Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Proliferation och differentiering av murina myeloiska föregångare 32D/G-CSF-R celler

Published: February 21, 2018 doi: 10.3791/57033
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1,2
1Department of Hemato-Oncology, Institute of Molecular Genetics of the ASCR, 2Childhood Leukaemia Investigation Prague, Department of Paediatric Haematology and Oncology, 2nd Faculty of Medicine, Charles University
* These authors contributed equally

Summary

Här presenteras detaljerade protokoll för odling av murina myeloiska föregångare 32D/G-CSF-R cellinje, utför virusinfektioner och utför proliferation och differentiering analyser. Denna cellinje är lämplig för att studera myeloida cell utveckling, och rollen av gener av intresse i myeloisk celltillväxt och neutrofil differentiering.

Abstract

Förståelse av hematopoetiska stamceller och stamceller cellbiologi har viktiga konsekvenser för regenerativ medicin och behandling av hematologiska sjukdomar. Trots de mest relevanta data som kan förvärvas med i vivo modeller eller primära kulturer, begränsar låga överflödet av hematopoetiska stamceller och stamceller celler avsevärt poolen av lämpliga tekniker för sin utredning. Därför, användningen av cellinjer tillåter tillräcklig produktion av biologiskt material för utförandet av filmvisningar eller analyser som kräver stora cell nummer. Här presenterar vi en detaljerad beskrivning, avläsning och tolkning av proliferation och differentiering analyser som används för utredning av processer för myelopoiesis och neutrofil differentiering. Dessa experiment anställa 32D/G-CSF-R cytokin beroende murina myeloiska celler linjen, som besitter förmågan att föröka sig i närvaro av IL-3 och differentiera i G-CSF. Vi tillhandahåller optimerade protokoll för hantering av 32D/G-CSF-R celler och diskutera viktiga fallgropar och nackdelar som skulle kunna äventyra den beskrivna analyser och förväntade resultat. Denna artikel innehåller dessutom protokoll för lentiviral och retrovirala produktion, titrering och transduktion 32D/G-CSF-R celler. Vi visar att genmanipulation av dessa celler kan användas för att framgångsrikt utföra funktionella och molekylära studier, som kan komplettera resultaten med primära hematopoetiska stamceller och stamceller celler eller i vivo modeller.

Introduction

Hematopoetiska stamceller och stamceller befolkningen levererar organismen med ett stort utbud av mogna celler, inklusive celler från myeloisk härstamning (neutrofiler, eosinofiler, basofiler och monocyter). Processen som driver produktion av myeloida celler från hematopoetiska stamceller kallas myelopoiesis, och tillräcklig produktion av mogen myeloida celler som svar på förändrade krav är en förutsättning för korrekt coping av organismen med stress förhållanden, såsom infektioner och blodförlust. Otillräcklig produktion av mogen myeloida celler kan leda till oförmåga att eliminera patogener, minskad koagulation och andra livshotande tillstånd1,2. Dessutom kan förändringar i myeloisk härstamning utveckling också vara associerade med hematologiska maligniteter, såsom akut myeloisk leukemi (AML)3. Förändringar i myelopoiesis kan uppstå på grund av olika skäl, såsom fel i cell surface receptorer4, förändrat uttryck av transkription faktorer5, nedsatt signalering vägar6, mutationer resulterar i bildandet / aktivering av onkogener7eller inaktivering av tumör suppressor gener8.

Olika metoder har utvecklats för att studera myeloisk utveckling och bedöma effekten av specifika genetiska förändringar i denna process. Gemensamma metoder för att studera myelopoiesis involverar primärceller och transgena möss. Om dessa modeller tillåter förvärv av biologiskt relevanta data, har de vissa begränsningar. Användning av primära celler påträffar ett begränsat antal celler och en begränsad period av kultur, förträngning möjligheterna att påverka genuttryck och efterföljande biologisk eller biokemisk analys. Transgena möss är kostsamma och kräver en rimlig grad av biologiska skäl. Arbeta med i vivo modeller lägger dessutom till en grad av komplexitet till förstå rollen som en gen av intresse för en viss process. Därför behövs alternativa sätt att kringgå dessa begränsningar. Cellinjer har obestridliga fördelar: (1) de har obegränsad spridning kapacitet som gör att generera tillräckligt med material för biokemiska och biologiska studier, (2) de är mottagliga för genetiska manipulationer (knockdown, knockout, överuttryck), (3) kostnaden är relativt låg, och (4) de tillåter en viss grad av biologiska förenkling krävs i vissa experimentella metoder.

Den föräldra IL-3 (Interleukin-3) beroende 32D cellinje grundades 1983 av Greenberger och kollegor av infektion i benmärgsceller från C3H/HeJ möss med vän murina leukemi virus9. Flera 32D kloner har beskrivits i litteraturen: cl-239, cl-310och cl-1011. 32D cl-3 cellerna visades att föröka i IL-3 och genomgå neutrofil differentiering vid behandling med granulocytkolonistimulerande stimulering faktor (G-CSF)10. Tvärtom 32D cl-10 celler, samtidigt vara IL-3 anhörigen, ursprungligen inte skilja i G-CSF behandlingssvaret. 1995 sensorik gruppen av Dr. Ivo Touw retrovirally 32D cl-10 celler med vildtyp och muterade former av G-CSF-receptorn (G-CSF-R), för att identifiera funktionellt viktiga regioner av denna receptor11. Denna studie resulterade i generation av 32D/G-CSF-R cellerna, vilket är på samma sätt beroende av IL-3, men inom 6 till 10 dagar efter byte av IL-3 med G-CSF, stoppa celler för att föröka sig och differentiera irreversibelt till mogna neutrofiler. Dessa egenskaper gör 32D cl-3 och 32D/G-CSF-R celler förenklade modeller av murina neutrofil differentiering som kan moduleras av två väldefinierade tillväxt och differentiering faktorer - IL-3 och G-CSF. Under de senaste decennierna har flera grupper använt 32D/G-CSF-R celler för att studera rollen av vissa gener i proliferation och differentiering av myeloida celler i kultur12,13,14,15 , 16, och att studera G-CSF signalering17,18. Ännu viktigare, de resultat som erhålls med hjälp av denna cellinje korrelerade med data som erhållits med primära celler och transgena möss16,19,20,21. Följaktligen anser vi att 32D/G-CSF-R celler, ett allmänt använt och väletablerad modell, utgör ett värdefullt system att studera myeloisk differentiering som kan användas parallellt med andra metoder att ta itu med denna fråga.

Här, detaljerade protokoll som beskriver hanteringen av de 32D/G-CSF-R cellinje, där locket expansion, differentiering och bedömning av proliferation och differentiering av dessa celler presenteras. Detaljerad information för genetisk modifiering av 32D/G-CSF-R celler, antingen genom retrovirala eller lentiviral transduktion, samt protokoll för virustitrering tillhandahålls. Dessutom finns flera representativa resultat som visar potentiella tillämpningar av 32D/G-CSF-R celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Obs: Steg som beskriver expansion, differentiering och transduktion 32D/G-CSF-R celler presenteras nedan.

1. beredning

  1. Media förberedelse
    1. Bereda 250 mL odlingsmedium: RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 medium kompletteras med 10% värme inaktiverat FBS (fetalt bovint serum) och murint IL-3 (10 ng/mL).
      1. Alternativt använda hemgjorda IL-3. Att producera hemgjorda IL-3, transduce HEK293 celler med IL-3 uttrycker vektor och samla IL-3 innehållande supernatant22.
        Obs: Antibiotika, såsom penicillin G (100 IE/mL), streptomycin (100 µg/mL) och gentamicin (40 µg/mL), kan användas för cell odling vid varje steg i protokollet om inget annat anges.
    2. Förbereda 50 mL differentiering medium: RPMI 1640 medium kompletteras med 10% FBS och humant G-CSF (100 ng/mL).
      Obs: (Viktigt) inte alla serum partier stöder differentiering av 32D/G-CSF-R celler. Testa olika partier av serum före experimentet start. Det rekommenderas att testa minst 4 olika partier och välj den optimala utifrån möjligheten för 32D/G-CSF-R cellerna att differentiera. Se 32D/G-CSF-R differentiering protokoll nedan.
    3. Förbereda 10 mL av frysning medium: RPMI 1640 medium kompletteras med 40% FBS och 10% DMSO (dimetyl sulfoxid).
  2. Produktion av retrovirus
    1. Plåt en enda cellsuspension av Bosc23 celler (6 × 10-6) i en 16 cm petriskål och odla i 18 mL DMEM (Dulbeccos modifierade örnens Medium) innehållande 10% FBS tills konfluens av kulturen når 80% (24 h).
      Obs: Celler bör växa i en enskiktslager och inte bildar klumpar i kultur. Cell räknar kan utföras med olika metoder (gäller för resten av de protokoll som presenteras här). Vid lågt antal prover rekommenderas manuell räknar under mikroskopet använder Bürker kammare. I detta fall, använda Trypan blå för uteslutning av döda celler. Blanda celler 1:1 med 0,4% Trypan blå i PBS. Utför inventering av stort antal prover genom kan en automatisk cell räknare användas.
    2. Kombinera 40 µg av retrovirala konstruktion (t.ex. MSCV), 20 µg pCL-Eco (förpackning vektor)23, 80 µl av PEI (polyethylenimine) och 2 mL minskas-Serum medium (t.ex. Opti-MEM) medium (utan antibiotika). Inkubera denna blandning i 20 min i rumstemperatur (RT).
    3. Försiktigt ersätta Bosc23 celler medium med 16 mL DMEM kompletteras med 2% FBS. Pre varma medellång till 37 ° C före användning.
      Obs: Använd inte antibiotika under transfection, eftersom det kan minska transfection effektivitet.
    4. Tillsätt blandningen beredd i punkt 1.2.2. droppvis och försiktigt till Bosc23 kultur och inkubera i 4 timmar vid 37 ° C. Begränsa inkubation till mindre än 6 h på grund av PEI toxicitet.
    5. Efter inkubation, ändra Bosc23 medium till 18 mL före värmde DMEM innehållande 10% FBS, och odla celler för 48 timmar vid 37 ° C. Placera rätter i ett laboratorium för biosäkerhet nivå 2, hålla här från detta steg på och följa standard säkerhetsrutiner.
    6. Samla in Bosc23 medium (innehållande ecotropic retrovirala partiklar) med 25 mL serologiska pipett till en 50 mL konisk rör och förvaras vid 4 ° C.
      Obs: (Viktigt) Transfection effektivitet bör nå 90% för att producera en hög titer virus.
    7. Lägg till 18 mL värmas före DMEM 10% FBS att Bosc23 celler och odla för 24 h.
    8. Upprepa steg 1.2.6.
      Obs: Retrovirala supernatanterna från 1.2.6 och 1.2.8 kan poolas när de når samma temperatur (4 ° C) för att bevara viral integritet.
    9. För att undvika Bosc23 förorening i viral supernatanterna, snurra insamlade virus vid 1500 × g i 10 minuter vid 4 ° C. Alikvotens virus, knäppa frysa med hjälp av torris eller flytande kväve, och lagra vid-80 ° C. Observera dock att nylagade virus är av högre kvalitet infektion effektivitet än fryst lager.
      Obs: (Viktigt) Undvik upprepad frysning/upptining av viruset, eftersom det leder till viral nedbrytning.
  3. Produktion av lentivirus
    1. Plåt en enda cellsuspension av HEK293T (mänskliga embryonala njure 293T) celler (6 × 10-6) i en 16-cm petriskål och odla i 18 mL DMEM innehållande 10% FBS tills konfluens av kulturen når 80% (24 h).
      Obs: Celler bör växa i en enskiktslager och inte bildar klumpar i kultur.
    2. Kombinera 15 µg av lentiviral konstruktion (t.ex. pGhU6), förpackning plasmider pCMVdR8.74 (kodning för gag/pol, 12 µg) och pMD2.VSVG (encoding för VSV-G, 1,4 µg) 85,2 µL PEI och 2 mL minskas-serum medium (utan antibiotika). Inkubera denna blandning i 20 min på RT.
    3. Försiktigt ersätta HEK293T medium med 16 mL DMEM kompletteras med 2% FBS. Pre varma medellång till 37 ° C före användning. Använd inte antibiotika under transfection, eftersom det kan minska transfection effektivitet.
    4. Försiktigt släppa blandningen beredd i 1.3.2 HEK293T cell kultur och inkubera i 4 timmar vid 37 ° C. Begränsa inkubation längd att inom 6 h att förhindra PEI toxicitet.
    5. Förändring medium till 18 mL värmas före DMEM 10% FBS och odla celler för 48 timmar vid 37 ° C. Placera rätter i ett laboratorium för biosäkerhet nivå 2, hålla här från detta steg på och följa standard säkerhetsrutiner.
    6. Samla in HEK293T medium (innehållande amphotropic lentiviral partiklar) med 25 mL serologiska pipett i en 50 mL konisk tub och lagra det vid 4 ° C.
      Obs: (Viktigt) Transfection effektivitet bör nå 90% för att producera en hög titer virus.
    7. Tillsätt försiktigt 18 mL före värmde DMEM 10% FBS i HEK293T celler. Odla för 24 timmar vid 37 ° C.
    8. Upprepa steg 1.3.6.
      Obs: Lentiviral supernatanterna från 1.3.6 och 1.3.8 kan poolas när de når samma temperatur (4 ° C) för att bevara viral integritet.
    9. För att undvika kontaminering av viral supernatanten med HEK293T celler, snurra insamlade virus vid 1500 × g i 10 minuter vid 4 ° C. Alikvotens virus, knäppa frysa med hjälp av torris eller flytande kväve, och förvara den vid-80 ° C. Men märke det nylagade virus är av högre kvalitet infektion effektivitet än fryst lager.
      Obs: (Viktigt) Undvik upprepad frysning/upptining av viruset, eftersom det leder till viral nedbrytning.
  4. Titrering av virus som innehåller en god Jordbrukarsed reporter
    1. Frö 1 × 105 NIH/3T3-celler i 300 µL DMEM 10% FBS per brunn till en 24-bra platta. 7 brunnar kommer att vara anställd till titer en virus.
    2. Tina virus vid 37 ° C och tillsätt 1, 5, 10, 50, 100 och 500 µL virus till NIH/3T3 kulturer. Lägg inte till något virus i negativ kontroll väl. Odla celler i närvaro av viruset för 48 timmar vid 37 ° C.
    3. Skörda NIH/3T3-celler använder 30 µL av trypsin/EDTA (etylendiamintetraättiksyra syra) (0,25% Trypsin, 0,01% EDTA i PBS) och placera celler i 250 µL PBS på FACS (fluorescens aktiverad cell sortering) tub.
    4. Bestämma frekvensen av GFP+ celler genom flödescytometri i varje prov24. Utesluta döda celler genom tillägg av en livskraft dye, såsom Hoechst 33258.
    5. Beräkna det totala antalet GFP+ celler (baserat på antalet guldpläterade celler och andelen GFP+ celler) och rita dem mot mängden virus som används för infektion.
      Obs: (Viktigt) effektiviteten i infektion når en platå när stora virala doser tillämpas. Det är därför viktigt att uppskatta titern baserat på viral koncentrationer som infektion effektivitet sker i ett linjärt intervall (exemplet i tabell 1). Antalet celler som GFP+ anger antalet funktionella viruspartiklar (TU - omvandla enheter) i en given virus volym. Beräkna antalet TU per mL.
  5. Titrering av virus som innehåller en puromycin reporter
    1. Utsäde 5 × 104 NIH/3T3-celler DMEM 3 ml 10% FBS per brunn i en 6-bra platta. anställa 6 wells till titer en virus. Kultur över natten vid 37 ° C.
    2. Nästa dag späd virus som anges i tabell 2. För att späda ut virus, använda pre värmde DMEM 10% FBS. Gör inte vortex.
    3. Ta bort odlingsmedium från NIH/3T3-celler och tillsätt 1 mL utspädd virus.
    4. Inkubera över natten vid 37 ° C.
    5. Försiktigt ersätta virusinnehållande medium med 2 mL före värmde DMEM 10% FBS, och inkubera över natten vid 37 ° C.
    6. Försiktigt ersätta NIH/3T3 medium med 2 mL före värmde DMEM 10% FBS innehållande puromycin (2 µg/mL).
    7. Kultur vid 37 ° C och noggrant uppdatera medium med puromycin varje 3 dagar eller när medium blir gul.
    8. 10-12 dagar efter infektion, aspirera medium från varje brunn och tvätta försiktigt med PBS.
    9. Fläcken med 1 mL kristallviolett lösning (0,5% kristallviolett i 20% etanol och dH2O), 2 min på RT och tvätta noggrant med PBS två gånger.
    10. Räkna blå kolonier i varje brunn under ett mikroskop (förstoring X4). Inga kolonier bör iakttas i den negativa kontrollen väl.
    11. Beräkna det totala antalet TU/mL överväger utspädningsfaktorn.

2. utbyggnad och underhåll av 32D/G-CSF-R celler

  1. Om 32D/G-CSF-R celler är frysta, ta en alikvot och Tina celler i 37 ° C vattenbad för 1 min och häll celler från injektionsflaskan direkt i 10 mL före värmde RPMI 1640 medium kompletteras med 10% FBS i en 15mL tub. Invertera röret 3 gånger och snurra cellerna ner vid 400 × g. avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i IL-3 innehållande odlingsmedium vid en koncentration på 0,3 × 106 celler/mL.
  2. Optimal tillväxt cellkoncentrationen är 0,25-0,5 × 106 celler/mL. Dela celler varannan dag föra dem till en koncentration av 0,1-0,2 × 106 celler/mL.
    Obs: (Viktigt) 32D/G-CSF-R celler kan delvis förlorar sin förmåga att skilja om vuxit till koncentrationer som är högre än 1 × 106 celler/mL. Det är därför mycket viktigt att dela 32D/G-CSF-R celler i tid.
  3. Som behövs, frysa och lagra cell alikvoter för långa perioder vid-80 ° C eller i flytande kväve. Snurra ner 3 × 106 celler, avlägsna supernatanten och återsuspendera i 1 mL iskallt medium. Placera röret i frysning behållare vid-80 ° C. För långtidsförvaring, flytta celler att flytande kväve.

3. transduktion 32D/G-CSF-R celler

  1. Plattan 32D/G-CSF-R celler i 6-väl plattan med en koncentration på 0,3 × 106 celler/mL.
  2. Tillsätt lämplig mängd virus att nå en MOI (multiplicity av infektion) mellan 10 och 40.
    Obs: Högre MOI kommer att resultera i ökad andel av GFP+ celler samt högre nivåer av uttryck av genen av intresse. Exempel: Att infektera 0,3 × 106 celler med en MOI i 10; 3 × 106 TU kommer att behöva läggas till 32D/G-CSF-R cellerna.
  3. Lägga till polybrene till slutlig koncentration 8 µg/mL och inkubera i 6 timmar vid 37 ° C. Alternativt gör en spin-inympningen för: Centrifugera vid 1200 × g i 90 min vid 30 ° C i en culturing platta med en swing-hink rotor och inkubera i 3 timmar vid 37 ° C.
  4. Samla celler, överföra till en 15-mL tub, och snurra på 450 × g för 5 min (4 ° C).
  5. Tag bort supernatanten, Omsuspendera pelleterat celler i 6 mL odlingsmedium, placera i en T25 cell kultur kolv och kultur vid 37 ° C.
  6. 48 h senare skörd celler och snurra dem vid 450 × g i 5 min (4 ° C). Kassera supernatanten.
  7. Vid en god Jordbrukarsed reporter: placera celler i 500 µL av PBS och sortera GFP+ celler med hjälp av ett flöde flödescytometri sorterare. Vid en puromycin reporter som innehåller vector: placera celler i odlingsmedium innehållande 2 µg/mL puromycin.
  8. Expandera celler som behövs för vidare analys och experiment.
    Obs: (Valfritt) Transduced celler kan frysas i frysning media i frysning behållare vid-80 ° C, och ytterligare lagras i flytande kväve.

4. 32D/G-CSF-R cell proliferation assay

  1. Att bedöma spridning ränta plats 0,2 × 106 celler i 1 mL odlingsmedium och inkubera över natten vid 37 ° C.
  2. Nästa dag räkna antalet celler och späda ut dem tillbaka till en koncentration av 0,2 × 106 celler/mL med hjälp av odlingsmedium. Inkubera över natten vid 37 ° C. Föra register över cell koncentrationer och spädningar tillämpas de dagliga kulturer med hjälp av tabell 3.
  3. Upprepa steg 4,2 för så många dagar som spridning behöver bedömas.
    NOTE: Längden på spridning analyserna kommer beror på effekten av genen av intresse. Vid en stark fenotyp, skulle 8-9 dagar vara tillräckligt att konstatera en signifikant effekt (se figur 3A). Dock vid en mild fenotyp kan längre tid behöva.
  4. Bedöma celltillväxt genom att göra en spridning kurva som anges i tabell 3.

5. 32D/G-CSF-R cell differentiering assay

  1. Tvätta 0,2 × 106 32D/G-CSF-R celler två gånger med RPMI medium utan cytokiner.
    Obs: Tvätt stegen före tillsats av G-CSF i kulturen är viktiga, eftersom förekomsten av kvarvarande IL-3 kan hämma differentiering.
  2. Placera celler i 1 mL differentiering medium (innehållande 100 ng/mL G-CSF) i en 24 brunn/platta, vilket resulterar i en cell koncentration av 0.2 × 106 celler/mL (dag 0). Kultur över natten vid 37 ° C.
  3. Räknar antalet celler/mL enligt ovan (steg 1.2.1).
  4. Cytospin 2-5 × 104 celler på en glasskiva (76 mm X 26 mm) med en centrifug med nödvändiga adaptrar på 20 × g.
  5. Uppdatera differentiering medium och platta celler vid en koncentration på 0,2 × 105 celler/mL på en 24 brunn/tallrik (dag 1). Kassera den gamla plattan och fortsätt nästa dag med steg 5,6 med nya plattan.
  6. Upprepa steg 5,3-5,5 dagar 2-7. Bedöma cellproliferation i närvaro av G-CSF som beskrivs i steg 4.
    Obs: (Viktigt) under differentiering, cellproliferation saktar ner, efter 3 till 4 dagar i närvaro av G-CSF är det därför lämpligt att odla celler vid högre koncentrationer.
  7. Bedöma differentiering delstaten 32D/G-CSF-R celler baserat på cellmorfologi.
    1. Fixa celler från steg 5,4 i metanol för 5 min på RT och lämna bilder lufttorka.
      Obs: Bilder från dag 0 till 7 kan vara lagrade på RT och fast samtidigt. Likaså kan de också hållas på RT under längre perioder efter fixering.
    2. Färga celler med maj-Grünwald Giemsa färgning följande tillverkarens protokollet.
    3. Visualisera färgade celler med ett mikroskop och förstoring X40.
    4. Kvantifiera antalet Blaster, intermediärt differentierade celler och mogna granulocyter med illustrativa bilder på figur 1 och beskrivning i tabell 4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Proliferation och differentiering av 32D/G-CSF-R celler

För att bedöma spridningen av 32D/G-CSF-R celler pro-proliferativ och Pro differentiering villkor, odlades 32D/G-CSF-R celler i media som innehåller IL-3 och G-CSF, respektive. Det observerades att celler odlade i IL-3 innehållande medium (10 ng/mL) delar ungefär varje 24 h (figur 2A). Vid byte av IL-3 med G-CSF (100 ng/mL) spridning gradvis avtog och slutade efter 4 dagar (figur 2A). Vidare bedömdes tillståndet differentiering av celler odlade i närvaro av G-CSF med maj-Grünwald Giemsa-färgade cytospun celler. Det visades att celler på dag 0 (före start av G-CSF-behandling), presenterar en omogen myeloblast morfologi kännetecknas av en stor kärna och en mörk cytoplasman (figur 2B). Under loppet av behandling, nukleära förminskas och formen på nucleus ändringarna till en månskärsformad eller donut-form. Ytterligare, cytoplasman är förstorad och förlorar den mörk violett färgen. Efter 6 dagars behandling med G-CSF presentera celler tecken på full neutrofil differentiering, kännetecknas av en lobulated kärna och en ljus violett cytoplasman (figur 2B). Differentiering av 32D/G-CSF-R celler är en gradvis process, där inte alla celler utvecklas mot mogna neutrofiler med exakt samma hastighet. Kvantifiering av celler i olika skeden under loppet av differentiering (nämligen blast, intermediärt differentierad cell och neutrofila) visas i figur 2B.

Murina Evi2b knockdown blockerar neutrofil differentiering i 32D/G-CSF-R celler

För nedreglering av EVI2B (Ecotropic Viral Integration webbplats 2B) i 32D/G-CSF-R celler, 3 Evi2b-inriktning (Sh2, Sh3, Sh4) och 1 icke-targeting icke-tysta kontroll (NSC1) shRNAs utformades; dessa var klonade in ett lentiviral vector redovisade en god Jordbrukarsed reporter16. 32d/G-CSF-R celler var sensorik med kontroll- och Evi2b-tysta shRNAs använder en MOI av 10. Två dagar efter transduktion, var GFP+ (sensorik) celler sorterade och expanderat för ytterligare experiment. I fall av Sh3 och Sh4, EVI2B utarmning når 80%, men Sh2 kunde effektivt downregulate EVI2B proteinnivåer, och därför användes som en ytterligare kontroll som anges här som icke-tysta kontroll 2 (NSC2). Fyra dagar efter transduktion, differentiering och spridning analyser utfördes i närvaro av G-CSF och effekterna av Evi2b nedreglering i dessa processer utvärderades. Konstaterades att Evi2b-utarmat celler (Sh2, Sh3) ihållande cellförökning i närvaro av GCSF, kontroll cellerna (NSC1 och NSC2) minska spridningen runt dag 4 (figur 3A). Vidare, Evi2b-tystade 32D/G-CSF-R celler produceras mindre mellanliggande och mogna neutrofiler jämfört med kontroll celler (figur 3B). Anmärkningsvärt, celler sensorik med NSC2, som visat dålig Evi2b knockdown effektivitet, också visade liten minskning av antalet mogna neutrofiler (figur 3B). Dessa uppgifter var nyligen publicerad16.

BCR-ABL-fusionsprotein försämrar neutrofil differentiering i 32D/G-CSF-R celler

Det har visats att BCR-ABL-fusionsprotein försämrar myeloisk differentiering, orsakar en omfattande expansion av myeloida vilket resulterar i hematopoetiska misslyckande under den akuta fasen av kronisk myeloisk leukemi25,26. Tidigare studier har visat att påtvingade uttryck för BCR-ABL i 32D cl-3 celler resulterade i ett block av neutrofila differentiering27,28. Därför undersökte vi om liknande resultat kan uppnås med 32D/G-CSF-R cell-linjen. 32d/G-CSF-R celler var sensorik med BCR-ABL eller kontroll MSCV retrovirala vektor redovisade en god Jordbrukarsed reporter (MOI = 20). 2 dagar efter transduktion, var GFP+ celler sorterade och expanderat för 2 veckor i IL-3 innehållande medium. Nästa, differentiering analyser utfördes i närvaro av G-CSF. Vi observerade att vid dag 0 (innan du överför cellerna till G-CSF innehållande medium), kontrollerar MSCV och BCR-ABL uttrycker 32D/G-CSF-R celler presenterade liknande morfologi, främst representerar omogna myeloida blast celler (figur 4). Vi visade dock att medan tom vektor sensorik kontroll celler inte genomgick neutrofil differentiering efter 6 dagar av G-CSF-behandling (producera 11,5% av mogna neutrofiler och 56,4% av intermediärt differentierade celler), mogna neutrofiler genererades från BCR-ABL-sensorik 32D/G-CSF-R celler (figur 4). Konsekvent, förblev andelen omogna blast i BCR-ABL uttrycker celler i G-CSF liknar procentandelen av blast i IL-3 villkor.

Figure 1
Figur 1. Representativa bilder av distinkta 32D/G-CSF-R cell morfologi. 32d/G-CSF-R celler kan vara morfologiskt klassificeras som blast, intermediärt differentierade celler och mogna neutrofiler. Se tabell 4 för beskrivning.

Figure 2
Figur 2. Proliferation och differentiering av 32D/G-CSF-R celler. (A) spridningen av 32D/GCSFR celler i 10 ng/mL IL-3 (svart linje) eller 100 ng/mL G-CSF (blå linje) som innehåller medium. X-axeln representerar dagars behandling. Y-axeln visas i logaritmisk skala (log2) och anger antalet celler × 105. Resultaten utgör genomsnitt av 3 oberoende experiment. Felstaplar visar standardavvikelsen. (B) differentiering av 32D/G-CSF-R celler i G-CSF-innehållande medium (100 ng/mL). I den övre panelen, pie-tomterna visar andelen Blaster (svart), intermediärt differentierade celler (rosa), och neutrofiler (röd) i kultur efter 0, 2, 4 och 6 dagar av G-CSF-behandling. Den nedre panelen innehåller representativa bilder av cytospun celler från respektive tidpunkter som färgas med maj-Grünwald Giemsa. Minst 100 celler utvärderades för varje tidpunkt.

Figure 3
Figur 3. Evi2b tysta blockerar neutrofil differentiering i 32D-G-CSF-R celler. (A) spridning av Evi2b-tystade (orange linje) och kontroll (svarta linjer) 32D/G-CSF-R celler i 100 ng/mL G-CSF innehållande medium. X-axeln representerar dagars behandling. Y-axeln visas i logaritmisk skala (log2) och anger antalet celler × 105. Resultaten visar representativa resultat av 3 oberoende experiment. (B) bedömning av differentiering av 32D/G-CSF-R celler sensorik med Evi2b-ljuddämpning och kontroll shRNAs i G-CSF-innehållande medium (100 ng/mL) med maj-Grünwald Giemsa färgning av cytospun celler. I övre panelen, pie-tomterna visar andelen Blaster (svart), intermediärt differentierade celler (rosa) och neutrofiler (röd) i kultur. De lägsta panelerna innehåller representativa bilder av cytospun celler. Differentiering bedömdes på dag 7 av differentiering. Minst 100 celler utvärderades för varje villkor.

Figure 4
Figur 4. Överuttryck av BCR-ABL-fusionsprotein försämrar differentiering av 32D/G-CSF-R celler. Bedömning av differentiering av 32D/G-CSF-R celler sensorik antingen med kontroll MSCV eller BCR-ABL fusion genen i G-CSF-innehållande medium (100 ng/mL). Övre pie-tomter visar andelen Blaster (svart), intermediärt differentierade celler (rosa) och neutrofiler (röd) på dag 6 av differentiering. De lägsta panelerna visar representativa bilder på cytospun cellerna färgas med maj-Grünwald Giemsa. Minst 100 celler utvärderades för varje tidpunkt.

Virus V [µL] Antal guldpläterade celler % GFP+ GFP+ celltal Linjär? TU/mL Genomsnitt (TU/mL)
1 100 000 1,83 1 830 Ja 1 830 000 2 350 000
5 100 000 12,9 12 900 Ja 2 580 000
10 100 000 26,4 26 400 Ja 2 640 000
50 100 000 71,4 71 400 Nej
100 100 000 85,1 85 100 Nej
500 100 000 85,6 85 600 Nej

Tabell 1. Viral titerbestämning för god Jordbrukarsed reporter som innehåller vektorer. Exempel på data som erhållits med den MSCV retrovirus och beräkningen utförs för att uppskatta viral titern. Viral titer var beräknas baserat på antalet GFP+ celler förvärvas när viss mängd virus tillämpades. Mängden virus som anställd för infektion bör vara i en linjär korrelation med procentandelen av GFP+ celler mätt. TU: omvandla enheter.

Tube Tube Beskrivning DMEM + 10% FBS Virus Totala volymen Utspädningsfaktor
(ΜL) (ΜL) (ΜL)
1 utspädning 1 1485 15 µL viral lager 1500 1 x 102
2 utspädning 2 1350 150 µL tube 1 1500 1 x 103
3 utspädning 3 1350 150 µL tube 2 1500 1 x 104
4 utspädning 4 1350 150 µL tube 3 1500 1 x 105
5 utspädning 5 1350 150 µL tube 4 1500 1 x 106

Tabell 2. Viral titerbestämning för puromycin reporter som innehåller vektorer. Viral utspädning strategi att bestämma viral titern i puromycin som innehåller vektorer. Tabellen visar hur man förbereder 5 rör (1-5) som innehåller en seriell utspädning av viral beståndet. 1 tub innehåller 1485 µL DMEM + 10% FBS och 15 µL av producerade viruset, som tillhandahåller en 1 × 10-2 utspädd virus. Tub 2 innehåller 1350 µL DMEM + 10% FBS och 150 µL av 1 × 102 utspädd virus (Tube 1), som tillhandahåller en 1 × 10-3 utspädda virus. Tub 3 innehåller 1350 µL DMEM + 10% FBS och 150 µL av de 1 × 10-3 utspädd virus (Tube 2), som tillhandahåller en 1 × 10-4 utspädda virus. Tub 4 innehåller 1350 µL DMEM + 10% FBS och 150 µL av 1 × 104 utspädd virus (Tube 3), som tillhandahåller en 1 × 10-5 utspädda virus. Tub 5 innehåller 1350 µL DMEM + 10% FBS och 150 µL av 1 × 105 utspädd virus (Tube 4), som tillhandahåller en 1 × 10-6 utspädda virus. 1 ml från lysrör 1-5 används till titer viruset.

Blodkroppar (x = antal celler per ml)
dag 0 dag 1 dag 2 dag 3 dag 4 dag 5 dag 6
Prov 1 x0 x1 x2 x3 x4 x5 x6
Utspädning (d) (y = volymen av celler som används för replating [mL]; z = slutlig volym [mL])
dag 0 dag 1 dag 2 dag 3 dag 4 dag 5 dag 6
Prov 1 d0= 1 d1= y1/z1 d2= y2/z2 d3= y3/z3 d4= y4/z4 d5= y5/z5
Totala celltal
dag 0 dag 1 dag 2 dag 3 dag 4 dag 5 dag 6
Prov 1 x0 x1 d0 x2d1 x3d2d1 x4d3d2d1 x5d4d3d2d1 x6d5d4d3d2d1

Tabell 3. Tillväxt kurva generation. Tabellen beskriver ekvationer som är nödvändiga för bedömning av spridning 32D/G-CSF-R celler.

Nucleus Cytoplasman
Blaster Mörk, rundade Mörk, nästan omöjlig att skilja från kärna
Intermediärt differentierade celler Uttalade förändringar i nukleära form, ofta donut-liknande eller månen-liknande formade Lättare, distinguishable cytoplasman
Mogna neutrofiler Lobulated kärna; nästan inga anslutningar mellan lobules Ljus cytoplasma

Tabell 4. 32D/G-CSF-R cellmorfologi under neutrofil differentiering. Tabellen sammanfattar stora morfologiska egenskaper som gör det möjligt för skillnaden av omogna Blaster, intermediärt differentierade celler och mogna neutrofiler. Kärn- och cytoplasmiska egenskaperna beskrivs. Se figur 1 för representativa bilder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Valet av en experimentell modell är en av de viktigaste frågorna i forskning. Även om primära djurs och människors celler tros producera mest biologiskt relevanta data, dessa modeller kan innebära etiska betänkligheter och förknippas ofta med dyra eller sofistikerade isolering/odling förfaranden. Primära celler är begränsade i antal och det är svårt att genetiskt manipulera dem. Dessutom utgör primära celler en heterogen befolkning består av olika celltyper som kan komplicera data tolkning29. Däremot cellinjer ger en praktiskt taget obegränsad källa av biologiskt material, är kostnadseffektiva och kunna kringgå de etiska frågorna. Det är dock viktigt att beakta att cell linjer anses vara en konstgjord experimentella system, vilka kan genetiskt och fenotypiskt skiljer sig från deras vävnad av ursprung. Dock cellinjer i kombination med andra experimentella metoder, ger en värdefull modell för generering av reproducerbara och biologiskt relevant data.

Den 32D/G-CSF-R cellinje, liksom 32D cl-3 celler, är väletablerad och ofta används cellmodeller kultur av murina neutrofil differentiering14,15,24,30. Flera forskargrupper har använt dessa celler för att bedöma vissa gener i myelopoiesis roll, och resultat som korrelerade med data som erhållits med i vivo modeller och primärceller16,31. Här vi tillhandahåller ett protokoll för hantering av 32D/G-CSF-R cellinje, dock liknande förfaranden kan tillämpas för odling och manipulera 32D cl-3 celler. Det är viktigt att påpeka att olika partier av 32D cl-3 cellerna som används i olika laboratorier nuvarande skillnader i karyotyp, vilket tyder på att olika grupper kan arbeta med sina egna subkloner32. Baserat på denna observation, hypotes vi att genetisk variabilitet kan på liknande sätt finnas i 32D/G-CSF-R celler, och detta måste beaktas när man jämför resultaten erhållits genom olika forskargrupper. Alternativa cell kultur modeller till 32D/G-CSF-R celler är förevigade hematopoetiska stamceller linjerna22,33,34,35,36. Detta tillvägagångssätt är användbart när storskaliga stamceller expansion krävs, till exempel för att studera protein interaktioner22. En fördel till 32D/G-CSF-R celler är att förevigade föräldraparets kan genereras från någon genmodifierad mus, även om tid att etablera linjen är betydligt lång37. Hantering och manipulering av benmärgen förevigade föräldraparets kräver dessutom mer kompetens än 32D/G-CSF-R celler.

För att bekanta läsaren med 32D/G-CSF-R modellen, i den första delen av de representativa resultat visat vi proliferation och differentiering kinetik av 32D/G-CSF-R celler i närvaro av IL-3 och G-CSF. Representativa bilder visar morfologi av celler i IL-3 prolifererande villkor samt vid olika tidpunkter GCSF-inducerad differentiering presenterades. Vi bedömde neutrofil differentiering av Morfologisk analys, men det har rapporterats att 32D cl-3 celldifferentiering kan bestämmas genom flödet flödescytometrisk analys med CD11b cell surface markör27,31, 38,39. Vår kunskap och expertis är CD11b inte uppreglerad under neutrofil differentiering av 32D/G-CSF-R celler. För standardisering, i 32D/G-CSF-R spridning analyserna anställt vi kommersiellt tillgängliga IL-3. Vi konstaterade dock att celler förökar sig bra i hemgjorda IL-3, produceras som beskrivs av Drobek och kollegor22. För att få en bra grad av G-CSF-inducerad neutrofil differentiering, är det viktigt att komma ihåg att 32D/G-CSF-R cellernas differentiering förmåga kan försämras om celler odlas en koncentration av 1 × 106 celler/mL. Grad och hastighet av differentiering kan dessutom påverkas av serum sammansättning. Därför är det rekommenderat att testa 32D/G-CSF-R cellernas differentiering förmåga i flera FBS partier och välj en som bättre stödjer utvecklingen av mogna neutrofiler vid 6 till 9 dagar av kultur i närvaro av G-CSF.

Vi gav två representativa experiment som visar olika sätt att studera roll särskilt proteiner i myeloisk differentiering (figur 3 och figur 4). Först, vi visade att nedreglering av EVI2B, ett transmembrane protein uttryckt i hematopoetiska celler, leder till ett block av myeloisk differentiering i 32D/G-CSF-R celler. Dessa data publicerades nyligen av vår grupp, i kombination med analyser utförs med primära celler och Evi2b knockout möss16. Det andra undersökt vi effekten av BCR-ABL, ett fusionsprotein som följd av den genetiska translokation t(9,22) (q34; q11), på neutrofil differentiering av 32D/G-CSF-R celler. Translokationen identifierades ursprungligen hos patienter som lider av kronisk myeloisk leukemi40,41. Detta uttryck av BCR-ABL fusion onkoprotein visades tidigare i 32D cl-3 celler leder till en myeloisk differentiering gripandet27,28. Här visade vi att BCR-ABL-överuttryck har liknande effekter på 32D/G-CSF-R celler. I båda uppsättningar av experiment presenteras här (där Evi2b nedreglering och BCR-ABL-överuttryck), genetisk modifiering av 32D/G-CSF-R celler utfördes via viral transduktion, vilket resulterar i stabil genuttryck. Valet av retrovirala kontra lentiviral leverans påverkar inte spridning eller differentiering av 32D/G-CSF-R celler. Lentiviral infektion är dock mer effektiva än retrovirala transduktion beror på förekomsten av endogena retrovirus i 32D/G-CSF-R celler. Enligt vår erfarenhet är transfection av dessa celler använder standard lipofila reagenser inte effektiv. Men om övergående konstruera uttryck behövs, är transfection av elektroporation en livskraftig strategi42,43,44. Här, vi presenterade genmanipulation av 32D/G-CSF-R celler följt av GFP sortering och bulk analys av de infektera cellerna. Dock om det behövs, kunde enda cell sortering användas för att generera enda cell kloner som tidigare rapporterade12,45.

Utöver proliferation och differentiering-analyser, har 32D/G-CSF-R celler använts framgångsrikt bestämma rollen av vissa proteiner i cell migration och apoptos13,46,47,48 . Ytterligare, raden 32D/G-CSF-R har använts för att fastställa cytokin oberoende tillväxt medieras av oncoproteins19,20. En annan linje som ofta används för att studera cytokin självständighet är Ba/F3 celler21,49. BA/F3 är en IL-3 beroende murin cellinje härrör från C3H mus stam, likaså till 32D/G-CSF-R celler. Även om båda systemen kan användas för att studera cytokin oberoende spridning, skilja Ba/F3 celler dåligt i närvaro av G-CSF.

Sammantaget föreslår vi att 32D/G-CSF-R celler, trots att mindre Rekommenderad än primära celler, erbjuder flera fördelar inklusive obegränsad spridning kapacitet och enkel hantering. Vi tror att experimenten utförs i 32D/G-CSF-R celler för generering av tillförlitliga uppgifter, bör kompletteras med uppgifter som erhållits med hjälp av alternativa experimentella metoder såsom murina modeller och primära kulturer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Författarna vill tacka Prof. Ruud Delwel och Prof. Ivo Touw för att förse oss med 32D/G-CSF-R cell-linjen, och Prof. Daniel G. Tenen för att förse oss med raden Bosc23 cell. Detta arbete stöds av bidrag för Grant byrån i Tjeckien (GACR 15-03796S och GACR 17-02177S) till MA-J, stöd från Institutet för molekylär genetik av den tjeckiska vetenskapsakademin (RVO 68378050) till MA-J, ett GA UK stipendium (projekt nr 341015) från Charles University i Prag till MK och en GA UK fellowship (projekt nr 1278217) från Charles University i Prag till PD.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 powder medium Merck, Kenilworth, NJ, USA T 121-10 without NaHCO3, with L-glutamine
DMEM Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 15028
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 31985-047 L-Glutamine, Phenol Red
Fetal bovine serum (FBS) PAA Laboratories (GE Healthcare,Chicago, IL, USA) MT35011CV For differentiation of 32D/G-CSF-R cells
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 10270 Used for culturing HEK293T, NIH3T3, BOSC23 cells
Penicillin Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) P3032
Streptomycin Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) S9137 Streptomycin sulfate salt powder
Gentamicin Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) G1914
murine IL-3 PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA 213-13
human G-CSF PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA 300-23
Polyethylenimine Polyscience, Warrington, PA, USA 23966 Linear, MW 25,000 (PEI 25000)
Polybrene Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) H9268
Trypsin VWR Chemicals, Radnor, PA, USA 0458
EDTA Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) E5134
Crystal violet Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) C0775
Trypan blue Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) T6146
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) D2650
May-Grünwald Giemsa DiaPath, Martinengo, BG, Italy 10802

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bonilla, M. A., et al. Effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor on neutropenia in patients with congenital agranulocytosis. N Engl J Med. 320 (24), 1574-1580 (1989).
  2. Bennett, C. L., Djulbegovic, B., Norris, L. B., Armitage, J. O. Colony-stimulating factors for febrile neutropenia during cancer therapy. N Engl J Med. 368 (12), 1131-1139 (2013).
  3. Lowenberg, B., Downing, J. R., Burnett, A. Acute myeloid leukemia. N Engl J Med. 341 (14), 1051-1062 (1999).
  4. Dong, F., et al. Identification of a nonsense mutation in the granulocyte-colony-stimulating factor receptor in severe congenital neutropenia. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (10), 4480-4484 (1994).
  5. Rosenbauer, F., Tenen, D. G. Transcription factors in myeloid development: balancing differentiation with transformation. Nat Rev Immunol. 7 (2), 105-117 (2007).
  6. Kota, J., Caceres, N., Constantinescu, S. N. Aberrant signal transduction pathways in myeloproliferative neoplasms. Leukemia. 22 (10), 1828-1840 (2008).
  7. Kvinlaug, B. T., et al. Common and overlapping oncogenic pathways contribute to the evolution of acute myeloid leukemias. Cancer Res. 71 (12), 4117-4129 (2011).
  8. Krug, U., Ganser, A., Koeffler, H. P. Tumor suppressor genes in normal and malignant hematopoiesis. Oncogene. 21 (21), 3475-3495 (2002).
  9. Greenberger, J. S., Sakakeeny, M. A., Humphries, R. K., Eaves, C. J., Eckner, R. J. Demonstration of permanent factor-dependent multipotential (erythroid/neutrophil/basophil) hematopoietic progenitor cell lines. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (10), 2931-2935 (1983).
  10. Valtieri, M., et al. Cytokine-dependent granulocytic differentiation. Regulation of proliferative and differentiative responses in a murine progenitor cell line. J Immunol. 138 (11), 3829-3835 (1987).
  11. Dong, F., et al. Mutations in the gene for the granulocyte colony-stimulating-factor receptor in patients with acute myeloid leukemia preceded by severe congenital neutropenia. N Engl J Med. 333 (8), 487-493 (1995).
  12. Jorda, M. A., Lowenberg, B., Delwel, R. The peripheral cannabinoid receptor Cb2, a novel oncoprotein, induces a reversible block in neutrophilic differentiation. Blood. 101 (4), 1336-1343 (2003).
  13. Jorda, M. A., et al. Hematopoietic cells expressing the peripheral cannabinoid receptor migrate in response to the endocannabinoid 2-arachidonoylglycerol. Blood. 99 (8), 2786-2793 (2002).
  14. Abbas, S., et al. Integrated genome-wide genotyping and gene expression profiling reveals BCL11B as a putative oncogene in acute myeloid leukemia with 14q32 aberrations. Haematologica. 99 (5), 848-857 (2014).
  15. Zhuang, D., Qiu, Y., Kogan, S. C., Dong, F. Increased CCAAT enhancer-binding protein epsilon (C/EBPepsilon) expression and premature apoptosis in myeloid cells expressing Gfi-1 N382S mutant associated with severe congenital neutropenia. J Biol Chem. 281 (16), 10745-10751 (2006).
  16. Zjablovskaja, P., et al. EVI2B is a C/EBPalpha target gene required for granulocytic differentiation and functionality of hematopoietic progenitors. Cell Death Differ. 24 (4), 705-716 (2017).
  17. Santini, V., et al. The carboxy-terminal region of the granulocyte colony-stimulating factor receptor transduces a phagocytic signal. Blood. 101 (11), 4615-4622 (2003).
  18. Liu, H., Qiu, Y., Xiao, L., Dong, F. Involvement of protein kinase Cepsilon in the negative regulation of Akt activation stimulated by granulocyte colony-stimulating factor. J Immunol. 176 (4), 2407-2413 (2006).
  19. Kelly, L. M., et al. FLT3 internal tandem duplication mutations associated with human acute myeloid leukemias induce myeloproliferative disease in a murine bone marrow transplant model. Blood. 99 (1), 310-318 (2002).
  20. Pikman, Y., et al. MPLW515L is a novel somatic activating mutation in myelofibrosis with myeloid metaplasia. PLoS Med. 3 (7), e270 (2006).
  21. Schwaller, J., et al. Transformation of hematopoietic cell lines to growth-factor independence and induction of a fatal myelo- and lymphoproliferative disease in mice by retrovirally transduced TEL/JAK2 fusion genes. EMBO J. 17 (18), 5321-5333 (1998).
  22. Drobek, A., et al. PSTPIP2, a Protein Associated with Autoinflammatory Disease, Interacts with Inhibitory Enzymes SHIP1 and Csk. J Immunol. 195 (7), 3416-3426 (2015).
  23. Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. J Virol. 70 (8), 5701-5705 (1996).
  24. Alberich-Jorda, M., et al. C/EBPgamma deregulation results in differentiation arrest in acute myeloid leukemia. J Clin Invest. 122 (12), 4490-4504 (2012).
  25. Calabretta, B., Perrotti, D. The biology of CML blast crisis. Blood. 103 (11), 4010-4022 (2004).
  26. Ren, R. Mechanisms of BCR-ABL in the pathogenesis of chronic myelogenous leukaemia. Nat Rev Cancer. 5 (3), 172-183 (2005).
  27. Schuster, C., et al. The effects of Bcr-Abl on C/EBP transcription-factor regulation and neutrophilic differentiation are reversed by the Abl kinase inhibitor imatinib mesylate. Blood. 101 (2), 655-663 (2003).
  28. Chang, J. S., et al. High levels of the BCR/ABL oncoprotein are required for the MAPK-hnRNP-E2 dependent suppression of C/EBPalpha-driven myeloid differentiation. Blood. 110 (3), 994-1003 (2007).
  29. Velten, L., et al. Human haematopoietic stem cell lineage commitment is a continuous process. Nat Cell Biol. 19 (4), 271-281 (2017).
  30. Jorda, M. A., Rayman, N., Valk, P., De Wee, E., Delwel, R. Identification, characterization, and function of a novel oncogene: the peripheral cannabinoid receptor Cb2. Ann N Y Acad Sci. 996, 10-16 (2003).
  31. Wurm, A. A., et al. Disruption of the C/EBPalpha-miR-182 balance impairs granulocytic differentiation. Nat Commun. 8 (1), 46 (2017).
  32. Agliano, A. M., et al. On chromosomal instability: what is the karyotype of your 32D CI3 cell line. Blood. 95 (11), 3636-3637 (2000).
  33. Wang, G. G., et al. Quantitative production of macrophages or neutrophils ex vivo using conditional Hoxb8. Nat Methods. 3 (4), 287-293 (2006).
  34. Houston, I. B., Huang, K. J., Jennings, S. R., DeKoter, R. P. PU.1 immortalizes hematopoietic progenitors in a GM-CSF-dependent manner. Exp Hematol. 35 (3), 374-384 (2007).
  35. Calvo, K. R., Sykes, D. B., Pasillas, M., Kamps, M. P. Hoxa9 immortalizes a granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-dependent promyelocyte capable of biphenotypic differentiation to neutrophils or macrophages, independent of enforced meis expression. Mol Cell Biol. 20 (9), 3274-3285 (2000).
  36. Calvo, K. R., Sykes, D. B., Pasillas, M. P., Kamps, M. P. Nup98-HoxA9 immortalizes myeloid progenitors, enforces expression of Hoxa9, Hoxa7 and Meis1, and alters cytokine-specific responses in a manner similar to that induced by retroviral co-expression of Hoxa9 and Meis1. Oncogene. 21 (27), 4247-4256 (2002).
  37. Fossati-Jimack, L., et al. Phagocytosis is the main CR3-mediated function affected by the lupus-associated variant of CD11b in human myeloid cells. PLoS One. 8 (2), e57082 (2013).
  38. Schwable, J., et al. RGS2 is an important target gene of Flt3-ITD mutations in AML and functions in myeloid differentiation and leukemic transformation. Blood. 105 (5), 2107-2114 (2005).
  39. Worch, J., et al. The serine-threonine kinase MNK1 is post-translationally stabilized by PML-RARalpha and regulates differentiation of hematopoietic cells. Oncogene. 23 (57), 9162-9172 (2004).
  40. Rowley, J. D. Letter: A new consistent chromosomal abnormality in chronic myelogenous leukaemia identified by quinacrine fluorescence and Giemsa staining. Nature. 243 (5405), 290-293 (1973).
  41. Stam, K., et al. Evidence of a new chimeric bcr/c-abl mRNA in patients with chronic myelocytic leukemia and the Philadelphia chromosome. N Engl J Med. 313 (23), 1429-1433 (1985).
  42. Holly, S. P., Larson, M. K., Parise, L. V. The unique N-terminus of R-ras is required for Rac activation and precise regulation of cell migration. Mol Biol Cell. 16 (5), 2458-2469 (2005).
  43. Pierce, J. H., et al. Macrophage-colony-stimulating factor (CSF-1) induces proliferation, chemotaxis, and reversible monocytic differentiation in myeloid progenitor cells transfected with the human c-fms/CSF-1 receptor cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (15), 5613-5617 (1990).
  44. Pierce, J. H., et al. Signal transduction through the EGF receptor transfected in IL-3-dependent hematopoietic cells. Science. 239 (4840), 628-631 (1988).
  45. Oomen, S. P., et al. Somatostatin modulates G-CSF-induced but not interleukin-3-induced proliferative responses in myeloid 32D cells via activation of somatostatin receptor subtype 2. Hematol J. 2 (5), 322-329 (2001).
  46. Oomen, S. P., et al. Somatostatin is a selective chemoattractant for primitive (CD34(+)) hematopoietic progenitor cells. Exp Hematol. 30 (2), 116-125 (2002).
  47. Nogami, A., et al. FLT3-ITD confers resistance to the PI3K/Akt pathway inhibitors by protecting the mTOR/4EBP1/Mcl-1 pathway through STAT5 activation in acute myeloid leukemia. Oncotarget. 6 (11), 9189-9205 (2015).
  48. Rodel, J. E., Link, D. C. Suppression of apoptosis during cytokine deprivation of 32D cells is not sufficient to induce complete granulocytic differentiation. Blood. 87 (3), 858-864 (1996).
  49. Daley, G. Q., Baltimore, D. Transformation of an interleukin 3-dependent hematopoietic cell line by the chronic myelogenous leukemia-specific P210bcr/abl protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 85 (23), 9312-9316 (1988).

Tags

Utvecklingsbiologi fråga 132 32D/G-CSF-R celler murina myeloiska prekursorceller flytande kultur differentiering neutrofiler spridning cytokiner IL-3 G-CSF
Proliferation och differentiering av murina myeloiska föregångare 32D/G-CSF-R celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zjablovskaja, P., Danek, P.,… More

Zjablovskaja, P., Danek, P., Kardosova, M., Alberich-Jorda, M. Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells. J. Vis. Exp. (132), e57033, doi:10.3791/57033 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter