Summary
Apresentam-se aqui detalhados protocolos para a linha de celular de 32G/G-CSF-R precursor mieloide murino de cultivo, realizando a infecções virais e realizar ensaios de proliferação e diferenciação. Esta linha de celular é adequada para estudar o desenvolvimento de células mieloides e o papel dos genes de interesse no crescimento de células mieloides e diferenciação neutrofílica.
Abstract
Compreensão da hematopoiética estaminais e progenitor da biologia das células tem implicações importantes para o tratamento de patologias hematológicas e medicina regenerativa. Apesar dos dados mais relevantes que podem ser adquiridos usando modelos na vivo ou culturas primárias, a baixa abundância de células estaminais e progenitoras hematopoiéticas restringe consideravelmente a piscina de técnicas adequadas para sua investigação. Portanto, o uso de linhas celulares permite produção suficiente de material biológico para o desempenho das seleções ou ensaios que requerem números de células grandes. Aqui apresentamos uma descrição detalhada, leitura e interpretação de ensaios de proliferação e diferenciação, que são utilizados para a investigação dos processos envolvidos na myelopoiesis e diferenciação neutrofílica. Estas experiências empregam a linha de célula mieloide murino dependente de citocinas 32G/G-CSF-R, que possui a habilidade de se proliferam na presença de IL-3 e se diferenciam em G-CSF. Nós fornecemos otimizado de protocolos para a manipulação de células de 32G/G-CSF-R... e discutir as principais armadilhas e inconvenientes que possam comprometer os ensaios descritos e os resultados esperados. Além disso, este artigo contém protocolos para produção de Lentivirus e retroviral, titulação e transdução de células de 32G/G-CSF-R. Demonstramos que manipulação genética destas células pode ser empregada com sucesso realizar estudos moleculares e funcionais, que podem complementar os resultados obtidos com primárias células tronco e progenitoras hematopoiéticas ou modelos na vivo .
Introduction
A população de tronco e progenitoras hematopoiética fornece o organismo com uma grande variedade de células maduras, incluindo as células da linhagem mieloide (neutrófilos, eosinófilos, basófilos e monócitos). O processo que conduz à produção de células mieloides das pilhas de haste hematopoietic é conhecido como myelopoiesis, e produção adequada de células mieloides maduras, em resposta às novas demandas é um pré-requisito para o enfrentamento adequado do organismo com o stress condições, tais como infecções e perda de sangue. Produção insuficiente de células mieloides maduras pode levar à incapacidade de eliminar os agentes patogénicos, coagulação sanguínea reduzida e outros fatais condições1,2. Além disso, alterações no desenvolvimento da linhagem mieloide podem também ser associadas com malignidades hematológicas, como a leucemia mieloide aguda (LMA)3. Alterações no myelopoiesis podem ocorrer devido a várias razões, tais como defeitos no celular receptores de superfície4, expressões alterados de fatores de transcrição5, prejudicados de vias de sinalização6, mutações, resultando na formação / ativação de oncogenes7ou inactivação do tumor supressor genes8.
Vários métodos foram desenvolvidos para estudar o desenvolvimento mieloide e avaliar o efeito de alterações genéticas específicas neste processo. Abordagens comuns usadas para estudar myelopoiesis envolvem as células primárias e ratos transgénicos. Embora estes modelos permitem a aquisição de dados biologicamente relevantes, eles têm certas limitações. O uso de células primárias encontra um número limitado de células e um período restrito da cultura, estreitando as possibilidades para alterar a expressão gênica e posterior análise biológica ou bioquímica. Camundongos transgênicos são caros e exigem um grau razoável de justificação biológica. Além disso, trabalho com modelos em vivo adiciona um grau de complexidade em compreender o papel de um gene de interesse em um determinado processo. Portanto, abordagens alternativas para contornar essas limitações são necessários. Linhas celulares têm vantagens indiscutíveis: (1) eles possuem capacidade de proliferação ilimitada que permite gerar material suficiente para estudos bioquímicos e biológicos, (2) eles são suscetíveis a manipulações genéticas (knockdown, nocaute, superexpressão), (3) o custo é relativamente baixo, e (4) permitem um grau de simplificação biológica necessária em certas abordagens experimentais.
A IL-3 parental (interleucina-3) dependente 32G linha celular foi criada em 1983 por Greenberger e colegas por infecção de células de medula óssea de camundongos C3H/HeJ com amigo murino leucemia vírus9. Vários clones 32D foram descritos na literatura: cl-239, cl-310e cl-1011. As células de cl-3 32D foram mostradas para proliferar em IL-3 e se submeter a diferenciação neutrofílica após tratamento com estimulação de colônias de granulócitos-colônia factor (G-CSF)10. Pelo contrário, 32D cl-10 células, enquanto ser dependente de IL-3, originalmente foram não diferenciar na resposta ao tratamento de G-CSF. Em 1995, o grupo do Dr. Ivo Touw retrovirally transfectadas 32D cl-10 pilhas tipo selvagem e formas mutantes do receptor de G-CSF (G-CSF-R), a fim de identificar regiões funcionalmente importantes deste receptor11. Este estudo resultou na geração de células 32G/G-CSF-R, que são da mesma forma dependente da IL-3, mas dentro de 6 a 10 dias após a substituição da IL-3 G-CSF, células param para proliferar e diferenciar irreversivelmente em neutrófilos maduros. Estas propriedades tornam 32D cl-3 e modelos simplificados de 32G/G-CSF-R células de murino neutrofílico diferenciação que pode ser modulada por duas crescimento bem definido e fatores de diferenciação - IL-3 e G-CSF. Durante as últimas décadas vários grupos utilizaram células 32G/G-CSF-R para estudar o papel dos genes específicos em proliferação e diferenciação de células mieloides em cultura12,13,14,15 , 16e estudar o G-CSF sinalização17,18. Importante, os resultados obtidos com esta linha de celular correlacionaram com dados obtidos com as células primárias e ratos transgénicos16,19,20,21. Consequentemente, acreditamos que células de 32G/G-CSF-R, sendo um modelo amplamente utilizado e bem estabelecido, representam um valioso sistema de estudar a diferenciação mieloide, que pode ser usada em paralelo com outras abordagens para tratar esta questão.
Aqui, protocolos detalhados descrevendo a manipulação da linha celular 32G/G-CSF-R, que expansão de cobertura, diferenciação e avaliação da proliferação e diferenciação dessas células é apresentada. Informações detalhadas para modificação genética de células de 32G/G-CSF-R, quer por transdução retroviral ou particulas de Lentivirus, bem como os protocolos para a titulação do vírus são fornecidas. Além disso, vários resultados representativos que demonstram potenciais aplicações das células de 32G/G-CSF-R são fornecidos.
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Protocol
Nota: Passos descrevendo a expansão, diferenciação e transdução de 32G/G-CSF-R células são apresentados abaixo.
1. preparação
- Preparação de meios de comunicação
- Preparar 250 mL de meio de cultura: suplementado com 10% de calor 1640 RPMI (Roswell Park Memorial Institute) inativada FBS (soro fetal bovino) e IL-3 murino (10 ng/mL).
- Como alternativa, use o caseiro IL-3. Para produzir caseiras IL-3, transduce células HEK293 com vetor expressando IL-3 e IL-3 contendo sobrenadante22de recolher.
Nota: Os antibióticos, como a penicilina G (100 UI/mL), estreptomicina (100 µ g/mL) e gentamicina (40 µ g/mL), podem ser usados para o cultivo de células em qualquer etapa do protocolo a menos que indicado o contrário.
- Como alternativa, use o caseiro IL-3. Para produzir caseiras IL-3, transduce células HEK293 com vetor expressando IL-3 e IL-3 contendo sobrenadante22de recolher.
- Prepare-se 50 mL de meio de diferenciação: RPMI 1640 meio suplementado com 10% FBS e G-CSF humano (100 ng/mL).
Nota: Nem todos os lotes de soro suportam a diferenciação das células de 32G/G-CSF-R (importante). Antes do início do experimento teste diferentes lotes de soro. É aconselhável testar pelo menos 4 lotes diferentes e selecione o ideal baseado na capacidade das células de 32G/G-CSF-R para diferenciar. Veja o protocolo de diferenciação de 32G/G-CSF-R abaixo. - Prepare-se 10 mL de meio de congelação: RPMI 1640 meio suplementado com 40% FBS e 10% DMSO (Dimetilsulfóxido).
- Preparar 250 mL de meio de cultura: suplementado com 10% de calor 1640 RPMI (Roswell Park Memorial Institute) inativada FBS (soro fetal bovino) e IL-3 murino (10 ng/mL).
- Produção de retrovírus
- Placa de uma suspensão de célula única de células Bosc23 (6 × 10-6) em um prato de Petri de 16 cm e cultivar em 18 mL de DMEM (médio modificado águia de Dulbecco) contendo 10% FBS até a confluência da cultura chega a 80% (24h).
Nota: As células devem crescer em uma monocamada e não forma touceiras em cultura. Contagem de células pode ser realizada usando diferentes métodos (válidos para o resto dos protocolos aqui apresentados). Em caso de baixo número de amostras, contagem manual sob o microscópio utilizando câmara de Bürker é recomendado. Nesse caso, use Trypan azul para exclusão de células mortas. Misture pilhas 1:1 com 0,4% Trypan azul em PBS. Para realizar a contagem de grande número de amostras, um contador automático de células pode ser empregado. - Combine a 40 µ g de construção retroviral (como MSCV), 20 µ g de pCL-Eco (vetor de embalagem)23, 80 µ l de PEI (o polyethylenimine) e 2 mL do meio médio reduzido-soro (por exemplo, Opti-MEM) (sem antibióticos). Incube a mistura por 20 min em temperatura ambiente (RT).
- Cuidadosamente, substituir Bosc23 células medium com 16 mL DMEM suplementado com 2% FBS. Pré-aquecer a médio e a 37 ° C antes do uso.
Nota: Não use antibióticos durante a transfeccao, uma vez que pode reduzir a eficiência do transfection. - Adicione a mistura preparada em 1.2.2. gota a gota e cuidadosamente para o Bosc23 da cultura e incube por 4 h a 37 ° C. Incubação de limite inferior a 6 h devido à toxicidade de PEI.
- Após a incubação, altere Bosc23 médio para 18 mL pré aquecido DMEM contendo 10% FBS e cultivar células por 48 h a 37 ° C. Coloque os pratos em um laboratório de nível 2 de biossegurança, manter aqui desta etapa em e siga os procedimentos de segurança padrão.
- Bosc23 médio (contendo partículas de ecotropic retroviral) usando uma pipeta sorológica de 25 mL para um tubo cónico de 50 mL de coletar e armazenar a 4 ° C.
Nota: Eficiência de transfeccao (importante) deve chegar a 90% para produzir um vírus de alta concentração. - Adicionar 18ml pré aquecido DMEM 10% FBS para Bosc23 células e cultivar por 24 h.
- Repita a etapa 1.2.6.
Nota: Retroviral sobrenadantes de 1.2.6 e 1.2.8 podem ser pool, uma vez que eles atinjam a mesma temperatura (4 ° C) para preservar a integridade viral. - Para evitar a contaminação de Bosc23 em sobrenadantes virais, girar o vírus coletado em 1500 × g por 10 min a 4 ° C. Alíquota vírus, snap congelamento com nitrogênio líquido ou gelo seco e armazenar a-80 ° C. No entanto, observe que esse vírus recentemente preparado é de qualidade superior em termos de eficiência de infecção estoques congelados.
Nota: Evite (importante) repetitiva de congelamento/descongelamento de vírus, uma vez que leva à degradação viral.
- Placa de uma suspensão de célula única de células Bosc23 (6 × 10-6) em um prato de Petri de 16 cm e cultivar em 18 mL de DMEM (médio modificado águia de Dulbecco) contendo 10% FBS até a confluência da cultura chega a 80% (24h).
- Produção de lentivirus
- Placa de uma suspensão de célula única de HEK293T (rim embrionário humano 293T) células (6 × 10-6) em um prato de Petri de 16 cm e cultivar em 18 mL de DMEM contendo 10% FBS até a confluência da cultura chega a 80% (24h).
Nota: As células devem crescer em uma monocamada e não forma touceiras em cultura. - Combinar a 15 µ g de Lentivirus construção (como pGhU6), embalagem pCMVdR8.74 de plasmídeos (codificação para gag/pol, 12 µ g) e pMD2.VSVG (codificação para VSV-G, 1,4 µ g), µ l 85.2 PEI e 2 mL de meio de soro e reduzida (sem antibióticos). Incubar a esta mistura por 20 min no RT
- Cuidadosamente, substituir HEK293T medium com 16 mL de DMEM suplementado com 2% FBS. Pré-aquecer a médio e a 37 ° C antes do uso. Não utilize antibióticos durante a transfeccao, uma vez que pode reduzir a eficiência do transfection.
- Com cuidado solte a mistura preparada em 1.3.2 à cultura de pilha HEK293T e incube por 4 h a 37 ° C. Limitar a duração de incubação para dentro de 6 h para prevenir a toxicidade de PEI.
- Médio e mudança 18ml pré aquecido DMEM 10% FBS e cultivar células por 48 h a 37 ° C. Coloque os pratos em um laboratório de nível 2 de biossegurança, manter aqui desta etapa em e siga os procedimentos de segurança padrão.
- Coletar HEK293T médio (que contém particulas de Lentivirus de amphotropic), usando uma pipeta sorológica de 25 mL para um tubo cónico de 50 mL e armazená-lo em 4 ° C.
Nota: Eficiência de transfeccao (importante) deve chegar a 90% para produzir um vírus de alta concentração. - Adicionar cuidadosamente 18 mL de DMEM pré-aquecido 10% FBS às células HEK293T. Cultivamos por 24 h a 37 ° C.
- Repita a etapa 1.3.6.
Nota: Lentivirus sobrenadantes de 1.3.6 e 1.3.8 podem ser agrupados quando atingem a mesma temperatura (4 ° C) para preservar a integridade viral. - Para evitar a contaminação do sobrenadante viral com células HEK293T, girar o vírus coletado em 1500 × g por 10 min a 4 ° C. Alíquota vírus, snap congelamento com nitrogênio líquido ou gelo seco e armazená-lo a-80 ° C. No entanto, observe que preparadas de vírus é de qualidade superior em termos de eficiência de infecção estoques congelados.
Nota: Evite (importante) repetitiva de congelamento/descongelamento de vírus, uma vez que leva à degradação viral.
- Placa de uma suspensão de célula única de HEK293T (rim embrionário humano 293T) células (6 × 10-6) em um prato de Petri de 16 cm e cultivar em 18 mL de DMEM contendo 10% FBS até a confluência da cultura chega a 80% (24h).
- Titulação do vírus contendo um repórter GFP
- 1 × 105 NIH/3T3 células em 300 µ l de DMEM de sementes 10% FBS por alvéolo em uma placa de 24. 7 poços serão empregados para vírus de um título.
- Descongelar o vírus a 37 ° C e adicionar 1, 5, 10, 50, 100 e 500 vírus µ l para culturas de NIH/3T3. Não adicione qualquer vírus no controle negativo bem. Cultivar células na presença do vírus por 48 h a 37 ° C.
- Colher células NIH/3T3 usando 30 µ l de tripsina/EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) (0,25% Trypsin, EDTA 0,01% em PBS) e colocar as células em 250 µ l PBS em um tubo de FACS (classificação de célula de fluorescência ativada).
- Determine a frequência de células GFP+ por citometria de fluxo em cada amostra24. Exclua células mortas pela adição de um corante de viabilidade, tais como a Hoechst 33258.
- Calcular o número total de células GFP+ (com base no número de células chapeados e percentagem de células GFP+ ) e parcela-las contra o volume de vírus usada para infecção.
Nota: (Importante) eficiência de infecção atinge um platô quando grandes doses de virais são aplicadas. Portanto, é importante estimar o título com base na concentração viral no qual infecção eficiência ocorre em uma escala linear (exemplo mostrado na tabela 1). O número de células GFP+ indica o número de partículas virais funcionais (TU - transformando unidades) em um volume determinado vírus. Recalcule o número de TU por mL.
- Titulação do vírus contendo um repórter de puromicina
- 10% de sementes 5 × 104 células de NIH/3T3 em 3 mL de DMEM FBS por alvéolo em uma placa de 6; emprega 6 poços de vírus de um título. Cultura durante a noite a 37 ° C.
- No dia seguinte diluir vírus conforme indicado na tabela 2. Para diluir o vírus, use DMEM pré-aquecido 10% FBS. Fazer não o vórtice.
- Remover o meio de cultura de células NIH/3T3 e adicionar 1 mL de vírus diluído.
- Incubar durante uma noite a 37 ° C.
- Delicadamente, substituir o meio contendo vírus com 2 mL de DMEM pré-aquecido 10% FBS e incubar durante uma noite a 37 ° C.
- Delicadamente, substitua NIH/3T3 médio com 2 mL de pré-aquecido DMEM 10% FBS contendo puromicina (2 µ g/mL).
- Cultura em 37 ° C e cuidadosamente atualização médio com puromicina cada 3 dias ou quando o meio fica amarelo.
- Em 10-12 dias após a infecção, Aspire o meio de cada poço e lave delicadamente com PBS.
- Manchar com 1 mL de solução de cristal violeta (violeta de cristal de 0,5% em 20% de etanol e dH2O), 2 min no RT e Lave cuidadosamente com PBS duas vezes.
- Colônias de contagem azul presentes em cada poço sob um microscópio (ampliação X4). Não devem ser observadas colónias no controle negativo bem.
- Calcule o número total de TU/mL, considerando o factor de diluição.
2. a expansão e manutenção das células de 32G/G-CSF-R
- Se as células de 32G/G-CSF-R estão congeladas, tomar uma alíquota e descongelar as células em um banho de água de 37 ° C por 1 min e despeje células do frasco diretamente em 10 mL de pré-aquecido RPMI 1640 suplementado com 10% FBS em um tubo de 15mL. Inverter o tubo 3 vezes e girar as células para baixo a 400 g. × remover o sobrenadante e ressuspender as células em meio de cultura contendo IL-3 em uma concentração de 0,3 × 106 células/mL.
- Concentração de crescimento de célula ideal é 0.25-0.5 × 106 células/mL. Dividir células a cada 2 dias, trazendo-os para uma concentração de 0.1-0.2 × 106 células/mL.
Nota: As células de 32G/G-CSF-R (importante) podem parcialmente perdem a capacidade de diferenciar-se crescido para concentrações superiores a 1 × 106 células/mL. Portanto, é muito importante dividir células 32G/G-CSF-R no tempo. - Conforme necessário, congelar e armazenar alíquotas de célula por longos períodos de tempo a-80 ° C ou em nitrogênio líquido. Spin para baixo 3 × 106 células, remover o sobrenadante e ressuspender em 1 mL de meio de congelação. Coloque o tubo em um recipiente de congelamento a-80 ° C. Para armazenamento a longo prazo, reposicione as células de nitrogênio líquido.
3. transdução da células de 32G/G-CSF-R
- Células de 32G/G-CSF-R de placa em placa de 6 em uma concentração de 0,3 × 106 células/mL.
- Adicione a quantidade apropriada de vírus para alcançar um MOI (multiplicidade de infecção), entre 10 e 40.
Nota: MOI superior resultará em maior percentagem de células GFP+ , bem como maiores níveis de expressão do gene de interesse. Exemplo: Para infectar 0,3 × 106 células com um MOI de 10; 3 × 106 TU precisará ser adicionado às células 32G/G-CSF-R. - Adicionar polybrene à concentração final 8 µ g/mL e incubar durante 6 h a 37 ° C. Alternativamente, executar um procedimento de inoculação de centrifugação: centrifugar a 1200 × g por 90 min a 30 ° C em uma placa de cultivo utilizando um rotor de balanço-balde e incubar durante 3 h a 37 ° C.
- Coletamos células, transfira para um tubo de 15 mL e giram em 450 × g por 5 min (4 ° C).
- Desprezar o sobrenadante, resuspenda o pellet de células em 6 mL de meio de cultura, colocar em um frasco de cultura celular T25 e cultura a 37 ° C.
- 48 h depois, colher células e girá-los em 450 × g por 5 min (4 ° C). Desprezar o sobrenadante.
- No caso de um repórter GFP: colocar as células em 500 µ l de PBS e classificar células GFP+ usando um classificador de citometria de fluxo. No caso de um repórter de puromicina contendo vector: colocar as células em meio de cultura contendo 2 µ g/mL de puromicina.
- Expanda as células conforme necessário para experiências e análises posteriores.
Nota: Células Transduced (opcional) podem ser congeladas no congelamento de mídia em um recipiente de congelamento a-80 ° C e mais armazenadas em nitrogênio líquido.
4. 32G/G-CSF-R ensaio de proliferação de células
- Para avaliar a proliferação taxa lugar 0.2 × 106 células em 1 mL de meio de cultura e incubar durante uma noite a 37 ° C.
- No dia seguinte contar o número de células e diluí-los de volta para uma concentração de 0.2 × 106 células/mL, utilizando o meio de cultura. Incubar durante uma noite a 37 ° C. Manter registros de célula concentrações e diluições aplicadas às culturas diariamente usando a tabela 3.
- Repita a etapa 4.2 para tantos dias como proliferação deve ser avaliada.
Nota: O comprimento dos ensaios proliferação vai depender do efeito do gene de interesse. No caso de um fenótipo forte, 8-9 dias pode ser suficientes para observar um efeito significativo (ver Figura 3A). No entanto, no caso de um fenótipo suave, longos períodos de tempo podem ser necessários. - Avalie o crescimento celular, fazendo uma curva de proliferação, como indicado na tabela 3.
5. ensaio de diferenciação de células 32G/G-CSF-R
- Lavam-se 0,2 × 106 células de 32G/G-CSF-R duas vezes com meio RPMI sem citocinas.
Nota: As etapas de lavagem antes da adição de G-CSF na cultura são importantes, desde que a presença de IL-3 residual pode inibir a diferenciação. - Colocar as células em meio de diferenciação 1 mL (contendo 100 ng/mL G-CSF) em um poço 24/placa, resultando em uma concentração de célula de 0.2 × 106 células/mL (dia 0). Cultura durante a noite a 37 ° C.
- Contar o número de células/mL, como indicado acima (passo 1.2.1).
- Cytospin 2-5 × 104 células sobre uma lâmina de vidro (76 X 26 mm) utilizando uma centrífuga com adaptadores necessários em 20 × g.
- Atualize as células de médio e placa de diferenciação na concentração de 0.2 × 105 células/mL em um poço/placa 24 (1 dia). Descartar a placa velha e prosseguir no dia seguinte com passo 5.6 com a placa nova.
- Nos dias 2 a 7, repita as etapas de 5,3 a 5.5. Avalie a proliferação celular na presença de G-CSF, conforme descrito na etapa 4.
Nota: (Importante) durante a diferenciação, proliferação celular desacelera, portanto depois de 3 a 4 dias na presença de G-CSF é adequada para as células de cultura em altas concentrações. - Avalie o estado de diferenciação das células de 32G/G-CSF-R com base na morfologia celular.
- Consertar as células da etapa 5.4 em metanol durante 5 min à RT e deixar slides para secar ao ar livre.
Nota: Slides de dia 0 a 7 podem ser armazenadas no RT e fixo ao mesmo tempo. Da mesma forma, eles podem também ser mantidos no RT por longos períodos após a fixação. - Mancha de células usando maio-Grünwald Giemsa mancha o protocolo seguinte do fabricante.
- Visualize células coradas, usando um microscópio e ampliação X40.
- Quantificar o número de blastos, células intermediària diferenciadas e granulócitos maduros usando Fotos ilustrativas na descrição na tabela 4e Figura 1 .
- Consertar as células da etapa 5.4 em metanol durante 5 min à RT e deixar slides para secar ao ar livre.
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Representative Results
Proliferação e diferenciação das células de 32G/G-CSF-R
Para avaliar a proliferação de células de 32G/G-CSF-R condições pro-proliferativa e pro-diferenciação, 32G/G-CSF-R as células foram cultivadas em meios contendo IL-3 e G-CSF, respectivamente. Observou-se que as células cultivadas num meio contendo de IL-3 (10 ng/mL) dividem aproximadamente cada 24 h (Figura 2A). Após substituição da IL-3 com G-CSF (100 ng/mL) proliferação gradualmente diminuiu e parou depois de 4 dias (Figura 2A). Além disso, o estado de diferenciação das células cultivadas na presença de G-CSF usando células manchadas de maio-Grünwald Giemsa cytospun foi avaliado. Foi demonstrado que, no dia 0 (antes do início do tratamento de G-CSF), as células apresentam uma morfologia mieloblasto como imatura, caracterizada por um grande núcleo e uma citoplasma escura (Figura 2B). No decorrer do tratamento, o tamanho nuclear é reduzido e a forma das alterações núcleo em forma de lua ou forma de donut. Além disso, o citoplasma é ampliado e perde a cor violeta escura. Após 6 dias de tratamento com G-CSF, células apresentam sinais de diferenciação completa neutrofílica, caracterizada por um núcleo lobulado e uma luz violeta citoplasma (Figura 2B). A diferenciação das células de 32G/G-CSF-R é um processo gradual, onde nem todas as células evoluem para neutrófilos maduros na mesma velocidade exata. Quantificação de células em diferentes fases ao longo da diferenciação (ou seja explosão, célula intermediària diferenciada e neutrófilos) é mostrada na Figura 2B.
Murino Evi2b nocaute bloqueia neutrofílica diferenciação em células de 32G/G-CSF-R
Para downregulation de EVI2B (Site de integração Viral Ecotropic 2B) em células de 32G/G-CSF-R, 3 Evi2b-foram projetados visando (Sh2, Sh3, Sh4) e 1 não-direcionamento não silenciar controle (NSC1) shRNAs; Estas foram clonadas em um vetor de Lentivirus carregando um GFP repórter16. Células de 32G/G-CSF-R foram transfectadas com controle e Evi2b-silenciar shRNAs usando um MOI de 10. Dois dias depois de transdução, células GFP+ (nao) foram classificadas e expandiu-se para novas experiências. No caso de Sh3 e Sh4, EVI2B depleção chegou a 80%, no entanto Sh2 foi incapaz de forma eficiente os níveis de proteína downregulate EVI2B e, portanto, foi usado como um controle adicional refere aqui como não-silenciar controle 2 (NSC2). Quatro dias depois de transdução, diferenciação e proliferação de ensaios foram realizados na presença de G-CSF, e foram avaliados os efeitos dos Evi2b downregulation nestes processos. Observou-se que Evi2b-células empobrecidas (Sh2, Sh3) sustentada proliferação celular na presença de GCSF, Considerando que as células de controle (NSC1 e NSC2) reduziram a proliferação em torno do dia 4 (Figura 3A). Além disso, Evi2b-silenciadas 32G/G-CSF-R de células produzidas menos neutrófilos intermediários e maduros em comparação com células de controle (Figura 3B). Notavelmente, as células transfectadas com NSC2, que demonstrou eficiência de "knockdown" pobre Evi2b , também mostraram ligeira redução no número de neutrófilos maduros (Figura 3B). Estes dados foram publicados recentemente16.
Proteína de fusão BCR-ABL prejudica neutrofílica diferenciação em células de 32G/G-CSF-R
Ficou demonstrado que a proteína de fusão BCR-ABL prejudica diferenciação mieloide, causando uma expansão extensiva de progenitores mieloides, que resulta em falha hematopoiética durante a fase aguda da leucemia mieloide crônica25,26. Estudos anteriores demonstraram que expressão forçada de BCR-ABL em 32D cl-3 células resultou em um bloco de diferenciação dos neutrófilos27,28. Portanto, nós investigamos se resultados semelhantes poderiam ser obtidos com a linha celular 32G/G-CSF-R. Células de 32G/G-CSF-R foram transfectadas com BCR-ABL ou controle MSCV vetor retroviral carregando um repórter GFP (MOI = 20). 2 dias depois de transdução, células GFP+ foram classificadas e expandidas por 2 semanas em meio contendo IL-3. Em seguida, realizaram-se ensaios de diferenciação, na presença de G-CSF. Observamos que no dia 0 (antes de transferir as células contendo meio de G-CSF), MSCV controlar e BCR-ABL expressando 32G/G-CSF-R células apresentou morfologia semelhante, principalmente representando imaturos blastos mieloides (Figura 4). No entanto, temos demonstrado que enquanto vector vazio células transduzidas controle passou por diferenciação neutrofílica após 6 dias de tratamento de G-CSF (produção de 11,5% de neutrófilos maduros e 56,4% de células intermediària diferenciadas), não amadurecem neutrófilos foram gerados a partir de células de 32G/G-CSF-R BCR-ABL-transfectadas (Figura 4). Consistentemente, o percentual de explosão imaturo nas células expressando de BCR-ABL em G-CSF permaneceu semelhante à percentagem da explosão em condições de IL-3.
Figura 1. Morfologia de células de imagens representativas de distinto 32G/G-CSF-R. Células de 32G/G-CSF-R pode ser classificado morfologicamente como explosão, intermediària diferenciadas células e neutrófilos maduros. Consulte a tabela 4 para descrição.
Figura 2. Proliferação e diferenciação das células de 32G/G-CSF-R. (A) proliferação de células de 32G/GCSFR em IL-3 (linha preta) de 10 ng/mL ou 100 ng/mL G-CSF (linha azul) contendo meio. O eixo X representa dias de tratamento. O eixo Y é mostrado em escala logarítmica (log2) e indica o número de células × 105. Os resultados representam a média de 3 experimentos independentes. Barras de erro indicam o desvio padrão. (B) a diferenciação de células de 32G/G-CSF-R no meio de G-CSF-contendo (100 ng/mL). No painel superior, as torta-plots demonstrar a porcentagem de blastos (pretos), medianamente diferenciadas células (rosa) e os neutrófilos (vermelhos) na cultura após 0, 2, 4 e 6 dias de tratamento de G-CSF. O painel inferior contém imagens representativas de cytospun células dos respectivos pontos manchados com maio-Grünwald Giemsa. Um mínimo de 100 células foram avaliados para cada ponto de tempo.
Figura 3. Evi2b silenciar bloqueia neutrofílica diferenciação em células de 32G-G-CSF-R. (A) proliferação de Evi2b-silenciadas (linhas laranja) e células de 32G/G-CSF-R controle (linhas pretas) num meio contendo de G-CSF 100 ng/mL. O eixo X representa dias de tratamento. O eixo Y é mostrado em escala logarítmica (log2) e indica o número de células × 105. Os resultados demonstram um resultado representativo de 3 experimentos independentes. (B) avaliação da diferenciação de 32G/G-CSF-R células transfectadas com Evi2b-silenciar e controle shRNAs no meio de G-CSF-contendo (100 ng/mL) usando maio-Grünwald Giemsa coloração de células cytospun. No painel superior, as torta-plots demonstrar a porcentagem de blastos (pretos), medianamente diferenciadas células (rosa) e neutrófilos (vermelho) na cultura. Os painéis inferiores contêm imagens representativas de células cytospun. Diferenciação foi avaliada no dia 7 de diferenciação. Pelo menos 100 células foram avaliadas para cada condição.
Figura 4. Superexpressão da proteína de fusão BCR-ABL prejudica a diferenciação das células de 32G/G-CSF-R. Avaliação da diferenciação de 32G/G-CSF-R células transfectadas com controle MSCV ou gene de fusão BCR-ABL no meio de G-CSF-contendo (100 ng/mL). Torta-parcelas superiores demonstram a proporção de blastos (pretos), medianamente diferenciadas células (rosa) e neutrófilos (vermelho) no dia 6 de diferenciação. Os painéis inferiores mostram imagens representativas de cytospun células coradas com maio-Grünwald Giemsa. Pelo menos 100 células foram avaliadas para cada ponto de tempo.
| Vírus V µ [l] | Número de células chapeados | %+ De GFP | Contagem de células GFP+ | Linear? | TU/mL | Média (TU/mL) |
| 1 | de 100 000 | 1.83 | 1 830 | Sim | 1 830 000 | 2 350 000 |
| 5 | de 100 000 | 12.9 | 12 900 | Sim | 2 580 000 | |
| 10 | de 100 000 | 26,4 | 26 400 | Sim | 2 640 000 | |
| 50 | de 100 000 | 71,4 | 71 400 | Não | ||
| 100 | de 100 000 | 85,1 | 85 100 | Não | ||
| 500 | de 100 000 | 85,6 | 85 600 | Não |
Tabela 1. Determinação do título viral para repórter GFP que contêm vetores. Exemplo de dados obtidos com o retrovírus MSCV e cálculo realizado para estimar o título viral. Titulação viral foi calculada com base no número de células GFP+ adquirida quando certa quantidade de vírus foi aplicada. A quantidade de empregados para infecção de vírus deve ser em uma correlação linear com a percentagem de células GFP+ medido. TU: transformação de unidades.
| Tubo | Descrição de tubo | DMEM + 10% FBS | Vírus | Volume total | Factor de diluição |
| (Μ L) | (Μ L) | (Μ L) | |||
| 1 | diluição 1 | 1485 | Ações virais de 15 µ l | 1500 | 1 x 102 |
| 2 | diluição 2 | 1350 | Tubo de 150 µ l 1 | 1500 | 1 x 103 |
| 3 | diluição 3 | 1350 | Tubo de 150 µ l 2 | 1500 | 1 x 104 |
| 4 | diluição 4 | 1350 | Tubo de 150 µ l 3 | 1500 | 1 x 105 |
| 5 | diluição 5 | 1350 | Tubo de 150 µ l 4 | 1500 | 1 x 106 |
Tabela 2. Determinação do título viral para repórter de puromicina que contêm vetores. Estratégia de diluição viral para determinar o título viral em puromicina que contêm vetores. Tabela indica como preparar 5 tubos (1-5) contendo uma diluição serial do viral circulante. Tubo 1 contém 1485 µ l DMEM + 10% FBS e 15 µ l do vírus produzido, fornecendo um 1 × 102 diluído vírus. Tubo 2 contém 1350 µ l DMEM + 10% FBS e 150 µ l a 1 × 102 diluído vírus (tubo 1), fornecendo 1 × 103 vírus diluído. Tubo 3 contém 1350 µ l DMEM + 10% FBS e 150 µ l de 1 × 103 diluído vírus (tubo 2), fornecendo 1 × 104 vírus diluído. Tubo 4 contém 1350 µ l DMEM + 10% FBS e 150 µ l a 1 × 104 diluído vírus (tubo 3), fornecendo 1 × 105 vírus diluído. Tubo 5 contém 1350 µ l DMEM + 10% FBS e 150 µ l a 1 × 105 diluído vírus (tubo 4), fornecendo um 1 × 106 diluídos vírus. 1 ml de tubos de 1-5 é usado para o título o vírus.
| Conta de celular (x = número de células por ml) | |||||||
| dia 0 | dia 1 | dia 2 | dia 3 | dia 4 | dia 5 | dia 6 | |
| Amostra 1 | x0 | x1 | x2 | x3 | x4 | x5 | x6 |
| Diluição (d) (y = volume de células usado para replating [mL]; z = volume final [mL]) | |||||||
| dia 0 | dia 1 | dia 2 | dia 3 | dia 4 | dia 5 | dia 6 | |
| Amostra 1 | d0= 1 | d1= y1/z1 | d2= y2/z2 | d3= y3/z3 | d4= y4/z4 | d5= y5/z5 | |
| Contagem total de células | |||||||
| dia 0 | dia 1 | dia 2 | dia 3 | dia 4 | dia 5 | dia 6 | |
| Amostra 1 | x0 | x1 /d0 | x2/d1 | x3/d2/d1 | x4/d3/d2/d1 | x5/d /d342/d /d1 | x6/d5/d4/d3/d2/d1 |
Tabela 3. Geração de curva de crescimento. A tabela descreve equações necessárias para a avaliação da taxa de proliferação de células de 32G/G-CSF-R.
| Núcleo | Citoplasma | |
| Explosões | Escuro, arredondada | Escuro, quase indistinguível do núcleo |
| Intermediària células diferenciadas | Pronuncia-se alterações na forma nuclear, muitas vezes como donut ou em forma de lua, como | Mais leve, distinguível do citoplasma |
| Neutrófilos maduros | Lobuladas núcleo; quase não há conexões entre os lóbulos | Citoplasma clara |
Tabela 4. morfologia celular 32G/G-CSF-R durante a diferenciação neutrofílica. A tabela resume os principais características morfológicas, permitindo a distinção de blastos imaturos, células intermediària diferenciadas e neutrófilos maduros. Características nucleares e citoplasmáticas são descritas. Veja a Figura 1 para imagens representativas.
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Discussion
A escolha de um modelo experimental é uma das principais questões em investigação. Apesar de células primárias de animais e humanas são acreditadas para produzir os dados mais biologicamente relevantes, estes modelos podem envolver preocupações éticas e são frequentemente associados com procedimentos caros e/ou sofisticado isolamento/cultivo. As células primárias são limitadas em número e é dificil geneticamente manipulá-los. Além disso, as células primárias representam uma população heterogênea, composta de vários tipos de células que podem complicar a interpretação de dados29. Em contraste, linhas celulares fornecem uma fonte virtualmente ilimitada de material biológico, são rentáveis e permitam ignorar as questões éticas. No entanto, é importante ter em conta que a célula linhas são consideradas um sistema experimental artificial, que pode geneticamente e fenotipicamente difere de seus tecidos de origem. No entanto, a célula linhas quando combinado com outras abordagens experimentais, fornecer um modelo valioso para a geração de dados reprodutíveis e biologicamente relevantes.
A linha celular 32G/G-CSF-R, bem como 32D cl-3 células, são bem estabelecidas e amplamente utilizado modelos de cultura celular de diferenciação neutrofílico murino14,15,24,30. Diversos grupos de pesquisa têm usado essas células para avaliar o papel dos genes específicos em myelopoiesis e obteve resultados que correlacionaram com os dados obtidos na vivo modelos e as células primárias16,31. Aqui nós fornecemos um protocolo para segurar a linha celular 32G/G-CSF-R, no entanto, procedimentos semelhantes podem ser aplicados para cultivo e manipulação 32D cl-3 células. É importante salientar que diferentes lotes das células 32D cl-3 usado em laboratórios diferentes diferenças presentes no cariótipo, sugerindo que os diferentes grupos podem estar trabalhando com seus próprios subclones32. Baseado nesta observação, nós hypothesize que a variabilidade genética da mesma forma pode estar presente nas células de 32G/G-CSF-R, e isto precisa ser levado em consideração quando comparar os resultados obtidos pelos grupos de pesquisa diferentes. Modelos de cultura celular alternativo para as células de 32G/G-CSF-R são progenitoras hematopoiéticas imortalizado linhas22,33,34,35,36. Essa abordagem é útil quando a expansão em grande escala do progenitor é necessária, por exemplo para estudo de interações proteína22. Uma vantagem às células de 32G/G-CSF-R é que progenitores imortalizados podem ser gerados a partir de qualquer rato geneticamente modificado, apesar do tempo para estabelecer a linha é consideravelmente longo37. Além disso, manuseio e manipulação dos progenitores da medula óssea imortalizada requer mais experiência do que células de 32G/G-CSF-R.
Para familiarizar o leitor com o modelo de 32G/G-CSF-R, na primeira parte dos resultados representativos demonstrámos cinética de proliferação e diferenciação das células de 32G/G-CSF-R na presença de IL-3 e G-CSF. Imagens representativas, demonstrando a morfologia das células em condições de proliferação de IL-3, bem como nos pontos de tempo diferente de diferenciação induzida por GCSF foram apresentadas. Avaliamos a diferenciação neutrofílica por análise morfológica, porém tem sido relatado que 32D diferenciação celular cl-3 pode ser determinada pela análise do fluxo cytometric usando o CD11b célula superfície marcador27,31, 38,39. Para nosso conhecimento e experiência, CD11b não é upregulated durante neutrofílica diferenciação das células de 32G/G-CSF-R. De normalização, os ensaios de proliferação de 32G/G-CSF-R em nós empregados comercialmente disponível IL-3. No entanto, observamos que as células proliferam bem caseiro IL-3, produzido conforme descrito por Angelita e colegas22. Para obter um bom grau de diferenciação neutrofílico G-CSF-induzida, é importante lembrar que a capacidade de diferenciação das células de 32G/G-CSF-R pode ser prejudicada se as células são cultivadas acima de uma concentração de 1 × 106 células/mL. Além disso, o grau e a velocidade de diferenciação podem ser afectadas pela composição soro. Portanto, é recomendável testar a capacidade de diferenciação das células de 32G/G-CSF-R em vários lotes FBS, e escolher o que melhor suporta o desenvolvimento de neutrófilos maduros após 6 a 9 dias de cultura na presença de G-CSF.
Nós fornecemos dois experimentos representativos demonstrando possíveis formas de estudar o papel das proteínas particulares na diferenciação mieloide (Figura 3 e Figura 4). Primeiro, nós mostramos aquele downregulation de EVI2B, uma proteína transmembrana expressa nas células hematopoiéticas, leva a um bloqueio da diferenciação mieloide em células de 32G/G-CSF-R. Estes dados foram recentemente publicados pelo nosso grupo, em combinação com ensaios realizados utilizando as células primárias e de camundongos nocaute Evi2b 16. Em segundo lugar, nós investigamos o efeito do BCR-ABL, uma proteína de fusão resultante da translocação genética t(9,22) (q34; q11), na neutrofílica diferenciação das células de 32G/G-CSF-R. Esta translocação foi originalmente identificada em pacientes que sofrem de leucemia mieloide crônica40,41. Anteriormente foi mostrado aquela expressão da oncoproteína de fusão BCR-ABL em 32D cl-3 células leva a uma diferenciação mieloide prisão27,28. Aqui temos demonstrado que a superexpressão de BCR-ABL tem efeitos similares em células de 32G/G-CSF-R. Em ambos os conjuntos de experiências aqui apresentados (envolvendo Evi2b downregulation e superexpressão do BCR-ABL), modificação genética de células de 32G/G-CSF-R foi realizada através de transdução viral, o que resulta na expressão gênica estável. A escolha do retroviral contra entrega Lentivirus não afeta proliferação ou diferenciação das células de 32G/G-CSF-R. No entanto, a infecção Lentivirus é mais eficiente que retroviral transdução devido à presença dos retrovírus endógenos em células de 32G/G-CSF-R. De acordo com nossa experiência, transfecção dessas células utilizando reagentes lipofílicos padrão não é eficiente. No entanto, se houver necessidade de expressão transiente de construção, transfection por eletroporação é uma abordagem viável42,,43,44. Aqui, apresentamos a manipulação genética de células de 32G/G-CSF-R seguido de GFP classificação e análise das células infectadas a granel. No entanto, se necessário, única célula classificação poderia ser empregada para gerar clones única célula como relatado anteriormente12,,45.
Além de ensaios de proliferação e diferenciação, 32G/G-CSF-R células têm sido empregadas com sucesso, determinar o papel de certas proteínas na célula migração e apoptose13,46,47,48 . Além disso, a linha de 32G/G-CSF-R serviu para determinar o crescimento independente de citocina mediado por oncoproteins19,20. Outra linha frequentemente usada para estudar citocinas independência é Ba/F3 células21,49. BA/F3 é uma linha de célula murino dependente de IL-3 derivada C3H cepa de rato, similarmente às células de 32G/G-CSF-R. Embora ambos os sistemas podem ser empregados para estudar a proliferação independente de citocinas, as células F3/Ba diferenciam mal na presença de G-CSF.
No total, sugerimos que as células de 32G/G-CSF-R, embora sendo menos preferido do que as células primárias, oferecem várias vantagens, incluindo a capacidade de proliferação ilimitada e manipulação simples. Acreditamos que, para a geração de dados fiáveis, experimentos realizados em células de 32G/G-CSF-R devem ser complementados com dados adquiridos usando abordagens experimentais alternativas tais como modelos murino e culturas primárias.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores Obrigado Prof Ruud Delwel e Prof Ivo Touw por nos oferecer a linha celular 32G/G-CSF-R e Prof Daniel G. Tenen por fornecer-nos com a linha de celular Bosc23. Este trabalho foi financiado por doações da Agência Grant da República Checa (GACR 15-03796S e GACR 17-02177S) a MA-J, o apoio do Instituto de Genética Molecular da Academia de Ciências a Checa (RVO 68378050) ao MA-J, uma bolsa de GA UK (projeto n. º 341015) da Universidade Charles de Praga para o MK e uma bolsa de GA UK (projeto n. º 1278217) da Universidade Charles de Praga para PD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 powder medium | Merck, Kenilworth, NJ, USA | T 121-10 | without NaHCO3, with L-glutamine |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15028 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 31985-047 | L-Glutamine, Phenol Red |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAA Laboratories (GE Healthcare,Chicago, IL, USA) | MT35011CV | For differentiation of 32D/G-CSF-R cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10270 | Used for culturing HEK293T, NIH3T3, BOSC23 cells |
| Penicillin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | P3032 | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | S9137 | Streptomycin sulfate salt powder |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | G1914 | |
| murine IL-3 | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA | 213-13 | |
| human G-CSF | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA | 300-23 | |
| Polyethylenimine | Polyscience, Warrington, PA, USA | 23966 | Linear, MW 25,000 (PEI 25000) |
| Polybrene | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | H9268 | |
| Trypsin | VWR Chemicals, Radnor, PA, USA | 0458 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | E5134 | |
| Crystal violet | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | C0775 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | T6146 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | D2650 | |
| May-Grünwald Giemsa | DiaPath, Martinengo, BG, Italy | 10802 |
References
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