Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Nükleer silahların yayılmasına karşı ve fare Miyeloid habercisi 32D/G-CSF-R farklılaşma hücre

Published: February 21, 2018 doi: 10.3791/57033
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1,2
1Department of Hemato-Oncology, Institute of Molecular Genetics of the ASCR, 2Childhood Leukaemia Investigation Prague, Department of Paediatric Haematology and Oncology, 2nd Faculty of Medicine, Charles University
* These authors contributed equally

Summary

Burada fare Miyeloid habercisi 32D/G-CSF-R hücre kültürünü kültür, viral enfeksiyonlar gerçekleştirme ve yayılmasını önleme ve farklılaşma deneyleri için detaylı protokol sunulmuştur. Bu hücre kültürünü myeloid hücre gelişimini ve myeloid hücre büyümesi ve Nötrofilik farklılaşma ilgi genlerin rol çalışmak için uygundur.

Abstract

Hematopoetik kök ve progenitör hücre biyolojisi anlayış rejeneratif tıp ve hematolojik patolojiler tedavisi için önemli sonuçları vardır. Vivo modelleri veya birincil kültürler kullanarak elde edilebilir en alakalı verileri rağmen hematopoetik kök ve progenitör hücre düşük bereket önemli ölçüde onların soruşturma için uygun teknikleri havuzu kısıtlar. Bu nedenle, hücre hatları gösterimleri veya büyük hücreli numaraları gerektirir deneyleri için biyolojik malzeme yeterli üretim sağlar. Burada ayrıntılı bir açıklama, okuma ve myelopoiesis ve Nötrofilik farklılaşma gerçekleştirilen işlemlere incelenmesi için kullanılan nükleer silahların yayılmasına karşı ve farklılaşma deneyleri yorumlanması mevcut. Bu deneyler IL-3 huzurunda çoğalırlar ve G-CSF içinde ayırt etmek yeteneği sahip 32D/G-CSF-R sitokin bağımlı fare myeloid hücre kültürünü istihdam. Biz protokolleri 32D/G-CSF-R hücreleri işleme için en iyi duruma getirilmiş sağlamak ve büyük tuzaklar ve açıklanan deneyleri ve beklenen sonuçları tehlikeye atabilir sakıncaları tartışıyorlar. Ayrıca, bu makale için lentiviral ve retroviral üretim, titrasyon ve 32D/G-CSF-R hücre iletim protokolleri içerir. Bu hücrelerin genetik manipülasyon başarılı bir şekilde birincil hematopoetik kök ve progenitör hücre veya vivo içinde modelleri ile elde edilen sonuçlar tamamlayabilir işlevsel ve moleküler çalışmalar gerçekleştirmek için istihdam edilecek göstermektedir.

Introduction

Hematopoetik kök ve yaratıcı nüfus organizma Olgun Hücreler, myeloid silsilesi (nötrofiller, eozinofiller, bazofil ve monosit) hücrelerden de dahil olmak üzere geniş bir dizi sağlar. Hematopoetik kök hücre myeloid hücre üretim sürücüler işlem myelopoiesis bilinir ve değişen taleplerine karşılık olgun myeloid hücrelerin yeterli üretim ile stres organizmanın uygun başa çıkma için bir önkoşuldur koşullar, enfeksiyonlar ve kan kaybı gibi. Olgun myeloid hücrelerin yetersiz üretim yetersizlik patojenler, düşük kan pıhtılaşması ve diğer hayati koşulları1,2ortadan kaldırmak için neden olabilir. Buna ek olarak, değişiklikler Miyeloid lineage gelişiminde de Akut Miyeloid Lösemi (AML)3gibi hematolojik maligniteler ile iliskili olabilir. Değişiklikler myelopoiesis içinde kusurları hücre yüzey reseptörlerinin4, transkripsiyon faktörleri5, değiştirilen ifadeler sinyal yolları6, mutasyonlar oluşumu sonucu Engelli gibi çeşitli nedenlerden dolayı oluşabilir / oncogenes7, ya da Tümör baskılayıcı genler8inactivation aktivasyonu.

Myeloid geliştirme çalışma ve bu süreçte belirli genetik değişiklikler etkisini değerlendirmek için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Myelopoiesis eğitim için kullanılan yaygın bir yaklaşım Primer hücre ve transgenik fareler içerir. Bu modelleri biyolojik ilgili verileri edinimi izin rağmen bazı kısıtlamalar bulunmaktadır. Primer hücre kullanımı sınırlı sayıda hücre ve gen ekspresyonu ve daha sonraki biyolojik ya da biyokimyasal analiz değiştirmek için olasılıklar daralma kültür, sınırlı bir süre karşılaşır. Transgenik fareler yüksek maliyetlidir ve biyolojik gerekçe makul bir ölçüde gerektirir. Buna ek olarak, vivo içinde modelleri ile çalışma bir ölçüde ilgi belirli bir süreç içinde bir gen rolünün anlaşılması halinde karmaşıklık ekler. Bu nedenle, bu sınırlamaları aşmak için alternatif yaklaşımlar ihtiyaç vardır. Hücre hatları tartışılmaz avantajı var: (1) onlar biyolojik ve biyokimyasal araştırmalar için yeterli malzeme üreten sağlar sınırsız nükleer silahların yayılmasına karşı kapasitesine sahip, (2) genetik manipülasyon (nakavt, nakavt, duyarlı oldukları overexpression), (3) maliyeti nispeten düşüktür, ve (4) biyolojik basitleştirme bazı deneysel yaklaşımlar gerekli bir ölçüde olanak tanır.

Ebeveyn IL-3 (İnterlökin-3) bağımlı 32D hücre kültürünü kurulmuştur 1983'te Greenberger ve meslektaşları tarafından enfeksiyon C3H/HeJ fareler arkadaş fare lösemi virüs9ile kemik iliği hücre tarafından. Birkaç 32D klonlar literatürde tarif edildi: cl-239, cl-310ve cl-1011. 32D cl-3 hücreleri IL-3'te çoğalırlar ve granülosit-koloni stimülasyon faktör (G-CSF)10ile tedavi üzerine Nötrofilik farklılaşma tabi gösterilmiştir. Aksine, olurken IL-3 bağımlı, 32D cl-10 hücreleri aslında yanıt G-CSF tedavisi olarak ayırt değil. 1995 yılında Dr Ivo Touw grup retrovirally bu reseptör11işlevsel olarak önemli bölgeleri tanımlamak için 32D cl-10 hücreleri vahşi türü ve G-CSF reseptör (G-CSF-R), mutasyona uğramış formlar transduced. Bu çalışmada IL-3 üzerinde benzer şekilde bağlıdır, 32D/G-CSF-R hücreler nesilde sonuçlandı ama IL-3 G-CSF ile replasmanı sonrası 6-10 gün içinde hücreleri çoğalırlar ve geri dönüşümsüz olgun nötrofiller ayırt durdurmak. Bu özellikleri 32D cl-3 ve iki iyi tanımlanmış büyüme ve farklılaşma faktörlerden - IL-3 ve G-CSF modülasyonlu fare Nötrofilik farklılaşma 32D/G-CSF-R hücreleri Basitleştirilmiş modelleri yapmak. Son yıllarda birden fazla grup nükleer silahların yayılmasına karşı belirli genlerin rol ve farklılaşma myeloid hücre kültürü12,13,14,15 dakika içinde çalışmaya 32D/G-CSF-R hücreleri kullandık , 16ve G-CSF sinyal17,18çalışmaya. Önemlisi, bu hücre satırı kullanarak elde edilen sonuçları Primer hücre ve transgenik fareler16,19,20,21ile elde edilen verilerle ilişkili. Sonuç olarak, 32D/G-CSF-R hücreleri, yaygın olarak kullanılan ve iyi kurulmuş bir model olmak bu soruyu ele diğer yaklaşımlar ile paralel olarak kullanılan Miyeloid farklılaşma eğitim için değerli bir sistemini temsil inanıyorum.

Burada, 32D/G-CSF-R hücre kullanımı açıklayan ayrıntılı iletişim kuralları, hangi kapak genişleme, farklılaşma ve nükleer silahların yayılmasına karşı değerlendirilmesi ve bu hücreler farklılaşma sunulur. Detaylı bilgi için 32D/G-CSF-R hücrelerinin genetik değişiklik retroviral veya lentiviral iletim gibi virüs titrasyon için iletişim kuralları tarafından sağlanır. Ayrıca, potansiyel uygulamalar 32D/G-CSF-R hücre göstermek birkaç temsilcisi sonuçları temin edilmektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Not: genişleme açıklayan adımları, farklılaşma ve iletim 32D/G-CSF-R hücre aşağıda sunulmuştur.

1. hazırlık

  1. Medyası hazırlama
    1. 250 mL kültür ortamı hazırlamak: RPMI (Roswell Park Memorial Enstitüsü) 1640 orta % 10 ısı ile desteklenmiş inaktive FBS (fetal sığır serum) ve fare IL-3 (10 ng/mL).
      1. Alternatif olarak, ev yapımı IL-3'ü kullanın. Ev yapımı IL-3 üretmek için HEK293 hücreleri ile IL-3 ifade vektör transduce ve IL-3 süpernatant22içeren toplamak.
        Not: Antibiyotik, penisilin G gibi (100 IU/mL), streptomisin (100 µg/mL) ve gentamisin (40 µg/mL), aksi belirtilmedikçe Protokolü'nün herhangi bir aşamada hücre kültürü için kullanılabilir.
    2. Farklılaşma orta 50 mL hazırlamak: RPMI 1640 orta takıma % 10 ile FBS ve insan G-CSF (100 ng/mL).
      Not: (Önemli) tüm serum toplu işlemleri desteklemek 32D/G-CSF-R hücrelere farklılaşma. Deney başlamadan önce serum farklı toplu işlemleri test. Bu en az 4 farklı toplu işlemleri test etmek ve en iyi ayırt 32D/G-CSF-R hücre becerisi ilgili seçin tavsiye edilir. Bkz: 32D/G-CSF-R farklılaşma protokolü aşağıdaki.
    3. Dondurucu orta 10 mL hazırlamak: RPMI 1640 orta FBS ve % 10 DMSO (Dimetil sülfoksit) % 40 ile desteklenmiştir.
  2. Retrovirüs imalatı
    1. Bir tek hücre süspansiyon (6 × 106) Bosc23 hücrelerinin 16 cm Petri kabına plaka ve 18 içeren FBS kültür confluency kadar (24 saat) % 80 ulaşır % 10 mL DMEM (Dulbecco'nın modifiye kartal orta) yetiştirmek.
      Not: Hücre kültüründe monolayer ve değil form kümeleri içinde yetişen gerekir. Hücre sayımı, farklı yöntemler (kalanı burada sunulan iletişim kuralları için geçerli) kullanılarak gerçekleştirilebilir. Örnekleri düşük dizi durumunda, el ile Bürker odası kullanma mikroskop altında sayma tavsiye edilir. Bu durumda, Trypan mavi ölü hücreleri hariç tutma için kullanın. Mix hücreleri 1:1 ile % 0,4 PBS Trypan mavi. Örnekler çok sayıda sayım gerçekleştirmek için bir otomatik hücre sayaç istihdam edilebilir.
    2. Birleştirmek retroviral yapı (örneğin MSCV) 40 µg, pCL-eko (ambalaj vektör)2320 µg, 80 µl PEI (polyethylenimine) ve (olmadan antibiyotik) indirimli Serum orta (örneğin Opti-MEM) orta 2 mL. Bu karışımı oda sıcaklığında (RT) 20 dk için kuluçkaya.
    3. Dikkatle 16 mL %2 ile desteklenmiş DMEM Bosc23 hücreleri orta yerine FBS. Orta kullanmadan önce 37 ° C olarak önceden ısıtmak.
      Not: transfection etkinliğini azaltmak beri antibiyotik transfection sırasında kullanmayın.
    4. 1.2.2 içinde hazırlanan karışımı ekleyin. dropwise ve dikkatli bir şekilde Bosc23 için kültür ve 37 ° C'de 4 h için kuluçkaya Kuluçka az 6 h PEI toksisite nedeniyle sınırlama.
    5. Kuluçka sonra Bosc23 orta 18 mL değiştirin önceden ısınmış % 10 içeren DMEM FBS ve 37 ° C'de 48 h için hücre yetiştirmek Yemekler bir biyogüvenlik seviye 2 laboratuarda yerleştirin, burada bu adımı tutmak ve standart güvenlik prosedürleri izleyin.
    6. 50 mL konik tüp 25 mL serolojik pipet kullanarak Bosc23 orta (içeren ecotropic retroviral parçacıklar) toplamak ve 4 ° C'de depolayın
      Not: (Önemli) Transfection verimliliği yüksek titresi virüs üretmek için % 90 ulaştırılması gerekmektedir.
    7. 18 mL % 10 ön DMEM ısındı eklemek FBS Bosc23 için hücreleri ve 24 saat için yetiştirmek.
    8. 1.2.6 arasındaki adımları yineleyin.
      Not: bir kez onlar uzanmak viral bütünlüğünün korunması için aynı sıcaklığı (4 ° C) 1.2.6 ve 1.2.8 Retroviral supernatants havuza.
    9. Viral supernatants Bosc23 kirlenmesini önlemek için toplanan virüs 1500 × g 4 ° C'de 10 dakika için de spin Aliquot virüs, Kuru buz veya sıvı nitrojen kullanarak donma dişlemek ve-80 ° C'de depolayın Ancak, donmuş stokları daha enfeksiyon verimlilik açısından yüksek kalitede taze hazırlanmış bu virüs olduğunu unutmayın.
      Not: (Önemli) donma/virüs, viral düşmesine yol açar bu yana çözdürme yinelenen kaçının.
  3. Lentivirus imalatı
    1. Bir tek hücre süspansiyon HEK293T (insan embriyonik böbrek 293T) hücre (6 × 106) 16 cm Petri kabına plaka ve 18 mL % 10 FBS kültür confluency kadar (24 saat) % 80 ulaşır içeren DMEM yetiştirmek.
      Not: Hücre kültüründe monolayer ve değil form kümeleri içinde yetişen gerekir.
    2. Lentiviral yapısı (gag/pol için 12 µg kodlama) plazmid pCMVdR8.74 ambalaj (örneğin pGhU6), 15 µg birleştirmek ve pMD2.VSVG (VSV-G 1.4 µg kodlama), 85.2 µL PEI ve (olmadan antibiyotik) indirimli serum orta 2 mL. Bu karışım RT., 20 dk için kuluçkaya
    3. Dikkatle 16 mL %2 ile desteklenmiş DMEM HEK293T orta yerine FBS. Orta kullanmadan önce 37 ° C olarak önceden ısıtmak. Transfection etkinliğini azaltmak beri antibiyotik transfection sırasında kullanmayın.
    4. Dikkatle 1.3.2 HEK293T hücre kültürü için hazırlanan karışım damla ve 37 ° C'de 4 h için kuluçkaya Kuluçka süresi için PEI toksisite önlemek için 6 h içinde sınırlayın.
    5. Değişim orta 18 ml % 10 DMEM ısındı önceden FBS ve 37 ° C'de 48 h için hücre yetiştirmek Yemekler bir biyogüvenlik seviye 2 laboratuarda yerleştirin, burada bu adımı tutmak ve standart güvenlik prosedürleri izleyin.
    6. 50 mL konik tüp 25 mL serolojik pipet kullanarak HEK293T orta (içeren amphotropic lentiviral parçacıklar) toplamak ve 4 ° C'de saklayın
      Not: (Önemli) Transfection verimliliği yüksek titresi virüs üretmek için % 90 ulaştırılması gerekmektedir.
    7. Dikkatli bir şekilde Önceden ısıtılmış DMEM 18 mL % 10 ekleyin HEK293T hücrelere FBS. 37 ° C'de 24 h için yetiştirmek
    8. 1.3.6 arasındaki adımları yineleyin.
      Not: bir kez onlar uzanmak viral bütünlüğünün korunması için aynı sıcaklığı (4 ° C) Lentiviral supernatants 1.3.6 ve 1.3.8 havuza.
    9. Viral süpernatant HEK293T hücreleri ile kontaminasyonu önlemek için toplanan virüs 1500 × g 4 ° C'de 10 dakika için de spin Aliquot virüs, Kuru buz veya sıvı nitrojen kullanarak donma dişlemek ve-80 ° C'de depolayın Ancak, bu virüs taze hazırlanmış donmuş stokları daha yüksek kalitede enfeksiyon verimlilik açısından dikkat edin.
      Not: (Önemli) donma/virüs, viral düşmesine yol açar bu yana çözdürme yinelenen kaçının.
  4. Titrasyon GFP muhabir içeren virüs
    1. 1 × 105 NIH/3T3 hücrelerde DMEM 300 µL % 10 tohum FBS 24-şey plaka kuyuya başına. 7 kuyu titresi bir virüs için istihdam edilecektir.
    2. Virüs 37 ° C'de erimek ve 1, 5, 10, 50, 100 ve 500 µL virüs NIH/3T3 kültürler için ekleyin. Herhangi bir virüs negatif denetime de eklemeyin. Hücreleri 37 ° C'de 48 h için virüs huzurunda yetiştirmek
    3. Tripsin/EDTA (ethylenediaminetetraacetic asit) 30 µL kullanarak NIH/3T3 hücre hasat (% 0.25 Tripsin, PBS % 0,01 EDTA) ve hücreleri 250 µL PBS (floresan aktif hücre sıralama) FACS tüp içinde gerçekleşti.
    4. Her örnek24Akış Sitometresi tarafından GFP+ hücreleri sıklığını belirler. Ölü hücreleri tarafından Höchst 33258 gibi bir canlılık boya ilavesi hariç.
    5. GFP+ hücre (kaplama hücre sayısı ve yüzdesi GFP+ hücrelerinin göre) toplam sayıları hesaplamak ve onlara karşı virüs enfeksiyonu için kullanılan birim arsa.
      Not: büyük viral dozlarda uygulandığında bir plato (önemli) verimlilik enfeksiyon ulaşır. Bu nedenle, viral konsantrasyonları hangi enfeksiyon verimliliği doğrusal aralığı ( Tablo 1' de gösterilen örnek) ortaya çıkan temel titresi tahmin etmek önemlidir. GFP+ hücreleri belirli virüs hacmindeki fonksiyonel viral parçacıkların (TU - birimleri dönüştürme) sayısını gösterir. ML başına TU sayısı yeniden hesaplayın.
  5. Titrasyon puromisindir muhabir içeren virüs
    1. 5 × 104 NIH/3T3 hücrelerde DMEM 3 mL % 10 tohum FBS başına iyi bir 6-şey plaka; 6 kuyu titresi bir virüs için istihdam. 37 ° C'de gecede kültür
    2. Ertesi gün Tablo 2' de gösterildiği gibi virüs oranında seyreltin. Virüs sulandırmak için Önceden ısıtılmış DMEM % 10 kullanın FBS. Değil girdap yapmak.
    3. Kültür orta NIH/3T3 hücrelerinden kaldırmak ve 1 mL sulandırılmış virüs ekleyin.
    4. Gecede 37 ° C'de kuluçkaya
    5. Yavaşça virüs içeren orta yerine Önceden ısıtılmış DMEM 2 mL ile %10 FBS ve gecede 37 ° C'de kuluçkaya
    6. Yavaşça NIH/3T3 orta Önceden ısıtılmış DMEM % 10 FBS içeren puromisindir (2 µg/mL) 2 mL ile değiştirin.
    7. Kültür 37 ° C ve puromisindir 3 günde ile dikkatli bir şekilde yenileme orta veya orta sarı döndüğünde.
    8. 10-12 gün sonra enfeksiyon, orta her kuyudan Aspire edin ve yavaşça PBS ile yıkayın.
    9. 1 mL kristal violet çözeltisi (% 0.5 kristal violet % 20 etanol ve dH2O) ile 2 dk RT, leke ve dikkatli bir şekilde iki kez PBS ile yıkayın.
    10. Sayısı mavi koloniler mikroskop (büyütme X4) altında her şey mevcut. Hiçbir kolonileri negatif denetiminde de dikkat edilmelidir.
    11. TU/mL seyreltme faktörü göz önünde bulundurarak toplam sayısını hesaplayın.

2. Genleşme ve bakım 32D/G-CSF-R hücre

  1. 32D/G-CSF-R hücreleri donduruldu, bir aliquot alabilir ve 37 ° C su banyosu 1 dk. için hücrelerde çözülme ve doğrudan içine Önceden ısıtılmış RPMI 1640 orta % 10 ile desteklenmiş 10 mL flakon hücrelerden dökün FBS 15mL tüp içinde. Tüp 3 kez ve spin hücreleri aşağı 400 × g. ters çevir süpernatant kaldırmak ve IL-3 içeren kültür Orta 0.3 × 106 hücre/mL bir konsantrasyon, hücrelerde resuspend.
  2. Optimum hücre büyüme bölgedir 0,25-0,5 × 106 hücre/mL. Her 2 günde bir konsantrasyon 0.1-0.2 × 10 duruma getirmeden hücreleri bölme6 hücre/mL.
    Not: (Önemli) 32D/G-CSF-R hücreleri kısmen 1 × 106 hücre/mL yüksek konsantrasyonları yetiştirilen Eğer ayırt yeteneğini kaybedebilirsiniz. Bu nedenle, zamanında 32D/G-CSF-R hücreleri bölmek çok önemlidir.
  3. Gerektiğinde, donma ve cep aliquots uzun bir süre için-80 ° C'de veya sıvı azot depolamak. 3 × 106 hücre aşağı spin, süpernatant kaldırmak ve 1 mL dondurucu orta resuspend. Tüp-80 ° C'de dondurucu bir kapsayıcı yerleştirin Uzun süreli depolama için sıvı azot hücrelere yeniden konumlandırın.

3. iletim 32D/G-CSF-R hücre

  1. Plaka 32D/G-CSF-R bir konsantrasyon 0.3 × 106 hücre/mL 6-şey plaka hücrelere.
  2. Virüs 10 ile 40 arasında MOI (enfeksiyon çokluğu) ulaşmak için uygun miktarda ekleyin.
    Not: Daha yüksek MOI GFP+ hücreleri artan yüzdesi gibi yüksek düzeyde ilgi gen ifade neden olur. Örnek: 10 MOI ile hücreleri 0.3 × 106 bulaştırmak için; 3 × 106 TU 32D/G-CSF-R hücrelere eklenmesi gerekir.
  3. Polybrene son konsantrasyon 8 µg/mL için eklemek ve 37 ° C'de 6 h için kuluçkaya Alternatif olarak, bir spin-aşı yordamı gerçekleştirmek: santrifüj kapasitesi 1200 × g bir salıncak-kova rotor kullanarak bir kodlamayla plaka 30 ° C'de 90 dk için de ve 37 ° C'de 3 h için kuluçkaya
  4. Toplamak hücreleri, bir 15 mL tüp aktarmak ve 450 × g 5 min (4 ° C) için de spin.
  5. Süpernatant atmak, kültür ortamının 6 mL pelleted hücrelerde resuspend, T25 hücre kültür şişesi ve 37 ° C'de kültür yeri
  6. 48 saat sonra hücre hasat ve onlarla 450 × g 5 min (4 ° C) için de spin. Süpernatant atmak.
  7. GFP muhabir durumunda: PBS ve sıralama GFP+ hücreleri bir Akış Sitometresi sıralayıcısı kullanarak 500 µL içinde hücreleri yerleştirmek. Vektör içeren bir puromisindir muhabir durumunda: hücre kültürü 2 µg/mL puromisindir içeren ortamda yer.
  8. Hücreleri daha fazla analiz ve deneyler için gerektiği gibi genişletin.
    Not: (İsteğe bağlı) Transduced hücreleri medya-80 ° C'de dondurucu bir kapta buz gibi donmuş ve daha fazla sıvı azot içinde depolanır.

