Summary
本文介绍了培养小鼠髓质前体32维/G-脑脊液 R 细胞系的详细规程, 并进行了病毒感染, 并进行了增殖和分化测定。该细胞系适合研究髓细胞发育, 以及兴趣基因在髓细胞生长和中性分化中的作用。
Abstract
对造血干细胞和祖细胞生物学的理解对再生医学和血液病理学的治疗具有重要意义。尽管可以使用体内模型或初级区域性获取最相关的数据, 但造血干细胞和祖细胞的低丰度大大限制了适当技术的研究。因此, 使用细胞线可以充分生产生物材料, 以执行需要大量细胞数的筛查或化验。在这里, 我们提供了一个详细的描述, 读数, 和解释的增殖和分化的检测, 用于调查过程中涉及 myelopoiesis 和中性分化。这些实验采用32维/克-脑脊液-R 细胞因子依赖的小鼠髓细胞系, 具有在 IL-3 存在时增殖的能力, 并能分化为 g 脑脊液。我们为处理32维/克-脑脊液 R 细胞提供了最优化的协议, 并讨论了可能危及所描述的化验结果和预期效果的主要缺陷和缺点。此外, 本文还包含了慢病毒载体和逆转录病毒的生产、滴定和转导32维/克-脑脊液 R 细胞的协议。我们证明, 这些细胞的遗传操作可以用来成功地进行功能和分子研究, 这可以补充取得的结果与原发性造血干细胞和祖细胞或在体内模型。
Introduction
造血干细胞和祖细胞为生物体提供了大量成熟的细胞, 包括来自髓系谱系 (中性粒、嗜酸性细胞、嗜碱性细胞和单核) 的干细胞。推动从造血干细胞生产髓细胞的过程被称为 myelopoiesis, 适当地生产成熟的髓细胞以响应不断变化的需求是适当应对压力的有机体的先决条件。条件, 如感染和失血。成熟髓细胞的生产不足可能导致无法消除病原体, 减少凝血和其他危及生命的条件1,2。此外, 髓系发育的改变也可能与血液恶性肿瘤有关, 如急性髓细胞白血病 (AML)3。myelopoiesis 的改变可能是由于各种原因造成的, 例如细胞表面受体的缺陷4、转录因子5、受损信号通路6的改变表达、形成的突变激活癌基因7, 或抑癌基因的失活8。
开发了各种方法来研究髓系发育, 并评估了特定基因改变在这一过程中的作用。用于研究 myelopoiesis 的常用方法涉及原代细胞和转基因小鼠。虽然这些模型允许获取生物相关的数据, 但它们有一定的局限性。使用初级细胞遇到有限的细胞数量和限制的文化周期, 缩小改变基因表达和随后的生物或生化分析的可能性。转基因小鼠成本高昂, 需要合理程度的生物合理性。此外, 使用体内模型也增加了一定程度的复杂性, 从而理解了在给定过程中感兴趣的基因的作用。因此, 需要采取其他办法来规避这些限制。细胞系具有无可争辩的优势: (1) 它们具有无限的增殖能力, 允许产生足够的物质进行生物化学和生物研究, (2) 它们容易受到基因的操控 (击倒, 挖空,过度表达), (3) 成本相对较低, (4) 它们允许某些实验方法所需的生物简化程度。
父母 IL-3 (Interleukin-3) 依赖32D 细胞系成立于1983年由 Greenberger 和同事通过感染的骨髓细胞从 C3H/HeJ 鼠与朋友小鼠白血病病毒9。文献中描述了几个32D 克隆: cl-239、cl-310和 cl-1011。32D cl-3 细胞在 IL-3 中增殖, 并经粒细胞集落刺激因子 (CSF)10治疗中性分化。相反, 32D cl-10 细胞, 而 IL-3 依赖, 最初并没有区别于对 G 脑脊液治疗的反应。在 1995年, Touw 博士 retrovirally 转基因 32D cl-10 细胞与野生类型和突变形式的 g-脑脊液受体 (g 脑脊液 R), 以确定该受体的功能重要区域11。这项研究结果产生的32维/克脑脊液 R 细胞, 这是同样依赖于 IL-3, 但在6至10天后, 替换 IL-3 与 G 脑脊液, 细胞停止增殖和不可逆转地分化成成熟的中性粒细胞。这些特性使 32D cl-3 和32维/克脑脊液 R 细胞简化模型的小鼠中性分化, 可由两个明确的增长和分化因子-IL-3 和 G 脑脊液。在过去的几十年中, 多组使用了32维/克脑脊液 R 细胞来研究特定基因在培养过程中细胞增殖和分化中的作用12,13,14,15,16, 并研究 G CSF 信号17,18。重要的是, 使用该细胞线获得的结果与主要细胞和转基因小鼠的数据相关,16,19,20,21。因此, 我们认为, 32 维/克脑脊液 R 细胞作为一种广泛使用和建立良好的模型, 是研究髓样分化的一个有价值的系统, 可与处理这个问题的其他方法并行使用。
在这里, 详细的协议描述处理32维/克-脑脊液 R 细胞线, 包括扩展, 分化, 并评估这些细胞的增殖和分化。提供了32维/克-脑脊液 R 细胞的基因修饰的详细信息, 可以采用逆转录病毒或慢病毒载体转导, 以及病毒滴定的协议。此外, 还提供了一些表明潜在应用32维/克-脑脊液 R 细胞的典型结果。
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Protocol
注: 以下是描述32维/克-脑脊液 R 细胞的扩张、分化和转导的步骤。
1. 准备
- 媒体准备
- 准备250毫升培养基: RPMI (罗斯威尔公园纪念研究所) 1640 中辅以10% 种热灭活 (胎牛血清) 和小鼠 IL-3 (10 ng/毫升)。
- 或者, 使用自制的 IL-3。生产国产 IL-3, 传感器 HEK293 细胞 IL-3 表达载体和收集 IL-3 含有上清22。
注: 抗生素, 如青霉素 G (100 毫升/ml), 链霉素 (100 µg/毫升), 和庆大霉素 (40 µg/毫升), 可用于细胞培养在任何步骤的议定书, 除非另有说明。
- 或者, 使用自制的 IL-3。生产国产 IL-3, 传感器 HEK293 细胞 IL-3 表达载体和收集 IL-3 含有上清22。
- 准备50毫升的分化培养基: RPMI 1640 培养基辅以10% 的血清, 人的 G 脑脊液 (100 ng/毫升)。
注: (重要) 并非所有血清批次都支持32维/克-脑脊液 R 细胞的分化。实验开始之前, 测试不同批次的血清。建议测试至少4种不同的批次, 并选择最佳的基础上的能力, 32 维/克脑脊液 R 细胞区分。请参阅下面的32维/克-CSF 鉴别协议。 - 准备10毫升的冷冻培养基: RPMI 1640 培养基辅以40% 的血清, 10% 二甲基亚砜。
- 准备250毫升培养基: RPMI (罗斯威尔公园纪念研究所) 1640 中辅以10% 种热灭活 (胎牛血清) 和小鼠 IL-3 (10 ng/毫升)。
- 逆转录病毒的生产
- 将 Bosc23 细胞 (6 x 106) 的单个细胞悬浮在16厘米培养皿中, 并在18毫升的 DMEM (Dulbecco 的修饰鹰的培养基) 中培养, 其中含有10% 个血清, 直到培养的融合达到 80% (24 h)。
注意: 细胞应该以单层生长, 而不是在培养中形成团簇。可以使用不同的方法执行单元格计数 (对此处提供的其他协议有效)。在样品数量较少的情况下, 建议使用 Bürker 室在显微镜下进行手动计数。在这种情况下, 使用台盼蓝来排除死细胞。混合单元1:1 与0.4% 台盼蓝在 PBS。要对大量样品进行计数, 可以使用自动单元计数器。 - 结合40µg 的逆转录病毒构造 (如 MSCV), 20 µg 的 pCL-生态 (包装载体)23, 80 µl 的裴 (聚乙烯亚胺) 和2毫升的减少血清培养基 (如, 无抗生素)。在室温下 (RT) 孵育这种混合物20分钟。
- 小心地取代 Bosc23 细胞培养基与16毫升 DMEM 补充2% 的血清。预热中至37°c 使用前。
注: 在转染过程中不要使用抗生素, 因为它可以降低转染效率。 - 添加1.2.2 中制备的混合物。滴状和仔细的 Bosc23 文化, 并孵化4小时在37摄氏度。由于裴毒性, 限制孵化到少于6小时。
- 孵化后, 改变 Bosc23 培养基至18毫升预热 DMEM, 含10% 的血清, 并培养48小时在37摄氏度的细胞。将菜肴放在生物安全2级实验室, 从这一步骤保持在这里, 并遵循标准的安全程序。
- 收集 Bosc23 培养基 (含有 ecotropic 逆转录病毒粒子), 使用25毫升血清吸管进入50毫升圆锥管, 并存储在4摄氏度。
注: (重要) 转染效率应达到 90%, 以产生高效价病毒。 - 加入18毫升预热 DMEM 10% Bosc23 细胞, 培养24小时。
- 重复步骤1.2.6。
注: 1.2.6 和1.2.8 的逆转录病毒上清液, 一旦达到相同的温度 (4 摄氏度), 就可以进行汇集, 以保持病毒的完整性。 - 为了避免病毒上清液中的 Bosc23 污染, 在4摄氏度时, 将收集到的病毒在 1500 x g 处旋转10分钟。整除病毒, 用干冰或液氮冷冻, 并贮存在-80 摄氏度。然而, 请注意, 新制备的病毒在感染效率方面比冷冻储存的质量高。
注意: (重要) 避免病毒重复冰冻/解冻, 因为它导致病毒的降解。
- 将 Bosc23 细胞 (6 x 106) 的单个细胞悬浮在16厘米培养皿中, 并在18毫升的 DMEM (Dulbecco 的修饰鹰的培养基) 中培养, 其中含有10% 个血清, 直到培养的融合达到 80% (24 h)。
- 慢病毒北疆生产
- 单细胞悬浮 HEK293T (人胚肾 293T) 细胞 (6 x 106) 在 16 cm 培养皿和培养在18毫升 DMEM 包含10% 个血清, 直到文化的融合达到 80% (24 h)。
注意: 细胞应该以单层生长, 而不是在培养中形成团簇。 - 结合15µg 的慢病毒载体构造 (如 pGhU6), 包装质粒 pCMVdR8.74 (编码为插科打诨/波兰, 12 µg) 和 pMD2. VSVG (编码为 VSV G, 1.4 µg), 85.2 µL 裴, 2 毫升的减少血清培养基 (没有抗生素)。在 RT 中孵化这种混合物20分钟。
- 小心地更换 HEK293T 培养基与16毫升的 DMEM 补充2% 的血清。预热中至37°c 使用前。在转染过程中不要使用抗生素, 因为它可以降低转染效率。
- 小心地将1.3.2 中制备的混合物放到 HEK293T 细胞培养中, 在37摄氏度孵化4小时。将潜伏期限制在6小时以内以防止裴毒性。
- 改变培养基到18毫升预热 DMEM 10%, 培养细胞48小时在37摄氏度。将菜肴放在生物安全2级实验室, 从这一步骤保持在这里, 并遵循标准的安全程序。
- 收集 HEK293T 介质 (含有 amphotropic 慢病毒载体粒子), 使用25毫升血清吸管进入50毫升圆锥管, 并将其存储在4摄氏度。
注: (重要) 转染效率应达到 90%, 以产生高效价病毒。 - 小心地添加18毫升预热 DMEM 10% 的 HEK293T 细胞。在37摄氏度培养24小时。
- 重复步骤1.3.6。
注: 慢病毒载体上清液从1.3.6 和1.3.8 可以汇集, 一旦他们达到相同的温度 (4 °c), 以保持病毒的完整性。 - 为了避免病毒上清的 HEK293T 细胞的污染, 旋转收集的病毒在 1500 x g 10 分钟4摄氏度。整除病毒, 用干冰或液氮冷冻, 并储存在-80 摄氏度。但是, 请注意, 新制备的病毒在感染效率方面比冷冻储存的质量高。
注意: (重要) 避免病毒重复冰冻/解冻, 因为它导致病毒的降解。
- 单细胞悬浮 HEK293T (人胚肾 293T) 细胞 (6 x 106) 在 16 cm 培养皿和培养在18毫升 DMEM 包含10% 个血清, 直到文化的融合达到 80% (24 h)。
- 含有 GFP 报告的病毒滴定法
- 种子 1 x 105 NIH/3T3 细胞在300µL 的 DMEM 10% 的血清, 每井到24井板。7口井将被用来效价一种病毒。
- 解冻病毒在37°c, 并添加 1, 5, 10, 50, 100, 500 µL 病毒的 NIH/3T3 文化。不要将任何病毒添加到负控制好。培养细胞在病毒存在48小时在37摄氏度。
- 收获 NIH/3T3 细胞使用30µL 胰蛋白酶/EDTA (乙二胺二乙酸) (0.25% 胰蛋白酶, 0.01% EDTA 在 PBS) 和放置细胞在250µL PBS 在一个外地活动 (荧光活化细胞分拣) 管。
- 通过流式细胞术在每个示例24中确定 GFP+单元格的频率。通过添加活性染料 (如赫斯特 33258) 排除死细胞。
- 计算 gfp+单元格的总数 (根据被镀的单元格数和 gfp+单元格的百分比), 并将它们与用于感染的病毒量进行绘制。
注: (重要) 当应用大剂量病毒时, 感染的效率达到高原。因此, 重要的是要估计的效价基于病毒浓度的感染效率发生在一个线性范围 (如表 1中所示)。GFP+单元格的数量指示特定病毒卷中功能性病毒粒子 (TU 转换单位) 的数量。重新计算每毫升的土数。
- 含有嘌呤霉素报告的病毒滴定法
- 种子 5 x 104 NIH/3T3 细胞在3毫升的 DMEM 10%, 每井在6井板;使用6口井来滴出一种病毒。文化隔夜在37°c。
- 第二天稀释病毒, 如表 2所示。为了稀释病毒, 使用预热后的 DMEM 10% 的血清。不要旋涡。
- 从 NIH/3T3 细胞中去除培养基, 加入1毫升稀释病毒。
- 孵化过夜在37摄氏度。
- 用2毫升预热的 DMEM 10% 的血清, 轻轻地取代含有病毒的培养基, 并在37摄氏度一夜之间孵化。
- 轻轻地取代 NIH/3T3 培养基与2毫升预热 DMEM 10% 血清含嘌呤霉素 (2 µg/毫升)。
- 文化在37°c 和仔细刷新培养基与嘌呤霉素每3天或当中等变成黄色。
- 感染后10-12 天, 从各井中抽出培养基, 用 PBS 轻轻冲洗。
- 着色与1毫升水晶紫罗兰溶液 (0.5% 水晶紫在20% 乙醇和 dH2O), 2 分钟在 RT, 并且仔细洗涤与 PBS 两次。
- 计数蓝色殖民地出现在每个井在显微镜之下 (放大 X4)。在负控制井中不应观察到菌落。
- 计算考虑稀释因子的土/毫升的总数量。
2. 扩展和维护32维/克-脑脊液 R 细胞
- 如果32维/克-脑脊液 R 细胞被冷冻, 采取一个整除和解冻细胞在37°c 水浴1分钟, 并将细胞从瓶子直接倒入10毫升的预预热 RPMI 1640 培养基补充10% 毫升的管。反转管3次, 旋转细胞向下 400 x g. 在含有培养基的 IL-3 中移除上清和并用重悬细胞, 浓度为 0.3 x10 6 细胞/毫升。
- 最佳细胞生长浓度为 0.25-0. 5 x 106细胞/毫升。每2天拆分单元格, 使其浓度为 0.1-0.2 x 106单元格/毫升。
注: (重要) 32 维/克-脑脊液 R 细胞可能部分丧失其分化的能力, 如果生长到浓度高于 1 x 106细胞/毫升。因此, 在时间上分裂32维/克-脑脊液 R 细胞是非常重要的。 - 根据需要, 冷冻和储存细胞整除数长时间在-80 °c 或液态氮。向下旋转 3 x 106单元格, 移除上清, 并在1毫升的冷冻培养基中并用重悬。把管子放在冷冻容器里-80 摄氏度。对于长期存储, 将单元格重定位到液氮。
3. 转导32维/克-脑脊液 R 细胞
- 在 0.3 x 106细胞/毫升浓度下, 将32维/克脑脊液 R 细胞转化为6井板。
- 添加适当数量的病毒达到10和40之间的语言 (感染多样性)。
注意: 更高的教学语言将导致 GFP+细胞的百分比增加, 以及感兴趣基因表达的更高层次。示例: 感染 0.3 x 106细胞, 其语言为 10;3 x 106 TU 将需要添加到32维/克-脑脊液 R 细胞。 - 添加凝聚胺到最终浓度8µg/毫升和孵化6小时37摄氏度。或者, 执行一个自旋接种过程: 离心机在 1200 x g 90 分钟在30°c 在培养的板材使用摆动铲斗转子, 并且孵育 3 h 在37°c。
- 收集细胞, 转移到一个15毫升管, 并在 450 x g 旋转5分钟 (4 °c)。
- 放弃上清, 并用重悬颗粒细胞在6毫升培养基, 放置在 T25 细胞培养瓶, 并在37摄氏度的文化。
- 48小时后, 收获细胞和旋转他们在 450 x g 5 分钟 (4 °c)。放弃上清。
- 在 gfp 记者的情况下: 将单元格放在 PBS 的500µL 中, 并使用流式细胞仪排序 GFP+单元格。如果嘌呤霉素记者包含向量: 放置细胞在培养基中含有2µg/毫升的嘌呤霉素。
- 根据需要展开单元格以进行进一步的分析和实验。
注: (可选) 转基因细胞可以冻结在冷冻容器中, 在-80 摄氏度, 并进一步储存在液氮中。
4. 32 维/克-脑脊液-R 细胞增殖试验
- 评估增殖率 0.2 x 106细胞在1毫升培养基和孵化隔夜在37°c。
- 第二天计数单元格数, 并将其稀释回浓度为 0.2 x 106细胞/毫升使用培养基。孵化过夜在37摄氏度。使用表 3保存用于日常区域性的单元格浓度和稀释的记录。
- 重复步骤 4.2, 因为需要评估扩散的天数。
注: 增殖测定的长度将取决于感兴趣基因的影响。如果有强烈的表型, 8-9 天可能足以观察到一个显著的效果 (请参见图 3A)。然而, 在轻度表型的情况下, 可能需要较长的时间段。 - 通过根据表 3中的说明进行扩散曲线来评估细胞生长。
5. 32 维/克-脑脊液-R 细胞分化试验
- 清洗 0.2 x 106 32 维/克-脑脊液 R 细胞两次与 RPMI 培养基无细胞因子。
注: 在添加 G 型脑脊液之前, 洗涤步骤是重要的, 因为存在残留 IL-3 可能抑制分化。 - 将细胞在1毫升分化培养基中 (含有 100 ng/毫升) 在24井/盘中, 导致细胞浓度为 0.2 x 106细胞/毫升 (天 0)。文化隔夜在37°c。
- 如上所示的单元格/mL 数 (步骤 1.2.1)。
- Cytospin 2-5 x 104单元玻璃滑动 (76 毫米 X 26 毫米) 使用离心机与必要的适配器在 20 x g。
- 在24井/盘 (天 1) 中, 刷新分化培养基和平板细胞, 浓度为 0.2 x 105细胞/毫升。扔掉旧盘子, 第二天用新盘子的步骤5.6 进行。
- 在2到7天, 重复步骤5.3 到5.5。按照步骤4中的说明, 评估在脑脊液中出现的细胞增殖。
注意: (重要) 在分化过程中, 细胞增殖减慢, 因此, 在3到4天的时间内, 在脑脊液的存在, 它是足够的培养细胞在较高浓度。 - 根据细胞形态学评估32维/克脑脊液 R 细胞的分化状态。
- 固定单元从步骤5.4 在甲醇5分钟的 RT 和保持幻灯片的空气干燥。
注: 从0天到7的幻灯片可以存储在 RT, 并同时固定。同样, 他们也可以保持在 RT 在固定后较长的时间。 - 染色细胞使用可能 Grünwald 姬姆萨染色后制造商的协议。
- 使用显微镜和放大 X40 可视化染色细胞。
- 使用图 1上的说明性图片和表 4中的描述, 量化爆炸、intermediately 分化细胞和成熟粒度的数量。
- 固定单元从步骤5.4 在甲醇5分钟的 RT 和保持幻灯片的空气干燥。
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Representative Results
32维/G-脑脊液 R 细胞的增殖与分化
为评估32维/g-脑脊液 r 细胞在促增殖和诱导分化条件下的增殖, 分别在含有 IL-3 和脑脊液的培养基中培养出32维/克脑脊液 r 细胞。据观察, 在含有培养基的 IL-3 中培养的细胞 (10 ng/毫升) 大约每 24 h (图 2A) 分。在更换 IL-3 时 (100 ng/毫升) 的增殖逐渐减慢并在4天后停止 (图 2A)。此外, Grünwald 姬姆萨染色的 cytospun 细胞在 G 型脑脊液存在下培养细胞的分化状态。结果表明, 在0天 (在 G-脑脊液治疗开始之前), 细胞呈现出一种不成熟的 myeloblast 状形态, 其特征是大核和深胞浆 (图 2B)。在处理过程中, 核尺寸减少, 原子核形状改变为月亮形或甜甜圈形状。进一步, 细胞质扩大, 并失去了深紫色的颜色。经过6天的治疗与 G 脑脊液, 细胞呈现完全中性分化的迹象, 其特点是肿块核和淡紫色细胞质 (图 2B)。32维/克-脑脊液 R 细胞的分化是一个渐进的过程, 并不是所有的细胞都以同样的速度向成熟的白细胞进化。在分化过程 (即爆炸、intermediately 分化细胞和中性粒细胞) 的不同阶段, 细胞的量化表现在图 2B中。
小鼠Evi2b击倒块中性32维/克-脑脊液 R 细胞的分化
为将 EVI2B (Ecotropic 病毒集成站点 2B) 下调在32维/克-脑脊液 R 细胞中, 设计了3个EVI2B靶向 (Sh2、Sh3、Sh4) 和1个非目标非静音控制 (NSC1) shRNAs;这些克隆成一个携带 GFP 记者16的慢病毒载体向量。32维/克-脑脊液 R 细胞转基因控制和Evi2b-沉默 shRNAs 使用的语言10。转导后两天, GFP+ (转基因) 细胞进行了排序, 并展开进一步的实验。在 Sh3 和 Sh4 的情况下, EVI2B 损耗达到 80%, 但是 Sh2 无法有效 downregulate EVI2B 蛋白质水平, 因此被用作非静音控制 2 (NSC2) 的附加控制。在转导后四天, 在 Evi2b 的存在下进行分化和增殖检测, 并评估了下调在这些过程中的作用. 据观察, Evi2b耗尽的细胞 (Sh2、Sh3) 在 GCSF 存在的情况下持续细胞增殖, 而控制细胞 (NSC1 和 NSC2) 减少了4天左右的增殖 (图 3A)。此外, 与控制单元相比, Evi2b静音32维/克-脑脊液 R 细胞产生的中间和成熟的中性粒度较低 (图 3B)。值得注意的是, 细胞转基因与 NSC2, 这表明了较差的Evi2b击倒效率, 也显示了轻微减少的数量成熟的中性粒细胞 (图 3B)。这些数据最近发布了16。
BCR 融合蛋白对32维/克-脑脊液 R 细胞中性分化的损害
结果表明, BCR 融合蛋白损害髓细胞分化, 导致髓祖细胞的广泛扩张, 导致慢性髓系白血病急性期造血功能衰竭25,26。先前的研究表明, 在 32D cl-3 细胞中强迫表达 BCR, 导致一大块中性粒细胞分化27,28。因此, 我们研究了是否有类似的结果可以得到与32维/克脑脊液 R 细胞线。32维/克-脑脊液 R 细胞转基因与 BCR 或控制 MSCV 逆转录病毒载体携带 GFP 记者 (语言 = 20)。转导后2天, GFP+单元格在包含介质的 IL-3 中进行了2周的排序和扩展。其次, 在脑脊液的存在下进行分化测定。我们观察到, 在0天 (将细胞转移到含 G 型脑脊液中), MSCV 控制和 BCR 表达的32维/G-脑脊液 R 细胞呈现相似的形态学, 主要表现为未成熟的髓样爆炸细胞 (图 4)。然而, 我们证明, 当空的载体转基因控制细胞接受中性分化后6天的 G 脑脊液治疗 (产生11.5% 成熟的中性粒细胞和 56.4% intermediately 分化细胞), 没有成熟的中性粒细胞是由 BCR-转基因32维/克-脑脊液 R 单元生成的 (图 4)。在 BCR 的表达细胞中, 不成熟的爆炸率与 IL-3 条件下的爆炸百分率保持一致。
图1。有代表性的图像, 不同的32维/克脑脊液 R 细胞形态学.32维/克-脑脊液 R 细胞可以被归类为爆炸, intermediately 分化细胞和成熟的中性粒细胞。有关说明, 请参见表 4 。
图2。32维/克-脑脊液 R 细胞的增殖和分化.(A)在 10 ng/毫升 IL-3 (黑线) 或 100 GCSFR (蓝线) 中含有培养基的32维/细胞增生。X 轴表示治疗天数。Y 轴以对数刻度 (日志2) 显示, 并指示单元格数 x 105。结果代表3项独立实验的平均值。误差线表示标准偏差。(B)在含 G 型脑脊液中32维/克-脑脊液 R 细胞的分化 (100 ng/毫升)。在上部板, 饼图显示了爆炸 (黑色), intermediately 分化细胞 (粉红色) 和中性粒细胞 (红色) 在0、2、4和6天的 G 脑脊液治疗后的百分比。下部面板包含有代表性的 cytospun 细胞的图像, 从各自的时间点染色的可能-Grünwald 姬姆萨。每个时间点的最小100个细胞被评估。
图3。Evi2b沉默块中性32维-脑脊液 R 细胞的分化。(A)增殖的Evi2b静音 (橙色线) 和控制 (黑线) 32 维/克-脑脊液 R 细胞在 100 ng/毫升脑脊液中含有培养基。X 轴表示治疗天数。Y 轴以对数刻度 (日志2) 显示, 并指示单元格数 x 105。结果显示3项独立实验的代表性结果。(B)使用姬姆萨细胞的 Grünwald cytospun 染色法, 对32维/克脑脊液 R 细胞转基因与Evi2b-沉默和控制 shRNAs 在含 G 型脑脊液中 (100 ng/毫升) 的分化进行评估。在上部板, 饼图显示了爆炸的百分比 (黑色), intermediately 分化细胞 (粉红色) 和中性粒细胞 (红色) 在文化中。下部板包含 cytospun 细胞的代表性图片。分化被评估在7天的分化。每个条件至少有100个细胞被评估。
图4。过度表达 BCR 的融合蛋白会损害32维/克-脑脊液 R 细胞的分化.32维/克-脑脊液-R 细胞的分化转基因在含 G 型脑脊液中的控制 MSCV 或 BCR 的融合基因 (100 ng/毫升)。上部饼图显示了爆炸的比例 (黑色), intermediately 分化细胞 (粉红色) 和中性粒细胞 (红色) 在6天的分化。下部的面板显示有代表性的图片 cytospun 细胞染色的可能-Grünwald 姬姆萨。每个时间点至少评估100个细胞。
| 病毒 V [µL] | 电镀单元数 | % GFP+ | GFP+单元格计数 | 线性? | 涂/毫升 | 平均 (土/毫升) |
| 1 | 100 000 | 1.83 | 1 830 | 是的 | 1 830 000 | 2 350 000 |
| 5 | 100 000 | 12。9 | 12 900 | 是的 | 2 580 000 | |
| 10 | 100 000 | 26。4 | 26 400 | 是的 | 2 640 000 | |
| 50 | 100 000 | 71。4 | 71 400 | 不 | ||
| 100 | 100 000 | 85。1 | 85 100 | 不 | ||
| 500 | 100 000 | 85。6 | 85 600 | 不 |
表1。含有载体的 GFP 报告病毒滴度测定。使用 MSCV 逆转录病毒获得的数据的示例, 并进行计算以估计病毒滴度。病毒滴度是根据在应用一定数量的病毒时获得的 GFP+细胞数量计算的。感染病毒的数量应与用于测量的 GFP+单元格的百分比线性相关。转换单位。
| 管 | 管材说明 | DMEM+10%fbs | 病毒 | 总容积 | 稀释系数 |
| (µL) | (µL) | (µL) | |||
| 1 | 稀释1 | 1485 | 15µL 病毒性股 | 1500 | 1 x 102 |
| 2 | 稀释2 | 1350 | 150µL 管1 | 1500 | 1 x 103 |
| 3 | 稀释3 | 1350 | 150µL 管2 | 1500 | 1 x 104 |
| 4 | 稀释4 | 1350 | 150µL 管3 | 1500 | 1 x 105 |
| 5 | 稀释5 | 1350 | 150µL 管4 | 1500 | 1 x 106 |
表2。含载体嘌呤霉素的病毒滴度测定。病毒稀释策略, 以确定嘌呤霉素中含有载体的病毒滴度。表指示如何准备5管 (1-5), 其中包含病毒储存的连续稀释。管1包含1485µL DMEM + 10% 的血清和15µL 的产生的病毒, 提供 1 x 102稀释病毒。管2包含1350µL DMEM + 10% 血清和150µL 1 x 102稀释病毒 (管 1), 提供 1 x 103稀释病毒。管3包含1350µL DMEM + 10% 血清和150µL 1 x 103稀释病毒 (管 2), 提供 1 x 104稀释病毒。管4包含1350µL DMEM + 10% 血清和150µL 1 x 104稀释病毒 (管 3), 提供 1 x 105稀释病毒。管5包含1350µL DMEM + 10% 血清和150µL 1 x 105稀释病毒 (管 4), 提供 1 x 106稀释病毒。1毫升从管子1-5 用于滴度病毒。
| 单元格计数(x = 每个 ml 的单元格数) | |||||||
| 0天 | 1天 | 2天 | 3天 | 4天 | 5天 | 6天 | |
| 样品1 | x0 | x1 | x2 | x3 | x4 | x5 | x6 |
| 稀释 (d)(y = 用于 replating 的细胞体积 [ml]; z = 最后体积 [ml]) | |||||||
| 0天 | 1天 | 2天 | 3天 | 4天 | 5天 | 6天 | |
| 样品1 | d0= 1 | d1= y1/z1 | d2= y2/z2 | d3= y3/z3 | d4= y4/z4 | d5= y5/z5 | |
| 单元格总计数 | |||||||
| 0天 | 1天 | 2天 | 3天 | 4天 | 5天 | 6天 | |
| 样品1 | x0 | x1 /d0 | x2/d1 | x3/d2/d1 | x4/d3/d2/d1 | x5/d4/d3/d2/d1 | x6/d5/d4/d3/d2/d1 |
表3。增长曲线生成.该表描述了评估32维/克脑脊液 R 细胞增殖率所需的方程式。
| 核 | 细胞质 | |
| 爆炸 | 深色, 圆形 | 黑暗, 几乎无法区分从原子核 |
| Intermediately 分化细胞 | 核形状的明显变化, 通常是甜甜圈状或像月亮一样的形状 | 更轻, 有区别的细胞质 |
| 成熟中性粒细胞 | 肿块核;小叶之间几乎没有连接 | 光细胞质 |
表 4. 在中性分化期间的32维/克-脑脊液 R 细胞形态学.该表总结了主要的形态学特征, 使未成熟的爆炸, intermediately 分化细胞和成熟的中性粒细胞的区别。描述了核和细胞质特征。有关代表性图像, 请参见图 1 。
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Discussion
实验模型的选择是研究的主要课题之一。虽然主要动物和人类细胞被认为能产生最具生物学意义的数据, 但这些模型可能涉及伦理问题, 往往与昂贵和/或复杂的隔离/培养程序相关。初级细胞数量有限, 很难进行基因调控。此外, 主单元格表示由各种单元格类型组成的异构填充, 可能会使数据解释29复杂化。相反, 细胞线提供了一个几乎无限的生物材料来源, 是成本效益, 并允许绕过伦理问题。然而, 重要的是要考虑到细胞系被认为是一个人工实验系统, 这可能遗传和表型不同的起源组织。然而, 细胞系与其他实验方法结合在一起, 为生成可再生和生物相关的数据提供了一个有价值的模型。
32维/克脑脊液 R 细胞线, 以及 32D cl-3 细胞, 是建立良好和广泛使用的细胞培养模型小鼠中性分化14,15,24,30。几个研究小组使用这些细胞来评估特定基因在 myelopoiesis 中的作用, 并获得了与使用体内模型和主细胞16、31所获得的数据相关的结果。在这里, 我们提供了一个处理32维/克脑脊液 R 细胞线的协议, 但是, 类似的程序可以用于培养和操作 32D cl-3 细胞。需要指出的是, 不同实验室使用的 32D cl-3 细胞的不同批次在核型上存在差异, 表明不同的组可能使用自己的 subclones32。基于这一观察, 我们推测32维/克-脑脊液 R 细胞的遗传变异可能同样存在, 在比较不同研究组获得的结果时需要考虑到这一点。替代细胞培养模型, 以32维/克脑脊液 R 细胞是永生化造血祖线22,33,34,35,36。当需要大规模的祖展开时, 这种方法很有用, 例如为了研究蛋白质相互作用22。32维/克-脑脊液 R 细胞的优点是永生祖可以从任何基因修饰的老鼠中产生, 尽管建立该线的时间相当长37。此外, 对骨髓永生祖细胞的处理和操纵, 需要比32维/克-脑脊液 R 电池更多的专业知识。
为了使读者熟悉32维/g-csf 模型, 在代表的第一部分, 我们展示了在 IL-3 和 csf 的存在下, 32 维/克脑脊液 r 细胞的增殖和分化动力学。介绍了 IL-3 增殖条件下细胞形态和 GCSF 诱导分化的不同时间点的代表性图像。通过形态学分析, 我们评估了中性分化, 但据报道, 32D cl-3 细胞分化可以通过 CD11b 细胞表面标记27,31的流细胞分析来确定, 38,39。根据我们的知识和专长, CD11b 在32维/克-脑脊液 R 细胞的中性分化过程中不上调。为了标准化, 在32维/克-脑脊液扩散检测中, 我们使用了商业上可用的 IL-3。然而, 我们观察到, 细胞在自制的 IL-3 中增殖良好, 如 Drobek 和同事22所描述的那样产生。为了获得良好的 G-脑脊液诱导的中性分化, 重要的是要记住, 如果细胞培养超过 1 x 106细胞/毫升的浓度, 32 维/克-脑脊液 R 细胞的分化能力可能会受损。此外, 分化的程度和速度可能受到血清成分的影响。因此, 建议在几批血清中检测32维/G-脑脊液 R 细胞的分化能力, 并选择一个更好地支持在6到9天的时间内, 在有脑脊液的情况下发展成熟的中性粒细胞。
我们提供了两个代表性的实验, 展示了研究特定蛋白质在髓系分化中的作用的可能方法 (图 3和图 4)。首先, 我们表明, 下调的 EVI2B, 一种跨膜蛋白表达的造血细胞, 导致一个块的骨髓分化的32维/克脑脊液 R 细胞。这些数据是我们组最近发布的, 结合使用主细胞和Evi2b挖空鼠标16进行的化验。其次, 我们研究了由遗传易位 t (922) (q34;q11) 引起的融合蛋白 BCR 对32维/克脑脊液 R 细胞中性分化的影响。这种易位最初是在患有慢性髓系白血病的患者中发现的40,41。此前表明, 在 32D cl-3 细胞中 BCR 的融合 oncoprotein 的表达导致髓样分化拘捕27,28。在这里我们证明了 BCR 的过度表达对32维/克脑脊液 R 细胞有类似的影响。在这里提出的两组实验 (涉及Evi2b下调和 BCR 的过度表达), 通过病毒转导进行32维/G-脑脊液 R 细胞的基因修饰, 从而产生稳定的基因表达。逆转录病毒与慢病毒载体的选择不影响32维/克脑脊液 R 细胞的增殖或分化。然而, 慢病毒载体感染比逆转录病毒转导更有效, 因为有内源性逆转录病毒在32维/克脑脊液 R 细胞中存在。根据我们的经验, 使用标准的亲脂试剂对这些细胞进行转染是不有效的。但是, 如果需要瞬态构造表达式, 则通过电穿孔进行转染是可行的方法42,43,44。在这里, 我们提出了32维/克-脑脊液 R 细胞的遗传操作, 其次是 GFP 分类和对受感染细胞的批量分析。但是, 如果需要, 可以使用单个单元格排序来生成单个单元格克隆, 如以前报告的12、45。
除了增殖和分化化验, 32 维/克脑脊液 R 细胞已被用于成功地确定某些蛋白质在细胞迁移和凋亡中的作用13,46,47,48.此外, 32 维/克-脑脊液 R 线已被用来确定细胞因子独立生长介导的癌基因蛋白19, 20.另一个经常用于研究细胞因子独立性的线是 Ba/F3 单元格21,49。Ba/F3 是一种 IL-3 依赖的小鼠细胞系, 来源于 C3H 鼠株, 类似于32维/克-脑脊液 R 细胞。尽管这两种系统都可以用来研究细胞因子的独立增殖, Ba/F3 细胞在脑脊液的存在下差异很低。
总之, 我们建议, 32 维/克-脑脊液 R 细胞, 虽然低于原细胞的首选, 提供了一些优势, 包括无限的增殖能力和简单的处理。我们认为, 为生成可靠的数据, 在32维/克脑脊液 R 细胞中进行的实验应辅以使用替代实验方法 (如小鼠模型和初级文化) 获得的数据。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢 Delwel 教授和 Touw 教授为我们提供了32维/克脑脊液 R 细胞线, 丹尼尔教授 Tenen 为我们提供了 Bosc23 细胞系。这项工作得到了捷克共和国赠款机构 (GACR 15-03796S 和 GACR 17-02177S) 赠款的支助, 由捷克科学院分子遗传学研究所 (RVO 68378050) 提供的支助, 以 ma j, 一项 GA 英国研究金 (341015 号项目)。从布拉格的查尔斯大学到 MK, 和一个 GA 英国奖学金 (1278217 号项目) 从布拉格查尔斯大学到 PD。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 powder medium | Merck, Kenilworth, NJ, USA | T 121-10 | without NaHCO3, with L-glutamine |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15028 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 31985-047 | L-Glutamine, Phenol Red |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAA Laboratories (GE Healthcare,Chicago, IL, USA) | MT35011CV | For differentiation of 32D/G-CSF-R cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10270 | Used for culturing HEK293T, NIH3T3, BOSC23 cells |
| Penicillin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | P3032 | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | S9137 | Streptomycin sulfate salt powder |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | G1914 | |
| murine IL-3 | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA | 213-13 | |
| human G-CSF | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA | 300-23 | |
| Polyethylenimine | Polyscience, Warrington, PA, USA | 23966 | Linear, MW 25,000 (PEI 25000) |
| Polybrene | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | H9268 | |
| Trypsin | VWR Chemicals, Radnor, PA, USA | 0458 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | E5134 | |
| Crystal violet | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | C0775 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | T6146 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | D2650 | |
| May-Grünwald Giemsa | DiaPath, Martinengo, BG, Italy | 10802 |
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