Summary
Ici sont présentés les protocoles détaillés pour cultiver la lignée murine précurseurs myéloïdes 32D/G-CSF-R, effectuant des infections virales et effectuer des tests de prolifération et la différenciation. Cette lignée cellulaire convient pour étudier le développement des cellules myéloïdes et le rôle des gènes d’intérêt dans la croissance des cellules myéloïdes et différenciation des neutrophile.
Abstract
Compréhension de la biologie des cellules souches et progénitrices hématopoïétique a des implications importantes pour la médecine régénérative et le traitement des pathologies hématologiques. Malgré les données les plus pertinentes qui peuvent être acquis en utilisant des modèles in vivo ou des cultures primaires, la faible abondance de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques restreint considérablement l’ensemble des techniques appropriées pour leur enquête. Par conséquent, l’utilisation de lignées cellulaires permet une production suffisante de matériel biologique pour l’exécution des examens préalables ou des dosages nécessitant un nombre de grandes cellules. Nous présentons ici une description détaillée, lecture et interprétation des tests de prolifération et la différenciation qui sont utilisées pour l’étude des processus impliqués dans la myelopoiesis et la différenciation des neutrophile. Ces expériences utilisent la ligne de cellule myéloïde murine dépendante de cytokine 32D/G-CSF-R, qui possède la capacité à proliférer en présence de l’IL-3 et se différencier dans le G-CSF. Nous fournissons optimisé des protocoles de traitement des cellules-32D/G-CSF-R et discuter les principaux écueils et les inconvénients qui pourraient compromettre les essais décrits et les résultats escomptés. En outre, cet article contient des protocoles pour la production des gènes et rétrovirale, titrage et transduction des cellules-32D/G-CSF-R. Nous démontrons que la manipulation génétique de ces cellules peut être employée pour réaliser avec succès des études moléculaires et fonctionnelles, qui peuvent compléter les résultats obtenus avec des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques primaires ou des modèles in vivo .
Introduction
La population de souches et progénitrices hématopoïétique fournit à l’organisme avec une grande variété de cellules matures, y compris les cellules de la lignée myéloïde (neutrophiles, éosinophiles, basophiles et monocytes). Le processus qui entraîne la production de cellules myéloïdes de cellules souches hématopoïétiques est connu comme myelopoiesis, et une production adéquate des cellules myéloïdes matures en réponse aux demandes changeantes est une condition sine qua non pour la bonne adaptation de l’organisme au stress conditions, telles que les infections et la perte de sang. Production insuffisante de cellules myéloïdes matures peut conduire à l’impossibilité d’éliminer les agents pathogènes, réduit la coagulation sanguine et autres mortelle conditions1,2. En outre, les modifications dans le développement de la lignée myéloïde peuvent également être associées avec des hémopathies malignes, telles que la leucémie myéloïde aiguë (AML)3. Altérations de myelopoiesis peuvent se produire pour diverses raisons, tels que les défauts dans la cellule récepteurs de surface4, expressions altérées de facteurs de transcription5, impaired signalisation des voies6, mutations entraînant la formation de / activation des oncogènes7ou inactivation de gènes suppresseur tumeur8.
Diverses méthodes ont été développées pour étudier le développement myéloïde et évaluer l’effet des altérations génétiques spécifiques dans ce processus. Des approches communes utilisées pour étudier myelopoiesis impliquent des cellules primaires et les souris transgéniques. Bien que ces modèles permettent l’acquisition des données pertinentes sur le plan biologique, ils ont certaines limites. L’utilisation de cellules primaires rencontre un nombre limité de cellules et une période de restriction de la culture, réduisant les possibilités pour modifier l’expression génétique et analyse biologique ou biochimique. Les souris transgéniques sont coûteuses et exigent un degré raisonnable de justification biologique. En outre, le travail avec des modèles in vivo ajoute un degré de complexité dans la compréhension du rôle d’un gène d’intérêt dans un processus donné. Par conséquent, les approches alternatives pour contourner ces limitations sont nécessaires. Lignées cellulaires ont des avantages incontestables : (1) ils possèdent la capacité de prolifération illimitée qui permet de générer assez de matériel pour les études biochimiques et biologiques, (2) ils sont sensibles aux manipulations génétiques (précipitation, knockout, surexpression), (3) le coût est relativement faible, et (4), elles permettent un degré de simplification biologique requis dans certaines approches expérimentales.
L’IL-3 parental (interleukine-3) dépendantes 32D lignée cellulaire a été créée en 1983 par Greenberger et ses collègues de l’infection des cellules de moelle osseuse de souris C3H/HeJ ami murine leukemia virus9. Plusieurs clones 32D ont été décrits dans la littérature : cl-239cl-310et cl-1011. Les cellules de cl-3 32D apparaissaient à proliférer dans IL-3 et subissent une différenciation neutrophilique après traitement avec des colonies de granulocytes stimulation facteur (G-CSF)10. Au contraire, 32D cl-10 cellules, tout en étant dépendant de l’IL-3, ont été à l’origine ne différenciant en réponse au traitement de G-CSF. En 1995 le groupe du Dr. Ivo Touw transduites retrovirally 32D cl-10 cellules de type sauvage et des formes mutantes de récepteur de G-CSF (G-CSF-R), afin d’identifier les régions fonctionnellement importantes de ce récepteur11. Cette étude a abouti à la génération des cellules-32D/G-CSF-R, qui dépendent de la même façon sur l’IL-3, mais dans les 6 à 10 jours après le remplacement de l’IL-3 avec le G-CSF, les cellules arrêtent pour proliférer et irréversiblement se différencient en neutrophiles matures. Ces propriétés font 32D cl-3 et modèles simplifiés 32D/G-CSF-R cellules murines différenciation neutrophiles qui peut être modulée par deux croissance bien définie et facteurs de différenciation - IL-3 et G-CSF. Durant les dernières décennies plusieurs groupes ont utilisé des cellules-32D/G-CSF-R pour étudier le rôle de certains gènes dans la prolifération et la différenciation des cellules myéloïdes en culture12,13,14,15 , 16et d’étudier le G-CSF, signalisation17,18. Ce qui est important, les résultats obtenus à l’aide de cette lignée cellulaire en corrélation avec les données obtenues avec les cellules primaires et les souris transgéniques16,19,20,21. En conséquence, nous pensons que les cellules 32D/G-CSF-R, étant un modèle largement utilisé et bien établi, représentent un système utile pour étudier la différenciation myéloïde qui peut être utilisée en parallèle avec d’autres approches de répondre à cette question.
Ici, les protocoles détaillés décrivant la manipulation de la lignée cellulaire 32D/G-CSF-R, dont la couverture de l’expansion, la différenciation et l’évaluation de la prolifération et la différenciation de ces cellules est présenté. Information détaillée pour la modification génétique des cellules-32D/G-CSF-R, soit par transduction rétrovirale ou des gènes, ainsi que des protocoles pour le titrage de virus sont prévus. En outre, plusieurs résultats représentatifs qui illustrent les applications potentielles des cellules-32D/G-CSF-R sont fournis.
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Protocol
Remarque : La procédure décrivant l’expansion, la différenciation et la transduction des cellules-32D/G-CSF-R sont présentés ci-dessous.
1. préparation
- Préparation des médias
- Préparer 250 mL de milieu de culture : milieu de 1640 de RPMI (Roswell Park Memorial Institute) additionné de 10 % de chaleur inactivé FBS (sérum de veau fœtal) et murins IL-3 (10 ng/mL).
- Vous pouvez également utiliser artisanale IL-3. Pour produire artisanale IL-3, transduce cellules HEK293 avec vecteur exprimant IL-3 et recueillir IL-3 contenant surnageant22.
NOTE : Antibiotiques, tels que la pénicilline G (100 UI/mL), streptomycine (100 µg/mL) et gentamicine (40 µg/mL), peuvent être utilisés pour la culture des cellule à n’importe quelle étape du protocole, sauf indication contraire.
- Vous pouvez également utiliser artisanale IL-3. Pour produire artisanale IL-3, transduce cellules HEK293 avec vecteur exprimant IL-3 et recueillir IL-3 contenant surnageant22.
- Préparer 50 mL de milieu de différenciation : milieu RPMI 1640 additionné de 10 % FBS et humaine de G-CSF (100 ng/mL).
NOTE : (Important), pas de tous les lots de sérum soutiennent la différenciation des cellules-32D/G-CSF-R. Avant le début de l’expérience, tester différents lots de sérum. Il est recommandé de tester au moins 4 lots différents et sélectionnez l’optimal basé sur la capacité des cellules-32D/G-CSF-R à différencier. Voir protocole de différenciation 32D/G-CSF-R ci-dessous. - Préparer 10 mL de milieu de congélation : milieu RPMI 1640 additionné de 40 % FBS et 10 % DMSO (diméthyl sulfoxyde).
- Préparer 250 mL de milieu de culture : milieu de 1640 de RPMI (Roswell Park Memorial Institute) additionné de 10 % de chaleur inactivé FBS (sérum de veau fœtal) et murins IL-3 (10 ng/mL).
- Production des rétrovirus
- Une suspension monocellulaire de cellules Bosc23 (6 × 106) dans un plat de Pétri de 16 cm sur plaque et cultiver chez 18 mL de DMEM (milieu de l’aigle de la modification de Dulbecco) contenant 10 % FBS jusqu'à la confluence de la culture atteint 80 % (24h).
Remarque : Les cellules devraient croître en une monocouche et non forme des touffes dans la culture. Comptage de cellules peut être effectuée à l’aide de différentes méthodes (valables pour le reste des protocoles présentés ici). En cas de faible nombre d’échantillons, il est recommandé de comptage manuel sous le microscope à l’aide de Bürker chambre. Dans ce cas, utilisez le bleu Trypan pour l’exclusion des cellules mortes. Mélange 1:1 des cellules avec 0,4 % bleu Trypan dans du PBS. Pour effectuer le comptage du grand nombre d’échantillons, un compteur de cellule automatique peut être employé. - Mélanger 40 µg de construction rétrovirale (notamment MSCV), 20 µg de pCL-Eco (vecteur d’emballage)23, 80 µl de PEI (polyethylenimine) et 2 mL de sérum réduit moyen (p. ex. Opti-MEM) moyen (sans antibiotiques). Incuber à ce mélange pendant 20 min à température ambiante (RT).
- Bosc23 milieu de cellules soigneusement remplacer 16 mL DMEM additionné de 2 % FBS. Réchauffez le milieu à 37 ° C avant utilisation.
Remarque : N’utilisez pas d’antibiotiques au cours de la transfection, car elle peut réduire l’efficacité de la transfection. - Ajouter le mélange préparé en 1.2.2. goutte à goutte et soigneusement la Bosc23 culture et incuber pendant 4 h à 37 ° C. Limite d’incubation de moins de 6 h en raison de la toxicité du PEI.
- Après incubation, changer Bosc23 moyen à 18 mL préchauffée DMEM contenant 10 % FBS et de cultiver des cellules pendant 48 h à 37 ° C. Placer les capsules dans un laboratoire de niveau 2 de biosafety, garder ici de cette étape sur et suivez les procédures de sécurité standard.
- Bosc23 moyen (contenant ecotropic des particules rétrovirales) à l’aide d’une pipette sérologique de 25 mL dans un tube conique de 50 mL de recueillir et stocker à 4 ° C.
Remarque : L’efficacité de la Transfection (Important) devrait atteindre 90 % pour produire un titre élevé de virus. - Ajouter 18 mL préchauffée DMEM 10 % FBS à Bosc23 cellules et cultiver pendant 24 h.
- Répétez l’étape 1.2.6.
NOTE : Retroviral surnageants de 1.2.6 et 1.2.8 peuvent être regroupés dès qu’ils atteignent la même température (4 ° C) afin de préserver l’intégrité virale. - Pour éviter toute contamination de Bosc23 dans les surnageants de virales, spin virus prélevés à 1500 × g pendant 10 min à 4 ° C. Virus aliquote, snap gel à l’aide d’azote liquide ou de glace sèche et conserver à-80 ° C. Toutefois, Notez que le virus fraîchement préparé est de meilleure qualité en termes d’efficacité de l’infection que les stocks congelés.
NOTE : (Important) Eviter répétitive de gel/dégel du virus, car elle conduit à une dégradation virale.
- Une suspension monocellulaire de cellules Bosc23 (6 × 106) dans un plat de Pétri de 16 cm sur plaque et cultiver chez 18 mL de DMEM (milieu de l’aigle de la modification de Dulbecco) contenant 10 % FBS jusqu'à la confluence de la culture atteint 80 % (24h).
- Production de lentivirus
- Une suspension monocellulaire HEK293T (rein embryonnaires humaines 293 t) cellules (6 × 106) dans un plat de Pétri de 16 cm sur plaque et cultiver chez 18 mL de DMEM contenant 10 % FBS jusqu'à la confluence de la culture atteint 80 % (24h).
Remarque : Les cellules devraient croître en une monocouche et non forme des touffes dans la culture. - Mélanger 15 µg de construction des gènes (par exemple, pGhU6), emballage des plasmides pCMVdR8.74 (encodage pour gag/pol, 12 µg) et pMD2.VSVG (encodage de VSV-G, 1,4 µg), 85.2 µL PEI et 2 mL de sérum réduit moyen (sans antibiotiques). Incuber à ce mélange pendant 20 min à température ambiante.
- Soigneusement remplacer HEK293T moyen par 16 mL de DMEM additionné de 2 % FBS. Réchauffez le milieu à 37 ° C avant utilisation. Ne pas utiliser antibiotiques au cours de la transfection, car cela pourrait réduire l’efficacité de transfection.
- Soigneusement, déposer le mélange préparé dans la section 1.3.2 à la culture de cellules HEK293T et incuber pendant 4 h à 37 ° C. Limiter la durée d’incubation de moins de 6 h à prévenir la toxicité du PEI.
- Moyenne de changement à 18 mL préchauffée DMEM 10 % FBS et cultiver des cellules pendant 48 h à 37 ° C. Placer les capsules dans un laboratoire de niveau 2 de biosafety, garder ici de cette étape sur et suivez les procédures de sécurité standard.
- HEK293T moyen (contenant amphotropic de Particules Lentivirales) à l’aide d’une pipette sérologique de 25 mL dans un tube conique de 50 mL de recueillir et de conserver à 4 ° C.
Remarque : L’efficacité de la Transfection (Important) devrait atteindre 90 % pour produire un titre élevé de virus. - Ajouter avec précaution 18 mL de DMEM préchauffé 10 % FBS aux cellules HEK293T. Cultiver pendant 24 h à 37 ° C.
- Répétez l’étape 1.3.6.
Remarque : Des gènes surnageants de 1.3.6 et 1.3.8 peuvent être regroupés dès qu’ils atteignent la même température (4 ° C) afin de préserver l’intégrité virale. - Pour éviter toute contamination du surnageant viral avec cellules HEK293T, spin virus prélevés à 1500 × g pendant 10 min à 4 ° C. Virus aliquote, snap gel à l’aide d’azote liquide ou de glace sèche et conserver à-80 ° C. Toutefois, Notez que fraîchement préparé des virus est de meilleure qualité en termes d’efficacité de l’infection que les stocks congelés.
NOTE : (Important) Eviter répétitive de gel/dégel du virus, car elle conduit à une dégradation virale.
- Une suspension monocellulaire HEK293T (rein embryonnaires humaines 293 t) cellules (6 × 106) dans un plat de Pétri de 16 cm sur plaque et cultiver chez 18 mL de DMEM contenant 10 % FBS jusqu'à la confluence de la culture atteint 80 % (24h).
- Titrage des virus contenant un reporter GFP
- Graines de 1 × 105 NIH/3 t 3 cellules dans 300 µL de DMEM 10 % FBS / puits dans une plaque de 24 puits. 7 puits seront employés pour les un virus titre.
- Décongeler les virus à 37 ° C et ajouter 1, 5, 10, 50, 100 et 500 virus µL à NIH/3 t 3 cultures. N’ajoutez pas n’importe quel virus dans contrôle négatif bien. Cultiver des cellules en présence de virus pendant 48 h à 37 ° C.
- Récolter les cellules NIH/3 t 3 avec 30 µL de trypsine/EDTA (acide éthylènediamine tétra-acétique) (0,25 % trypsine, EDTA de 0,01 % dans du PBS) et placer les cellules dans 250 µL PBS dans un tube de FACS (fluorescence activé cellule Tri).
- Déterminer la fréquence des cellules GFP+ par cytométrie en flux dans chaque échantillon24. Exclure les cellules mortes par ajout d’un colorant de la viabilité, comme Hoechst 33258.
- Calculer le nombre total de cellules GFP+ (basés sur le nombre de cellules plaqués et le pourcentage de cellules GFP+ ) et leur complot contre le volume de virus utilisé pour l’infection.
NOTE : (Important) l’efficacité de l’infection atteint un plateau lorsque de fortes doses virales sont appliquées. Par conséquent, il est important d’estimer le titre basé sur la concentration virale à laquelle infection efficacité se produit dans une gamme de linéarité (exemple illustré dans le tableau 1). Le nombre de cellules GFP+ indique le nombre de particules virales fonctionnelles (TU - transformant des unités) dans un volume donné de virus. Recalculer le nombre de TU / mL.
- Titrage des virus contenant un journaliste puromycine
- Graines de 5 × 104 NIH/3 t 3 cellules dans 3 mL de DMEM 10 % FBS / puits dans une plaque 6 puits ; emploient 6 puits au un virus titre. Culture nuit à 37 ° C.
- Lendemain diluer les virus comme il est indiqué dans le tableau 2. Pour diluer les virus, utilisez DMEM préchauffé 10 % FBS. Ne pas vortexer.
- Retirer le milieu de culture de cellules NIH/3 t 3 et ajouter 1 mL de virus dilué.
- Incuber une nuit à 37 ° C.
- Doucement de remplacer le support contenant le virus avec 2 mL de DMEM préchauffé 10 % FBS et incuber une nuit à 37 ° C.
- Remplacer doucement NIH/3 t 3 moyen avec 2 mL de préchauffé DMEM 10 % FBS contenant la puromycine (2 µg/mL).
- Culture à 37 ° C et soigneusement rafraîchissement moyen avec la puromycine tous les 3 jours ou quand milieu se colore en jaune.
- À 10-12 jours après l’infection, aspirer la moyenne de chaque puits et laver doucement avec du PBS.
- Tache avec 1 mL de solution de violet de gentiane (cristal violet 0,5 % à 20 % d’éthanol et dH2O), 2 min à ta et laver soigneusement avec du PBS.
- Compter les colonies bleues présentes dans chaque puits sous un microscope (grossissement X4). Eh bien, aucune colonie ne doit être observée dans le contrôle négatif.
- Calculer le nombre total de TU/mL tenant compte du facteur de dilution.
2. l’expansion et l’entretien des cellules-32D/G-CSF-R
- Si les cellules 32D/G-CSF-R sont figés, prélever une partie aliquote et dégel des cellules dans un bain-marie à 37 ° C pendant 1 min et verser dans le flacon directement dans 10 mL de pré chauffé additionné de RPMI 1640 à 10 % des cellules FBS dans un tube de 15mL. Inverser le tube 3 fois et faire tourner les cellules vers le bas à 400 × g. éliminer le surnageant et remettre en suspension des cellules dans un milieu de culture contenant IL-3 à une concentration de 0,3 × 106 cellules/mL.
- La concentration de la croissance cellulaire optimale est de 0,25 à 0,5 × 106 cellules/mL. Fractionner les cellules tous les 2 jours amenant à une concentration de 0,1 à 0,2 × 106 cellules/mL.
Remarque : Les cellules 32D/G-CSF-R (Important) peuvent partiellement perdent leur capacité de différencier si elles sont cultivées à des concentrations supérieures à 1 × 106 cellules/mL. Par conséquent, il est très important de scinder les cellules 32D/G-CSF-R à l’heure. - Au besoin, congeler et stocker les aliquotes de la cellule pendant de longues périodes de temps à-80 ° C ou dans l’azote liquide. Tournez en bas 3 × 106 cellules, éliminer le surnageant et remettre en suspension dans 1 mL de milieu de congélation. Placer le tube dans un récipient de congélation à-80 ° C. Pour le stockage à long terme, repositionner les cellules à l’azote liquide.
3. transduction des cellules-32D/G-CSF-R
- Cellules 32D/G-CSF-R de plaque en plaque 6 puits à une concentration de 0,3 × 106 cellules/mL.
- Ajouter la quantité appropriée de virus pour atteindre un MOI (multiplicité d’infection) entre 10 et 40.
NOTE : MOI supérieur se traduira par l’augmentation du pourcentage de cellules GFP+ ainsi que des niveaux plus élevés d’expression du gène d’intérêt. Exemple : Pour infecter 0,3 × 106 cellules avec un MOI de 10 ; 3 × 106 TU devront être ajoutés aux cellules 32D/G-CSF-R. - Ajouter polybrene à concentration finale 8 µg/mL et incuber pendant 6 h à 37 ° C. Vous pouvez également effectuer une procédure de spin-inoculation : centrifuger à 1200 × g pendant 90 min à 30 ° C dans une plaque de culture à l’aide d’un rotor de swing-seau et incuber pendant 3 h à 37 ° C.
- Cellules de collecter, transférer dans un tube de 15 mL et actionner à 450 × g pendant 5 min (4 ° C).
- Jeter le surnageant, remettre en suspension les cellules granulés dans 6 mL de milieu de culture, placer dans un flacon de culture cellulaire T25 et de la culture à 37 ° C.
- 48 h plus tard, récolter les cellules et les essorer à 450 × g pendant 5 min (4 ° C). Jeter le surnageant.
- Dans le cas d’un journaliste GFP : placer les cellules dans 500 µL de PBS et trier les cellules GFP+ à l’aide d’un trieur de cytométrie de flux. Dans le cas d’un journaliste de puromycine contenant le vecteur : placer les cellules dans un milieu de culture contenant 2 µg/mL de puromycine.
- Développez les cellules nécessaires aux expériences et à une analyse plus approfondie.
NOTE : (Facultatif) Transduced cellules peuvent être congelés dans de la presse dans un conteneur de congélation à-80 ° C et encore conservés dans l’azote liquide.
4. 32D/G-CSF-R analyse de prolifération de cellules
- Pour évaluer la prolifération taux place 0,2 × 106 cellules dans 1 mL de milieu de culture et incuber une nuit à 37 ° C.
- Lendemain compter nombre de cellules et diluer à une concentration de 0,2 × 106 cellules/mL à l’aide de milieu de culture. Incuber une nuit à 37 ° C. Tenir des registres des concentrations cellulaires et des dilutions appliquées aux cultures quotidiennes à l’aide du tableau 3.
- Répétez l’étape 4.2 pour autant de jours que la prolifération doit être évaluée.
Remarque : La longueur des prolifération des essais dépendra de l’effet du gène d’intérêt. Dans le cas d’un phénotype solide, 8-9 jours pourrait être suffisantes pour observer un effet significatif (voir la Figure 3 a). Toutefois, dans le cas d’un phénotype doux, de longues périodes de temps peuvent être nécessaires. - Évaluer la croissance cellulaire en faisant une courbe de prolifération, comme il est indiqué dans le tableau 3.
5. 32D/G-CSF-R test de différenciation des cellules
- Laver 0,2 × 106 cellules 32D/G-CSF-R deux fois avec le milieu RPMI sans cytokines.
Remarque : Les étapes de lavage avant l’ajout de G-CSF dans la culture sont importantes, car la présence d’IL-3 résiduelle peut inhiber la différenciation. - Placer les cellules dans 1 mL de milieu de différenciation (contenant 100 ng/mL de G-CSF) dans un puits/plaque 24, ce qui entraîne une concentration de cellules de 0,2 × 106 cellules/mL (jour 0). Culture nuit à 37 ° C.
- Compter le nombre de cellules/mL comme indiqué ci-dessus (1.2.1 étape).
- Cytospin 2-5 × 104 cellules sur une lame de verre (76 X 26 mm) en utilisant une centrifugeuse avec adaptateurs nécessaires à 20 × g.
- Actualiser la différenciation moyen et plaque de cellules à une concentration de 0,2 × 105 cellules/mL sur une plaque 24 puits / (jour 1). Jeter la vieille plaque et continuez le lendemain avec point 5.6 avec la nouvelle plaque.
- Jours 2 à 7, répétez les étapes 5.3 à 5.5. Évaluer la prolifération cellulaire en présence de G-CSF tel que décrit à l’étape 4.
NOTE : (Important) au cours de la différenciation, la prolifération des cellules se ralentit, donc après 3 à 4 jours en présence de G-CSF, il est possible de cellules en culture à des concentrations plus élevées. - Évaluer l’état de différenciation des cellules 32D/G-CSF-R basée sur la morphologie des cellules.
- Difficulté des cellules de l’étape 5.4 dans le méthanol pendant 5 min à ta et laisser les diapositives à sécher à l’air.
NOTE : Diapositives de jour 0 à 7 peuvent être stockées sur RT et fixe en même temps. De même, ils peuvent également être conservés à RT pendant une période prolongée après fixation. - Colorer les cellules à l’aide de May-Grünwald Giemsa souillant le protocole du fabricant suivant.
- Visualiser les cellules colorées à l’aide d’un microscope et grossissement X40.
- Quantifier le nombre de blastes, cellules moyennement différenciées et granulocytes mûrs à l’aide de photos illustratives sur la Figure 1 et la description du tableau 4.
- Difficulté des cellules de l’étape 5.4 dans le méthanol pendant 5 min à ta et laisser les diapositives à sécher à l’air.
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Representative Results
Prolifération et la différenciation des cellules-32D/G-CSF-R
Pour évaluer la prolifération des cellules 32D/G-CSF-R dans des conditions pro-prolifération et de Pro-différenciation, on a cultivé des cellules 32D/G-CSF-R dans des milieux contenant IL-3 et G-CSF, respectivement. Il a été observé que les cellules cultivées dans un milieu contenant IL-3 (10 ng/mL) divisent approximativement toutes les 24 h (Figure 2 a). Lors de remplacement de l’IL-3 par G-CSF (100 ng/mL) prolifération graduellement ralenti et s’est arrêté après 4 jours (Figure 2 a). En outre, l’état de différenciation des cellules cultivées en présence de G-CSF en utilisant des cellules cytocentrifugé coloré au May-Grünwald Giemsa a été évaluée. Il a été démontré que le jour 0 (avant le début du traitement de G-CSF), les cellules présentent une morphologie immature myeloblast, caractérisée par un gros noyau et un cytoplasme foncé (Figure 2 b). Au cours du traitement, la taille du noyau est réduite et la forme des modifications du noyau à une forme de lune ou forme de beignet. En outre, le cytoplasme est élargi et perd la couleur violette foncé. Après 6 jours de traitement avec le G-CSF, les cellules présentent des signes de différenciation complète neutrophilique, caractérisé par un noyau sphériques et un cytoplasme violet clair (Figure 2 b). La différenciation des cellules-32D/G-CSF-R est un processus graduel, où pas toutes les cellules évoluent vers des neutrophiles matures à la même vitesse exacte. Quantification des cellules à différents stades au cours de la différenciation (à savoir blast, cellule moyennement différencié et neutrophiles) est montrée dans la Figure 2 b.
Murin Evi2b knockdown bloque neutrophilique différenciation en cellules-32D/G-CSF-R
Pour la diminution de EVI2B (Site d’intégration virale Ecotropic 2 b) dans les cellules 32D/G-CSF-R, 3 Evi2b-1 ne pointeraient non-baffle control (NSC1) interférents et ciblage (Sh2, Sh3, Sh4) ont été conçus ; ceux-ci ont été clonés dans un vecteur lentiviral transportant un journaliste GFP16. Cellules-32d/G-CSF-R ont été transduites avec contrôle et Evi2b-silencieux interférents utilisant un MOI de 10. Surlendemain de la transduction, GFP+ (transduite) cellules ont été triés et élargis à d’autres expériences. Dans le cas de Sh3 et Sh4, EVI2B épuisement atteint 80 %, cependant Sh2 n’a pas pu efficacement les niveaux de protéines downregulate EVI2B et par conséquent a été utilisé comme un contrôle supplémentaire mentionné ici comme non-baffle control 2 (NSC2). Quatre jours après la transduction, la différenciation et la prolifération des analyses ont été effectuées en présence de G-CSF, et on a évalué les effets de la diminution de l’expression Evi2b dans ces processus. Il a été observé Evi2b-cellules appauvris (Sh2, Sh3) subi la prolifération cellulaire en présence de GC & SF, tandis que les cellules de contrôle (NSC1 et NSC2) réduit la prolifération autour du jour 4 (Figure 3 a). En outre, Evi2b-silencieux 32D/G-CSF-R cellules produisent moins neutrophiles matures et intermédiaires par rapport aux cellules témoins (Figure 3 b). Remarquablement, les cellules transduites avec NSC2, qui fait preuve de mauvaise efficacité défiant Evi2b , également montrent légère réduction du nombre de neutrophiles matures (Figure 3 b). Ces données ont été publiées récemment16.
Protéine de fusion BCR-ABL altère neutrophilique différenciation en cellules-32D/G-CSF-R
Il a été démontré que la protéine de fusion BCR-ABL entrave la différenciation myéloïde, provoquant une vaste expansion des progéniteurs myéloïdes qui se traduit par l’insuffisance hématopoïétique durant la phase aiguë de la leucémie myéloïde chronique25,26. Des études antérieures démontré qu’expression forcée de BCR-ABL dans les cellules de cl-3 32D entraînait dans un bloc de différenciation neutrophiles27,28. Par conséquent, nous avons étudié si des résultats similaires pourraient être obtenus avec la lignée cellulaire 32D/G-CSF-R. Cellules-32d/G-CSF-R ont été transduites avec contrôle ou BCR-ABL MSCV vecteur rétroviral transportant un journaliste GFP (MOI = 20). 2 jours après transduction, GFP+ cellules ont été triés et élargis pendant 2 semaines dans un milieu contenant IL-3. Ensuite, les analyses de différenciation ont été effectuées en présence de G-CSF. Nous avons observé qu’au jour 0 (avant le transfert des cellules au milieu contenant de G-CSF), MSCV contrôle et BCR-ABL exprimant des cellules-32D/G-CSF-R présente une morphologie similaire, représentant principalement les cellules blastiques myéloïdes immatures (Figure 4). Cependant, nous avons démontré que tout vecteur vide hématies transduite a subi une différenciation neutrophilique après 6 jours de traitement de G-CSF (production de 11,5 % des neutrophiles matures et 56,4 % des cellules moyennement différenciées), ne mûrissent neutrophiles ont été générés de BCR-ABL-transduites 32D/G-CSF-R cellules (Figure 4). Constamment, le pourcentage de blast immature dans les cellules exprimant BCR-ABL dans G-CSF est demeuré semblable au pourcentage d’explosion dans des conditions de l’IL-3.
Figure 1. Morphologie de cellules des images représentatives de distincte 32D/G-CSF-R. Cellules-32d/G-CSF-R peuvent être qualifiées de morphologiquement blast, moyennement différencié des cellules et des neutrophiles matures. Voir le tableau 4 pour la description.
Figure 2. Prolifération et la différenciation des cellules-32D/G-CSF-R. (A) la prolifération des cellules de la 32D/GCSFR à 10 ng/mL IL-3 (ligne noire) ou 100 ng/mL de G-CSF (ligne bleue) contenant le support. L’axe X représente les jours de traitement. L’axe des Y est montré en échelle logarithmique (log2) et indique le nombre de cellules × 105. Les résultats représentent en moyenne 3 expériences indépendantes. Barres d’erreur indiquent la déviation standard. (B) la différenciation des cellules-32D/G-CSF-R dans un milieu contenant du G-CSF (100 ng/mL). Dans le panneau supérieur, les tarte-parcelles montrent le pourcentage de blastes (noirs), moyennement différenciées (rose), les cellules et les neutrophiles (rouges) en culture après 0, 2, 4 et 6 jours de traitement de G-CSF. Le panneau inférieur contient des images représentatives des cellules cytocentrifugé de le respectifs fois points colorés au May-Grünwald Giemsa. Un minimum de 100 cellules ont été évalués pour chaque point dans le temps.
La figure 3. Evi2b silencieux d’échappement bloque neutrophilique différenciation en cellules-32D-G-CSF-R. (A) prolifération des Evi2b-réduits au silence (lignes orange) et des hématies (lignes noires) 32D/G-CSF-R à 100 ng/mL de milieu contenant de G-CSF. L’axe X représente les jours de traitement. L’axe des Y est montré en échelle logarithmique (log2) et indique le nombre de cellules × 105. Les résultats montrent un résultat représentatif de 3 expériences indépendantes. (B) évaluation de la différenciation des cellules-32D/G-CSF-R transduites avec Evi2b-silencieux d’échappement et contrôle interférents dans un milieu contenant du G-CSF (100 ng/mL) à l’aide de May-Grünwald Giemsa coloration des cellules cytocentrifugé. Dans le panneau supérieur, les tarte-emplacements démontrer le pourcentage de blastes (noirs), moyennement différenciés de cellules (roses) et des neutrophiles (rouge) dans la culture. Les panneaux inférieurs contiennent des images représentant des cellules cytocentrifugé. La différenciation a été évaluée le jour 7 de différenciation. Au moins 100 cellules ont été évalués pour chaque condition.
Figure 4. La surexpression de la protéine de fusion BCR-ABL altère la différenciation des cellules-32D/G-CSF-R. Évaluation de la différenciation des cellules-32D/G-CSF-R transduites avec contrôle MSCV ou gène de fusion BCR-ABL dans un milieu contenant du G-CSF (100 ng/mL). Tarte-emplacements supérieurs démontrer la proportion de blastes (noirs), moyennement différenciés de cellules (roses) et des neutrophiles (rouge) au jour 6 de différenciation. Les panneaux inférieurs montrent des images représentant des cellules cytocentrifugé colorés au May-Grünwald Giemsa. Au moins 100 cellules ont été évalués pour chaque point dans le temps.
| Virus V [µL] | Nombre de cellules plaqués | % GFP+ | Nombre de cellules GFP+ | Linéaire ? | TU/mL | Moyenne (TU/mL) |
| 1 | 100 000 | 1.83 | 1 830 | Oui | 1 830 000 | 2 350 000 |
| 5 | 100 000 | 12,9 | 12 900 | Oui | 2 580 000 | |
| 10 | 100 000 | 26.4 | 26 400 | Oui | 2 640 000 | |
| 50 | 100 000 | 71,4 | 71 400 | N° | ||
| 100 | 100 000 | 85,1 | 85 100 | N° | ||
| 500 | 100 000 | 85,6 | 85 600 | N° |
Tableau 1. Détermination du titre viral pour reporter GFP contenant les vecteurs. Exemple de résultats obtenus avec le rétrovirus MSCV et le calcul effectué pour évaluer le titre viral. Titre viral a été calculée selon le nombre de cellules GFP+ acquis lorsque certaine quantité de virus a été appliquée. La quantité de virus employées pour l’infection doit être dans une corrélation linéaire avec le pourcentage de cellules GFP+ mesurée. TU : transformer des unités.
| Tube | Description tube | DMEM + 10 % BF | Virus | Volume total | Facteur de dilution |
| (ΜL) | (ΜL) | (ΜL) | |||
| 1 | dilution 1 | 1485 | Stock virale 15 µL | 1500 | 1 x 102 |
| 2 | dilution 2 | 1350 | Tube de 150 µL 1 | 1500 | 1 x 103 |
| 3 | dilution 3 | 1350 | Tube de 150 µL 2 | 1500 | 1 x 104 |
| 4 | dilution 4 | 1350 | Tube de 150 µL 3 | 1500 | 1 x 105 |
| 5 | dilution 5 | 1350 | Tube de 150 µL 4 | 1500 | 1 x 106 |
Le tableau 2. Détermination du titre viral pour reporter la puromycine contenant les vecteurs. Stratégie virale dilution pour déterminer le titre viral dans la puromycine contenant les vecteurs. Le tableau indique comment préparer 5 tubes (1-5) contenant une dilution en série du stock virale. Tube 1 contient 1485 µL DMEM + 10 % FBS et 15 µL du produit virus, fournissant un 1 × 102 dilué virus. Tube 2 contient 1350 µL DMEM + 10 % FBS et 150 µL de 1 × 102 dilué virus (1 Tube), fournissant un virus dilué de 1 × 103 . Tube 3 contient 1350 µL DMEM + 10 % FBS et 150 µL de 1 × 103 dilué virus (Tube 2), fournissant un virus dilué de 1 × 104 . Tube 4 contient 1350 µL DMEM + 10 % FBS et 150 µL du × 10 14 dilué virus (Tube 3), fournissant un virus dilué de 1 × 105 . Tube 5 contient 1350 µL DMEM + 10 % FBS et 150 µL du × 10 15 dilué virus (4 tubes), fournissant un virus dilué de 1 × 106 . 1 ml de tubes 1-5 est utilisée pour le titre du virus.
| Numération des lymphocytes (x = nombre de cellules / ml) | |||||||
| jour 0 | jour 1 | jour 2 | jour 3 | jour 4 | jour 5 | jour 6 | |
| Échantillon 1 | x0 | x1 | x2 | x3 | x4 | x5 | x6 |
| Dilution (d) (y = volume de cellules utilisée pour peuvent [mL] ; z = volume final [mL]) | |||||||
| jour 0 | jour 1 | jour 2 | jour 3 | jour 4 | jour 5 | jour 6 | |
| Échantillon 1 | d0= 1 | d1= y1/z1 | d2= y2/z2 | d3= y3/z3 | d4= y4/z4 | d5= y5/z5 | |
| Nombre total de cellules | |||||||
| jour 0 | jour 1 | jour 2 | jour 3 | jour 4 | jour 5 | jour 6 | |
| Échantillon 1 | x0 | x1 /d0 | x2/j1 | x3/j2/d1 | x4/d3/d2/d1 | x5/d4/d3/d2/d1 | x6/d5/d4/d3/d2/d1 |
Tableau 3. Génération de courbe de croissance. Le tableau décrit les équations nécessaires à l’évaluation du taux de prolifération des cellules-32D/G-CSF-R.
| Noyau | Cytoplasme | |
| Explosions | Sombres et arrondies | Sombre, presque impossible à distinguer du noyau |
| Moyennement les cellules différenciées | Prononcé des changements dans la forme nucléaire, souvent beignet-comme ou lunaire en forme | Plus léger et distinguable cytoplasme |
| Neutrophiles matures | Noyaux sphériques ; presque aucune connexion entre les lobules | Cytoplasme clair |
Tableau 4. 32D/G-CSF-R la morphologie durant la différenciation neutrophilique. Le tableau résume les principales caractéristiques morphologiques permettant la distinction des explosions immatures et moyennement différenciés de cellules neutrophiles matures. Caractéristiques nucléaires et cytoplasmiques sont décrites. Voir la Figure 1 pour les images représentatives.
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Discussion
Le choix d’un modèle expérimental est l’une des principales questions de recherche. Si des cellules animales et humaines primaires sont censés produire des données plus biologiquement pertinentes, ces modèles peuvent impliquer des préoccupations d’ordre éthique et sont souvent associés avec les procédures d’isolement/culture coûteux et sophistiqués. Les cellules primaires sont limités en nombre et il est difficile de les manipuler génétiquement. Par ailleurs, les cellules primaires représentent une population hétérogène, composée de divers types de cellules qui peuvent compliquer l' interprétation de données29. En revanche, les lignées cellulaires constituent une source quasi illimitée de matériel biologique, sont rentables et permettent de contourner les questions éthiques. Cependant, il est important de tenir compte de cette cellule lignes sont considérées comme un système expérimental artificiel, qui peuvent génétiquement et phénotypiquement diffère de leur tissu d’origine. Néanmoins, cell lines lorsqu’il est combiné avec d’autres approches expérimentales, fournissent un modèle précieux pour la génération de données pertinentes sur le plan biologique et reproductibles.
La lignée cellulaire 32D/G-CSF-R, mais aussi 32D cl-3 cellules, sont bien établies et largement utilisé des modèles de culture de cellules de différenciation neutrophilique murine14,15,24,30. Plusieurs groupes de recherche ont utilisé ces cellules pour évaluer le rôle des gènes particuliers dans myelopoiesis et obtenu des résultats qui en corrélation avec les données obtenues à l’aide de in vivo des modèles et des cellules primaires16,31. Ici, nous fournissons un protocole pour le traitement de la lignée cellulaire 32D/G-CSF-R, cependant, des procédures similaires peuvent être appliquées pour mise en culture et la manipulation 32D cl-3 cellules. Il est important de souligner que les différents lots de cellules 32D cl-3 utilisé dans différents laboratoires différences existant actuellement entre caryotype, suggérant que différents groupes peuvent travailler avec leur propre sous-clones32. D’après cette observation, nous émettons l’hypothèse que la variabilité génétique peut de même être présente dans les cellules 32D/G-CSF-R, et cela doit être pris en considération lorsque la comparaison des résultats obtenus par différents groupes de recherche. Modèles de culture de cellules alternative aux cellules 32D/G-CSF-R sont immortalisées progéniteurs hématopoïétiques lignes22,33,34,35,36. Cette approche est utile lorsque l’expansion de géniteur à grande échelle est nécessaire, par exemple afin d’étudier les interactions de protéine22. Un avantage aux cellules 32D/G-CSF-R est que les progéniteurs immortalisées peuvent être générés de toute souris génétiquement modifiée, bien que le temps d’établir la ligne est considérablement long37. En outre, la manutention et la manipulation des cellules souches de moelle osseuse immortalisé exige plus d’expertise que les cellules 32D/G-CSF-R.
Afin de familiariser le lecteur avec le modèle 32D/G-CSF-R, dans la première partie des résultats représentatifs, nous avons démontré cinétique de la prolifération et la différenciation des cellules-32D/G-CSF-R en présence d’IL-3 et G-CSF. Les images représentatives démontrant la morphologie des cellules dans des conditions de prolifération IL-3, ainsi qu’à des moments différents de la différenciation induite par le GC & SF ont été présentés. Nous avons évalué la différenciation neutrophilique par analyse morphologique, mais il a été rapporté que la différenciation des cellules de cl-3 32D peut être déterminée par cytométrie utilisant le CD11b cellule marqueur de surface27,31, 38,39. À nos connaissances et notre expertise, CD11b n'est pas augmentée durant la différenciation des cellules-32D/G-CSF-R neutrophilique. De normalisation, dans les essais de prolifération 32D/G-CSF-R, nous avons utilisé commercialement disponible IL-3. Cependant, nous avons observé que les cellules prolifèrent Eh bien en fait maison IL-3, produit comme décrit par Guillaume et ses collègues22. Pour obtenir un bon degré de différenciation neutrophilique induite par G-CSF, il est important de se rappeler que la capacité de différenciation des cellules-32D/G-CSF-R peut être réduite si les cellules sont cultivées au-dessus d’une concentration de 1 × 106 cellules/mL. En outre, le degré et la vitesse de la différenciation peuvent être affectées par la composition de sérum. Par conséquent, il est recommandé de tester la capacité de différenciation des cellules-32D/G-CSF-R en plusieurs lots FBS et choisissez celui qui supporte mieux le développement des neutrophiles matures sur 6 à 9 jours de culture en présence de G-CSF.
Nous avons fourni deux expériences représentatives démontrant les moyens possibles pour étudier le rôle des protéines particulières dans la différenciation myéloïde (Figure 3 et Figure 4). Tout d’abord, nous avons montré que la diminution de EVI2B, une protéine transmembranaire exprimée dans les cellules hématopoïétiques, mène à un bloc de différenciation myéloïde dans les cellules 32D/G-CSF-R. Ces données ont été récemment publiées par notre groupe, en combinaison avec des analyses effectuées à l’aide de cellules primaires et Evi2b de souris knock-out16. Deuxièmement, nous analysons les effets de BCR-ABL, une protéine de fusion résultant de le t(9,22) de translocation génétique (q34 ; q11), sur la différenciation des cellules-32D/G-CSF-R neutrophilique. Cette translocation a été initialement identifiée chez des patients souffrant de leucémie myéloïde chronique40,41. Il a été précédemment démontré que l’expression de l’oncoprotéine fusion BCR-ABL dans 32D cl-3 cellules conduit à une différenciation myéloïde arrestation27,28. Ici, nous avons démontré que la surexpression de BCR-ABL a des effets similaires sur les cellules-32D/G-CSF-R. Dans les deux séries d’expériences présentées ici (impliquant downregulation de Evi2b et de la surexpression de BCR-ABL), la modification génétique des cellules-32D/G-CSF-R a fait l’objet la transduction virale, qui se traduit par l’expression des gènes stable. Le choix des antirétroviraux contre la livraison des gènes n’affecte pas la prolifération ou la différenciation des cellules-32D/G-CSF-R. Toutefois, l’infection des gènes est plus efficace que retroviral transduction due à la présence d’un rétrovirus endogène dans les cellules 32D/G-CSF-R. Selon notre expérience, la transfection des cellules à l’aide de réactifs lipophiles standards n’est pas efficace. Toutefois, si l’expression transitoire construct est nécessaire, transfection par électroporation est une approche viable42,43,44. Ici, nous avons présenté une manipulation génétique de cellules 32D/G-CSF-R suivie de GFP tri et en vrac de l’analyse des cellules infectées. Toutefois, si nécessaire, seule cellule Tri pouvait être employé pour générer des clones à cellule unique comme indiqué précédemment12,45.
En plus des tests de prolifération et la différenciation, les cellules 32D/G-CSF-R ont été employées pour déterminer avec succès le rôle de certaines protéines dans la cellule migration et apoptose13,46,47,48 . En outre, la ligne 32D/G-CSF-R a été utilisée pour déterminer la croissance indépendante de cytokine médiée par oncoprotéines19,20. Une autre ligne fréquemment utilisée pour étudier l’indépendance cytokine est Ba/F3 cellules21,49. BA/F3 est une ligne de cellule murine dépendante de IL-3 dérivée de la souche de souris C3H, de la même façon aux cellules 32D/G-CSF-R. Bien que les deux systèmes peuvent être employés pour étudier la prolifération indépendant de cytokine, Ba/F3 cellules se différencient mal en présence de G-CSF.
Au total, nous suggérons que cellules 32D/G-CSF-R, bien qu’étant moins privilégiée que les cellules primaires, offrent plusieurs avantages, y compris la capacité de prolifération illimitée et simple à manier. Nous croyons que pour la génération de données fiables, expériences réalisées sur des cellules-32D/G-CSF-R devraient être complétées avec les données recueillies à l’aide des approches expérimentales alternatives telles que les modèles murins et cultures primaires.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Prof. Ruud Delwel et Prof. Ivo Touw pour nous avoir fourni la lignée cellulaire 32D/G-CSF-R et Prof. Daniel G. Tenen pour nous avoir fourni la lignée cellulaire de Bosc23. Ce travail a été soutenu par des subventions de l’Agence de Grant de la République tchèque (GACR 15-03796S et GACR 17-02177S) de la MA-J, le soutien de l’Institut de génétique moléculaire de l’Académie tchèque des Sciences (RVO 68378050) de la MA-J, une bourse de GA UK (projet n° 341015) de l’Université Charles à Prague pour MK et une bourse de GA UK (projet no 1278217) de l’Université Charles à Prague pour PD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 powder medium | Merck, Kenilworth, NJ, USA | T 121-10 | without NaHCO3, with L-glutamine |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15028 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 31985-047 | L-Glutamine, Phenol Red |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAA Laboratories (GE Healthcare,Chicago, IL, USA) | MT35011CV | For differentiation of 32D/G-CSF-R cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10270 | Used for culturing HEK293T, NIH3T3, BOSC23 cells |
| Penicillin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | P3032 | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | S9137 | Streptomycin sulfate salt powder |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | G1914 | |
| murine IL-3 | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA | 213-13 | |
| human G-CSF | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA | 300-23 | |
| Polyethylenimine | Polyscience, Warrington, PA, USA | 23966 | Linear, MW 25,000 (PEI 25000) |
| Polybrene | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | H9268 | |
| Trypsin | VWR Chemicals, Radnor, PA, USA | 0458 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | E5134 | |
| Crystal violet | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | C0775 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | T6146 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | D2650 | |
| May-Grünwald Giemsa | DiaPath, Martinengo, BG, Italy | 10802 |
References
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