4. 32D/G-CSF-R Hücre proliferasyonu tahlil

  1. Nükleer silahların yayılmasına karşı oranı yer 0.2 × 106 hücre kültür orta 1 ml değerlendirmek ve gecede 37 ° C'de kuluçkaya
  2. Ertesi gün hücreleri saydırmak ve onları bir konsantrasyon 0.2 × 106 hücre/mL kültür ortamı kullanarak için sulandırmak. Gecede 37 ° C'de kuluçkaya Hücre konsantrasyonları ve Tablo 3kullanarak günlük kültürler uygulanan dilutions kayıtlarını tutmak.
  3. 4.2 olarak nükleer silahların yayılmasına karşı değerlendirilmesi gerekiyor günlerdir arasındaki adımları yineleyin.
    Not: Uzunluğu proliferasyon deneyleri, gene ilgi etkisi bağlıdır. Güçlü bir fenotip durumunda, 8-9 gün önemli bir etkisi (bkz: şekil 3A) gözlemlemek yeterli olabilir. Ancak, hafif bir fenotip durumunda, daha uzun süreler gerekli olabilir.
  4. Hücre büyümesini Tablo 3' te gösterildiği gibi bir nükleer silahların yayılmasına karşı eğri yaparak değerlendirmek.

5. 32D/G-CSF-R hücre farklılaşması tahlil

  1. 0.2 × 106 32D/G-CSF-R hücreler sitokinler olmadan RPMI orta ile iki kez yıkayın.
    Not: artık IL-3 varlığı farklılaşma inhibe beri çamaşır G-CSF ilavesi kültür içine önce önemli adımlardır.
  2. Hücreleri (100 ng/mL G-CSF içeren) 1 mL farklılaşma orta 24 iyi/plaka, 0.2 × 106 hücre/mL (0 gün) bir hücre konsantrasyon kaynaklanan yerleştirin. 37 ° C'de gecede kültür
  3. Hücre/mL (yukarıdaki adım 1.2.1) belirtildiği gibi sayma.
  4. Bir santrifüj 20 × g de gerekli adaptörler ile Cytospin 2-5 × 104 hücreleri kullanarak bir cam slayt (76 mm X 26 mm) üzerinde.
  5. Bir 24 iyi/plaka (gün 1) 0.2 × 105 hücre/mL konsantre farklılaşma orta ve plaka hücreleri yenilemek. Eski plaka atmak ve basamak 5.6 ve yeni plaka ertesi gün devam edin.
  6. 2-7 günlerde tamamlayana 5,5 5,3. Hücre çoğalması G-CSF huzurunda adım 4'te açıklandığı gibi değerlendirmek.
    Not: (Önemli) hücre çoğalması sırasında farklılaşma, yavaşlar, bu nedenle G-CSF huzurunda 3-4 gün sonra bu daha yüksek konsantrasyonlarda kültür hücrelere yeterli.
  7. 32D/G-CSF-R hücreleri hücre morfolojisi alarak farklılaşma durumu değerlendirmek.
    1. Metanol RT, 5 min için 5,4 adımda hücrelerden düzeltmek ve slaytlar kurumasını bırakın.
      Not: 0-7 gün slaytlardan RT depolanan ve aynı anda sabit. Benzer şekilde, onlar da RT fiksasyon sonra uzun süre tutulabilir.
    2. Mayıs-Grünwald Giemsa aşağıdaki üreticinin iletişim kuralı boyama kullanarak hücreleri leke.
    3. Lekeli hücrelerin mikroskop ve büyütme X40 kullanarak görselleştirmek.
    4. Patlamaların, ayda farklılaşmış hücreler ve olgun granülosit şekil 1 ve Tablo 4açıklama açıklayıcı resimleri kullanarak ölçmek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Nükleer silahların yayılmasına karşı ve 32D/G-CSF-R hücrelere farklılaşma

Pro proliferatif ve yanlısı farklılaşma koşullar altında 32D/G-CSF-R hücrelerin çoğalması değerlendirmek için 32D/G-CSF-R hücreleri IL-3 G-CSF, sırasıyla içeren medyayı ve içinde kültürlü. IL-3 içeren ortamda (10 ng/mL) kültürlü hücreleri yaklaşık her 24 h (şekil 2A) bölmek gözlendi. Yavaş yavaş yavaş aşağı ve 4 gün sonra (şekil 2A) durdu G-CSF (100 ng/mL) yayılması ile IL-3 yedek üzerine. Ayrıca, G-CSF huzurunda Mayıs-Grünwald Giemsa lekeli cytospun hücreleri kullanarak kültürlü hücrelerinin farklılaşma durumu değerlendirildi. Bu gün 0 (G-CSF tedavisi başlamadan), büyük bir çekirdek ve karanlık sitoplazma (şekil 2B) ile karakterize bir olgunlaşmamış myeloblast benzeri Morfoloji hücreleri mevcut gösterilmiştir. Tedavi boyunca, nükleer boyutu küçülür ve ay şeklindeki çekirdeği yapılan değişiklikler veya çörek-şekil şeklinde. Ayrıca, sitoplazma genişletilir ve koyu mor renk kaybeder. G-CSF ile tedavinin 6 gün sonra hücre tam Nötrofilik farklılaşma, loblu bir çekirdek ve bir ışık mor sitoplazma (şekil 2B) ile karakterize belirtileri mevcut. 32D/G-CSF-R hücrelere farklılaşma nerede tam olarak aynı hızda olgun nötrofiller doğru tüm hücreleri gelişmeye aşamalı bir süreçtir. Miktar hücre farklılaşması (yani patlama, ayda farklılaşmış hücre ve nötrofil) boyunca farklı aşamalarında şekil 2Biçinde gösterilir.

Fare Evi2b nakavt 32D/G-CSF-R hücrelerdeki Nötrofilik farklılaşma engeller

EVI2B downregülasyon için (Ecotropic Viral Tümleştirme sitesi 2B) 32D/G-CSF-R hücrelere, 3 Evi2b-(Sh2, Sh3, Sh4) hedefleme ve 1 sigara hedef sigara susturmak denetim (NSC1) shRNAs tasarlanmıştır; Bunlar bir GFP muhabir16taşıyan bir lentiviral vektör klonlanmış. 32D/G-CSF-R hücreleri transduced denetim ve Evi2bile-MOI 10 kullanarak shRNAs susturmak. İki gün sonra iletim, GFP+ (transduced) hücreleri sıralanmış ve daha fazla deneyler için genişletilmiş. Sh3 ve Sh4, % 80'i EVI2B tükenmesi ulaştı diye, ancak Sh2 verimli tümleyici EVI2B protein düzeyleri bulamadı ve bu nedenle ek bir denetim kullanılan sevk burada sigara susturmak denetimi 2 (NSC2) olarak. Dört gün sonra iletim, farklılaşma ve nükleer silahların yayılmasına karşı deneyleri G-CSF huzurunda gerçekleştirilen ve bu süreçlerde Evi2b downregülasyon etkileri değerlendirilmiştir. Bu gözlenmiştir o Evi2b-tükenmiş hücreler (Sh2, Sh3) sürekli hücre çoğalması GCSF, varlığında ise kontrol hücreleri (NSC1 ve NSC2) yayılması gün 4 (şekil 3A) azaltılmış. Ayrıca, Evi2b-sessiz 32D/G-CSF-R hücreler üretilen kontrol hücreleri (şekil 3B) kıyasla daha az ara ve olgun nötrofiller. Dikkat çekici, zavallı Evi2b devirme verimliliği gösterdi, NSC2 ile transduced hücreler olgun nötrofiller (şekil 3B) sayısında da hafif azalma gösterdi. Bu veriler kısa bir süre önce16yaşında.

BCR-ABL füzyon protein 32D/G-CSF-R hücrelerdeki Nötrofilik farklılaşma bozar

BCR-ABL füzyon protein Miyeloid farklılaşma, akut Kronik Miyeloid Lösemi25,26aşamasında hematopoetik başarısızlıkla sonuçlanır Miyeloid ataları kapsamlı bir genişleme neden bozar gösterilmiştir. Önceki çalışmalar zorunlu ifade BCR-ABL 32D cl-3 hücrelerdeki nötrofil farklılaşma27,28bir blok içinde sonuçlandı gösterdi. Bu nedenle, biz 32D/G-CSF-R hücre satırıyla benzer sonuçlar elde olup olmadığını araştırdık. 32D/G-CSF-R hücreleri GFP muhabir taşıyan BCR-ABL veya denetim MSCV retroviral vektör ile transduced (MOI = 20). 2 gün sonra iletim, GFP+ hücreleri sıralanmış ve 2 hafta içinde IL-3 içeren orta için genişletilmiş. Ardından, farklılaşma deneyleri G-CSF huzurunda yapıldı. Biz (hücreleri G-CSF içeren ortamına aktarılması) gün önce 0, MSCV kontrol ve esas olarak olgunlaşmamış Miyeloid blast hücreler (şekil 4) temsil eden benzer görünümdeki, BCR-ABL 32D/G-CSF-R hücreleri ifade sunulan gözlenen. Ancak, biz boş vektör transduced kontrol hücreleri Nötrofilik farklılaşma (%11,5 olgun nötrofil ve ayda farklılaştırılmış hücrelerin % 56.4 üreten) G-CSF tedavisinin 6 gün sonra Hayır uygulandı gösterdi olgun nötrofiller BCR-ABL transduced 32D/G-CSF-R hücrelerden (şekil 4) oluşturuldu. Sürekli olarak, G-CSF BCR-ABL ifade hücrelerde olgunlaşmamış patlama yüzdesi benzer IL-3 koşullar patlamada yüzdesini kaldı.

Figure 1
Şekil 1. Farklı 32D/G-CSF-R temsilcisi görüntülerini hücre morfolojisi. 32D/G-CSF-R hücreleri morfolojik patlama sınıflandırılabilir, ayda hücreleri ve olgun nötrofiller tanır. Tablo 4 açıklamasına bakın.

Figure 2
Şekil 2. Nükleer silahların yayılmasına karşı ve 32D/G-CSF-R hücrelere farklılaşma. (A) 10 ng/mL IL-3 (siyah çizgi) veya 100 ng/mL G-CSF (mavi çizgi) orta içeren 32D/GCSFR hücrelerin çoğalması. X ekseni gün tedavi temsil eder. Y ekseni logaritmik ölçek (günlük2) gösterilir ve hücreleri × 105sayısını gösterir. Sonuçları 3 bağımsız deneyler ortalamasını temsil eder. Hata çubukları standart sapma gösterir. (B) orta (100 ng/mL) G-CSF-içeren hücrelerde 32D/G-CSF-R farklılaşma. Üst panel, pasta-araziler patlamaların (siyah) yüzdesini göstermek, ayda hücreleri (pembe) ve nötrofil (kırmızı) kültür sonra 0, 2, 4 ve 6 gün G-CSF tedavisinin ayrıştırılan. Alt paneli cytospun hücrelerden ilgili temsilcisi görüntülerini içerir zaman Mayıs-Grünwald Giemsa ile lekeli puan. En az 100 hücre her zaman noktası için değerlendirilmiştir.

Figure 3
Şekil 3. Evi2b susturmak 32D-G-CSF-R hücrelerdeki Nötrofilik farklılaşma engeller. (A) Evi2byayılması-sessiz (turuncu hat) ve kontrol (siyah çizgiler) 32D/G-CSF-R hücreleri 100 ng/mL G-CSF içeren ortamda. X ekseni gün tedavi temsil eder. Y ekseni logaritmik ölçek (günlük2) gösterilir ve hücreleri × 105sayısını gösterir. Sonuçlar temsilcisi 3 bağımsız deneyler sonucunda gösterilmektedir. (B) değerlendirme farklılaşma 32D/G-CSF-R hücre Evi2bile transduced-Mayıs-Grünwald Giemsa cytospun hücreleri boyama kullanarak susturmak ve kontrol shRNAs G-CSF-içeren orta (100 ng/mL). Üst panelinde pasta araziler patlamaların (siyah) yüzdesini göstermek, ayda farklılaşmış hücreler (pembe) ve nötrofil (kırmızı) kültür. Alt panelleri cytospun hücre temsilcisi resimleri içerecek. Farklılaşma farklılaşma gün 7 değerlendirildi. En az 100 hücreleri her koşul için değerlendirildi.

Figure 4
Şekil 4. Overexpression BCR-ABL füzyon proteinin 32D/G-CSF-R hücrelere farklılaşma bozar. 32D/G-CSF-R hücrelere farklılaşma değerlendirilmesi denetim MSCV veya BCR-ABL füzyon gen G-CSF-içeren orta (100 ng/mL) ile transduced. Üst pasta-araziler patlamaların (siyah) oranını göstermek, hücreleri (pembe) ve nötrofil (kırmızı) farklılaşma gün 6 ayda tanır. Alt panelleri Mayıs-Grünwald Giemsa ile lekeli cytospun hücrelerinin temsilcisi resimleri göster. En az 100 hücreler her zaman noktası için değerlendirildi.

Virüs V [µL] Kaplama hücre sayısı % GFP+ GFP+ hücre sayısı Doğrusal? TU/mL Ortalama (TU/mL)
1 100 000 1.83 1 830 Evet 1 830 000 2 350 000
5 100 000 12,9 12 900 Evet 2 580 000
10 100 000 26,4 26 400 Evet 2 640 000
50 100 000 71.4 71 400 Hayır
100 100 000 85.1 85 100 Hayır
500 100 000 85.6 85 600 Hayır

Tablo 1. Viral titresi belirlenmesi için vektörel çizimler içeren GFP muhabir. MSCV retrovirüsü ve hesaplama ile elde edilen veri örneği gerçekleştirilen viral titresi tahmin etmek için. Viral titresi GFP+ hücreleri belirli miktarda virüs uygulandığında elde sayısına göre hesaplanır. Virüs enfeksiyonu için istihdam miktarı GFP+ hücreleri ölçülen yüzdesi ile doğrusal bir ilişki içinde olması gerekir. TU: Birim dönüştürme.

Tüp Tüp açıklama DMEM + % 10 FBS Virüs Toplam hacim Seyreltme faktörü
(ΜL) (ΜL) (ΜL)
1 seyreltme 1 1485 15 µL viral stok 1500 1 x 102
2 seyreltme 2 1350 150 µL tüp 1 1500 1 x 103
3 seyreltme 3 1350 150 µL tüp 2 1500 1 x 104
4 seyreltme 4 1350 150 µL tüp 3 1500 1 x 105
5 seyreltme 5 1350 150 µL tüp 4 1500 1 x 106

Tablo 2. Viral titresi belirlenmesi için vektörel çizimler içeren puromisindir muhabir. Vektörel çizimler içeren puromisindir viral titresi belirlemek için viral seyreltme strateji. Tablo 5 tüpler (1-5) içeren bir seri seyreltme viral stokunun hazırlamak nasıl gösterir. Tüp 1 içerir 1485 µL DMEM + % 10 FBS ve 1 × 102 sağlayan üretilen virüsün 15 µL seyreltilmiş virüs. Tüp 2 içerir 1350 µL DMEM + % 10 FBS ve 1 × 102 150 µL seyreltilmiş virüsü (tüp 1), 1 × 103 seyreltilmiş virüsü sağlama. Tüp 3 içeren 1350 µL DMEM + % 10 FBS ve 1 × 103 150 µL seyreltilmiş virüs (tüp 2), 1 × 104 seyreltilmiş virüs sağlamak. Tüp 4 içerir 1350 µL DMEM + % 10 FBS ve 1 × 104 150 µL seyreltilmiş virüs (tüp 3), 1 × 105 seyreltilmiş virüs sağlamak. Tüp 5 içerir 1350 µL DMEM + % 10 FBS ve 1 × 105 150 µL seyreltilmiş virüs (tüp 4), 1 × 106 seyreltilmiş virüs sağlamak. 1 ml tüpler 1-5 üzerinden kullanılan titresi virüs için.

Hücre sayar (x = ml başına hücre sayısı)
gün 0 1. gün 2. gün 3. gün 4. gün 5. gün 6. gün
Örnek 1 x0 x1 x2 3 x x4 x5 x6
Seyreltme (d) (y [mL]; replating için kullanılan hücre hacmi = z son hacim [mL] =)
gün 0 1. gün 2. gün 3. gün 4. gün 5. gün 6. gün
Örnek 1 d0= 1 d1= y1/z1 d2= y2/z2 d3= y3/z3 d4= y4/z4 d5= y5/z5
Toplam hücre sayısı
gün 0 1. gün 2. gün 3. gün 4. gün 5. gün 6. gün
Örnek 1 x0 x 1/d0 x2/d1 x3/d2/d1 x4/d3/d2/d1 x5/d4/d3/d2/d1 x6/d5/d4/d3/d2/d1

Tablo 3. Büyüme eğrisi üretimi. Tablo denklemler 32D/G-CSF-R hücre proliferasyon oranı değerlendirilmesi için gerekli açıklar.

Çekirdeği Sitoplazma
Patlamaların Karanlık, yuvarlak Karanlık, çekirdeği neredeyse ayırt
Ayda hücreleri ayrıştırılan Değişiklikleri nükleer şeklinde kez çörek gibi telaffuz ya da ay benzeri şeklinde Daha hafif, ayırt sitoplazma
Olgun nötrofiller Loblu çekirdeği; Neredeyse lobules arasında bağlantı yok Işık sitoplazma

Tablo 4. Nötrofilik farklılaşma sırasında 32D/G-CSF-R hücre morfolojisi. Tablo ayrım olgunlaşmamış patlamaların, ayda farklılaştırılmış hücrelerin ve olgun nötrofiller etkinleştirme büyük Morfolojik özellikleri özetlenmiştir. Nükleer ve sitoplazmik özellikleri açıklanmaktadır: Temsilcisi görüntüler için bkz: şekil 1 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Deneysel bir model seçimi tek araştırma ana sorunlardan biridir. Birincil hayvan ve insan hücreleri en biyolojik ilgili verileri üretmek inanılan bu modeller etik kaygılar içerebilir ve çoğu kez yalıtım/pahalı ve/veya sofistike kültür yordamları ile ilgili. Primer hücre sayıları sınırlıdır ve genetik olarak onları manipüle etmek zordur. Buna ek olarak, Primer hücre veri yorumu29karmaşık hale çeşitli hücre tiplerinin oluşan heterojen bir nüfus temsil eder. Buna ek olarak, hücre hatları biyolojik malzemenin neredeyse sınırsız bir kaynağı sağlamak, uygun maliyetli ve etik sorunlar atlamasına izin. Ancak, bu hücre hatları genetiği ve phenotypically kökenli kendi dokusundan farklı bir yapay deneysel sistem olarak kabul edilir dikkate almak önemlidir. Yine de, diğer deneysel yaklaşımlar ile birleştirildiğinde satırları hücre, tekrarlanabilir ve biyolojik olarak ilgili veri üretimi için değerli bir modeli sağlar.

32D cl-3 hücreleri, yanı sıra 32D/G-CSF-R hücre kültürünü köklü ve yaygın olarak kullanılan hücre kültür modelleri fare Nötrofilik farklılaşma14,15,24,30. Birkaç araştırma grubu bu hücreler myelopoiesis belirli genlerin rol değerlendirmek için kullanılan ve in vivo modelleri ve Primer hücre16,31kullanarak elde edilen verilerle ilişkili sonuçlar elde. Burada biz 32D/G-CSF-R hücre satırı işlemek için bir protokol sağlar, ancak, benzer yordamlar kültür ve 32D cl-3 hücreleri işleme için uygulanabilir. 32D cl-3 hücre farklı toplu işlemleri farklı gruplar kendi subclones32ile çalışıyor olabilirsiniz düşündüren karyotip, mevcut farklılıkları farklı laboratuvarlarda kullanılan işaret etmek önemlidir. Bu gözleme dayalı, biz genetik değişkenliği benzer şekilde 32D/G-CSF-R hücrelerde bulunabilecek ve bu karşılaştırma-den sonuçlanmak farklı araştırma gruplarınca elde edilen göz önüne alınması gereken öngörmekteyiz. Alternatif hücre kültür 32D/G-CSF-R hücrelere ölümsüzleştirdi hematopoetik progenitör satırları22,33,34,35,36modellerdir. Büyük ölçekli yaratıcı genişleme örneğin için gerekli olduğunda bu yaklaşım kullanışlıdır protein etkileşimleri22çalışma. Çizgi kurmak için zaman önemli ölçüde uzun37olmasına rağmen bir 32D/G-CSF-R hücrelere ölümsüzleştirdi ataları genetiği değiştirilmiş herhangi bir fareden oluşturulabilir avantajdır. Buna ek olarak, işleme ve kemik iliği ölümsüzleştirilmiş ataları manipülasyon 32D/G-CSF-R hücreleri daha daha fazla uzmanlık gerektirir.

Temsilcisi sonuçlarının ilk bölümünde 32D/G-CSF-R modeli ile okuyucu daha yakından tanımak için IL-3 ve G-CSF 32D/G-CSF-R hücrelerinin yayılmasını önleme ve farklılaşma Kinetik gösterdi. IL-3 Proliferasyona koşullarında yanı sıra farklı zaman Puan GCSF kaynaklı farklılaşma hücre morfolojisi gösteren temsilcisi görüntüleri sunuldu. 32D cl-3 hücre farklılaşması CD11b hücre yüzey marker27,31kullanarak akış sitometrik analizi ile tespit edilebilecek bildirilmiştir ancak Nötrofilik farklılaşma morfolojik analiz tarafından değerlendirilir, 38,39. Bizim bilgi ve uzmanlık için CD11b upregulated 32D/G-CSF-R hücreleri Nötrofilik farklılaşma sırasında değil. Standardizasyon, 32D/G-CSF-R proliferasyon deneyleri çalıştırmaya başladık piyasada bulunan IL-3. Ancak, hücreleri de ev yapımı IL-Drobek ve arkadaşları22tarafından açıklandığı gibi üretilen 3 ' te çoğalırlar görülmektedir. G-CSF-indüklenen Nötrofilik farklılaşma iyi bir derece elde etmek için hücreleri 1 × 106 hücre/mL konsantrasyonu kültürlü Eğer 32D/G-CSF-R hücrelerinin farklılaşma yeteneği Engelli olabilir hatırlamak önemlidir. Buna ek olarak, derecesi ve hız farklılaşma serum kompozisyon tarafından etkilenebilir. Bu nedenle, bu birkaç FBS toplu olarak 32D/G-CSF-R hücrelerinin farklılaşma olanağı sınamak ve daha iyi 6-9 gün G-CSF huzurunda kültürünün üzerine olgun nötrofiller gelişimini destekleyen bir seçmek için önerilir.

Biz iki temsilcisi deney Miyeloid ayrımında (şekil 3 ve şekil 4) belirli proteinlerin rolü eğitim için olası yolları gösteren sağladı. İlk olarak, biz EVI2B, o downregülasyon gösterdi hematopoetik hücrelerin içinde ifade bir transmembran protein yol açar 32D/G-CSF-R hücrelerdeki Miyeloid farklılaşma bloğu için. Bu veriler son zamanlarda Primer hücre ve Evi2b nakavt fareler16kullanılarak gerçekleştirilen deneyleri ile birlikte grubumuz tarafından yayınlandı. İkinci olarak, biz 32D/G-CSF-R hücreleri Nötrofilik farklılaşma BCR-ABL, genetik translocation t(9,22) (q34; S11), sonuçlanan bir füzyon protein etkisini araştırdık. Bu translocation hastalarda Kronik Miyeloid Lösemi40,41acı başlangıçta tespit edilmiştir. Bu daha önce bir Miyeloid farklılaşma tutuklama27,2832D cl-3 hücreleri yol açar, bu ifade BCR-ABL füzyon oncoprotein gösterilmiştir. Burada BCR-ABL overexpression 32D/G-CSF-R hücreleri üzerinde benzer etkileri vardır gösterdi. Deneyler her iki kümedeki burada ( Evi2b downregülasyon ve BCR-ABL overexpression içeren) sunulan, 32D/G-CSF-R hücrelerinin genetik değişiklik istikrarlı gen ifadesinde sonuç viral iletim yoluyla gerçekleştirildi. Seçtiğiniz bir retroviral lentiviral teslim karşı nükleer silahların yayılmasına karşı veya 32D/G-CSF-R hücrelere farklılaşma etkilemez. Ancak, lentiviral enfeksiyon daha 32D/G-CSF-R hücrelerde endojen retrovirüsü retroviral iletim varlığı nedeniyle daha etkilidir. Bizim deneyim göre standart lipofilik reaktifler kullanarak bu hücre transfection verimli değil. Ancak, geçici yapı ifade gereklidir transfection elektroporasyon tarafından uygun yaklaşım42,43,44olur. Burada, GFP sıralayarak takip 32D/G-CSF-R hücrelerinin genetik manipülasyon sunulan ve toplu enfekte hücreleri analizi. Ancak, gerekirse, tek hücre sıralama tek hücre klonlar daha önce bildirilen12,45oluşturmak için istihdam olabilir.

Yayılması ve farklılaşma deneyleri yanı sıra, 32D/G-CSF-R hücreleri hücre göç ve Apoptozis13,46,47,48 belirli proteinlerin rolü başarıyla belirlemek için istihdam edilmiştir . Ayrıca, 32D/G-CSF-R satır sitokin bağımsız büyüme oncoproteins19,20tarafından aracılı belirlemek için kullanılır. Sitokin bağımsızlığı eğitim için sık kullanılan başka bir Ba/F3 hücreleri21,49çizgidir. Ba/F3 C3H fare zorlanma benzer şekilde 32D/G-CSF-R hücrelere türetilmiş bir IL-3 bağımlı fare hücre satırdır. Her ne kadar her iki sistemin sitokin bağımsız nükleer silahların yayılmasına karşı çalışmaya istihdam, Ba/F3 hücreler kötü G-CSF huzurunda ayırt etmek.

Tamamen, öneririz 32D/G-CSF-R hücreleri yine de Primer hücre daha az tercih edilen varlık, sınırsız nükleer silahların yayılmasına karşı kapasite ve basit işleme de dahil olmak üzere birkaç avantaj sunar. Bizce güvenilir veri üretimi için fare modelleri ve birincil kültürler gibi alternatif deneysel yaklaşımlar kullanarak alınan verilerle 32D/G-CSF-R hücrelerde gerçekleştirilen deneyler tamamlanmalıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Yazarlar Prof. Ruud Delwel ve Prof. Ivo bize 32D/G-CSF-R hücre satırıyla sağlamak için Touw ve Prof. Dr. Daniel G. Tenen bize Bosc23 hücre satırıyla sağlamak için teşekkür ederiz. Bu eser hibe MA-J için Çek Cumhuriyeti (GACR 15-03796S ve GACR 17-02177S) Grant ajansı tarafından desteklenen, MA-J, GA İngiltere Bursu (Proje No. 341015) Enstitüsü, moleküler genetik üzerinden çek Bilimler Akademisi (RVO 68378050) desteği MK ve GA İngiltere Bursu (Proje No. 1278217) Prag Charles Üniversitesi PD Prag'a'nden Charles Üniversitesi'nden.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 powder medium Merck, Kenilworth, NJ, USA T 121-10 without NaHCO3, with L-glutamine
DMEM Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 15028
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 31985-047 L-Glutamine, Phenol Red
Fetal bovine serum (FBS) PAA Laboratories (GE Healthcare,Chicago, IL, USA) MT35011CV For differentiation of 32D/G-CSF-R cells
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 10270 Used for culturing HEK293T, NIH3T3, BOSC23 cells
Penicillin Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) P3032
Streptomycin Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) S9137 Streptomycin sulfate salt powder
Gentamicin Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) G1914
murine IL-3 PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA 213-13
human G-CSF PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA 300-23
Polyethylenimine Polyscience, Warrington, PA, USA 23966 Linear, MW 25,000 (PEI 25000)
Polybrene Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) H9268
Trypsin VWR Chemicals, Radnor, PA, USA 0458
EDTA Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) E5134
Crystal violet Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) C0775
Trypan blue Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) T6146
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) D2650
May-Grünwald Giemsa DiaPath, Martinengo, BG, Italy 10802

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bonilla, M. A., et al. Effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor on neutropenia in patients with congenital agranulocytosis. N Engl J Med. 320 (24), 1574-1580 (1989).
  2. Bennett, C. L., Djulbegovic, B., Norris, L. B., Armitage, J. O. Colony-stimulating factors for febrile neutropenia during cancer therapy. N Engl J Med. 368 (12), 1131-1139 (2013).
  3. Lowenberg, B., Downing, J. R., Burnett, A. Acute myeloid leukemia. N Engl J Med. 341 (14), 1051-1062 (1999).
  4. Dong, F., et al. Identification of a nonsense mutation in the granulocyte-colony-stimulating factor receptor in severe congenital neutropenia. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (10), 4480-4484 (1994).
  5. Rosenbauer, F., Tenen, D. G. Transcription factors in myeloid development: balancing differentiation with transformation. Nat Rev Immunol. 7 (2), 105-117 (2007).
  6. Kota, J., Caceres, N., Constantinescu, S. N. Aberrant signal transduction pathways in myeloproliferative neoplasms. Leukemia. 22 (10), 1828-1840 (2008).
  7. Kvinlaug, B. T., et al. Common and overlapping oncogenic pathways contribute to the evolution of acute myeloid leukemias. Cancer Res. 71 (12), 4117-4129 (2011).
  8. Krug, U., Ganser, A., Koeffler, H. P. Tumor suppressor genes in normal and malignant hematopoiesis. Oncogene. 21 (21), 3475-3495 (2002).
  9. Greenberger, J. S., Sakakeeny, M. A., Humphries, R. K., Eaves, C. J., Eckner, R. J. Demonstration of permanent factor-dependent multipotential (erythroid/neutrophil/basophil) hematopoietic progenitor cell lines. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (10), 2931-2935 (1983).
  10. Valtieri, M., et al. Cytokine-dependent granulocytic differentiation. Regulation of proliferative and differentiative responses in a murine progenitor cell line. J Immunol. 138 (11), 3829-3835 (1987).
  11. Dong, F., et al. Mutations in the gene for the granulocyte colony-stimulating-factor receptor in patients with acute myeloid leukemia preceded by severe congenital neutropenia. N Engl J Med. 333 (8), 487-493 (1995).
  12. Jorda, M. A., Lowenberg, B., Delwel, R. The peripheral cannabinoid receptor Cb2, a novel oncoprotein, induces a reversible block in neutrophilic differentiation. Blood. 101 (4), 1336-1343 (2003).
  13. Jorda, M. A., et al. Hematopoietic cells expressing the peripheral cannabinoid receptor migrate in response to the endocannabinoid 2-arachidonoylglycerol. Blood. 99 (8), 2786-2793 (2002).
  14. Abbas, S., et al. Integrated genome-wide genotyping and gene expression profiling reveals BCL11B as a putative oncogene in acute myeloid leukemia with 14q32 aberrations. Haematologica. 99 (5), 848-857 (2014).
  15. Zhuang, D., Qiu, Y., Kogan, S. C., Dong, F. Increased CCAAT enhancer-binding protein epsilon (C/EBPepsilon) expression and premature apoptosis in myeloid cells expressing Gfi-1 N382S mutant associated with severe congenital neutropenia. J Biol Chem. 281 (16), 10745-10751 (2006).
  16. Zjablovskaja, P., et al. EVI2B is a C/EBPalpha target gene required for granulocytic differentiation and functionality of hematopoietic progenitors. Cell Death Differ. 24 (4), 705-716 (2017).
  17. Santini, V., et al. The carboxy-terminal region of the granulocyte colony-stimulating factor receptor transduces a phagocytic signal. Blood. 101 (11), 4615-4622 (2003).
  18. Liu, H., Qiu, Y., Xiao, L., Dong, F. Involvement of protein kinase Cepsilon in the negative regulation of Akt activation stimulated by granulocyte colony-stimulating factor. J Immunol. 176 (4), 2407-2413 (2006).
  19. Kelly, L. M., et al. FLT3 internal tandem duplication mutations associated with human acute myeloid leukemias induce myeloproliferative disease in a murine bone marrow transplant model. Blood. 99 (1), 310-318 (2002).
  20. Pikman, Y., et al. MPLW515L is a novel somatic activating mutation in myelofibrosis with myeloid metaplasia. PLoS Med. 3 (7), e270 (2006).
  21. Schwaller, J., et al. Transformation of hematopoietic cell lines to growth-factor independence and induction of a fatal myelo- and lymphoproliferative disease in mice by retrovirally transduced TEL/JAK2 fusion genes. EMBO J. 17 (18), 5321-5333 (1998).
  22. Drobek, A., et al. PSTPIP2, a Protein Associated with Autoinflammatory Disease, Interacts with Inhibitory Enzymes SHIP1 and Csk. J Immunol. 195 (7), 3416-3426 (2015).
  23. Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. J Virol. 70 (8), 5701-5705 (1996).
  24. Alberich-Jorda, M., et al. C/EBPgamma deregulation results in differentiation arrest in acute myeloid leukemia. J Clin Invest. 122 (12), 4490-4504 (2012).
  25. Calabretta, B., Perrotti, D. The biology of CML blast crisis. Blood. 103 (11), 4010-4022 (2004).
  26. Ren, R. Mechanisms of BCR-ABL in the pathogenesis of chronic myelogenous leukaemia. Nat Rev Cancer. 5 (3), 172-183 (2005).
  27. Schuster, C., et al. The effects of Bcr-Abl on C/EBP transcription-factor regulation and neutrophilic differentiation are reversed by the Abl kinase inhibitor imatinib mesylate. Blood. 101 (2), 655-663 (2003).
  28. Chang, J. S., et al. High levels of the BCR/ABL oncoprotein are required for the MAPK-hnRNP-E2 dependent suppression of C/EBPalpha-driven myeloid differentiation. Blood. 110 (3), 994-1003 (2007).
  29. Velten, L., et al. Human haematopoietic stem cell lineage commitment is a continuous process. Nat Cell Biol. 19 (4), 271-281 (2017).
  30. Jorda, M. A., Rayman, N., Valk, P., De Wee, E., Delwel, R. Identification, characterization, and function of a novel oncogene: the peripheral cannabinoid receptor Cb2. Ann N Y Acad Sci. 996, 10-16 (2003).
  31. Wurm, A. A., et al. Disruption of the C/EBPalpha-miR-182 balance impairs granulocytic differentiation. Nat Commun. 8 (1), 46 (2017).
  32. Agliano, A. M., et al. On chromosomal instability: what is the karyotype of your 32D CI3 cell line. Blood. 95 (11), 3636-3637 (2000).
  33. Wang, G. G., et al. Quantitative production of macrophages or neutrophils ex vivo using conditional Hoxb8. Nat Methods. 3 (4), 287-293 (2006).
  34. Houston, I. B., Huang, K. J., Jennings, S. R., DeKoter, R. P. PU.1 immortalizes hematopoietic progenitors in a GM-CSF-dependent manner. Exp Hematol. 35 (3), 374-384 (2007).
  35. Calvo, K. R., Sykes, D. B., Pasillas, M., Kamps, M. P. Hoxa9 immortalizes a granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-dependent promyelocyte capable of biphenotypic differentiation to neutrophils or macrophages, independent of enforced meis expression. Mol Cell Biol. 20 (9), 3274-3285 (2000).
  36. Calvo, K. R., Sykes, D. B., Pasillas, M. P., Kamps, M. P. Nup98-HoxA9 immortalizes myeloid progenitors, enforces expression of Hoxa9, Hoxa7 and Meis1, and alters cytokine-specific responses in a manner similar to that induced by retroviral co-expression of Hoxa9 and Meis1. Oncogene. 21 (27), 4247-4256 (2002).
  37. Fossati-Jimack, L., et al. Phagocytosis is the main CR3-mediated function affected by the lupus-associated variant of CD11b in human myeloid cells. PLoS One. 8 (2), e57082 (2013).
  38. Schwable, J., et al. RGS2 is an important target gene of Flt3-ITD mutations in AML and functions in myeloid differentiation and leukemic transformation. Blood. 105 (5), 2107-2114 (2005).
  39. Worch, J., et al. The serine-threonine kinase MNK1 is post-translationally stabilized by PML-RARalpha and regulates differentiation of hematopoietic cells. Oncogene. 23 (57), 9162-9172 (2004).
  40. Rowley, J. D. Letter: A new consistent chromosomal abnormality in chronic myelogenous leukaemia identified by quinacrine fluorescence and Giemsa staining. Nature. 243 (5405), 290-293 (1973).
  41. Stam, K., et al. Evidence of a new chimeric bcr/c-abl mRNA in patients with chronic myelocytic leukemia and the Philadelphia chromosome. N Engl J Med. 313 (23), 1429-1433 (1985).
  42. Holly, S. P., Larson, M. K., Parise, L. V. The unique N-terminus of R-ras is required for Rac activation and precise regulation of cell migration. Mol Biol Cell. 16 (5), 2458-2469 (2005).
  43. Pierce, J. H., et al. Macrophage-colony-stimulating factor (CSF-1) induces proliferation, chemotaxis, and reversible monocytic differentiation in myeloid progenitor cells transfected with the human c-fms/CSF-1 receptor cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (15), 5613-5617 (1990).
  44. Pierce, J. H., et al. Signal transduction through the EGF receptor transfected in IL-3-dependent hematopoietic cells. Science. 239 (4840), 628-631 (1988).
  45. Oomen, S. P., et al. Somatostatin modulates G-CSF-induced but not interleukin-3-induced proliferative responses in myeloid 32D cells via activation of somatostatin receptor subtype 2. Hematol J. 2 (5), 322-329 (2001).
  46. Oomen, S. P., et al. Somatostatin is a selective chemoattractant for primitive (CD34(+)) hematopoietic progenitor cells. Exp Hematol. 30 (2), 116-125 (2002).
  47. Nogami, A., et al. FLT3-ITD confers resistance to the PI3K/Akt pathway inhibitors by protecting the mTOR/4EBP1/Mcl-1 pathway through STAT5 activation in acute myeloid leukemia. Oncotarget. 6 (11), 9189-9205 (2015).
  48. Rodel, J. E., Link, D. C. Suppression of apoptosis during cytokine deprivation of 32D cells is not sufficient to induce complete granulocytic differentiation. Blood. 87 (3), 858-864 (1996).
  49. Daley, G. Q., Baltimore, D. Transformation of an interleukin 3-dependent hematopoietic cell line by the chronic myelogenous leukemia-specific P210bcr/abl protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 85 (23), 9312-9316 (1988).

Tags

Gelişim biyolojisi sayı 132 32D/G-CSF-R hücreleri fare Miyeloid öncül hücreleri sıvı kültür farklılaşma nötrofiller nükleer silahların yayılmasına karşı sitokinler IL-3 G-CSF
Nükleer silahların yayılmasına karşı ve fare Miyeloid habercisi 32D/G-CSF-R farklılaşma hücre
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zjablovskaja, P., Danek, P.,… More

Zjablovskaja, P., Danek, P., Kardosova, M., Alberich-Jorda, M. Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells. J. Vis. Exp. (132), e57033, doi:10.3791/57033 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter