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Developmental Biology

प्रसार और Murine माइलॉयड अग्रदूत 32D/जी-सीएसएफ-आर कोशिकाओं के भेदभाव

Published: February 21, 2018 doi: 10.3791/57033
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1,2
1Department of Hemato-Oncology, Institute of Molecular Genetics of the ASCR, 2Childhood Leukaemia Investigation Prague, Department of Paediatric Haematology and Oncology, 2nd Faculty of Medicine, Charles University
* These authors contributed equally

Summary

यहां संवर्धन के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल murine माइलॉयड अग्रदूत 32D/जी-सीएसएफ-R सेल लाइन, वायरल संक्रमण प्रदर्शन, और बाहर ले जाने के प्रसार और विभेद परख प्रस्तुत कर रहे हैं । यह सेल लाइन माइलॉयड कोशिका विकास की पढ़ाई के लिए उपयुक्त है, और माइलॉयड सेल विकास और neutrophilic भेदभाव में रुचि के जीन की भूमिका ।

Abstract

टेम स्टेम और जनक कोशिका जीवविज्ञान की समझ अपक्षयी दवा और रक्त विकृतियों के उपचार के लिए महत्वपूर्ण निहितार्थ है । सबसे अधिक प्रासंगिक डेटा है कि vivo मॉडल या प्राथमिक संस्कृतियों में का उपयोग कर अधिग्रहीत किया जा सकता है के बावजूद, टेम स्टेम और जनक कोशिकाओं की कम बहुतायत काफी उनकी जांच के लिए उपयुक्त तकनीकों के पूल प्रतिबंधित । इसलिए, सेल लाइनों के उपयोग की अनुमति देता है कि बड़े सेल की संख्या की आवश्यकता होती है या स्क्रीन के प्रदर्शन के लिए जैविक सामग्री का पर्याप्त उत्पादन । यहां हम एक विस्तृत वर्णन, readout, और प्रसार और भेदभाव परख जो myelopoiesis और neutrophilic भेदभाव में शामिल प्रक्रियाओं की जांच के लिए उपयोग किया जाता है की व्याख्या प्रस्तुत करते हैं । इन प्रयोगों 32D/जी-सीएसएफ-R cytokine निर्भर murine माइलॉयड सेल लाइन है, जो IL-3 की उपस्थिति में पैदा करना और जी सीएसएफ में अंतर करने की क्षमता के पास रोजगार । हम 32D/जी-सीएसएफ-आर कोशिकाओं से निपटने और प्रमुख नुकसान और कमियां है कि वर्णित परख और अपेक्षित परिणाम समझौता हो सकता है पर चर्चा के लिए अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । साथ ही, इस आलेख में lentiviral और retroviral उत्पादन, अनुमापन, और transduction के 32D/G-सीएसएफ-R कक्षों के लिए प्रोटोकॉल हैं । हम प्रदर्शित करते है कि इन कोशिकाओं के आनुवंशिक हेरफेर को सफलतापूर्वक कार्यात्मक और आणविक अध्ययन, जो प्राथमिक टेम स्टेम और जनक कोशिकाओं या vivo में मॉडलों के साथ प्राप्त परिणामों के पूरक कर सकते है प्रदर्शन कार्यरत किया जा सकता है ।

Introduction

टेम स्टेम और जनक आबादी परिपक्व कोशिकाओं की एक बड़ी रेंज के साथ जीव की आपूर्ति, माइलॉयड वंश से कोशिकाओं को शामिल (न्यूट्रोफिल, इयोस्नोफिल्स, बेसोफिल, और monocytes) । प्रक्रिया है कि टेम स्टेम कोशिकाओं से माइलॉयड कोशिकाओं के उत्पादन ड्राइव myelopoiesis के रूप में जाना जाता है, और बदलने की मांग के जवाब में परिपक्व माइलॉयड कोशिकाओं का पर्याप्त उत्पादन तनाव के साथ जीव का उचित मुकाबला करने के लिए एक शर्त है शर्तों, जैसे संक्रमण और खून की कमी । परिपक्व माइलॉयड कोशिकाओं की अपर्याप्त उत्पादन रोगजनकों, कम रक्त जमावट, और अन्य जीवन की धमकी शर्तों1,2को खत्म करने के लिए अक्षमता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इसके अलावा, माइलॉयड वंश विकास में परिवर्तन भी ऐसी गंभीर माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल) के रूप में रक्त द्रोह, के साथ जुड़ा हो सकता है3. myelopoiesis में परिवर्तन विभिन्न कारणों से हो सकता है, जैसे कोशिका की सतह रिसेप्टर्स में दोष के रूप में4, प्रतिलेखन कारकों की बदल अभिव्यक्ति5, बिगड़ा संकेत रास्ते6, परिवर्तन गठन में जिसके परिणामस्वरूप/ oncogenes7, या ट्यूमर शमन करनेवाला जीन की निष्क्रियता के सक्रियकरण8।

विभिंन तरीकों माइलॉयड विकास का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है, और इस प्रक्रिया में विशिष्ट आनुवंशिक परिवर्तन के प्रभाव का आकलन । myelopoiesis अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया आम दृष्टिकोण प्राथमिक कोशिकाओं और ट्रांसजेनिक चूहों शामिल. हालांकि इन मॉडलों को जैविक रूप से प्रासंगिक डेटा के अधिग्रहण की अनुमति है, वे कुछ सीमाएं हैं । प्राथमिक कोशिकाओं का उपयोग कोशिकाओं की एक सीमित संख्या और संस्कृति की एक प्रतिबंधित अवधि मुठभेड़ों, जीन अभिव्यक्ति और बाद में जैविक या जैव रासायनिक विश्लेषण को बदलने के लिए संभावनाओं को सीमित. ट्रांसजेनिक चूहों महंगा है और जैविक औचित्य की एक उचित डिग्री की आवश्यकता होती है । इसके अलावा, vivo में मॉडल के साथ काम करना एक दिया प्रक्रिया में ब्याज की एक जीन की भूमिका को समझने में जटिलता की एक डिग्री कहते हैं । इसलिए, इन सीमाओं को दरकिनार करने के लिए वैकल्पिक दृष्टिकोण की जरूरत है । सेल लाइनों निर्विवाद लाभ है: (1) वे जैव रासायनिक और जैविक अध्ययन के लिए पर्याप्त सामग्री पैदा करने की अनुमति देता है कि असीमित प्रसार क्षमता के अधिकारी, (2) वे आनुवंशिक जोड़तोड़ के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं (पछाड़ना, नॉकआउट, एक्सप्रेस), (3) लागत अपेक्षाकृत कम है, और (4) वे कुछ प्रायोगिक दृष्टिकोण में आवश्यक जैविक सरलीकरण की एक डिग्री की अनुमति ।

पैतृक आईएल 3 (Interleukin-3) निर्भर 32D सेल लाइन १९८३ में Greenberger और सहयोगियों द्वारा C3H/HeJ चूहों से अस्थि मज्जा कोशिकाओं के संक्रमण के द्वारा स्थापित किया गया था दोस्त murine ल्यूकेमिया वायरस9के साथ । साहित्य में कई 32D क्लोन बताए गए: सीएल-239, सीएल-310, और सीएल-1011। 32D सीएल-3 कोशिकाओं IL-3 में पैदा करना करने के लिए दिखाया गया था और granulocyte-कॉलोनी उत्तेजना कारक (जी सीएसएफ) के साथ उपचार पर neutrophilic भेदभाव से गुजरना 10. इसके विपरीत, 32D सीएल-10 कोशिकाओं, जबकि आईएल 3 पर निर्भर किया जा रहा है, मूल रूप से जी सीएसएफ उपचार के जवाब में अंतर नहीं थे । १९९५ में डॉ इवो Touw retrovirally transduced 32D सीएल के समूह जंगली प्रकार और जी सीएसएफ रिसेप्टर (जी सीएसएफ-आर) के उत्परिवर्ती रूपों के साथ 10 कोशिकाओं, क्रम में इस रिसेप्टर11के कार्यात्मक महत्वपूर्ण क्षेत्रों की पहचान करने के लिए. इस अध्ययन 32D/जी-सीएसएफ-R कोशिकाओं है, जो इसी तरह il-3 पर निर्भर हैं की पीढ़ी के परिणामस्वरूप, लेकिन 6 से 10 दिनों के भीतर il-3 जी के साथ प्रतिस्थापन के बाद सीएसएफ, कोशिकाओं पैदा करना और अचल के लिए बंद करो परिपक्व न्यूट्रोफिल में अंतर. IL-3 और जी-सीएसएफ-इन गुणों 32D सीएल-3 और 32D/जी-सीएसएफ-आर कोशिकाओं murine neutrophilic भेदभाव है कि दो अच्छी तरह से परिभाषित विकास और विभेद कारकों द्वारा संग्राहक किया जा सकता के मॉडल सरलीकृत । पिछले दशकों के दौरान कई समूहों 32D/जी-सीएसएफ-आर कोशिकाओं का उपयोग किया है प्रसार और संस्कृति में माइलॉयड कोशिकाओं के भेदभाव में विशेष जीन की भूमिका का अध्ययन करने के लिए12,13,14,15 , 16, और जी सीएसएफ का अध्ययन17,18संकेतन । महत्वपूर्ण बात, परिणाम प्राथमिक कोशिकाओं और ट्रांसजेनिक चूहों के साथ प्राप्त डेटा के साथ संबंधित इस सेल लाइन का उपयोग कर प्राप्त16,19,20,21. नतीजतन, हमें विश्वास है कि 32D/जी सीएसएफ-आर कोशिकाओं, एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जा रहा है और अच्छी तरह से मॉडल की स्थापना की, माइलॉयड भेदभाव जो अंय इस सवाल को संबोधित दृष्टिकोण के साथ समानांतर में इस्तेमाल किया जा सकता अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान प्रणाली का प्रतिनिधित्व करते हैं ।

यहां, विस्तृत 32D/G-सीएसएफ-R सेल लाइन है, जो विस्तार, भेदभाव, और प्रसार और इन कोशिकाओं के भेदभाव के आकलन को कवर की हैंडलिंग का वर्णन प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है । 32D/G-सीएसएफ-R कोशिकाओं के आनुवंशिक संशोधन के लिए विस्तृत जानकारी, या तो retroviral या lentiviral transduction द्वारा, साथ ही वायरस अनुमापन के लिए प्रोटोकॉल प्रदान की जाती हैं । इसके अलावा, 32D/G-सीएसएफ-R कोशिकाओं के संभावित अनुप्रयोगों को प्रदर्शित करने वाले कई प्रतिनिधि परिणाम प्रदान किए गए हैं ।

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Protocol

नोट: 32D/G-सीएसएफ-R कक्षों के विस्तार, विभेद, और transduction का वर्णन करने वाले चरण नीचे प्रस्तुत किए गए हैं ।

1. तैयारी

  1. मीडिया की तैयारी
    1. संस्कृति माध्यम के २५० मिलीलीटर तैयार: RPMI (रोसवेल पार्क मेमोरियल संस्थान) १६४० मध्यम 10% गर्मी निष्क्रिय FBS (भ्रूण गोजातीय सीरम) और murine आईएल-3 (10 एनजी/एमएल) के साथ पूरक ।
      1. वैकल्पिक रूप से, उपयोग घर बनाया आईएल-3 । घर में निर्मित il-3, transduce HEK293 कोशिकाओं के साथ आईएल-3 एक्सप्रेस वेक्टर और इकट्ठा il-3 supernatant22युक्त उत्पादन ।
        नोट: पेनिसिलिन के रूप में एंटीबायोटिक दवाओं, (१०० IU/एमएल), streptomycin (१०० µ जी/एमएल), और gentamicin (४० µ जी/एमएल), प्रोटोकॉल के किसी भी कदम पर सेल संवर्धन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जब तक अंयथा कहा गया है ।
    2. ५० मिलीलीटर मध्यम से तैयार करें: RPMI १६४० मध्यम 10% FBS के साथ पूरक, और मानव जी-सीएसएफ (१०० एनजी/
      नोट: (महत्वपूर्ण) नहीं सभी सीरम बैचों 32D/G-सीएसएफ-R कोशिकाओं के विभेद का समर्थन । प्रयोग से पहले सीरम के विभिंन बैचों परीक्षण शुरू करते हैं । यह अलग से कम 4 विभिंन बैचों का परीक्षण और 32D/G-सीएसएफ-R कोशिकाओं अंतर करने की क्षमता के आधार पर इष्टतम का चयन करने के लिए सिफारिश की है । देखें 32D/G-सीएसएफ-R भिंनता प्रोटोकॉल नीचे ।
    3. तैयार ठंड के 10 मिलीलीटर मध्यम: RPMI १६४० मध्यम ४०% FBS, और 10% DMSO (dimethyl sulfoxide) के साथ पूरक ।
  2. retrovirus का उत्पादन
    1. थाली Bosc23 कोशिकाओं के एक सेल निलंबन (6 × 106) में एक 16 सेमी पेट्री डिश और DMEM के 18 मिलीलीटर में खेती (है Dulbecco संशोधित ईगल माध्यम) 10% FBS युक्त जब तक संस्कृति का प्रवाह ८०% (24 एच) तक पहुंचता है ।
      नोट: कक्ष एक monolayer में विकसित करना चाहिए और संस्कृति में नहीं झुरमुट फार्म का । सेल गिनती विभिंन तरीकों का उपयोग किया जा सकता है (यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल के आराम के लिए मांय) । नमूनों की कम संख्या के मामले में, मैनुअल Bürker चैंबर का उपयोग कर माइक्रोस्कोप के तहत गिनती की सिफारिश की है. इस मामले में, मृत कोशिकाओं के अपवर्जन के लिए Trypan ब्लू का उपयोग करें । मिक्स सेल 1:1 पंजाबियों में ०.४% Trypan ब्लू के साथ । नमूनों की बड़ी संख्या की गिनती करने के लिए, एक स्वचालित सेल काउंटर कार्यरत किया जा सकता है ।
    2. retroviral के ४० µ जी का मिश्रण (जैसे MSCV के रूप में), pCL-पारिस्थितिकी के 20 µ जी (पैकेजिंग वेक्टर)23, ८० µ एल पी के (polyethylenimine), और कम सीरम मध्यम के 2 मिलीलीटर (जैसे Opti-मेम) मध्यम (एंटीबायोटिक दवाओं के बिना) । कमरे के तापमान (आरटी) में 20 मिनट के लिए इस मिश्रण की मशीन ।
    3. ध्यान से बदलें Bosc23 कोशिकाओं के साथ मध्यम 16 मिलीलीटर DMEM के साथ पूरक 2% FBS. उपयोग करने से पहले ३७ ° c करने के लिए मध्यम पूर्व गर्म ।
      नोट: अभिकर्मक के दौरान एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग न करें, क्योंकि यह अभिकर्मक क्षमता को कम कर सकते हैं ।
    4. 1.2.2 में तैयार मिश्रण डालें । dropwise और Bosc23 संस्कृति को ध्यान से, और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए मशीन । सीमा से कम 6 पी विषाक्तता के कारण एच के लिए मशीन ।
    5. Bosc23 के माध्यम से 18 मिलीलीटर पूर्व गर्म DMEM 10% FBS युक्त, और ३७ डिग्री सेल्सियस पर ४८ घंटे के लिए कोशिकाओं की खेती । एक सुरक्षा स्तर 2 प्रयोगशाला में बर्तन प्लेस, इस कदम से यहां रखने के लिए, और मानक सुरक्षा प्रक्रियाओं का पालन करें ।
    6. एक ५०-एमएल शंकु ट्यूब में एक 25 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग कर Bosc23 मध्यम (युक्त ecotropic retroviral कणों), और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ले लीजिए ।
      नोट: (महत्वपूर्ण) अभिकर्मक दक्षता एक उच्च titer वायरस का उत्पादन करने के लिए ९०% तक पहुंच जाना चाहिए ।
    7. 18 मिलीलीटर पूर्व उष्ण DMEM 10% FBS को Bosc23 कोशिकाओं में डालें और 24 ज के लिए खेती करें ।
    8. दोहराएँ चरण 1.2.6.
      नोट: वायरल अखंडता को बनाए रखने के लिए एक ही तापमान (4 डिग्री सेल्सियस) तक पहुंचने के बाद 1.2.6 और 1.2.8 से Retroviral supernatants को परित किया जा सकता है ।
    9. वायरल supernatants में Bosc23 संदूषण से बचने के लिए, स्पिन 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए १५०० × जी में वायरस एकत्र । Aliquot वायरस, स्नैप फ्रीज सूखी बर्फ या तरल नाइट्रोजन का उपयोग कर, और स्टोर पर-८० ° c । हालांकि, ध्यान दें कि ताजा तैयार वायरस जमे हुए शेयरों की तुलना में संक्रमण दक्षता के मामले में उच्च गुणवत्ता का है ।
      नोट: (महत्वपूर्ण) वायरस के दोहराव ठंड से बचने के लिए, क्योंकि यह वायरल गिरावट की ओर जाता है ।
  3. lentivirus का उत्पादन
    1. थाली एक 16 सेमी पेट्री डिश में HEK293T (मानव भ्रूण गुर्दे 293T) कोशिकाओं (6 × 106) के एक सेल निलंबन और 10% FBS युक्त DMEM के 18 मिलीलीटर में खेती जब तक संस्कृति का प्रवाह ८०% (24 ज) तक पहुंचता है ।
      नोट: कक्ष एक monolayer में विकसित करना चाहिए और संस्कृति में नहीं झुरमुट फार्म का ।
    2. lentiviral के 15 µ G का मिश्रण (जैसे pGhU6), पैकेजिंग plasmids pcmvdr 8.74 (झूठ/पोल, 12 µ g के लिए एंकोडिंग) और pMD2. VSVG (VSV के लिए एंकोडिंग-G, १.४ µ g), ८५.२ µ l बेई, और 2 मिलीलीटर की कम सीरम मध्यम (एंटीबायोटिक दवाओं के बिना) । आर टी पर 20 मिनट के लिए इस मिश्रण की मशीन ।
    3. ध्यान से बदलें HEK293T मध्यम DMEM के 16 मिलीलीटर के साथ 2% FBS के साथ पूरक । उपयोग करने से पहले ३७ ° c करने के लिए मध्यम पूर्व गर्म । अभिकर्मक के दौरान एंटीबायोटिक दवाओं का प्रयोग न करें, क्योंकि इससे अभिकर्मक क्षमता कम हो सकती है ।
    4. ध्यान से HEK293T सेल संस्कृति के लिए 1.3.2 में तैयार मिश्रण छोड़ और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 4 एच के लिए मशीन । पी विषाक्तता को रोकने के लिए 6 घंटे के भीतर के लिए सीमा मशीन अवधि ।
    5. बदलें मध्यम करने के लिए 18 मिलीलीटर पूर्व गर्म DMEM 10% FBS और ३७ डिग्री सेल्सियस पर ४८ ज के लिए कोशिकाओं की खेती । एक सुरक्षा स्तर 2 प्रयोगशाला में बर्तन प्लेस, इस कदम से यहां रखने के लिए, और मानक सुरक्षा प्रक्रियाओं का पालन करें ।
    6. HEK293T मध्यम (युक्त amphotropic lentiviral कणों) एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में एक 25 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग कर लीजिए और यह 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
      नोट: (महत्वपूर्ण) अभिकर्मक दक्षता एक उच्च titer वायरस का उत्पादन करने के लिए ९०% तक पहुंच जाना चाहिए ।
    7. सावधानी HEK293T कोशिकाओं के लिए पूर्व गर्म DMEM 10% FBS के 18 मिलीलीटर जोड़ें । ३७ डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए खेती ।
    8. दोहराएँ चरण 1.3.6.
      नोट: वायरल अखंडता को बनाए रखने के लिए एक ही तापमान (4 डिग्री सेल्सियस) तक पहुंचने के बाद 1.3.6 और 1.3.8 से Lentiviral supernatants को परित किया जा सकता है ।
    9. HEK293T कोशिकाओं के साथ वायरल supernatant के संक्रमण से बचने के लिए, स्पिन 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए १५०० × जी में वायरस एकत्र । Aliquot वायरस, स्नैप फ्रीज सूखी बर्फ या तरल नाइट्रोजन का उपयोग कर, और यह दुकान पर-८० ° c । हालांकि, सूचना है कि ताजा तैयार वायरस जमे हुए शेयरों की तुलना में संक्रमण दक्षता के मामले में उच्च गुणवत्ता का है ।
      नोट: (महत्वपूर्ण) वायरस के दोहराव ठंड से बचने के लिए, क्योंकि यह वायरल गिरावट की ओर जाता है ।
  4. एक GFP रिपोर्टर युक्त वायरस का अनुमापन
    1. बीज 1 × 105 NIH/3T3 कोशिकाओं के ३०० µ एल में DMEM 10% FBS प्रति अच्छी तरह से एक 24 अच्छी तरह से थाली में । 7 कुओं को titer एक वायरस को रोजगार मिलेगा ।
    2. गल वायरस ३७ डिग्री सेल्सियस और NIH/3T3 संस्कृतियों के लिए 1, 5, 10, ५०, १००, और ५०० µ एल वायरस जोड़ें । नकारात्मक नियंत्रण में किसी भी वायरस को अच्छी तरह से न जोड़ें । ३७ डिग्री सेल्सियस पर ४८ ज के लिए वायरस की उपस्थिति में कोशिकाओं की खेती ।
    3. हार्वेस्ट NIH/3T3 कोशिकाओं के 30 µ l का उपयोग trypsin/EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) (०.२५% trypsin, ०.०१% EDTA में) और जगह कोशिकाओं में २५० µ l पंजाब में एक FACS (प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई) ट्यूब.
    4. प्रत्येक नमूना24में प्रवाह cytometry द्वारा GFP+ कोशिकाओं की आवृत्ति का निर्धारण । ऐसे Hoechst ३३२५८ के रूप में एक व्यवहार्यता डाई, के अलावा द्वारा मृत कोशिकाओं को शामिल न करें ।
    5. GFP+ कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना (मढ़वाया कोशिकाओं और GFP+ कोशिकाओं की प्रतिशत की संख्या के आधार पर), और उन्हें संक्रमण के लिए इस्तेमाल किया वायरस की मात्रा के खिलाफ साजिश.
      नोट: (महत्वपूर्ण) संक्रमण की दक्षता बड़े वायरल खुराक लागू कर रहे हैं जब एक पठार तक पहुँच जाता है. इसलिए, वायरल सांद्रता पर आधारित titer का अनुमान लगाना महत्वपूर्ण है जिस पर रेखीय श्रेणी में संक्रमण दक्षता होती है ( तालिका 1में दिखाया गया उदाहरण) । GFP+ कक्षों की संख्या कार्यात्मक वायरल कणों (टू-ट्रांस्फ़ॉर्मिंग यूनिट्स) की संख्या को किसी दिए गए वायरस की मात्रा को इंगित करती है । प्रति मिलीलीटर की संख्या की पुन गणना करें ।
  5. एक puromycin रिपोर्टर युक्त वायरस का अनुमापन
    1. बीज 5 × 104 NIH/3T3 कोशिकाओं के 3 मिलीलीटर में DMEM 10% FBS प्रति अच्छी तरह से एक 6-वेल प्लेट में; एक वायरस titer करने के लिए 6 कुओं को रोजगार । ३७ ° c पर रातोंरात संस्कृति ।
    2. अगले दिन तालिका 2में संकेत के रूप में वायरस पतला । वायरस को पतला करने के लिए, प्री-वार्म DMEM 10% FBS का इस्तेमाल करें । भंवर मत करो ।
    3. NIH/3T3 कोशिकाओं से संस्कृति मध्यम निकालें और पतला वायरस के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
    4. ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी ।
    5. धीरे पूर्व के 2 मिलीलीटर-गर्म DMEM 10% FBS के साथ वायरस युक्त माध्यम की जगह है, और ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी ।
    6. धीरे NIH/3T3 मध्यम से 2 मिलीलीटर पूर्व गरम DMEM 10% FBS युक्त puromycin (2 µ g/एमएल) की जगह ।
    7. ३७ डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति और ध्यान से puromycin के साथ मध्यम ताज़ा हर 3 दिन या जब मध्यम पीले रंग का हो जाता है ।
    8. संक्रमण के बाद 10-12 दिनों में, एक अच्छी तरह से महाप्राण माध्यम और पंजाबियों के साथ धीरे से धो लो ।
    9. क्रिस्टल वायलेट समाधान के 1 मिलीलीटर के साथ दाग (०.५% 20% इथेनॉल और डीएच2O में क्रिस्टल वायलेट), आरटी में 2 मिनट, और दो बार पंजाबियों के साथ ध्यान से धो लो ।
    10. एक खुर्दबीन (आवर्धन X4) के तहत एक अच्छी तरह से प्रत्येक में मौजूद ब्लू कालोनियों गिनती । कोई कालोनियों नकारात्मक नियंत्रण में अच्छी तरह से मनाया जाना चाहिए ।
    11. कमजोर पड़ने वाले पहलू को ध्यान में रखते हुए मं/एमएल की कुल संख्या की गणना करें ।

2.32D/जी-सीएसएफ-आर कोशिकाओं के विस्तार और रखरखाव

  1. यदि 32D/जी-सीएसएफ-R कोशिकाओं जम रहे हैं, 1 मिनट के लिए एक ३७ ° c पानी के स्नान में एक aliquot और गल कोशिकाओं ले लो और सीधे एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में 10% FBS के साथ पूरक पूर्व गर्म RPMI १६४० माध्यम के 10 मिलीलीटर में शीशी से डाल कोशिकाओं । ट्यूब 3 बार पलटना और ४०० × जी पर नीचे कोशिकाओं स्पिन supernatant निकालें और IL-3 में संस्कृति माध्यम से कोशिकाओं को पुनः निलंबित ०.३ × 106 कोशिकाओं/एमएल के एक एकाग्रता पर ।
  2. इष्टतम सेल वृद्धि एकाग्रता 0.25-0.5 × 106 कोशिकाओं/एमएल है । विभाजित कोशिकाओं को हर 2 दिन उंहें 0.1-0.2 × 106 कोशिकाओं/एमएल की एकाग्रता के लिए लाने के ।
    नोट: (महत्वपूर्ण) 32D/G-सीएसएफ-R कोशिकाओं को आंशिक रूप से अगर 1 × 10 से अधिक सांद्रता करने के लिए बड़े अंतर करने के लिए अपनी क्षमता खो सकते है 76 कोशिकाओं/ इसलिए, समय पर 32D/G-सीएसएफ-R कक्षों को विभाजित करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है ।
  3. आवश्यकतानुसार, फ्रीज और स्टोर सेल aliquots समय की लंबी अवधि के लिए-८० ° c या तरल नाइट्रोजन में । नीचे स्पिन 3 × 106 कोशिकाओं, supernatant हटाने, और ठंड मध्यम के 1 मिलीलीटर में reसस्पेंड । -८० ° c में एक फ्रीजिंग कंटेनर में ट्यूब प्लेस । दीर्घकालिक भंडारण के लिए, तरल नाइट्रोजन के लिए कोशिकाओं की स्थिति ।

3.32D/जी का Transduction-सीएसएफ-आर कोशिकाओं

  1. प्लेट 32D/जी-सीएसएफ-आर कोशिकाओं में 6-खैर प्लेट ०.३ × 106 कोशिकाओं के एक एकाग्रता में/
  2. 10 और ४० के बीच एक MOI (संक्रमण की बहुलता) तक पहुंचने के लिए वायरस की उचित मात्रा जोड़ें ।
    नोट: उच्च MOI GFP+ कोशिकाओं के प्रतिशत में वृद्धि के साथ ही ब्याज की जीन की अभिव्यक्ति के उच्च स्तर में परिणाम होगा । उदाहरण: 10 के एक MOI के साथ ०.३ × 106 कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए; 3 × 106 TU को 32D/G-सीएसएफ-R कक्षों में जोड़ने की आवश्यकता होगी ।
  3. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 6 घंटे के लिए अंतिम एकाग्रता 8 µ g/mL और मशीन के लिए polybrene जोड़ें । वैकल्पिक रूप से, एक स्पिन-टीका प्रक्रिया प्रदर्शन: 30 डिग्री सेल्सियस पर ९० मिनट के लिए १२०० × जी में एक संवर्धन प्लेट में एक स्विंग बाल्टी रोटर का उपयोग कर, और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए मशीन ।
  4. इकट्ठा कोशिकाओं, एक 15 एमएल ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण, और 5 मिनट (4 डिग्री सेल्सियस) के लिए ४५० × g पर स्पिन ।
  5. supernatant त्यागें, संस्कृति माध्यम के 6 मिलीलीटर, एक T25 सेल संस्कृति कुप्पी में जगह है, और ३७ डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति में छर्रों कोशिकाओं reसस्पेंड ।
  6. ४८ ज बाद में, फसल कोशिकाओं और 5 मिनट (4 डिग्री सेल्सियस) के लिए ४५० × g पर उंहें स्पिन । supernatant को त्यागें ।
  7. एक GFP रिपोर्टर के मामले में: पंजाब के ५०० µ एल में जगह कोशिकाओं और सॉर्ट GFP+ एक प्रवाह cytometry सॉर्टर का उपयोग कर कोशिकाओं । एक puromycin रिपोर्टर के मामले में वेक्टर युक्त: संस्कृति मध्यम में जगह कोशिकाओं 2 µ जी/puromycin के एमएल ।
  8. आगे विश्लेषण और प्रयोगों के लिए आवश्यकतानुसार कक्षों का विस्तार करें.
    नोट: (वैकल्पिक) Transduced कोशिकाओं फ्रीजिंग कंटेनर में-८० डिग्री सेल्सियस पर ठंड में मीडिया में जमे हुए किया जा सकता है, और आगे तरल नाइट्रोजन में संग्रहीत ।

4.32D/जी-सीएसएफ-आर सेल प्रसार परख

  1. प्रसार दर जगह का आकलन करने के लिए ०.२ × 106 कोशिकाओं संस्कृति माध्यम के 1 मिलीलीटर में और गर्मी में रात भर ३७ ° c ।
  2. अगले दिन कोशिकाओं की संख्या गिनती और उन्हें वापस कमजोर ०.२ × 106 कोशिकाओं की एकाग्रता के लिए संस्कृति माध्यम का उपयोग कर एमएल/ ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी । सेल सांद्रता और दैनिक संस्कृतियों के लिए लागू कमजोर पड़ने का रिकॉर्ड रखें तालिका 3का उपयोग कर ।
  3. के रूप में कई दिनों के रूप में प्रसार की जरूरत है मूल्यांकन करने के लिए ४.२ कदम दोहराएं ।
    नोट: प्रसार परख की लंबाई ब्याज के जीन के प्रभाव पर निर्भर करेगा । एक मजबूत phenotype के मामले में, 8-9 दिन एक महत्वपूर्ण प्रभाव का पालन करने के लिए पर्याप्त हो सकता है ( चित्र 3ए देखें) । हालांकि, एक हल्के phenotype के मामले में, समय की लंबी अवधि की आवश्यकता हो सकती है ।
  4. तालिका 3में दर्शाए अनुसार एक जखीरे वक्र बनाकर कक्ष वृद्धि का आकलन करें ।

5.32D/जी-सीएसएफ-R सेल विभेद परख

  1. धो ०.२ × 106 32D/जी-सीएसएफ-R दो बार साइटोकिंस बिना RPMI माध्यम के साथ कोशिकाओं ।
    नोट:-संस्कृति में जी सीएसएफ के अलावा पहले धुलाई कदम महत्वपूर्ण हैं, अवशिष्ट IL-3 की उपस्थिति के बाद से भेदभाव को बाधित कर सकते हैं ।
  2. 1 मिलीलीटर भेदभाव मध्यम में प्लेस (१०० एनजी/एमएल जी-सीएसएफ) में एक 24 अच्छी तरह से/प्लेट, ०.२ × 106 कोशिकाओं के एक सेल एकाग्रता में जिसके परिणामस्वरूप/एमएल (0 दिन) । ३७ ° c पर रातोंरात संस्कृति ।
  3. (चरण 1.2.1) ऊपर संकेत के रूप में कक्षों/एमएल की संख्या गिनती ।
  4. एक गिलास स्लाइड (७६ मिमी X 26 मिमी) पर Cytospin 2-5 × 104 कोशिकाओं 20 × जी में आवश्यक एडेप्टर के साथ एक केंद्रापसारक का उपयोग कर
  5. एक 24 अच्छी तरह से/प्लेट पर ०.२ × 105 कोशिकाओं/एमएल के एक एकाग्रता पर भिंनता मध्यम और प्लेट कोशिकाओं को ताज़ा करें (1 दिन) । पुरानी थाली त्यागें, और अगले दिन नई थाली के साथ ५.६ कदम के साथ आगे बढ़ें ।
  6. 2 से 7 दिनों पर, चरण ५.३ से ५.५ दोहराएं । चरण 4 में वर्णित के रूप में जी सीएसएफ की उपस्थिति में सेल प्रसार का आकलन करें ।
    नोट: (महत्वपूर्ण) विभेदन के दौरान, कोशिका प्रसार धीमा हो जाता है, इसलिए जी-सीएसएफ की उपस्थिति में 3 से 4 दिनों के बाद यह उच्च सांद्रता पर संस्कृति कोशिकाओं के लिए पर्याप्त है ।
  7. कक्ष आकृति विज्ञान के आधार पर 32D/G-सीएसएफ-R कोशिकाओं के विभेदक स्थिति का आकलन करें ।
    1. RT में 5 मिनट के लिए मेथनॉल में कदम ५.४ से कोशिकाओं को ठीक करें और स्लाइड को एयर-ड्राई पर छोड़ें.
      नोट: 0 से 7 दिन से स्लाइड आरटी में संग्रहीत किया जा सकता है, और एक साथ तय । इसी तरह, वे भी निर्धारण के बाद लंबी अवधि के लिए आरटी में रखा जा सकता है ।
    2. दाग मई का उपयोग कर कोशिकाओं-Grünwald Giemsa निंनलिखित निर्माता प्रोटोकॉल धुंधला ।
    3. एक खुर्दबीन और आवर्धन X40 का उपयोग कर सना हुआ कोशिकाओं कल्पना ।
    4. चित्रा 1 और तालिका 4में वर्णन पर गाये चित्रों का उपयोग कर, विस्फोटों की संख्या, मध्यवर्ती विभेदित कोशिकाओं, और परिपक्व granulocytes ।

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Representative Results

32D/जी-सीएसएफ-आर कोशिकाओं के प्रसार और भेदभाव

32D के प्रसार का आकलन करने के लिए/जी-सीएसएफ-आर कोशिकाओं के तहत प्रो-प्रफलन और समर्थक भेदभाव की स्थिति, 32D/जी-सीएसएफ-r कोशिकाओं मीडिया में शामिल थे IL-3 और जी-सीएसएफ, क्रमशः । यह देखा गया था कि प्रसंस्कृत कोशिकाओं IL-3 मध्यम से युक्त (10 एनजी/एमएल) लगभग हर 24 एच (चित्रा 2a) विभाजित । जी सीएसएफ (१०० एनजी/एमएल के साथ आईएल-3 के प्रतिस्थापन पर) प्रसार धीरे-धीरे धीमा और 4 दिनों के बाद बंद कर दिया (चित्रा 2a) । इसके अलावा, जी की उपस्थिति में प्रसंस्कृत कोशिकाओं के भेदभाव राज्य-सीएसएफ मई का उपयोग-Grünwald Giemsa-सना हुआ cytospun कोशिकाओं का आकलन किया गया था. यह दिखाया गया है कि 0 दिन पर (जी सीएसएफ उपचार के शुरू होने से पहले), कोशिकाओं को एक अपरिपक्व myeloblast की तरह आकृति विज्ञान मौजूद है, एक बड़े नाभिक और एक अंधेरे कोशिका द्रव्य (चित्रा2बी) की विशेषता. उपचार के दौरान, परमाणु आकार कम हो गया है और नाभिक के आकार एक चांद के आकार या डोनट आकार में बदल जाता है । इसके अलावा, कोशिका द्रव्य बढ़ा है और डार्क वायलेट रंग खो देता है । जी सीएसएफ के साथ उपचार के 6 दिनों के बाद, कोशिकाओं को पूर्ण neutrophilic भेदभाव के लक्षण मौजूद, एक lobulated नाभिक और एक हल्के वायलेट कोशिका द्रव्य (चित्रा2बी) की विशेषता है । 32D/जी का भेदभाव-सीएसएफ-आर कोशिकाओं को एक क्रमिक प्रक्रिया है, जहां नहीं सभी कोशिकाओं को एक ही गति से परिपक्व न्यूट्रोफिल की ओर विकसित । अंतर के दौरान विभिन्न चरणों में कोशिकाओं की ठहराव (अर्थात् विस्फोट, मध्यवर्ती विभेदित कोशिका, और न्युट्रोफिल) चित्रा bमें दिखाया गया है.

Murine Evi2b पछाड़ना blocks neutrophilic 32D/जी-सीएसएफ-R कोशिकाओं में विभेद

32D/जी-सीएसएफ-आर कोशिकाओं में EVI2B (Ecotropic वायरल एकीकरण साइट बी 2) के downregulation के लिए, 3 EVI2B-लक्ष्यीकरण (Sh2, Sh3, Sh4) और 1 गैर लक्ष्यीकरण गैर मुंह बंद करने नियंत्रण (NSC1) shRNAs डिजाइन किए गए थे; ये एक lentiviral वेक्टर एक GFP रिपोर्टर16ले जाने में क्लोन किया गया । 32D/G-सीएसएफ-R कक्षों को नियंत्रण और Evi2b-मुंह बंद करने shRNAs का उपयोग कर MOI के साथ transduced गया था । दो दिनों के बाद transduction, GFP+ transduced) कोशिकाओं को हल किया गया, और आगे के प्रयोगों के लिए विस्तारित. Sh3 और Sh4 के मामले में, EVI2B घट ८०% पर पहुंच गया, लेकिन Sh2 downregulate प्रोटीन के स्तर को कुशलतापूर्वक EVI2B करने में असमर्थ था, और इसलिए एक अतिरिक्त नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था यहां गैर मुंह बंद करने नियंत्रण 2 (NSC2) के रूप में भेजा । चार दिनों के बाद transduction, भेदभाव और प्रसार परख जी सीएसएफ की उपस्थिति में प्रदर्शन किया गया, और इन प्रक्रियाओं में Evi2b downregulation के प्रभाव का मूल्यांकन किया गया । यह देखा गया कि Evi2b-घट कोशिकाओं (Sh2, Sh3) GCSF की उपस्थिति में सेल प्रसार निरंतर, जबकि नियंत्रण कोशिकाओं (NSC1 और NSC2) 4 दिन के आसपास प्रसार कम (चित्रा 3) । इसके अलावा, Evi2b-खामोश 32D/जी-सीएसएफ-R कोशिकाओं नियंत्रण कोशिकाओं (चित्र बी) की तुलना में कम मध्यवर्ती और परिपक्व न्यूट्रोफिल का उत्पादन किया । उल्लेखनीय है, NSC2, जो गरीब Evi2b पछाड़ना दक्षता का प्रदर्शन के साथ कोशिकाओं transduced भी परिपक्व न्यूट्रोफिल (चित्र बी) की संख्या में मामूली कमी दिखाई । इन आंकड़ों को हाल ही में16प्रकाशित किया गया था ।

BCR-ABL फ्यूजन प्रोटीन 32D/जी में neutrophilic भेदभाव बिगड़ा-सीएसएफ-R कोशिकाओं

यह दिखाया गया है कि BCR-ABL संलयन प्रोटीन माइलॉयड भेदभाव बिगड़ा, माइलॉयड progenitors की एक व्यापक विस्तार है जो पुरानी माइलॉयड ल्यूकेमिया25,26की तीव्र चरण के दौरान टेम विफलता में परिणाम के कारण । पिछले अध्ययनों से प्रदर्शित किया है कि BCR के लागू अभिव्यक्ति-ABL 32D सीएल-3 कोशिकाओं में न्युट्रोफिल भेदभाव27,28के एक ब्लॉक के परिणामस्वरूप । इसलिए, हम जांचा कि क्या समान परिणाम 32D/G-सीएसएफ-R सेल लाइन के साथ प्राप्त किया जा सकता है । 32D/जी-सीएसएफ-R कोशिकाओं BCR-ABL या नियंत्रण MSCV retroviral वेक्टर एक GFP रिपोर्टर (MOI = 20) ले जाने के साथ transduced थे । 2 दिनों के बाद transduction, GFP+ कोशिकाओं को हल किया गया और आईएल-3 में 2 सप्ताह के लिए विस्तार के माध्यम से युक्त । अगले, विभेद परख जी सीएसएफ की उपस्थिति में प्रदर्शन किया गया । हमने देखा है कि 0 दिन में (जी-सीएसएफ के माध्यम से युक्त करने के लिए कोशिकाओं को स्थानांतरित करने से पहले), MSCV नियंत्रण और BCR-ABL व्यक्त 32D/जी-सीएसएफ-R कोशिकाओं समान आकृति विज्ञान प्रस्तुत, मुख्य रूप से अपरिपक्व माइलॉयड विस्फोट कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व (चित्रा 4). हालांकि, हम का प्रदर्शन किया है कि जब खाली वेक्टर transduced नियंत्रण कोशिकाओं जी सीएसएफ उपचार के 6 दिनों के बाद neutrophilic भेदभाव किया (परिपक्व न्यूट्रोफिल और मध्यवर्ती विभेदित कोशिकाओं के ५६.४% के ११.५% उत्पादन), कोई परिपक्व न्यूट्रोफिल BCR से उत्पन्न हुए थे-ABL-transduced 32D/जी-सीएसएफ-R कोशिकाओं (चित्रा 4) । लगातार, जी-सीएसएफ में BCR-ABL एक्सप्रेस कोशिकाओं में अपरिपक्व विस्फोट का प्रतिशत आईएल-3 की स्थिति में विस्फोट के प्रतिशत के समान ही रह गया.

Figure 1
चित्र 1. विशिष्ट 32D/G-सीएसएफ-R सेल आकृति विज्ञान के प्रतिनिधि छवियां । 32D/G-सीएसएफ-R कोशिकाओं विस्फोट के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता आकृति विज्ञान, मध्यवर्ती विभेदित कोशिकाओं, और परिपक्व न्यूट्रोफिल. वर्णन के लिए तालिका 4 देखें ।

Figure 2
चित्र 2. 32D/G-सीएसएफ-R कोशिकाओं के प्रसार और भेदभाव । (क) 32D/GCSFR कोशिकाओं का प्रसार 10 एनजी/एमएल आईएल-3 (ब्लैक लाइन) या १०० एनजी/एमएल जी-सीएसएफ (नीली रेखा) के माध्यम से युक्त । X अक्ष उपचार के दिनों का प्रतिनिधित्व करता है । Y अक्ष लघुगणकीय स्केल (लॉग2) में दिखाया गया है और कक्षों की संख्या × 105को इंगित करता है । परिणाम 3 स्वतंत्र प्रयोगों के औसत का प्रतिनिधित्व करते हैं । त्रुटि पट्टियां मानक विचलन इंगित करती हैं । (ख) जी-सीएसएफ-युक्त मध्यम (१०० एनजी/एमएल) में 32D/जी-सीएसएफ-आर कोशिकाओं का भेदभाव । ऊपरी पैनल में, पाई-भूखंडों विस्फोटों का प्रतिशत प्रदर्शित (काला), मध्यवर्ती विभेदित कोशिकाओं (गुलाबी), और संस्कृति में न्यूट्रोफिल (लाल) 0, 2, 4 के बाद, और 6 जी सीएसएफ उपचार के दिन । निचले पैनल संबंधित समय अंक से cytospun कोशिकाओं के प्रतिनिधि छवियों को शामिल मई के साथ दाग-Grünwald Giemsa । प्रत्येक समय बिंदु के लिए ंयूनतम १०० कक्षों का मूल्यांकन किया गया ।

Figure 3
चित्र 3. Evi2b मुंह बंद करने ब्लॉक्स neutrophilic 32D-G-सीएसएफ-R कोशिकाओं में भेदभाव । (क) Evi2bके प्रसार-खामोश (नारंगी लाइनों) और नियंत्रण (काली लाइनें) 32D/जी-सीएसएफ-आर कोशिकाओं में १०० एनजी/एमएल जी-सीएसएफ के माध्यम से युक्त । X अक्ष उपचार के दिनों का प्रतिनिधित्व करता है । Y अक्ष लघुगणकीय स्केल (लॉग2) में दिखाया गया है और कक्षों की संख्या × 105को इंगित करता है । परिणाम 3 स्वतंत्र प्रयोगों के एक प्रतिनिधि परिणाम प्रदर्शित करता है । (ख) 32D/जी-सीएसएफ-आर कोशिकाओं के भेदभाव का आकलन Evi2b-मुंह बंद करने के साथ transduced और नियंत्रण shRNAs जी-सीएसएफ-युक्त मध्यम (१०० एनजी/एमएल) मई-Grünwald Giemsa cytospun कोशिकाओं के धुंधला का उपयोग कर । ऊपरी पैनल में, पाई-भूखंडों विस्फोटों का प्रतिशत (काला), मध्यवर्ती विभेदित कोशिकाओं (गुलाबी), और संस्कृति में न्यूट्रोफिल (लाल) प्रदर्शित करता है । कम पैनलों cytospun कोशिकाओं के प्रतिनिधि चित्र होते हैं । भेदभाव के 7 दिन पर विभेद का आकलन किया गया था । प्रत्येक शर्त के लिए कम-से १०० कक्षों का मूल्यांकन किया गया ।

Figure 4
चित्र 4. BCR-ABL फ्यूजन प्रोटीन के व्यक्त 32D/जी-सीएसएफ-R कोशिकाओं के भेदभाव को बाधित करता है । 32D/जी-सीएसएफ-आर कोशिकाओं के भेदभाव का आकलन transduced के साथ या तो नियंत्रण MSCV या BCR-ABL फ्यूजन जीन जी-सीएसएफ युक्त मध्यम (१०० एनजी/ ऊपरी पाई-भूखंडों विस्फोटों के अनुपात को प्रदर्शित (काला), मध्यवर्ती विभेदित कोशिकाओं (गुलाबी), और न्यूट्रोफिल (लाल) भेदभाव के 6 दिन पर । कम पैनलों cytospun कोशिकाओं के प्रतिनिधि चित्र दिखाएं मई के साथ सना हुआ-Grünwald Giemsa । हर बार पॉइंट के लिए कम से १०० कक्षों का मूल्यांकन किया गया ।

वायरस V [µ l] मढ़वाया कोशिकाओं की संख्या % GFP+ GFP+ कक्ष गणना रैखिक? TU/mL औसत (TU/mL)
1 १०० ००० १.८३ १ ८३० हाँ १ ८३० ००० २ ३५० ०००
5 १०० ००० १२.९ १२ ९०० हाँ २ ५८० ०००
10 १०० ००० २६.४ २६ ४०० हाँ २ ६४० ०००
५० १०० ००० ७१.४ ७१ ४०० नहीं
१०० १०० ००० ८५.१ ८५ १०० नहीं
५०० १०० ००० ८५.६ ८५ ६०० नहीं

तालिका 1. GFP रिपोर्टर के लिए वायरल titer निर्धारण वैक्टर युक्त । MSCV retrovirus और गणना के साथ प्राप्त डेटा का उदाहरण वायरल titer का अनुमान लगाने के लिए किया । वायरल titer की गणना GFP+ की संख्या के आधार पर की गई थी जब वायरस की निश्चित मात्रा लागू की गई थी । संक्रमण के लिए कार्यरत वायरस की मात्रा GFP+ कक्षों के प्रतिशत के साथ रेखीय सहसंबंध में होनी चाहिए । TU: बदलने इकाइयों ।

ट्यूब ट्यूब विवरण DMEM + १०% FBS वायरस कुल मात्रा कमजोर पड़ने का कारक
(µ एल) (µ एल) (µ एल)
1 कमजोर पड़ने 1 १४८५ 15 µ l वायरल शेयर १५०० 1 x 102
2 कमजोर पड़ने 2 १३५० १५० µ एल ट्यूब 1 १५०० 1 x 103
3 कमजोर पड़ने 3 १३५० १५० µ एल ट्यूब 2 १५०० 1 x 104
4 कमजोर पड़ने 4 १३५० १५० µ एल ट्यूब 3 १५०० 1 x 105
5 कमजोर पड़ने 5 १३५० १५० µ एल ट्यूब 4 १५०० 1 x 106

तालिका 2. puromycin रिपोर्टर के लिए वायरल titer निर्धारण वैक्टर युक्त । puromycin युक्त वैक्टर में वायरल titer का निर्धारण करने के लिए वायरल कमजोर पड़ने की रणनीति । तालिका 5 ट्यूबों (1-5) वायरल स्टॉक के एक धारावाहिक कमजोर पड़ने युक्त तैयार करने के लिए कैसे इंगित करता है । ट्यूब 1 शामिल १४८५ µ l DMEM + 10% FBS और उत्पादित वायरस के 15 µ l, एक 1 × 102 पतला वायरस प्रदान. ट्यूब 2 शामिल १३५० µ एल DMEM + 10% FBS और १५० µ एल के 1 × 102 पतला वायरस (ट्यूब 1), एक 1 × 103 पतला वायरस प्रदान. ट्यूब 3 शामिल १३५० µ एल DMEM + 10% FBS और १५० µ एल के 1 × 103 पतला वायरस (ट्यूब 2), एक 1 × 104 पतला वायरस प्रदान. ट्यूब 4 शामिल १३५० µ एल DMEM + 10% FBS और १५० µ एल के 1 × 104 पतला वायरस (ट्यूब 3), एक 1 × 105 पतला वायरस प्रदान. ट्यूब 5 शामिल १३५० µ एल DMEM + 10% FBS और १५० µ एल के 1 × 105 पतला वायरस (ट्यूब 4), एक 1 × 106 पतला वायरस प्रदान. 1 मिलीलीटर से ट्यूबों 1-5 वायरस titer करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।

कक्ष संख्या एं (x = प्रति मिलीलीटर कक्षों की संख्या)
दिन 0 day 1 day 2 day 3 day 4 day 5 दिन 6
नमुना १ x0 x1 x2 x3 x4 x5 x6
कमजोर पड़ने (d) (y = चढ़ाना के लिए प्रयुक्त कक्षों की मात्रा [ml]; z = अंतिम वॉल्यूम [ml])
दिन 0 day 1 day 2 day 3 day 4 day 5 दिन 6
नमुना १ d0= 1 d1= y1/z1 d2= y2/z2 d3= y3/z3 d4= y4/z4 d5= y5/z5
कुल कक्ष संख्या
दिन 0 day 1 day 2 day 3 day 4 day 5 दिन 6
नमुना १ x0 x1 /d0 x2/d1 x3/d2/d1 x4/d3/d2/d1 x5/d4/d3/d2/d1 x6/d5/d4/d3/d2/d1

तालिका 3. विकास वक्र पीढ़ी । तालिका 32D/G-सीएसएफ-R कोशिकाओं के प्रसार दर के आकलन के लिए आवश्यक समीकरणों का वर्णन करता है ।

नाभिक कोशिका द्रव्य
धमाकों डार्क, गोल अंधेरा, नाभिक से लगभग भेद
मध्यवर्ती विभेदित कक्ष परमाणु आकार में स्पष्ट परिवर्तन, अक्सर डोनट की तरह या चाँद के आकार की तरह हल्का, विशिष्ठ कोशिका द्रव्य
परिपक्व न्यूट्रोफिल Lobulated नाभिक; खण्डों के बीच लगभग कोई कनेक्शन नहीं हल् कोशिका द्रव्य

तालिका 4.32D/G-सीएसएफ-R सेल आकृति विज्ञान neutrophilic विभेदन के दौरान । तालिका प्रमुख रूपात्मक अपरिपक्व विस्फोटों, मध्यवर्ती विभेदित कोशिकाओं, और परिपक्व न्यूट्रोफिल के भेद को सक्षम करने सुविधाओं संक्षेप । नाभिकीय और cytoplasmic विशेषताएँ बताई गई हैं. प्रतिनिधि छवियों के लिए चित्र 1 देखें ।

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Discussion

एक प्रयोगात्मक मॉडल का चुनाव अनुसंधान में मुख्य मुद्दों में से एक है । हालांकि प्राथमिक पशु और मानव कोशिकाओं के लिए सबसे अधिक जैविक रूप से प्रासंगिक डेटा का उत्पादन माना जाता है, इन मॉडलों नैतिक चिंताओं को शामिल कर सकते है और अक्सर महंगी और/या परिष्कृत अलगाव/संवर्धन प्रक्रियाओं के साथ जुड़े रहे हैं । प्राथमिक कोशिकाओं की संख्या में सीमित है और यह आनुवंशिक रूप से उंहें हेरफेर मुश्किल है । इसके अलावा, प्राथमिक कोशिकाओं को एक विषम विभिंन कोशिका प्रकार है कि डेटा व्याख्या29जटिल हो सकता है की रचना की आबादी का प्रतिनिधित्व करते हैं । इसके विपरीत, सेल लाइनों जैविक सामग्री की एक वस्तुतः असीमित स्रोत प्रदान करते हैं, लागत प्रभावी रहे हैं, और नैतिक मुद्दों बाईपास की अनुमति । हालांकि, यह ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है कि सेल लाइनों के लिए एक कृत्रिम प्रयोगात्मक प्रणाली है, जो आनुवंशिक रूप से और phenotypically मूल के अपने ऊतक से अलग हो सकता माना जाता है । फिर भी, जब अंय प्रायोगिक दृष्टिकोण के साथ संयुक्त सेल लाइनों, reproducible और जैविक रूप से प्रासंगिक डेटा की पीढ़ी के लिए एक मूल्यवान मॉडल प्रदान करते हैं ।

32D/G-सीएसएफ-R सेल लाइन, साथ ही 32D सीएल-3 कोशिकाओं, अच्छी तरह से स्थापित कर रहे हैं और व्यापक रूप से murine neutrophilic भेदभाव के सेल संस्कृति मॉडल का इस्तेमाल किया14,15,24,30. कई अनुसंधान समूहों myelopoiesis में विशेष जीन की भूमिका का आकलन करने के लिए इन कोशिकाओं का इस्तेमाल किया है, और प्राप्त परिणाम है कि vivo मॉडल और प्राथमिक कक्ष16,31 में का उपयोग कर प्राप्त डेटा के साथ संबद्ध । यहां हम 32D/जी-सीएसएफ-R सेल लाइन से निपटने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, हालांकि, इसी तरह की प्रक्रियाओं संवर्धन और 32D सीएल-3 कोशिकाओं हेर-फेर के लिए लागू किया जा सकता है । यह कहना है कि विभिंन समूहों 32D सीएल-3 विभिंन प्रयोगशालाओं में इस्तेमाल किया कोशिकाओं के विभिन्न बैचों कैरयोटाइप में मौजूद मतभेद महत्वपूर्ण है, सुझाव है कि अलग समूह अपने उपक्लोनों के साथ काम कर रहे हो सकता है३२। इस निरीक्षण के आधार पर, हम परिकल्पना है कि आनुवंशिक परिवर्तनशीलता इसी तरह 32D/जी-सीएसएफ-R कोशिकाओं में मौजूद हो सकता है, और इस पर ध्यान में रखा जाना चाहिए जब विभिंन अनुसंधान समूहों द्वारा प्राप्त परिणामों की तुलना । 32D/G-सीएसएफ-R कक्षों के लिए वैकल्पिक सेल कल्चर मॉडल टेम जनक पंक्तियाँ22,३३,३४,३५,३६हैं । इस दृष्टिकोण उपयोगी है जब बड़े पैमाने पर जनक विस्तार की आवश्यकता है, उदाहरण के लिए प्रोटीन बातचीत22का अध्ययन करने के लिए । 32D/G-सीएसएफ-R कोशिकाओं के लिए एक लाभ यह है कि नश्वर progenitors किसी भी आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस से उत्पंन किया जा सकता है, हालांकि समय लाइन स्थापित करने के लिए काफी लंबा है३७। इसके अलावा, हैंडलिंग और अस्थि मज्जा अमरता progenitors के हेरफेर 32D/जी-सीएसएफ-R कोशिकाओं की तुलना में अधिक विशेषज्ञता की आवश्यकता है ।

पाठक को 32D/g-सीएसएफ-r मॉडल के साथ परिचित करने के लिए, प्रतिनिधि परिणामों के पहले भाग में हम 32D/g-सीएसएफ-r कोशिकाओं के प्रसार और अंतर कैनेटीक्स का प्रदर्शन किया IL-3 और जी-सीएसएफ की उपस्थिति में । प्रतिनिधि छवियां IL-3 proliferating स्थितियों में कोशिकाओं की आकृति विज्ञान के रूप में अच्छी तरह के रूप में GCSF-प्रेरित भेदभाव के विभिंन समय अंक पर प्रदर्शन प्रस्तुत किए गए । हम रूपात्मक विश्लेषण द्वारा neutrophilic भेदभाव का मूल्यांकन किया है, लेकिन यह बताया गया है कि 32D सीएल-3 सेल भेदभाव प्रवाह cytometric CD11b सेल सतह मार्कर का उपयोग कर विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया जा सकता है27,31, ३८,३९. हमारे ज्ञान और विशेषज्ञता के लिए, CD11b 32D/जी-सीएसएफ-R कोशिकाओं के neutrophilic विभेद के दौरान विनियमित नहीं है । मानकीकरण के लिए, 32D/जी में-सीएसएफ-आर प्रसार परख हम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आईएल-3 कार्यरत हैं । हालांकि, हमने देखा है कि Drobek और सहकर्मियों के द्वारा वर्णित22के रूप में उत्पादित कक्ष-IL-3, में अच्छी तरह से पैदा करना । जी सीएसएफ-प्रेरित neutrophilic भेदभाव की एक अच्छी डिग्री प्राप्त करने के लिए, यह याद रखना महत्वपूर्ण है कि 32D/G-सीएसएफ-R कोशिकाओं की भिंनता की क्षमता अगर कोशिकाओं 1 × 10 की एकाग्रता के ऊपर संस्कृति रहे है बिगड़ा जा सकता है है6 कोशिकाओं/एमएल । इसके अलावा, डिग्री और भेदभाव की गति सीरम संरचना से प्रभावित हो सकता है । इसलिए, यह कई FBS बैचों में 32D/G-सीएसएफ-R कोशिकाओं के विभेदक क्षमता का परीक्षण करने के लिए सिफारिश की है, और एक कि बेहतर जी की उपस्थिति में संस्कृति के 6 से 9 दिनों पर परिपक्व न्यूट्रोफिल के विकास का समर्थन करता है सीएसएफ का चयन करें ।

हम दो प्रतिनिधि संभव माइलॉयड भेदभाव में विशेष रूप से प्रोटीन की भूमिका का अध्ययन करने के तरीके का प्रदर्शन प्रयोग (चित्रा 3 और चित्रा 4) प्रदान की है । सबसे पहले, हम EVI2B, एक transmembrane प्रोटीन टेम कोशिकाओं में व्यक्त की है कि downregulation से पता चला, 32D/जी-सीएसएफ-R कोशिकाओं में माइलॉयड विभेद के एक ब्लॉक की ओर जाता है । इन आंकड़ों को हाल ही में हमारे समूह द्वारा प्रकाशित किया गया था, संयोजन में प्राथमिक कोशिकाओं और Evi2b नॉकआउट चूहों16का उपयोग प्रदर्शन किया परख के साथ । दूसरा, हम BCR के प्रभाव की जांच-ABL, एक फ्यूजन प्रोटीन आनुवंशिक translocation टी से जिसके परिणामस्वरूप (9, 22) (q34; q11), neutrophilic के 32D भेदभाव पर/जी-सीएसएफ-R कोशिकाओं. इस translocation मूल रूप से पुरानी माइलॉयड ल्यूकेमिया४०,४१से पीड़ित रोगियों में पहचाना गया था । यह पहले दिखाया गया था कि BCR की अभिव्यक्ति-ABL फ्यूजन oncoprotein 32D सीएल-3 कोशिकाओं में एक माइलॉयड भेदभाव27,28गिरफ्तार करने के लिए सुराग । यहां हम प्रदर्शन किया है कि BCR-ABL 32D/जी-सीएसएफ-R कोशिकाओं पर समान प्रभाव है । यहां प्रस्तुत प्रयोगों के दोनों सेट में (शामिल Evi2b downregulation और BCR-ABL एक्सप्रेस), 32D/G-सीएसएफ-R कोशिकाओं के आनुवंशिक संशोधन वायरल transduction, जो स्थिर जीन अभिव्यक्ति में परिणाम के माध्यम से किया गया था । retroviral बनाम lentiviral वितरण का चुनाव 32D/जी-सीएसएफ-R कोशिकाओं के प्रसार या विभेद को प्रभावित नहीं करता है । हालांकि, lentiviral संक्रमण retrovirus/जी-सीएसएफ-R कोशिकाओं में अंतर्जात 32D की उपस्थिति के कारण retroviral transduction से अधिक कुशल है । हमारे अनुभव के अनुसार, मानक lipophilic रिएजेंट का उपयोग कर इन कोशिकाओं के अभिकर्मक कुशल नहीं है । हालांकि, अगर क्षणिक निर्माण अभिव्यक्ति की जरूरत है, electroporation द्वारा अभिकर्मक एक व्यवहार्य दृष्टिकोण४२,४३,४४है । यहां, हम 32D/G-सीएसएफ-R GFP छंटाई और संक्रमित कोशिकाओं के थोक विश्लेषण के बाद कोशिकाओं के आनुवंशिक हेरफेर प्रस्तुत किया । हालांकि, यदि आवश्यक हो, एक सेल छंटाई के रूप में पहले12,४५रिपोर्ट एक सेल क्लोन उत्पंन कार्यरत हो सकता है ।

प्रसार और विभेदक परख के अलावा, 32D/जी-सीएसएफ-आर कोशिकाओं को सफलतापूर्वक सेल माइग्रेशन में कुछ प्रोटीन की भूमिका का निर्धारण करने के लिए नियोजित किया गया है और apoptosis13,४६,४७,४८ . इसके अलावा, 32D/जी-सीएसएफ-आर लाइन oncoproteins19,20द्वारा मध्यस्थता cytokine स्वतंत्र विकास का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. एक अंय पंक्ति अक्सर cytokine निर्भरता का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है बा/F3 कोशिकाओं21,४९। Ba/F3 एक IL-3 निर्भर murine सेल लाइन C3H माउस तनाव से व्युत्पंन, इसी तरह 32D/जी-सीएसएफ-R कोशिकाओं के लिए है । हालांकि दोनों प्रणालियों cytokine स्वतंत्र प्रसार, बीए/F3 कोशिकाओं खराब जी सीएसएफ की उपस्थिति में अंतर का अध्ययन करने के लिए नियोजित किया जा सकता है ।

कुल मिलाकर, हम सुझाव है कि 32D/जी-सीएसएफ-आर कोशिकाओं, हालांकि प्राथमिक कोशिकाओं की तुलना में कम पसंद किया जा रहा है, असीमित प्रसार क्षमता और सरल हैंडलिंग सहित कई लाभ प्रदान करते हैं । हम मानते है कि विश्वसनीय डेटा की पीढ़ी के लिए, 32D/G-सीएसएफ-R कोशिकाओं में किया प्रयोगों murine मॉडल और प्राथमिक संस्कृतियों के रूप में वैकल्पिक प्रयोगात्मक दृष्टिकोण का उपयोग कर अधिग्रहीत डेटा के साथ पूरित किया जाना चाहिए.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक हमें 32D/जी सीएसएफ-आर सेल लाइन के साथ प्रदान करने के लिए प्रो रुड Delwel और प्रो इवो Touw धंयवाद, और प्रो डैनियल जी तेणें हमें Bosc23 सेल लाइन के साथ प्रदान करने के लिए । यह काम चेक गणराज्य की अनुदान एजेंसी (GACR 15-03796S और GACR 17-02177S) को मा-J के अनुदान से समर्थित था, चेक विज्ञान के आण्विक आनुवंशिकी के संस्थान से सहायता (RVO ६८३७८०५०) एमए-जंमू, एक GA ब्रिटेन फैलोशिप (परियोजना सं ३४१०१५) चार्ल्स विश्वविद्यालय प्राग में एमके के लिए, और एक GA ब्रिटेन फैलोशिप (परियोजना No. १२७८२१७) से चार्ल्स विश्वविद्यालय के प्राग में पीडी के लिए ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 powder medium Merck, Kenilworth, NJ, USA T 121-10 without NaHCO3, with L-glutamine
DMEM Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 15028
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 31985-047 L-Glutamine, Phenol Red
Fetal bovine serum (FBS) PAA Laboratories (GE Healthcare,Chicago, IL, USA) MT35011CV For differentiation of 32D/G-CSF-R cells
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 10270 Used for culturing HEK293T, NIH3T3, BOSC23 cells
Penicillin Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) P3032
Streptomycin Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) S9137 Streptomycin sulfate salt powder
Gentamicin Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) G1914
murine IL-3 PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA 213-13
human G-CSF PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA 300-23
Polyethylenimine Polyscience, Warrington, PA, USA 23966 Linear, MW 25,000 (PEI 25000)
Polybrene Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) H9268
Trypsin VWR Chemicals, Radnor, PA, USA 0458
EDTA Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) E5134
Crystal violet Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) C0775
Trypan blue Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) T6146
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) D2650
May-Grünwald Giemsa DiaPath, Martinengo, BG, Italy 10802

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक १३२ 32D/जी-सीएसएफ-आर कोशिकाओं murine माइलॉयड अग्रदूत कोशिकाओं तरल संस्कृति भेदभाव न्यूट्रोफिल प्रसार साइटोकिंस आईएल-3 जी सीएसएफ
प्रसार और Murine माइलॉयड अग्रदूत 32D/जी-सीएसएफ-आर कोशिकाओं के भेदभाव
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Zjablovskaja, P., Danek, P., Kardosova, M., Alberich-Jorda, M. Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells. J. Vis. Exp. (132), e57033, doi:10.3791/57033 (2018).

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