تي يو/مليلتر المتوسط (تي يو/mL)
1 كل 100000 1.83 1 830 نعم 1 830 000 2 350 000
5 كل 100000 12.9 12 900 نعم 2 580 000
10 كل 100000 26.4 26 400 نعم 2 640 000
50 كل 100000 71.4 71 400 لا
100 كل 100000 85.1 85 100 لا
500 كل 100000 85.6 85 600 لا

الجدول 1. تحديد عيار الفيروسية لمراسل بروتينات فلورية خضراء تحتوي على المتجهات. مثال للبيانات التي تم الحصول عليها بلفي مسكف وحساب إجراء تقدير عيار الفيروسية. وكان حساب عيار الفيروسية استناداً إلى عدد من الخلايا بروتينات فلورية خضراء+ المكتسبة عند تطبيق كمية معينة من الفيروس. ينبغي أن تكون كمية الفيروس المستخدمة للإصابة في علاقة خطية مع النسبة المئوية للخلايا بروتينات فلورية خضراء+ قياس. تو: تحويل الوحدات.

أنبوب وصف أنبوب دميم + 10% FBS فيروس الحجم الإجمالي عامل إضعاف
(ميليلتر) (ميليلتر) (ميليلتر)
1 تمييع 1 1485 الأسهم الفيروسية 15 ميليلتر 1500 1 × 102
2 تمييع 2 1350 أنبوب ميليلتر 150 1 1500 1 × 103
3 تمييع 3 1350 أنبوب 150 ميليلتر 2 1500 1 × 104
4 تمييع 4 1350 أنبوب 150 ميليلتر 3 1500 1 × 105
5 تمييع 5 1350 أنبوب 150 ميليلتر 4 1500 1 × 106

الجدول 2. تحديد عيار الفيروسية لمراسل بوروميسين التي تحتوي على نواقل. استراتيجية تخفيف الفيروسية لتحديد عيار الفيروسية في بوروميسين التي تحتوي على نواقل. ويبين الجدول كيفية تحضير أنابيب 5 (1-5) الذي يتضمن مسلسل إضعاف الأسهم الفيروسية. أنبوب 1 يحتوي على 1485 ميليلتر دميم + 10% FBS و 15 ميليلتر الفيروس المنتجة، وتوفير × 10 12 إضعاف الفيروس. أنبوب 2 يحتوي على 1350 ميليلتر دميم + 10% FBS وميليلتر 150 × 10 12 إضعاف الفيروس (أنبوب 1)، توفير فيروس مخفف3 × 10 1. 3 أنبوب يحتوي على 1350 ميليلتر دميم + 10% FBS وميليلتر 150 × 10 13 إضعاف الفيروس (أنبوب 2)، توفير فيروس مخفف4 × 10 1. 4 أنبوب يحتوي على 1350 ميليلتر دميم + 10% FBS وميليلتر 150 × 10 14 إضعاف الفيروس (أنبوب 3)، توفير فيروس مخفف5 × 10 1. 5 أنبوب يحتوي على 1350 ميليلتر دميم + 10% FBS وميليلتر 150 × 10 15 إضعاف الفيروس (أنبوب 4)، توفير فيروس مخفف6 × 10 1. 1 مل من أنابيب 1-5 يستخدم لعيار الفيروس.

حساب الخلية (x = عدد الخلايا كل مل)
اليوم 0 يوم 1 يوم 2 يوم 3 يوم 4 يوم 5 يوم 6
عينة 1 ×0 ×1 ×2 ×3 ×4 ×5 ×6
(د) التخفيف (y = حجم الخلايا المستخدمة ريبلاتينج [مل]؛ z = الحجم النهائي [مل])
اليوم 0 يوم 1 يوم 2 يوم 3 يوم 4 يوم 5 يوم 6
عينة 1 د0= 1 د1= y1/z1 د2= ص2/z2 د3= y3/z3 د4= y4/z4 د5= y/z55
عدد مجموع الخلايا
اليوم 0 يوم 1 يوم 2 يوم 3 يوم 4 يوم 5 يوم 6
عينة 1 ×0 ×1 /d0 ×2/d1 ×3/d2/d1 ×4/d3/d2/d1 ×54&/d &/d &/d32/d1 ×6/d5/d4/d3/d2/d1

الجدول 3. جيل منحنى نمو. ويصف الجدول المعادلات اللازمة لتقييم معدل انتشار الخلايا 32D/ز-CSF-R.

نواة السيتوبلازم
الانفجارات الظلام، وتقريب الظلام، ولا يمكن تمييزها تقريبا من نواة
العولم متمايزة خلايا وضوحاً التغيرات في الشكل النووي، وكثيراً ما تشبه دونات أو على شكل مثل القمر السيتوبلازم أخف وزنا، ويمكن تمييزها
العَدلات الناضجة نواة لوبولاتيد؛ تقريبا لا اتصالات بين الفصيصات السيتوبلازم الخفيفة

الجدول 4-مورفولوجيا الخلايا 32D/ز-CSF آر خلال التمايز بالعدلات. ويلخص الجدول السمات المورفولوجية الرئيسية تمكين تمييز الانفجارات غير ناضجة وخلايا متمايزة العولم العَدلات الناضجة. ويرد وصف الخصائص النووية وحشوية. انظر الشكل 1 للصور التمثيلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

اختيار نموذج تجريبي إحدى القضايا الرئيسية في مجال البحوث. على الرغم من أن يعتقد أن الخلايا الحيوانية والبشرية الأساسية لإنتاج البيانات ذات الصلة الأكثر بيولوجيا، هذه النماذج قد تشمل الشواغل الأخلاقية وغالباً ما تكون مقترنة بإجراءات مكلفة و/أو المتطورة العزلة/استزراع. الخلايا الأولية محدودة في الأرقام ومن الصعب معالجتها وراثيا. وبالإضافة إلى ذلك، تمثل الخلايا الأولية من سكان غير متجانسة تتألف من مختلف أنواع الخلايا التي قد تؤدي إلى تعقيد البيانات الشفوية29. وفي المقابل، خطوط الخلايا توفر مصدرا غير محدود تقريبا من المواد البيولوجية وفعالة من حيث التكلفة، وتسمح بتجاوز القضايا الأخلاقية. ومع ذلك، من المهم أن تأخذ في الاعتبار هذه الخلية تعتبر خطوط نظام تجريبي اصطناعية، التي قد وراثيا وفينوتيبيكالي تختلف عن تلك أنسجة أصل. ومع ذلك، الخلية خطوط عندما جنبا إلى جنب مع غيرها من النهج التجريبي، تقدم نموذجا قيماً لتوليد البيانات استنساخه وبيولوجيا ذات الصلة.

خط الخلية 32D/ز-CSF آر، فضلا عن 32D cl-3 خلايا، راسخة وتستخدم على نطاق واسع في نماذج الثقافة الخلية التمايز بالعدلات مورين14،15،،من2430. مجموعات بحثية عديدة استخدمت هذه الخلايا لتقييم دور الجينات خاصة في ميلوبويسيس، والحصول على النتائج التي ترتبط مع البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام في فيفو نماذج والخلايا الابتدائية16،31. هنا نحن نقدم على بروتوكول للتعامل مع خط الخلية 32D/ز-CSF-R، ومع ذلك، يمكن تطبيق إجراءات مماثلة لاستزراع والتلاعب 32D cl-3 خلايا. من المهم أن نشير إلى أن مجموعات مختلفة من الخلايا cl-3 32D المستخدمة في مختبرات مختلفة الاختلافات الحالية في تناذر، مما يوحي بأن مجموعات مختلفة قد تكون تعمل مع الخاصة بهم سوبكلونيس32. وبناء على هذه الملاحظة، ونحن افترض أن التنوع الجيني وبالمثل قد تكون موجودة في الخلايا 32D/ز-CSF-R، وهذا يحتاج إلى أن تؤخذ في الاعتبار عند مقارنة النتائج التي تم الحصول عليها من مجموعات بحثية مختلفة. هي نماذج ثقافة الخلية بديلة للخلايا 32D/ز-CSF آر السلف المكونة للدم مخلدة خطوط22،،من3334،35،36. هذا الأسلوب مفيد عندما توسع السلف على نطاق واسع المطلوب، على سبيل المثال من أجل دراسة تفاعلات البروتين22. ميزة للخلايا 32D/ز-CSF آر أن المتكفل مخلدة يمكن أن تتولد من أي ماوس المعدلة وراثيا، على الرغم من أن الوقت لإنشاء الخط طويلة إلى حد كبير37. وباﻹضافة إلى ذلك، المناولة والتلاعب بنخاع العظام خلد المتكفل يتطلب خبرة أكثر من الخلايا 32D/ز-CSF آر.

لتعريف القارئ بالطراز 32D/ز-CSF آر، في الجزء الأول من نتائج تمثيلية أثبتنا حركية انتشار وتمايز الخلايا 32D/ز-CSF آر حضور إيل-3 وز-CSF. وعرضت صور الممثل مما يدل على مورفولوجيا الخلايا في ظروف تكاثر إيل-3 وكذلك في نقاط زمنية مختلفة من التمايز المستحثة جكسف. قمنا بتقييم التمايز بالعدلات بتحليل الخصائص المورفولوجية، ولكن أفيد أن 32D cl-3 الخلية التمايز يمكن تحديده من خلال تحليل تدفق سيتوميتريك باستخدام CD11b الخلية علامة السطحية27،31، ،من 3839. لدينا المعرفة والخبرة، لا CD11b upregulated خلال التمايز بيضاء من الخلايا 32D/ز-CSF آر. للتوحيد القياسي، استخدمنا في فحوصات انتشار 32D/ز-CSF آر إيل-3 المتاحة تجارياً. ومع ذلك، لاحظنا أن الخلايا تتكاثر جيدا في 3 إيل الصنع، أنتجت كما هو موضح ب دروبك وزملاؤه22. للحصول على درجة جيدة من السائل الدماغي النخاعي المستحثة ز بالعدلات التمايز، من المهم أن نتذكر أن قدرة تمييز الخلايا 32D/ز-CSF آر يمكن أن تضعف إذا تستزرع خلايا أعلاه بتركيز 1 × 106 خلايا/مل. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تتأثر بدرجة وسرعة من المفاضلة تكوين المصل. لذلك، من المستحسن لاختبار قدرة تمييز الخلايا 32D/ز-CSF آر على عدة دفعات FBS، وقم بتحديد الإصدار الذي يدعم تطوير العَدلات الناضجة عند 6 إلى 9 أيام الثقافة حضور ز-الخدمات القطرية أفضل.

وقدمنا تجربتين تمثيلية تبين الطرق الممكنة لدراسة دور البروتينات خاصة في تمايز النقوي (رقم 3 و رقم 4). أولاً، أظهرنا أن downregulation EVI2B، ترانسميمبراني بروتين في الخلايا المكونة للدم، وأعرب عن يؤدي إلى كتلة من التمايز النقوي في الخلايا 32D/ز-CSF-R. مؤخرا نشرت هذه البيانات من مجموعتنا، بالاقتران مع فحوصات إجراء باستخدام الخلايا الأولية و الفئران بالضربة القاضية Evi2b 16. ثانيا، نحن التحقيق أثر المركز-ABL، بروتين انصهار الناجم عن t(9,22) إزفاء الوراثية (q34; q11)، على تمايز بيضاء من الخلايا 32D/ز-CSF آر. تم تحديد هذا إزفاء أصلاً في المرضى الذين يعانون من سرطان الدم النقوي المزمن40،41. فقد ظهر هذا التعبير من قبل بنك الانصهار أونكوبروتين سابقا 32D cl-3 الخلايا يؤدي إلى تمايز النقوي اعتقال27،28. هنا أثبتنا أن overexpression المركز-ABL قد آثار مماثلة على خلايا 32D/ز-CSF-R. في كلتا المجموعتين من التجارب المعروضة هنا (التي تشمل دوونريجوليشن Evi2b والمركز-ABL overexpression)، أجرى التعديل الوراثي للخلايا 32D/ز-CSF آر عن طريق توصيل الفيروسية، الذي ينتج التعبير الجيني مستقرة. لا يؤثر على خيار النسخ العكسي مقابل تسليم لينتيفيرال الانتشار أو التفريق بين الخلايا 32D/ز-CSF-R. ومع ذلك، لينتيفيرال العدوى أكثر كفاءة من توصيل للفيروسات الرجعية بسبب الوجود لفي الذاتية في الخلايا 32D/ز-CSF آر. ووفقا لخبرتنا، تعداء من هذه الخلايا باستخدام الكواشف محبتين القياسية ليست فعالة. إذا كانت هناك حاجة إلى التعبير بناء عابرة، تعداء انهانسر غير43،42،نهج قابلة للتطبيق44. هنا، وقد عرضنا التلاعب الجيني للخلايا 32D/ز-CSF آر تليها التجارة والنقل الفرز والتحليل للخلايا المصابة بالجملة. ومع ذلك، إذا لزم الأمر، الفرز خلية واحدة فقط يمكن استخدامها لتوليد الحيوانات المستنسخة من خلية واحدة فقط كما ذكر سابقا12،45.

بالإضافة إلى فحوصات الانتشار والتمايز، خلايا 32D/ز-CSF آر قد استخدمت بنجاح تحديد دور بعض البروتينات في الخلية الهجرة والمبرمج13،،من4647،48 . علاوة على ذلك، استخدمت الخط 32D/ز-CSF-R لتحديد النمو المستقل سيتوكين توسط أونكوبروتينس19،20. هو خط آخر كثيرا ما تستخدم لدراسة الاستقلالية سيتوكين با/F3 الخلايا21،49. با/F3 خط خلية مورين تابعة إيل-3 المستمدة من سلالة C3H الماوس، وبالمثل للخلايا 32D/ز-CSF-R. على الرغم من أن كلا النظامين يمكن أن تستخدم لدراسة انتشار سيتوكين مستقلة، التفريق بين الخلايا با/F3 ضعف حضور ز-CSF.

بالإجمال، فإننا نقترح أن الخلايا 32D/ز-CSF آر، على الرغم من أن يفضل أقل من الخلايا الأولية، تقدم العديد من المزايا بما في ذلك انتشار غير محدود القدرات ومعالجة بسيطة. ونحن نعتقد أن لتوليد بيانات موثوق بها، ينبغي أن تستكمل تجارب أجريت في الخلايا 32D/ز-CSF آر مع البيانات التي يحصل عليها باستخدام النهج التجريبي البديلة مثل نماذج مورين والثقافات الأولية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

يشكر المؤلفون البروفيسور رود دلول والبروفيسور إيفو تو لتزويدنا بخط الخلية 32D/ز-CSF آر، والبروفيسور دانيال زاي تينين على تزويدنا بخط الخلية Bosc23. أيد منح الوكالة منحة للجمهورية التشيكية (جاكر 15-03796S وجاكر 17-02177S) لما ي هذا العمل، ودعم من معهد علم الوراثة الجزيئي "أكاديمية العلوم التشيكية" (رفو 68378050) MA-ي، زمالة المملكة المتحدة GA (المشروع رقم 341015) من جامعة تشارلز في براغ لعضو الكنيست، وزمالة المملكة المتحدة GA (المشروع رقم 1278217) من جامعة تشارلز في براغ للمشتريات.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 powder medium Merck, Kenilworth, NJ, USA T 121-10 without NaHCO3, with L-glutamine
DMEM Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 15028
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 31985-047 L-Glutamine, Phenol Red
Fetal bovine serum (FBS) PAA Laboratories (GE Healthcare,Chicago, IL, USA) MT35011CV For differentiation of 32D/G-CSF-R cells
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 10270 Used for culturing HEK293T, NIH3T3, BOSC23 cells
Penicillin Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) P3032
Streptomycin Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) S9137 Streptomycin sulfate salt powder
Gentamicin Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) G1914
murine IL-3 PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA 213-13
human G-CSF PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA 300-23
Polyethylenimine Polyscience, Warrington, PA, USA 23966 Linear, MW 25,000 (PEI 25000)
Polybrene Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) H9268
Trypsin VWR Chemicals, Radnor, PA, USA 0458
EDTA Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) E5134
Crystal violet Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) C0775
Trypan blue Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) T6146
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) D2650
May-Grünwald Giemsa DiaPath, Martinengo, BG, Italy 10802

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bonilla, M. A., et al. Effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor on neutropenia in patients with congenital agranulocytosis. N Engl J Med. 320 (24), 1574-1580 (1989).
  2. Bennett, C. L., Djulbegovic, B., Norris, L. B., Armitage, J. O. Colony-stimulating factors for febrile neutropenia during cancer therapy. N Engl J Med. 368 (12), 1131-1139 (2013).
  3. Lowenberg, B., Downing, J. R., Burnett, A. Acute myeloid leukemia. N Engl J Med. 341 (14), 1051-1062 (1999).
  4. Dong, F., et al. Identification of a nonsense mutation in the granulocyte-colony-stimulating factor receptor in severe congenital neutropenia. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (10), 4480-4484 (1994).
  5. Rosenbauer, F., Tenen, D. G. Transcription factors in myeloid development: balancing differentiation with transformation. Nat Rev Immunol. 7 (2), 105-117 (2007).
  6. Kota, J., Caceres, N., Constantinescu, S. N. Aberrant signal transduction pathways in myeloproliferative neoplasms. Leukemia. 22 (10), 1828-1840 (2008).
  7. Kvinlaug, B. T., et al. Common and overlapping oncogenic pathways contribute to the evolution of acute myeloid leukemias. Cancer Res. 71 (12), 4117-4129 (2011).
  8. Krug, U., Ganser, A., Koeffler, H. P. Tumor suppressor genes in normal and malignant hematopoiesis. Oncogene. 21 (21), 3475-3495 (2002).
  9. Greenberger, J. S., Sakakeeny, M. A., Humphries, R. K., Eaves, C. J., Eckner, R. J. Demonstration of permanent factor-dependent multipotential (erythroid/neutrophil/basophil) hematopoietic progenitor cell lines. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (10), 2931-2935 (1983).
  10. Valtieri, M., et al. Cytokine-dependent granulocytic differentiation. Regulation of proliferative and differentiative responses in a murine progenitor cell line. J Immunol. 138 (11), 3829-3835 (1987).
  11. Dong, F., et al. Mutations in the gene for the granulocyte colony-stimulating-factor receptor in patients with acute myeloid leukemia preceded by severe congenital neutropenia. N Engl J Med. 333 (8), 487-493 (1995).
  12. Jorda, M. A., Lowenberg, B., Delwel, R. The peripheral cannabinoid receptor Cb2, a novel oncoprotein, induces a reversible block in neutrophilic differentiation. Blood. 101 (4), 1336-1343 (2003).
  13. Jorda, M. A., et al. Hematopoietic cells expressing the peripheral cannabinoid receptor migrate in response to the endocannabinoid 2-arachidonoylglycerol. Blood. 99 (8), 2786-2793 (2002).
  14. Abbas, S., et al. Integrated genome-wide genotyping and gene expression profiling reveals BCL11B as a putative oncogene in acute myeloid leukemia with 14q32 aberrations. Haematologica. 99 (5), 848-857 (2014).
  15. Zhuang, D., Qiu, Y., Kogan, S. C., Dong, F. Increased CCAAT enhancer-binding protein epsilon (C/EBPepsilon) expression and premature apoptosis in myeloid cells expressing Gfi-1 N382S mutant associated with severe congenital neutropenia. J Biol Chem. 281 (16), 10745-10751 (2006).
  16. Zjablovskaja, P., et al. EVI2B is a C/EBPalpha target gene required for granulocytic differentiation and functionality of hematopoietic progenitors. Cell Death Differ. 24 (4), 705-716 (2017).
  17. Santini, V., et al. The carboxy-terminal region of the granulocyte colony-stimulating factor receptor transduces a phagocytic signal. Blood. 101 (11), 4615-4622 (2003).
  18. Liu, H., Qiu, Y., Xiao, L., Dong, F. Involvement of protein kinase Cepsilon in the negative regulation of Akt activation stimulated by granulocyte colony-stimulating factor. J Immunol. 176 (4), 2407-2413 (2006).
  19. Kelly, L. M., et al. FLT3 internal tandem duplication mutations associated with human acute myeloid leukemias induce myeloproliferative disease in a murine bone marrow transplant model. Blood. 99 (1), 310-318 (2002).
  20. Pikman, Y., et al. MPLW515L is a novel somatic activating mutation in myelofibrosis with myeloid metaplasia. PLoS Med. 3 (7), e270 (2006).
  21. Schwaller, J., et al. Transformation of hematopoietic cell lines to growth-factor independence and induction of a fatal myelo- and lymphoproliferative disease in mice by retrovirally transduced TEL/JAK2 fusion genes. EMBO J. 17 (18), 5321-5333 (1998).
  22. Drobek, A., et al. PSTPIP2, a Protein Associated with Autoinflammatory Disease, Interacts with Inhibitory Enzymes SHIP1 and Csk. J Immunol. 195 (7), 3416-3426 (2015).
  23. Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. J Virol. 70 (8), 5701-5705 (1996).
  24. Alberich-Jorda, M., et al. C/EBPgamma deregulation results in differentiation arrest in acute myeloid leukemia. J Clin Invest. 122 (12), 4490-4504 (2012).
  25. Calabretta, B., Perrotti, D. The biology of CML blast crisis. Blood. 103 (11), 4010-4022 (2004).
  26. Ren, R. Mechanisms of BCR-ABL in the pathogenesis of chronic myelogenous leukaemia. Nat Rev Cancer. 5 (3), 172-183 (2005).
  27. Schuster, C., et al. The effects of Bcr-Abl on C/EBP transcription-factor regulation and neutrophilic differentiation are reversed by the Abl kinase inhibitor imatinib mesylate. Blood. 101 (2), 655-663 (2003).
  28. Chang, J. S., et al. High levels of the BCR/ABL oncoprotein are required for the MAPK-hnRNP-E2 dependent suppression of C/EBPalpha-driven myeloid differentiation. Blood. 110 (3), 994-1003 (2007).
  29. Velten, L., et al. Human haematopoietic stem cell lineage commitment is a continuous process. Nat Cell Biol. 19 (4), 271-281 (2017).
  30. Jorda, M. A., Rayman, N., Valk, P., De Wee, E., Delwel, R. Identification, characterization, and function of a novel oncogene: the peripheral cannabinoid receptor Cb2. Ann N Y Acad Sci. 996, 10-16 (2003).
  31. Wurm, A. A., et al. Disruption of the C/EBPalpha-miR-182 balance impairs granulocytic differentiation. Nat Commun. 8 (1), 46 (2017).
  32. Agliano, A. M., et al. On chromosomal instability: what is the karyotype of your 32D CI3 cell line. Blood. 95 (11), 3636-3637 (2000).
  33. Wang, G. G., et al. Quantitative production of macrophages or neutrophils ex vivo using conditional Hoxb8. Nat Methods. 3 (4), 287-293 (2006).
  34. Houston, I. B., Huang, K. J., Jennings, S. R., DeKoter, R. P. PU.1 immortalizes hematopoietic progenitors in a GM-CSF-dependent manner. Exp Hematol. 35 (3), 374-384 (2007).
  35. Calvo, K. R., Sykes, D. B., Pasillas, M., Kamps, M. P. Hoxa9 immortalizes a granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-dependent promyelocyte capable of biphenotypic differentiation to neutrophils or macrophages, independent of enforced meis expression. Mol Cell Biol. 20 (9), 3274-3285 (2000).
  36. Calvo, K. R., Sykes, D. B., Pasillas, M. P., Kamps, M. P. Nup98-HoxA9 immortalizes myeloid progenitors, enforces expression of Hoxa9, Hoxa7 and Meis1, and alters cytokine-specific responses in a manner similar to that induced by retroviral co-expression of Hoxa9 and Meis1. Oncogene. 21 (27), 4247-4256 (2002).
  37. Fossati-Jimack, L., et al. Phagocytosis is the main CR3-mediated function affected by the lupus-associated variant of CD11b in human myeloid cells. PLoS One. 8 (2), e57082 (2013).
  38. Schwable, J., et al. RGS2 is an important target gene of Flt3-ITD mutations in AML and functions in myeloid differentiation and leukemic transformation. Blood. 105 (5), 2107-2114 (2005).
  39. Worch, J., et al. The serine-threonine kinase MNK1 is post-translationally stabilized by PML-RARalpha and regulates differentiation of hematopoietic cells. Oncogene. 23 (57), 9162-9172 (2004).
  40. Rowley, J. D. Letter: A new consistent chromosomal abnormality in chronic myelogenous leukaemia identified by quinacrine fluorescence and Giemsa staining. Nature. 243 (5405), 290-293 (1973).
  41. Stam, K., et al. Evidence of a new chimeric bcr/c-abl mRNA in patients with chronic myelocytic leukemia and the Philadelphia chromosome. N Engl J Med. 313 (23), 1429-1433 (1985).
  42. Holly, S. P., Larson, M. K., Parise, L. V. The unique N-terminus of R-ras is required for Rac activation and precise regulation of cell migration. Mol Biol Cell. 16 (5), 2458-2469 (2005).
  43. Pierce, J. H., et al. Macrophage-colony-stimulating factor (CSF-1) induces proliferation, chemotaxis, and reversible monocytic differentiation in myeloid progenitor cells transfected with the human c-fms/CSF-1 receptor cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (15), 5613-5617 (1990).
  44. Pierce, J. H., et al. Signal transduction through the EGF receptor transfected in IL-3-dependent hematopoietic cells. Science. 239 (4840), 628-631 (1988).
  45. Oomen, S. P., et al. Somatostatin modulates G-CSF-induced but not interleukin-3-induced proliferative responses in myeloid 32D cells via activation of somatostatin receptor subtype 2. Hematol J. 2 (5), 322-329 (2001).
  46. Oomen, S. P., et al. Somatostatin is a selective chemoattractant for primitive (CD34(+)) hematopoietic progenitor cells. Exp Hematol. 30 (2), 116-125 (2002).
  47. Nogami, A., et al. FLT3-ITD confers resistance to the PI3K/Akt pathway inhibitors by protecting the mTOR/4EBP1/Mcl-1 pathway through STAT5 activation in acute myeloid leukemia. Oncotarget. 6 (11), 9189-9205 (2015).
  48. Rodel, J. E., Link, D. C. Suppression of apoptosis during cytokine deprivation of 32D cells is not sufficient to induce complete granulocytic differentiation. Blood. 87 (3), 858-864 (1996).
  49. Daley, G. Q., Baltimore, D. Transformation of an interleukin 3-dependent hematopoietic cell line by the chronic myelogenous leukemia-specific P210bcr/abl protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 85 (23), 9312-9316 (1988).

Tags

علم الأحياء التنموي، 132 قضية، خلايا 32D/ز-CSF آر، الخلايا السليفة النقوي موريني، ثقافة السائل، والتمايز، العَدلات، انتشار، السيتوكينات، إيل-3، ز-CSF
انتشار وتمايز السلائف النقوي موريني 32D/ز-CSF-R الخلايا
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zjablovskaja, P., Danek, P.,… More

Zjablovskaja, P., Danek, P., Kardosova, M., Alberich-Jorda, M. Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells. J. Vis. Exp. (132), e57033, doi:10.3791/57033 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter