Summary
ここでマウス骨髄前駆体 32D/G-CSF-R 細胞株を培養、ウイルス感染および増殖と分化アッセイを行う目的として詳細なプロトコルが表示されます。この細胞株は、骨髄性細胞と骨髄細胞の増殖および好中球分化の興味の遺伝子の役割を勉強に適しています。
Abstract
造血幹・前駆細胞の生物学の理解では、再生医療と血液病理の治療にとって重要な意味を持ってください。生体内でモデルや初代培養を使用して得ることができる最も関連性の高いデータ、にもかかわらず造血幹・前駆細胞の低豊富はかなり彼らの調査のための適切な技術のプールを制限します。したがって、細胞の使用は、上映または大規模な細胞数を必要とする試金のパフォーマンスのための生物材料の十分な生産できます。ここで詳細な説明、読み出し、イエウサギと好中球の分化に関与するプロセスの調査のために使用されている増殖・分化アッセイの解釈を提案します。これらの実験は、IL 3 存在下で増殖し、G-CSF で区別する能力を持って 32D/G-CSF-R サイトカイン依存マウス骨髄細胞ラインを採用しています。32D/G-CSF-R セルを処理するためのプロトコルを最適化を提供し、議論する主要な落とし穴とデメリット説明アッセイと予想される結果を危険にさらす可能性があります。さらに、この資料には、レンチ ウイルスやレトロ ウイルスの生産、滴定、および 32D/-r-CSF G 細胞の情報伝達のためのプロトコルが含まれています。機能分子研究一次造血幹・前駆細胞や生体内でモデルで得られた結果を補完することができますを正常に実行するこれらの細胞の遺伝的操作を用いることができることを示す.
Introduction
造血幹・前駆細胞の人口の成熟細胞は、骨髄系 (好中球、好酸球、好塩基球、単球) から細胞を含む広い範囲から有機物を供給します。造血幹細胞の骨髄系細胞の生産を運転するプロセスはイエウサギと呼ばれ、十分な生産要求の変化への応答で成熟した骨髄系細胞がストレスと生物の適切な対処のための前提条件感染症や出血量などの条件。成熟した骨髄系細胞の分泌不足は、病原体、減らされた血凝固および他の生命にかかわる条件1,の2を除去する無力をもたらすかもしれない。さらに、骨髄系開発の変化が急性骨髄性白血病 (AML)3などの造血器腫瘍に関連付けられてあります。細胞表面の受容器4、トランスクリプション要因5の変更された式の欠陥障害シグナリング経路6形成の突然変異のように、様々 な理由によってイエウサギの変化が発生する/遺伝子7、または8腫瘍サプレッサーの遺伝子の不活化の活性化。
様々 な方法は、骨髄性の開発を研究し、このプロセスで特定の遺伝子変異の影響評価開発されています。イエウサギを研究するために使用する一般的なアプローチは、初代培養細胞およびトランスジェニック マウスを含みます。これらのモデルは、生物学的関連性の高いデータの取得を許可する、しかし彼らは特定の制限があります。一次電池の使用細胞の限られた数および遺伝子発現とその後の生物学的または生化学的な分析を変更する可能性を絞り込む、文化の制限期間が発生します。トランスジェニック マウスは高価であり、生物学的正当性の合理的な程度を必要とします。さらに、体内モデルでの作業は、特定のプロセスの興味の遺伝子の役割を理解することの複雑さの程度を追加します。したがって、これらの制限を回避するために代替的なアプローチが必要です。細胞は疑う余地のない利点を持っている: (1) 彼らは生化学的・生物学的研究のための十分な材料を生成することができます無制限の増殖能力を持っている、(2) 彼らは (ノックダウン、ノックアウト、遺伝子操作を受けやすい過剰発現)、(3) コストは比較的低く、(4) 彼らは特定の実験的アプローチに必要な生物学的簡素化の程度を許可します。
親の IL 3 (インターロイキン-3) 依存 32D セルライン グリーンバーガーおよび同僚によって、友人マウス白血病ウイルス9C3h/hej マウス骨髄細胞の感染によって 1983 年に設立されました。いくつか 32D クローンは文献で記述されていた: cl 239cl 3 の10、および cl 1011。32D cl 3 細胞は IL 3 に増殖し、顆粒球コロニー刺激因子 (G-CSF)10の治療に好中球に分化する示されていた。それどころか、もともとは G-CSF の治療に反応ながら IL 3 依存 32D の cl-10 セルを区別することがないです。1995 年に博士 Ivo Touw のグループは、この受容体11の機能的に重要な領域を識別するために野生型と G-CSF 受容体 (G CSF R) の変異形 32D の cl-10 セルを遺伝子導入。本研究により IL 3 に同様に依存している、32D/G-CSF-R のセルの生成が、細胞が増殖、成熟好中球に分化する不可逆的停止 g-csf IL 3 の交換後 6 ~ 10 日以内。これらの特性は、32D cl 3 と 32D/G-CSF-R セル 2 つの明確に定義された成長と分化因子 - IL 3 と G-CSF によって変調することができますマウスの好中球分化の簡略化モデルを作る。最後の十年の間に複数のグループは、文化12,13,14,15骨髄細胞の分化と増殖における特定の遺伝子の役割を研究するのに 32D/G-CSF-R セルを使用しています。,16、G-CSF シグナル17,18を検討します。重要なは、この細胞ラインを使用して得られた結果は、初代培養細胞およびトランスジェニック マウス16,19,20,21で得られるデータと相関。したがって、この問題に対処する他の方法と並行して使用することができます骨髄性の微分を調査する貴重なシステムを表す 32D/G-CSF-R セル、広く使用され、確立されたモデルであると考えます。
ここでは、32D/G-CSF-R セル行の処理を説明する詳細なプロトコル、どのカバー拡大、分化およびこれらの細胞の分化・増殖の評価が表示されます。32D/-r-CSF G 細胞の遺伝の変更の詳細については、ウイルスの滴定のためのプロトコルと同様に、レトロ ウイルスやレンチ ウイルスの伝達によっていずれかが提供されます。また、32D/-r-CSF G 細胞の潜在的なアプリケーションを示すいくつかの代表的な結果が提供されます。
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Protocol
メモ: 手順は、拡張を記述する、分化および 32D/-r-CSF G 細胞の伝達以下に示します。
1. 準備
- メディアの準備
- 250 mL の培養液の準備: FBS (ウシ胎児血清) とマウス IL 3 に 10% 熱 (ロズウェル パーク記念研究所) RPMI 1640 培が不活化 (10 ng/mL)。
- また、自家製の IL 3 を使用します。自家製 IL 3 を生成するには、IL 3 表現するベクトルを HEK293 細胞を変換し、IL-3 清22を含むを収集します。
注: 抗生物質、ペニシリン G など (100 IU/mL)、(100 μ g/mL)、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン (40 μ g/mL) は、特に明記しない限り、プロトコルのすべてのステップで, 培養細胞の使用できます。
- また、自家製の IL 3 を使用します。自家製 IL 3 を生成するには、IL 3 表現するベクトルを HEK293 細胞を変換し、IL-3 清22を含むを収集します。
- 分化培地 50 mL を準備: RPMI 1640 中 10% 添加した引受とヒト G-CSF (100 ng/mL)。
注: しないすべての血清バッチ サポート 32D/-r-CSF G 細胞の分化 (重要)。実験開始前に、血清中の別のバッチをテストします。少なくとも 4 つの異なるバッチをテストし、最適な区別する 32D/G-CSF-R セルの能力に基づいて選択することをお勧めします。32D/G-CSF-R 分化プロトコルの以下を参照してください。 - 凍結培地 10 mL を準備: RPMI 1640 中 40% 添加した引受と 10 %dmso (ジメチルスルホキシド)。
- 250 mL の培養液の準備: FBS (ウシ胎児血清) とマウス IL 3 に 10% 熱 (ロズウェル パーク記念研究所) RPMI 1640 培が不活化 (10 ng/mL)。
- レトロ ウイルスの生産
- Bosc23 細胞 (6 × 106) 16 cm シャーレで単一細胞懸濁液をプレート、FBS 文化の confluency まで 80% (24 h) に達すると 10% を含む DMEM (ダルベッコ変更イーグル培地) の 18 mL で育んでいます。
注: 細胞培養単分子膜やフォームではなく塊で成長してください。細胞数は、異なるメソッド (ここに示すプロトコルの残りの部分に有効) を使用して実行できます。サンプル数が少ない、場合 Bürker チャンバーを用いた顕微鏡下で手動カウントを推奨します。この場合、死んだ細胞の排除のためトリパン ブルー色素を使用します。セル 1:1 を混ぜて 0.4% トリパン ブルー PBS で。多くのサンプル数のカウントを実行するには、セルの自動カウンターを用いることができます。 - レトロ ウイルスの構造 (たとえば、MSCV) の 40 μ g、pCL エコ (包装ベクトル)23の 20 μ g、PEI (ポリエチレンイミン) の 80 μ l と減少血清媒体 (例えばオプティ-MEM) 媒体 (抗生物質) なしの 2 mL を組み合わせます。部屋の温度 (RT) で 20 分のこの混合物を孵化させなさい。
- 16 ml の 2% を DMEM Bosc23 細胞中に慎重に取り付けます FBS。事前使用前に 37 ° C の中を温めます。
注: トランスフェクション効率を減らすことができるので、トランスフェクション、時に抗生物質を使わない。 - 1.2.2 で混合物を追加します。注意深く、Bosc23 滴文化と 37 ° C で 4 時間インキュベートプリンスエド ワード島の毒性により 6 h 未満までのインキュベーションを制限します。
- インキュベーション後、Bosc23 媒体を 18 mL に変更 10% を含む DMEM を予め加温 FBS、37 ° C で 48 時間のための細胞を養うとバイオ セーフティ レベル 2 の実験室で料理を配置、ここで、このステップから維持、標準的な安全手順に従ってください。
- 50 mL の円錐管に 25 mL の血清ピペットを使用して Bosc23 媒体 (含まれているマウス白血病ウイルスエンベ レトロ ウイルス粒子) を収集し、4 ° C で保存
注: (重要) トランスフェクション効率は、高力価ウイルスを生成する 90% に達する必要があります。 - 18 mL 加温 DMEM の 10% を追加 Bosc23 に FBS 細胞し、24 h の育成します。
- 1.2.6 のステップを繰り返します。
注: ウイルスの整合性を維持するために同じ温度 (4 ° C) に達すれば 1.2.6 1.2.8 からレトロ ウイルス上清をプールできます。 - ウイルス上清中に Bosc23 の汚染を避けるためには、4 ° C で 10 分間 1500 × g で収集されたウイルスをスピンします。分注ウイルスは、ドライアイスや液体窒素を用いて凍結をスナップし、-80 ° C で保存ただし、その作りたてのウイルスは凍結する在庫より感染効率の面で高品質。
注: (重要) 避けるため繰り返し凍結/融解ウイルス、ウイルスの劣化につながるので。
- Bosc23 細胞 (6 × 106) 16 cm シャーレで単一細胞懸濁液をプレート、FBS 文化の confluency まで 80% (24 h) に達すると 10% を含む DMEM (ダルベッコ変更イーグル培地) の 18 mL で育んでいます。
- レンチ ウイルスの生産
- HEK293T (人間の萌芽期の腎臓の 293 t) 細胞 (6 × 106) 16 cm シャーレで単一細胞懸濁液をプレート、FBS 文化の confluency まで 80% (24 h) に達すると 10% を含む DMEM の 18 mL で育んでいます。
注: 細胞培養単分子膜やフォームではなく塊で成長してください。 - 15 μ g のプラスミド pCMVdR8.74 (ギャグ/ポル、12 μ g のエンコーディング) をパッケージ化 (pGhU6) などレンチ ウイルスの構造を組み合わせると pMD2.VSVG (VSV G、1.4 μ g のエンコーディング)、85.2 μ L PEI、(抗生物質) なし減少血清培地 2 mL。室温に 20 分間のこの混合物を孵化させなさい
- 2 %dmem の 16 ml HEK293T の中に慎重に取り付けます FBS。事前使用前に 37 ° C の中を温めます。トランスフェクション効率を減らすことができるので、トランスフェクション、時に抗生物質を使用しないでください。
- 慎重に 1.3.2 HEK293T 細胞培養への準備混合物をドロップし、37 ° C で 4 時間インキュベートプリンスエド ワード島の毒性を防ぐために 6 時間以内に潜伏期間を制限します。
- 18 mL に変更培地加温 DMEM の 10 %fbs と 37 ° C で 48 時間のための細胞を育成バイオ セーフティ レベル 2 の実験室で料理を配置、ここで、このステップから維持、標準的な安全手順に従ってください。
- HEK293T 媒体 (含む・ ロープ ・ レンチ ウイルス粒子) 50 mL コニカル チューブに 25 mL の血清ピペットを使用してを収集し、4 ° C で保存
注: (重要) トランスフェクション効率は、高力価ウイルスを生成する 90% に達する必要があります。 - 慎重に予め温めておいた DMEM の 18 mL を追加し 10% FBS HEK293T 細胞へ。37 ° C で 24 時間を育成します。
- 1.3.6 のステップを繰り返します。
注: ウイルスの整合性を維持するために同じ温度 (4 ° C) に達すれば、1.3.6 1.3.8 からレンチ ウイルス上清をプールできます。 - 4 ° C で 10 分間 1500 × g で収集されたウイルスをスピン HEK293T 細胞とウイルス上清の汚染を避けるためには、分注ウイルスは、ドライアイスや液体窒素を用いて凍結をスナップし、-80 ° C で保存ただし、凍結する在庫よりも感染効率の面で高い品質の作りたてのウイルスそれは注意してください。
注: (重要) 避けるため繰り返し凍結/融解ウイルス、ウイルスの劣化につながるので。
- HEK293T (人間の萌芽期の腎臓の 293 t) 細胞 (6 × 106) 16 cm シャーレで単一細胞懸濁液をプレート、FBS 文化の confluency まで 80% (24 h) に達すると 10% を含む DMEM の 18 mL で育んでいます。
- GFP レポーターを含むウイルスの滴定
- シード DMEM の 300 μ L で 1 × 10 5/NIH 3T3 細胞 10 %24 ウェル プレートによくあたり FBS。7 つの井戸が 1 つのウイルスの力価が適用されます。
- 37 ° C でウイルスを解凍し、1、5、10、50、100、500 μ L のウイルスを NIH 3T3/文化に追加します。すべてのウイルスをネガティブ コントロールにも追加しません。37 ° C で 48 時間のウイルスの存在下で細胞を養う
- トリプシン/EDTA (エチレンジアミン四酢酸) の 30 μ L を使用して/NIH 3T3 細胞を収穫 (0.25% トリプシン、PBS で 0.01 %edta) 細胞の FACS (蛍光活性化細胞選別) 管で 250 μ L の PBS の場所と。
- 各サンプル24フローサイトメトリーによる GFP+細胞の頻度を決定します。ヘキスト 33258 などの生存性色素の添加により死んだ細胞を除外します。
- (GFP+細胞のめっきされたセルの数と割合に基づく) GFP+のセルの合計数を計算してウイルス感染症用のボリュームに対してそれらをプロットします。
注: (重要) 性感染症はウイルス大量が適用されるときに高原に達する。したがって、どの感染効率が線形の範囲 (例を表 1に示すように) 発生ウイルス濃度に基づいて価を推定することが重要です。GFP+細胞の数は、特定のウイルス量の機能性ウイルス粒子 (TU - 変換ユニット) の数を示します。TU の mL 数を再計算します。
- ピューロマイシン レポーターを含むウイルスの滴定
- シード 3 mL DMEM に 5 × 10 4/NIH 3T3 細胞 10 %6 ウェル プレートのウェルあたり FBS6 井戸 1 つのウイルスの力価を採用してください。37 ° C で一晩文化
- 次の日は、表 2に示されているようにウイルスを希釈します。ウイルスを希釈に使用して予め温めておいた DMEM 10 %fbs。ボルテックスにかけないでください。
- NIH/3T3 細胞から培養液を外し、希薄ウイルスの 1 つの mL を追加します。
- 37 ° C で一晩インキュベートします。
- 優しくウイルス含有培地 2 ml に予め温めておいた DMEM の 10% を取り替える政府短期証券、37 ° C で一晩インキュベートし、
- 優しく NIH 3T3/媒体を 2 mL に予め温めておいた DMEM 10 %fbs 含むピューロマイシン (2 μ G/ml) に置き換えます。
- 37 ° C ・ ピューロマイシン 3 日おきに更新中慎重に、中が黄色の文化。
- 感染後 10-12 日、各ウェルから培地を吸引、PBS でやさしく洗浄します。
- クリスタル バイオレット溶液 (0.5% 20% エタノールと dH2O でクリスタル バイオレット)、1 mL で常温では、2 分を汚し、慎重に PBS で 2 回洗います。
- 顕微鏡 (倍率 X4) 各ウェルに存在の青いコロニーをカウントします。コロニーを守らなければなりませんない負の制御にも。
- TU/ml の希釈倍率を考慮した数字の合計を計算します。
2. 拡張と 32D/-r-CSF G 細胞の維持
- 32D/G-CSF-R セルが固定されている場合、因数を取ると雪解けの 1 分の 37 ° C の水浴のセルと直接に 10% に予め温めておいた RPMI 1640 培の 10 mL バイアルから細胞を注ぐ 15 mL チューブに FBS。反転チューブ 3 回し、400 × g にセルをスピンダウンは、上清を除去し、IL 3 0.3 × 106セル/mL の濃度で含まれている培地の細胞を再懸濁します。
- 最適な細胞成長濃度は 0.25 0.5 × 106セル/mL。セルを分割する濃度 0.1 0.2 × 10 にそれらをもたらす 2 日ごと6セル/mL。
注: (重要) 32D/G-CSF-R セルは部分的に 1 × 106セル/mL 以上の濃度に成長した場合を区別するために彼らの能力を失う可能性があります。したがって、時間に 32D/G-CSF-R セルを分割するのに非常に重要です。 - 必要に応じて、凍結し、-80 ° c または液体窒素中での時間の長い期間のセル因数を格納します。スピン ・ ダウン 3 × 106細胞培養上清を削除し、凍結培地 1 mL で再懸濁します。-80 ° C で凍結容器にチューブを入れる長期保管のため液体窒素のセルの位置を変更します。
3. 32D/-r-CSF G 細胞の情報伝達
- 0.3 × 106セル/mL の濃度で 6 ウェル プレートにプレート 32D/G-CSF-R セルです。
- 10 と 40 の間の MOI (感染症の多様性) に到達するウイルスの適切な量を追加します。
注: 高い MOI は興味の遺伝子の発現の高いレベルと同様に、GFP+細胞の増加の割合になります。10; の MOI で 0.3 × 106に感染するには、細胞の例。3 × 106 TU 32D/G-CSF-R セルに追加する必要があります。 - 最終濃度 8 μ g/mL に polybrene を追加し、37 ° C で 6 時間インキュベートまたは、スピン接種手順を実行: スイング バケツ ローターを用いた培養プレートに 30 ° C で 90 分 1200 × g で遠心し、37 ° C で 3 時間インキュベート
- 収集細胞は 15 mL チューブに移し、5 分 (4 ° C) 450 × g でスピンします。
- 上澄みを廃棄、6 ml の培地の小球形にされた細胞を再懸濁します、37 ° C でコート t25 フラスコ細胞培養用フラスコ、文化が、
- 48 時間後に、細胞を収穫し、450 の × g で 5 分 (4 ° C) で、それらをスピンします。上清を捨てます。
- GFP レポーターの場合: 流れの cytometry の選別機を使用して PBS と並べ替えの GFP+セルを 500 μ l 添加にセルを配置します。ベクターを含むピューロマイシン レポーターの場合: 2 μ g/mL ピューロマイシンを含む培養液中の細胞を配置。
- さらなる分析と実験に必要なセルを展開します。
注: (オプション) Transduced セルできます-80 ° C の凍結容器でメディアを凍結で冷凍、さらに液体窒素で保存します。
4. 32D/G-CSF-R セル拡散の試金
- 増殖率場所 0.2 × 106細胞培養培地 1 mL を評価し、37 ° C で一晩インキュベート
- 次の日はセルの数をカウントし、0.2 × 10 の6セル/mL の培養液を使用しての濃度に戻るそれらを希釈します。37 ° C で一晩インキュベートします。細胞濃度および表 3を使用して毎日文化に適用される希薄の記録を保持します。
- 増殖を評価する必要がある日数の 4.2 の手順を繰り返します。
注: 増殖アッセイの長さは、興味の遺伝子の影響に依存します。強い表現型の場合 8-9 日は (参照してください図 3 a) 有意な効果を観察するための十分な可能性があります。ただし、軽度の表現型の場合、時間の長い期間は必要あります。 - 表 3に示すように増殖曲線を作る、細胞増殖を評価します。
5. 32D/G-CSF-R 細胞分化アッセイ
- 0.2 × 106 32D/G-CSF-R 細胞サイトカインなし RPMI 培地で 2 回洗います。
注: 残留 IL 3 の存在が分化を阻害するので文化への G-CSF の添加前に洗浄のステップは重要です。 - 細胞濃度 0.2 × 106セル/mL (0 日目) の結果、24 ウェル/プレートで 1 mL 分化培地 (100 ng/mL、G-CSF を含む) にセルを配置します。37 ° C で一晩文化
- 細胞/ml (ステップ 1.2.1) 上記の数をカウントします。
- Cytospin 2 5 × 104セル (76 mm × 26 mm) スライド ガラスに遠心分離機を用いた 20 × g で必要なアダプターです。
- 24 ウェル/プレート (1 日) に 0.2 × 105セル/mL の濃度で分化培地とプレート細胞を更新します。古い板を廃棄して続行するステップ 5.6 新しいプレートとの次の日。
- 2 に 7 日 5.5 5.3 の手順を繰り返します。手順 4 で説明した G-CSF の存在下で細胞増殖を評価します。
注: (重要) 分化、細胞増殖が遅く、したがって G-CSF の存在下で 3 〜 4 日後より高い濃度で培養細胞に十分です。 - 細胞の形態に基づく 32D/-r-CSF G 細胞の分化状態を評価します。
- 常温 5 分のメタノールのステップ 5.4 からセルを修正し、風乾するスライドを残します。
注: 0 に 7 日目からスライドすることができます RT に格納されているし、同時に固定します。同様に、彼らも保存できます RT で固定後より長い一定期間のため。 - 次の製造元のプロトコルを汚す 5 月グリューンヴァルト ギムザを使用してセルを汚します。
- 顕微鏡と X40 の倍率を使用して染色の細胞を可視化します。
- 爆発、中間分化した細胞は、および図 1と表 4で説明のイラストを使用して成熟した顆粒球の数を定量化します。
- 常温 5 分のメタノールのステップ 5.4 からセルを修正し、風乾するスライドを残します。
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Representative Results
32D/-r-CSF G 細胞の増殖と分化
32D/G-CSF-R pro 増殖とプロの分化条件下で細胞の増殖を評価するために IL 3、G-CSF をそれぞれ含んでいる媒体で 32D/-r-CSF G 細胞を培養されました。IL 3 含む媒体 (10 ng/mL) で培養された細胞分割 (図 2 a) すべて 24 h 約であることが観察されました。徐々 に減速し、4 日 (図 2 a) 後停止の G-CSF (100 ng/mL) 増殖と IL 3 の交換に。さらに、5 月グリューンヴァルト ギムザ染色サイトスピン細胞を用いた G-CSF の存在下で培養された細胞の分化状態を評価しました。前日に 0 (G-CSF の治療の開始)、細胞提示未熟な骨髄芽球のような形状、大きな核と暗い細胞質 (図 2 b) によって特徴づけられることが示されました。治療の過程で、核の大きさが減少と月形に核変更やドーナツ形のシェイプ。さらに、細胞質は拡大され、ダーク バイオレット色が失われます。G-CSF 投与の 6 日後細胞は葉状の核と光紫の細胞質 (図 2 b) によって特徴付けられる、完全好中球の分化の兆候を提示します。32D/-r-CSF G 細胞の分化はないすべてのセルが正確に同じ速度で成熟した好中球に向かって進化、漸進的なプロセスです。(すなわち爆発、中間の分化細胞、好中球) の分化の過程でさまざまな段階で細胞の定量は図 2 bに示すように。
マウスのEvi2bノックダウン ブロック 32D/G-CSF-R 細胞における好中球の分化
EVI2B のダウンレギュレーションの (マウス白血病ウイルスエンベ ウイルス統合サイト 2 b) 32D/G-CSF-R セル、3 Evi2bで-(国道 2 号線、Sh3、Sh4) をターゲットと 1 を対象とした非サイレンシング コントロール (NSC1) Shrna を設計されていた;これらは GFP レポーター16を運ぶレンチウイルスベクターに複製されました。32D/G-CSF-R セル コントロールとEvi2b導入された-10 の MOI を使用して Shrna を黙らせます。導入後、2 日間 GFP+ (導入) 細胞の並べ替え, さらに実験のために拡張.しかし Sh2 効率的にレセプター EVI2B 蛋白質のレベルにことができなかった、従って付加的な制御として使用されたがここで参照される、Sh3 と Sh4 の 80% に達した EVI2B の枯渇に備えて非サイレンシング コントロール 2 (NSC2) として。導入後、4 日間は、G-CSF の存在下で分化と増殖アッセイを行ったし、 Evi2bダウンレギュレーションでこれらのプロセスの影響を検討しました。観察されたそのEvi2b-コントロール細胞 (NSC1 と NSC2) が低下して一日中 4 (図 3 a) 増殖に対し劣化細胞 (国道 2 号線、Sh3) が GCSF の存在下で細胞増殖を持続します。さらに、 Evi2b-沈黙 32D/G-CSF-R セル生産制御の細胞 (図 3 b) と比較して少ないの中間と成熟した好中球。著しく、貧しいEvi2bのノックダウン効率を示した、NSC2 で導入した細胞はまた成熟好中球 (図 3 b) の数のわずかな減少を示した。これらのデータは、最近公開された16だった。
BCR-ABL 融合タンパク質を損なう 32D/G-CSF-R 細胞における好中球の分化
それは、BCR-ABL 融合タンパク質が造血障害で急性期慢性骨髄性白血病25,26の結果骨髄前駆細胞の広範な展開を引き起こして、骨髄性の分化を損なうことを示されています。以前の研究は示した 32D cl 3 細胞に BCR-ABL の強制発現により好中球分化27,28のブロックされました。したがって、同様の結果を 32D/G-CSF-R セルラインでできたかどうかを調べた。32D/G-CSF-R セルが BCR-ABL またはコントロール MSCV レトロウイルスベクター GFP レポーターを運ぶ増殖型 (MOI = 20)。2 日後の伝達、GFP+細胞ソート, IL 3 含む培地で 2 週間の展開.次に、G-CSF の存在下で分化アッセイを行った。見ました (G-CSF 含む媒体にセルを転送する) 前に、日 0、MSCV 制御 BCR-ABL 32D/G-CSF-R セルを表現する提示と同様の形態、主に未熟な骨髄系細胞 (図 4) を表します。しかし、我々 は空のベクター中導入された制御の細胞を受けたと G-CSF の治療 (成熟好中球の 11.5%、中間の分化細胞の 56.4% を生産) の 6 日後の好中球分化ない実証成熟好中球BCR ABL 導入 32D/-r-CSF G 細胞 (図 4) から生成されました。一貫して、G-CSF の BCR-ABL 発現細胞の未熟なブラストの割合残った IL 3 条件で爆発の割合のようです。
図 1。異なる 32D/G-CSF-R の代表的なイメージの細胞形態。32D/G-CSF-R 細胞形態学的爆発として分類することができます、中間分化細胞と成熟好中球。説明は、表 4を参照してください。
図 2。32D/-r-CSF G 細胞の増殖・分化します。(A)媒体を含んでいる 10 ng/mL IL 3 (黒線) や 100 ng/mL G-CSF (青線) の 32D/GCSFR 細胞の増殖。X 軸は、治療の日を表します。Y 軸は対数 (ログ2) に示すように、セル × 105の数を示します。結果は、3 の独立した実験の平均を表します。エラーバーは標準偏差を示します。32D/G-CSF-R 細胞 G CSF 含有培地 (100 ng/mL) の(B)分化。上部のパネルにパイ プロット (黒) の芽球の割合を示す、中間の差別化細胞 (ピンク)、好中球 (赤) 0、2、4 後の文化と G-CSF の治療の 6 日。下部のパネルにはからそれぞれサイトスピン細胞の代表的なイメージが含まれています時間ポイント 5 月グリューンヴァルト ギムザ染色します。100 セルの最小値は、各時点の評価されました。
図 3。Evi2bのサイレンシング 32D G CSF R 細胞における好中球の分化をブロックします。(A) Evi2bの増殖-沈黙 (オレンジ色の線) とコントロール (黒線) 32D/G-CSF-R セル 100 ng/mL G-CSF 含む中。X 軸は、治療の日を表します。Y 軸は対数 (ログ2) に示すように、セル × 105の数を示します。結果は、3 の独立実験の代表的な結果を示しています。Evi2b増殖型 32D/-r-CSF G 細胞の分化(B)評価-5 月グリューンヴァルト ギムザ染色サイトスピン セルを使用して G CSF を含む培地 (100 ng/mL) で黙らせるとコントロールの Shrna。上部のパネルにパイ プロット (黒) の芽球の割合を示す、中間の差別化 (ピンク) 細胞と好中球 (赤) 文化。下のパネルには、サイトスピン細胞の代表的な写真が含まれています。分化は、分化 7 日目に評価しました。少なくとも 100 セルは、条件ごとに評価しました。
図 4。BCR-ABL 融合蛋白の過剰発現を損なう 32D/-r-CSF G 細胞の分化します。32D/-r-CSF G 細胞の分化の評価は、コントロール MSCV または G CSF 含有培地 (100 ng/mL) に BCR-ABL 融合遺伝子を導入しました。上部円プロット (黒) の芽球の割合を示す、中間分化の日 6 (ピンク)、細胞および好中球 (赤) は区別されます。下のパネルは、サイトスピン セル 5 月グリューンヴァルト ギムザ染色の代表的な画像を表示します。少なくとも 100 セルは、各時点の評価しました。
| ウイルス V [μ] | めっきされたセルの数 | %Gfp+ | GFP+細胞数 | 線形か。 | TU/mL | 平均 (TU/mL) |
| 1 | 100 000 | 1.83 | 1 830 | うん | 1 830 000 | 2 350 000 |
| 5 | 100 000 | 12.9 | 12 900 | うん | 2 580 000 | |
| 10 | 100 000 | 26.4 | 26 400 | うん | 2 640 000 | |
| 50 | 100 000 | 71.4 | 71 400 | 違います | ||
| 100 | 100 000 | 85.1 | 85 100 | 違います | ||
| 500 | 100 000 | 85.6 | 85 600 | 違います |
テーブル 1。ベクトルを含む GFP レポーターのウイルス価決定。MSCV レトロ ウイルスと計算で得られるデータの例は、ウイルスの力価を推定する実行します。ウイルス力価はウイルスの特定の量が適用されたときに取得した GFP+セルの数に基づいて計算されます。ウイルス感染のために採用の量は線形相関測定 GFP+細胞の割合でなければなりません。TU: は変換ユニットです。
| チューブ | 管の説明 | DMEM + 10% FBS | ウイルス | 総容積 | 希釈倍率 |
| (Μ L) | (Μ L) | (Μ L) | |||
| 1 | 希釈 1 | 1485 | 15 μ L のウイルス ストック | 1500 | 1 x 102 |
| 2 | 希釈 2 | 1350 | 150 μ L 管 1 | 1500 | 1 x 10 の3 |
| 3 | 希釈 3 | 1350 | 150 μ L チューブ 2 | 1500 | 1 x 10 の4 |
| 4 | 希釈 4 | 1350 | 150 μ L チューブ 3 | 1500 | 1 x 10 の5 |
| 5 | 希釈 5 | 1350 | 150 μ L チューブ 4 | 1500 | 1 x 106 |
表 2。ベクトルが含まれるピューロマイシン記者のウイルス価決定。ウイルスの希釈戦略ベクトルが含まれるピューロマイシンでウイルス力価を決定します。(1-5) を含むウイルス ストックのシリアル希釈 5 チューブを準備する方法を示します。チューブ 1 含む 1485 μ l 添加 DMEM + 10 %fbs と 15 μ L 1 × 102を提供すること、作り出されたウイルスの希釈ウイルス。チューブ 2 含む 1350 μ l 添加 DMEM + 10 %fbs と 1 × 102の 150 μ L 希釈ウイルス (管 1) 1 × 103希釈ウイルスを提供すること。チューブ 3 含む 1350 μ l 添加 DMEM + 10 %fbs と 1 × 103 150 μ L 希釈ウイルス (管 2) 1 × 104希釈ウイルスを提供すること。チューブ 4 を含む 1350 μ l 添加 DMEM + 10 %fbs と 1 × 104の 150 μ L 希釈ウイルス (管 3) 1 × 105希釈ウイルスを提供すること。チューブ 5 を含む 1350 μ l 添加 DMEM + 10 %fbs と 1 × 105の 150 μ L 希釈ウイルス (チューブ 4) 1 × 106希釈ウイルスを提供すること。管 1-5 から 1 ml の使用ウイルスの力価に。
| 細胞数(x = 1 ml あたりの細胞数) | |||||||
| 0 日目 | 1 日目 | 2 日目 | 3 日目 | 4 日目 | 5 日目 | 6 日目 | |
| サンプル 1 | 0 x | 1 x | ×2 | 3 x | ×4 | 5 x | ×6 |
| 希釈 (d)(y = replating [mL]; に使用されるセルのボリューム z = 最終巻 [mL]) | |||||||
| 0 日目 | 1 日目 | 2 日目 | 3 日目 | 4 日目 | 5 日目 | 6 日目 | |
| サンプル 1 | d0= 1 | d1= y1/z1 | d2= y2/z2 | d3= y3/z3 | d4= y4/z4 | d5= y5/z5 | |
| 総セル数 | |||||||
| 0 日目 | 1 日目 | 2 日目 | 3 日目 | 4 日目 | 5 日目 | 6 日目 | |
| サンプル 1 | 0 x | 1 /d0 x | 2/d1 x | 3/d2/d1 x | 4/d3/d2/d1 x | 5/d4/d3/d/d1 2x | 6/d5/d4/d3/d2/d1 x |
表 3。成長曲線の生成します。32D/-r-CSF G 細胞の増殖率の評価に必要な方程式の表示します。
| 核 | 細胞質 | |
| 爆発 | 暗い、丸い | 暗い、核とほとんど区別がつかない |
| 中間に分化した細胞 | ドーナツのような多くの場合、核形で変更を発音または月のような形をしました。 | 軽量化、区別の細胞質 |
| 成熟好中球 | 葉状の核。小葉間接続がほとんどないです。 | 光の質 |
表 4 好中球分化 32D/G-CSF-R 細胞形態。 。未熟な芽球、中間の分化細胞と成熟好中球の区別を有効にする主要な形態学的特徴を表にまとめます。核と細胞質の特性を説明します。代表的なイメージは、図 1を参照してください。
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Discussion
実験的なモデルの選択は、研究の主要な課題の 1 つです。主な動物やヒトの細胞は、最も生物学的に関連するデータを生成すると考えられている、これらのモデル倫理的な問題を伴うことがあります、高価なまたは洗練された養殖/分離のプロシージャに関連付けられていることが多い。一次電池の数は限られて、それらは遺伝的に操作するは難しい。さらに、一次電池はデータ解釈29を複雑にする可能性がありますさまざまなセルタイプの構成異種集団を表します。対照的に、細胞生物材料の事実上無制限のソースを提供する、費用対効果、倫理的な問題を回避することができます。しかし、そのセルの行は、遺伝子と表現型に起源のティッシュとは異なる人工実験システムと見なされますを考慮する重要です。それにもかかわらず、細胞実験の他のアプローチと組み合わせれば、再現性と生物学的関連性の高いデータの世代の貴重なモデルを提供します。
32D/G-CSF-R セルラインとして 32D cl 3 セル、実績のあるし、広くマウス好中球分化14,15,24,30の細胞モデルを使用します。いくつかの研究グループ、イエウサギの特定の遺伝子の役割を評価するためにこれらの細胞を使用し、体内モデルと一次電池16,31を使用して得られたデータとの相関結果が得られました。ここで我々 は 32D/G-CSF-R セルの行を処理するためのプロトコルを提供、養殖および 32D cl 3 セルを操作するためただし、同様の手順を適用できます。32D cl 3 セルの異なるバッチ使用異なる研究室で、別のグループは、独自のサブクローン32処理場合を示唆しているの上の違いであることを指摘することが重要です。この観測に基づき、私たち仮説 32D/-r-CSF G 細胞に存在する同様に遺伝的多様性とこれは別の研究グループによって得られた結果を比較する場合を考慮する必要があります。32D/G-CSF-R セルに代替細胞モデルは、造血前駆細胞の不死化線22,33,34,35,36です。大規模な前駆拡張が必要な場合、インスタンスのために、このアプローチは便利22タンパク質の相互作用を研究します。ラインを確立する時間はかなり長い3732D/G-CSF-R セルに利点は、任意の遺伝子組み換えマウスから不死化前駆細胞が生成されることです。さらに、処理および不死化骨髄前駆細胞の操作 32D/G-CSF-R の細胞よりもより多くの専門知識が必要です。
32D/G-CSF-R モデルの代表の結果の最初の部分で、読者を理解するには、32D/G-CSF-R IL 3 と G-CSF の存在下で細胞の分化・増殖の動力学を示しました。IL 3 増殖条件でだけでなく、GCSF の分化の異なる時点で細胞の形態を示す代表的な画像が発表されました。32D cl 3 細胞の分化は、、CD11b 細胞表面マーカー27,31を用いたフローサイトメトリーによる解析によって決まりますが報告されているしかし、我々 は形態素解析による好中球分化を評価 38,39。私たちの知識と専門知識、CD11b は誘導 32D/-r-CSF G 細胞の好中球分化中です。標準化は 32D/G-CSF-R 増殖アッセイで市販 IL 3 を採用しました。ただし、自家製の IL-3、Drobek および同僚の22のとおり生産でも細胞が増殖を観察した.G 誘起髄液好中球分化の程度を得るためには、1 × 106セル/mL の濃度の上細胞を培養している場合 32D/-r-CSF G 細胞の分化能が低下することを覚えていることが重要です。さらに、度と分化の速度は、血清成分による影響は。したがって、バッチ、いくつか FBS の 32D/-r-CSF G 細胞の分化能力をテストし、G-CSF の存在下で文化の 6 〜 9 日間に成熟好中球の開発に対するサポートの向上を選択ことをお勧めします。
(図 3および図 4) 骨髄性の分化の特定蛋白質の役割を研究するための方法を示す 2 つの代表的な実験を行いました。造血細胞に発現する膜貫通型タンパク質はまず、EVI2B ののダウンレギュレーションを示した 32D/-r-CSF G 細胞の骨髄性の分化のブロックにつながるのです。これらのデータは、一次電池とEvi2bノックアウト マウス16を使用して実行の試金との組み合わせで、私たちのグループが最近出版されました。第二に、32D/-r-CSF G 細胞の好中球分化の BCR-ABL 遺伝子転座 t(9,22) (q34; q11) から生じる融合タンパク質の効果を調べた。この転座はもともと慢性骨髄性白血病40,41苦しんでいる患者で同定されました。32D cl 3 細胞骨髄分化逮捕27,28つながる BCR-ABL 融合癌タンパクの発現以前示した。ここで我々 は BCR-ABL の過剰発現が 32D/G-CSF-R 細胞で同様の効果を持っていることを示した。実験の両方のセットの紹介 ( Evi2bダウンレギュレーションと BCR-ABL の過剰発現を伴う)、32D/-r-CSF G 細胞の遺伝子組み換えウイルスの伝達、安定した遺伝子発現の結果を行った。レンチ ウイルス配信対レトロ ウイルスの選択は、32D/-r-CSF G 細胞の分化や増殖には影響しません。ただし、レンチ ウイルス感染は 32D/G-CSF-R 細胞内在性レトロ ウイルスの存在のためのレトロ ウイルス伝達よりも効率的です。私たちの経験によると、標準的な脂溶性試薬を用いるこれらのセルの transfection は効率的ではありません。ただし、一時的な構造式が必要な場合、エレクトロポレーション法による遺伝子導入は実行可能なアプローチ42,43,44です。ここでは、提案は GFP の並べ替えに続いて 32D/-r-CSF G 細胞の遺伝子操作および感染細胞の解析を一括します。ただし、以前に報告された12,45として単一細胞のクローンを生成するで必要に応じて、単一のセルの並べ替えが採用されます。
増殖・分化アッセイに加えて 32D/G-CSF-R 細胞が細胞アポトーシスと移行13,46,47,48 の特定の蛋白質の役割を正常に判断に採用されています。.さらに、32D/G-CSF-R ラインはコンディショナルノック19,20を介したサイトカイン独立した成長を決定するために使用されています。サイトカインの独立性を研究するために頻繁に使用される別の行は ba/f3 細胞21,49です。Ba/F3 は 32D/G-CSF-R セルに同様に C3H マウス株から派生した IL 3 依存のマウス細胞株。両方のシステムは、サイトカイン独立増殖の研究ために使用できる、ba/f3 細胞は悪い G-CSF の存在下で区別するため。
完全に、一次電池よりも優先度が低くいって 32D/-r-CSF G 細胞が無制限の増殖能力と簡単な処理などを含むいくつかの利点を提供することをお勧めします。信頼性の高いデータの生成のため 32D/G-CSF-R 細胞で実験をマウスモデルなど初代培養実験的方法を使用して取得したデータを補完する必要があります考えています。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者は、教授ルード ・ Delwel と 32D/G-CSF-R セルラインをご提供する教授 Ivo Touw と教授ダニエル g. Tenen Bosc23 細胞株をご提供するためにありがとうございます。この作品は MA J にチェコ共和国 (GACR 15 03796S と GACR 17 02177S) の助成機関の補助金によって支えられた、MA - j、ジョージア州英国フェローシップ (プロジェクト号 341015) チェコ科学アカデミー (RVO 68378050) の分子遺伝学研究所からのサポートPD にプラハ ・ カレル大学から MK とジョージア州英国親睦 (プロジェクト号 1278217) にプラハのチャールズ大学。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 powder medium | Merck, Kenilworth, NJ, USA | T 121-10 | without NaHCO3, with L-glutamine |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15028 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 31985-047 | L-Glutamine, Phenol Red |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAA Laboratories (GE Healthcare,Chicago, IL, USA) | MT35011CV | For differentiation of 32D/G-CSF-R cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10270 | Used for culturing HEK293T, NIH3T3, BOSC23 cells |
| Penicillin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | P3032 | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | S9137 | Streptomycin sulfate salt powder |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | G1914 | |
| murine IL-3 | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA | 213-13 | |
| human G-CSF | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA | 300-23 | |
| Polyethylenimine | Polyscience, Warrington, PA, USA | 23966 | Linear, MW 25,000 (PEI 25000) |
| Polybrene | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | H9268 | |
| Trypsin | VWR Chemicals, Radnor, PA, USA | 0458 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | E5134 | |
| Crystal violet | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | C0775 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | T6146 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | D2650 | |
| May-Grünwald Giemsa | DiaPath, Martinengo, BG, Italy | 10802 |
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