Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Proliferatie en differentiatie van lymfkliertest myeloïde voorloper 32 quinquies/G-CSF-R cellen

Published: February 21, 2018 doi: 10.3791/57033
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1,2
1Department of Hemato-Oncology, Institute of Molecular Genetics of the ASCR, 2Childhood Leukaemia Investigation Prague, Department of Paediatric Haematology and Oncology, 2nd Faculty of Medicine, Charles University
* These authors contributed equally

Summary

Hier worden gedetailleerde protocollen voor het kweken van de 32 quinquies/G-CSF-R cellijn van lymfkliertest myeloïde voorloper, uitvoeren van virale infecties en het uitvoeren van de proliferatie en differentiatie testen gepresenteerd. Deze cellijn is geschikt voor de studie van myeloïde cel ontwikkeling, en de rol van genen van belang in myeloïde celgroei en neutrofiele differentiatie.

Abstract

Inzicht in de hematopoietische stamcellen en voorlopercellen celbiologie heeft belangrijke implicaties voor regeneratieve geneeskunde en de behandeling van hematologische aandoeningen. Ondanks de meest relevante gegevens die kan worden verkregen met behulp van in vivo modellen of primaire culturen, beperkt de lage overvloed van hematopoietische cellen van de stam en voorlopercellen aanzienlijk de pool van geschikte technieken voor hun onderzoek. Daarom kan het gebruik van cellijnen voldoende productie van biologisch materiaal voor de uitvoering van screenings of testen waarvoor grote cel nummers. Hier presenteren we een gedetailleerde beschrijving, uitlezing en interpretatie van de proliferatie en differentiatie tests die worden gebruikt voor het onderzoek van de processen die betrokken zijn bij myelopoiesis en neutrofiele differentiatie. Deze experimenten gebruikmaken van de 32 quinquies/G-CSF-R cytokine lymfkliertest myeloïde doelcel lijn, die beschikt over de mogelijkheid om te verspreiden in het bijzijn van IL-3 en differentiëren in G-CSF. Wij bieden geoptimaliseerde protocollen voor het afhandelen van 32 quinquies/G-CSF-R cellen en bespreken van valkuilen en nadelen die de beschreven tests en de verwachte resultaten in gevaar kunnen brengen. Daarnaast bevat dit artikel protocollen voor lentivirale en retrovirale productie, titratie en transductie van 32 quinquies/G-CSF-R cellen. We laten zien dat genetische manipulatie van deze cellen kan worden gebruikt met succes functionele en moleculaire om onderzoek te verrichten, die resultaten verkregen met primaire hematopoietische cellen van de stam en voorlopercellen of in vivo modellen kunnen aanvullen.

Introduction

De hematopoietische stamcellen en voorlopercellen bevolking levert het organisme met een groot bereik van volwassen cellen, met inbegrip van cellen uit de myeloïde geslacht (neutrofiele granulocyten, eosinofielen basofielen en monocyten). Het proces dat de aandrijving van de productie van myeloïde cellen van hematopoietische stamcellen staat bekend als myelopoiesis, en voldoende productie van volwassen myeloïde cellen in reactie op de veranderende eisen is een voorwaarde voor goede coping van het organisme met stress voorwaarden, zoals infecties en bloedverlies. Onvoldoende productie van volwassen myeloïde cellen kan leiden tot onmogelijkheid tot het elimineren van pathogenen, verminderde bloedstolling en andere levensbedreigende omstandigheden1,2. Bovendien, kunnen wijzigingen in myeloïde lineage ontwikkeling ook gepaard gaan met hematologische maligniteiten, zoals acute myeloïde leukemie (AML)3. Wijzigingen in de myelopoiesis kunnen zich voordoen als gevolg van verschillende redenen, zoals gebreken in cel oppervlakte receptoren4, veranderde uitingen van transcriptie factoren5, verminderde signalering trajecten6, mutaties resulterend in vorming / activering van oncogenen7, of inactivering van tumor suppressor genen8.

Verschillende methoden hebben ontwikkeld om te studeren myeloïde ontwikkeling, en beoordelen van het effect van specifieke genetische wijzigingen in dit proces. Gemeenschappelijke benaderingen gebruikt bij het bestuderen van myelopoiesis omvatten primaire cellen en transgene muizen. Al deze modellen toe verwerving van biologisch relevante gegevens, hebben ze bepaalde beperkingen. Het gebruik van primaire cellen ontmoetingen een beperkt aantal cellen en een beperkte periode van cultuur, vernauwing van de mogelijkheden om te veranderen van genexpressie en de daaropvolgende biologische of biochemische analyse. Transgene muizen zijn kostbaar en vereisen een redelijke mate van biologische rechtvaardiging. Bovendien voegt werken met in vivo modellen een mate van complexiteit in het begrip van de rol van een gen van belang in een bepaald proces. Daarom, alternatieve benaderingen te omzeilen deze beperkingen nodig zijn. Cellijnen onbetwistbare voordelen hebben: (1) zij beschikken over onbeperkte proliferatie capaciteit waarmee het genereren van genoeg materiaal voor biochemische en biologische studies, (2) ze zijn gevoelig voor genetische manipulaties (knockdown, knock-out, overexpressie), (3) de kosten relatief laag is, en (4) zij toestaan dat een zekere mate van biologische vereenvoudiging vereist in bepaalde experimentele benaderingen.

De ouderlijke IL-3 (interleukine-3) afhankelijke 32 quinquies cellijn werd in 1983 opgericht door Greenberger en collega's door infectie van beenmergcellen van C3H/HeJ muizen met vriend lymfkliertest leukemie virus9. Verschillende 32ste klonen werden beschreven in de literatuur: cl-239, cl-310en cl-1011. De 32ste cl-3 cellen bleken te verspreiden in IL-3 en ondergaan neutrofiele differentiatie op een behandeling met granulocyt-kolonie stimulatie factor (G-CSF)10. Integendeel, werden 32ste cl-10 cellen, terwijl zijn afhankelijk van de IL-3, oorspronkelijk niet onderscheiden in reactie op G-CSF behandeling. In 1995 de groep van Dr. Ivo Touw retrovirally getransduceerde 32ste cl-10 cellen met wild type en mutant vormen van G-CSF receptor (G-CSF-R), teneinde functioneel belangrijke delen van deze receptor11. Deze studie resulteerde in de generatie van de 32 quinquies/G-CSF-R-cellen, die ook afhankelijk van IL-3 zijn, maar binnen 6 tot 10 dagen na de vervanging van IL-3 met G-CSF, cellen stoppen om te vermenigvuldigen en onherroepelijk onderscheiden in volwassen neutrofiele granulocyten. Deze eigenschappen maken 32ste cl-3 en 32 quinquies/G-CSF-R cellen vereenvoudigde modellen van lymfkliertest neutrofiele differentiatie die kan worden gedifferentieerd door twee welomschreven groei en differentiatie factoren - IL-3 en G-CSF. Tijdens de laatste decennia hebben meerdere groepen 32 quinquies/G-CSF-R cellen gebruikt om te bestuderen van de rol van bepaalde genen in de proliferatie en differentiatie van myeloïde cellen in cultuur12,13,14,15 , 16, en te bestuderen of G-CSF signalering17,18. Nog belangrijker is, de resultaten verkregen met behulp van deze cellijn gecorreleerd met gegevens die zijn verkregen met primaire cellen en transgene muizen16,19,20,21. Wij zijn bijgevolg van mening dat 32 quinquies/G-CSF-R paneeltechnologie, een wijd gebruikte en reeds lang gevestigde model een waardevolle systeem vormen te bestuderen myeloïde differentiatie die kan worden gebruikt in parallel met andere benaderingen voor het aanpakken van deze vraag.

Hier, gedetailleerde protocollen beschrijven de behandeling van de 32 quinquies/G-CSF-R cellijn, welke uitbreiding van de dekking, differentiatie en evaluatie van de proliferatie en differentiatie van deze cellen wordt gepresenteerd. Gedetailleerde informatie voor genetische modificatie van 32 quinquies/G-CSF-R cellen, hetzij door retrovirale of lentivirale signaaltransductie, evenals de protocollen voor virus titratie zijn verstrekt. Daarnaast vindt u enkele representatieve resultaten waaruit potentiële toepassingen van 32 quinquies/G-CSF-R cellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Opmerking: Stappen beschrijven expansie, differentiatie en transductie van 32 quinquies/G-CSF-R cellen zijn hieronder weergegeven.

1. voorbereiding

  1. Voorbereiding van de media
    1. 250 mL gestolde voedingsbodem voor te bereiden: RPMI (Roswell Park Memorial Instituut) 1640 medium aangevuld met 10% warmte geïnactiveerd FBS (foetale runderserum) en lymfkliertest IL-3 (10 ng/mL).
      1. U kunt ook gebruik zelfgemaakte IL-3. Voor de productie van zelfgemaakte IL-3, transduce HEK293 cellen met IL-3 waarin vector en verzamelen van IL-3 met supernatant22.
        Opmerking: Antibiotica, zoals penicilline G (100 IU/mL), streptomycine (100 µg/mL) en gentamicine (40 µg/mL), kunnen worden gebruikt voor de cel kweken bij elke stap van het protocol, tenzij anders vermeld.
    2. 50 mL van differentiatie medium bereiden: RPMI 1640 medium aangevuld met 10% FBS, en menselijke G-CSF (100 ng/mL).
      Opmerking: (Belangrijk) niet alle serum batches steunen differentiatie van 32 quinquies/G-CSF-R cellen. Test verschillende batches instellen van serum vóór aanvang van het experiment. Het is aanbevolen om test ten minste 4 verschillende batches instellen en selecteer de optimale gebaseerd op het vermogen van de 32 quinquies/G-CSF-R cellen te onderscheiden. Zie 32 quinquies/G-CSF-R differentiatie protocol hieronder.
    3. 10 mL van bevriezing medium bereiden: RPMI 1640 medium aangevuld met 40% FBS, en 10% DMSO (dimethylsulfoxide).
  2. Productie van retrovirus
    1. Een eencellige suspensie van Bosc23 cellen (6 × 106) in een petrischaal 16 cm plaat en cultiveer in 18 mL DMEM (Dulbecco van bewerkt Eagle's Medium) bevattende 10 gewichtspercenten FBS tot de confluentie van de cultuur 80% (24 h bedraagt).
      Opmerking: De cellen moeten groeien in een enkelgelaagde en niet formulier klontjes in cultuur. Cel tellen kan worden uitgevoerd met behulp van verschillende methoden (geldig voor de rest van de hier gepresenteerde protocollen). In het geval van lage aantal monsters, wordt handmatig tellen onder de microscoop met behulp van de Bürker kamer aanbevolen. In dit geval, gebruik Trypan blauw voor uitsluiting van dode cellen. Cellen 1:1 mengen met 0,4% Trypan blauw in PBS. Voor het uitvoeren van tellen van groot aantal monsters, kan een automatische cel teller worden gebruikt.
    2. Combineer 40 µg voor retrovirale construct (zoals MSCV), 20 µg voor pCL-Eco (verpakking vector)23, 80 µl van PEI (polyethylenimine) en 2 mL verminderd-Serum medium (bijvoorbeeld Opti-MEM) medium (zonder antibiotica). Incubeer dit mengsel gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (RT).
    3. Bosc23 cellen medium zorgvuldig vervangen door 16 mL DMEM aangevuld met 2% FBS. Vooraf warm het medium tot 37 ° C vóór gebruik.
      Opmerking: Gebruik geen antibiotica tijdens de transfectie, aangezien het transfectie efficiëntie kan verminderen.
    4. Voeg het mengsel bereid in 1.2.2. dropwise en zorgvuldig naar de Bosc23 cultuur en incubeer gedurende 4 uur bij 37 ° C. Incubatie tot minder dan 6 h als gevolg van PEI toxiciteit te beperken.
    5. Na incubatie, omzetten in Bosc23 medium 18 mL pre opgewarmd DMEM met 10% FBS, en cultiveer cellen gedurende 48 uur bij 37 ° C. Gerechten in een laboratorium van bioveiligheid niveau 2 plaatsen, houd hier van deze stap op en volg standaard veiligheidsprocedures.
    6. Bosc23 medium (met ecotropic retrovirale deeltjes) met behulp van een 25-mL serologische precisiepipet in een conische buis van 50 mL verzamelen en bewaren bij 4 ° C.
      Opmerking: (Belangrijk) transfectie efficiëntie moet 90% voor de productie van een hoge titer virus bereiken.
    7. Voeg 18 mL pre opgewarmd DMEM 10% FBS te Bosc23 cellen en cultiveren gedurende 24 uur.
    8. Herhaal stap 1.2.6.
      Opmerking: Retrovirale supernatant van 1.2.6 en 1.2.8 kunnen worden gepoold zodra ze bij dezelfde temperatuur (4 ° C) om virale integriteit te behouden.
    9. Bosc23 om besmetting te voorkomen in virale supernatant, spin verzamelde virus bij 1500 × g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Aliquot virus, snap bevriezing met behulp van droogijs of vloeibare stikstof, en opslaan bij-80 ° C. Nochtans, merken op dat vers bereide virus is van hogere kwaliteit in termen van efficiëntie van de infectie dan bevroren voorraden.
      Opmerking: (Belangrijk) Vermijd repetitieve invriezen/ontdooien van virus, omdat het leidt tot aantasting van het virale.
  3. Productie van lentivirus
    1. Een eencellige suspensie van HEK293T (menselijke embryonale nier 293T) cellen (6 × 106) in een petrischaal 16 cm plaat en cultiveer in 18 mL DMEM met 10% FBS tot de confluentie van de cultuur 80% (24 h bedraagt).
      Opmerking: De cellen moeten groeien in een enkelgelaagde en niet formulier klontjes in cultuur.
    2. Combineren van 15 µg voor lentivirale construct (zoals pGhU6), verpakking van plasmiden pCMVdR8.74 (codering voor gag/pol, 12 µg) en pMD2.VSVG (codering voor VSV-G, 1,4 µg), 85.2 µL PEI, en 2 mL verminderd-serum medium (zonder antibiotica). Incubeer dit mengsel gedurende 20 minuten op RT.
    3. Zorgvuldig vervangen HEK293T medium met 16 mL DMEM aangevuld met 2% FBS. Vooraf warm het medium tot 37 ° C vóór gebruik. Gebruik geen antibiotica tijdens de transfectie, aangezien het transfectie efficiëntie kan verminderen.
    4. Zorgvuldig drop het mengsel bereid in 1.3.2 aan de cultuur van de cel van de HEK293T en incubeer gedurende 4 uur bij 37 ° C. Duur van de incubatie naar binnen 6 uur om te voorkomen dat PEI toxiciteit te beperken.
    5. Verandering middellange tot 18 mL pre opgewarmd DMEM 10% FBS en cultiveren van cellen gedurende 48 uur bij 37 ° C. Gerechten in een laboratorium van bioveiligheid niveau 2 plaatsen, houd hier van deze stap op en volg standaard veiligheidsprocedures.
    6. HEK293T medium (met amphotropic lentivirale deeltjes) met behulp van een 25-mL serologische precisiepipet in een conische buis van 50 mL te verzamelen en op te slaan bij 4 ° C.
      Opmerking: (Belangrijk) transfectie efficiëntie moet 90% voor de productie van een hoge titer virus bereiken.
    7. Voeg voorzichtig 18 mL voorverwarmde DMEM 10% FBS aan de HEK293T cellen. Cultiveren gedurende 24 uur bij 37 ° C.
    8. Herhaal stap 1.3.6.
      Opmerking: Lentivirale supernatant van 1.3.6 en 1.3.8 kunnen worden gepoold zodra ze bij dezelfde temperatuur (4 ° C) om virale integriteit te behouden.
    9. Om besmetting te voorkomen van virale supernatans met HEK293T cellen, spin verzamelde virus bij 1500 × g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Aliquot virus, snap bevriezing met behulp van droogijs of vloeibare stikstof, en opslaan bij-80 ° C. Nochtans, opmerken dat vers bereide virus is van hogere kwaliteit in termen van efficiëntie van de infectie dan bevroren voorraden.
      Opmerking: (Belangrijk) Vermijd repetitieve invriezen/ontdooien van virus, omdat het leidt tot aantasting van het virale.
  4. Titratie van virus met een GFP-reporter
    1. Zaad van 1 × 105 NIH/3T3 cellen in 300 µL van DMEM 10% FBS per putje in een 24-well-plaat. 7 putten zal worden gebruikt om een virus van de titer.
    2. Ontdooi virus bij 37 ° C en 1, 5, 10, 50, 100 en 500 µL virus toevoegen aan NIH/3T3 culturen. Voeg geen een virus in negatieve controle goed. Cultiveren van cellen in aanwezigheid van het virus gedurende 48 uur bij 37 ° C.
    3. Oogsten van NIH/3T3 cellen met behulp van 30 µL trypsine/EDTA (ethyleendiamminetetra zuur) (0,25% trypsine, 0,01% EDTA in PBS) en cellen plaats in 250 µL PBS in een buis FACS (fluorescentie geactiveerd cel Sorteren).
    4. Bepaal de frequentie van GFP+ cellen door stroom cytometry in elk monster24. Dode cellen uitsluiten door toevoeging van een levensvatbaarheid kleurstof, zoals Hoechst 33258.
    5. Berekenen van het totale aantal GFP+ cellen (gebaseerd op het aantal vergulde cellen en percentage GFP+ cellen) en plot ze tegen de hoeveelheid virus gebruikt voor infectie.
      Opmerking: (Belangrijk) efficiëntie van infectie bereikt een plateau wanneer grote virale doses worden toegepast. Daarom is het belangrijk voor het schatten van de titer op basis van virale concentraties welke infectie efficiëntie in een lineaire reeks (zoals vermeld in tabel 1 optreedt). Het aantal cellen van het GFP+ geeft het aantal functionele virale deeltjes (TU - omzetten van eenheden) in een bepaald virus volume. Berekenen van het aantal TU per mL.
  5. Titratie van virus met een puromycin-reporter
    1. Zaad 5 × 104 NIH/3T3 cellen in 3 mL DMEM 10% FBS per putje in een 6-well plaat; dienst 6 wells titer een virus. Cultuur 's nachts bij 37 ° C.
    2. Volgende dag Verdun virus zoals aangegeven in tabel 2. Om te verdunnen virus, voorverwarmde DMEM 10% gebruiken FBS. Doen niet vortex.
    3. Kweekmedium uit NIH/3T3 cellen verwijderen en voeg 1 mL verdunde virus.
    4. Na een nacht bebroeden bij 37 ° C.
    5. Zachtjes vervangen door het medium virus-bevattende 2 mL voorverwarmde DMEM 10% FBS, en na een nacht bebroeden bij 37 ° C.
    6. Zachtjes vervangen NIH/3T3 medium met 2 mL voorverwarmde DMEM 10% FBS met puromycin (2 µg/mL).
    7. Cultuur bij 37 ° C en zorgvuldig vernieuwen medium met puromycin om de 3 dagen of wanneer medium omslaat naar geel.
    8. 10-12 dagen na infectie, gecombineerd medium uit elk putje en voorzichtig wassen met PBS.
    9. Vlek met kristalvioletoplossing (0,5% kristalviolet in 20% ethanol en dH2O), 1 mL 2 min op RT en zorgvuldig wassen met PBS tweemaal.
    10. Graaf blauwe kolonies in elk putje onder een microscoop (vergroting × X4) aanwezig. Geen kolonies moeten goed worden nageleefd in de negatieve controle.
    11. Bereken het totale aantal TU/mL overweegt de verdunningsfactor.

2. uitbreiding en het onderhoud van 32 quinquies/G-CSF-R cellen

  1. Als 32 quinquies/G-CSF-R cellen zijn bevroren, nemen een aliquoot gedeelte en ontdooien van cellen in een waterbad 37 ° C voor 1 min en giet cellen uit de ampul direct in 10 mL voorverwarmde RPMI 1640 voedingsbodem aangevuld met 10% FBS in een tube van 15mL. Omkeren de buis 3 keer en draaien de cellen neer op 400 × g. Verwijder supernatant en resuspendeer de cellen in de IL-3 met gestolde voedingsbodem in een concentratie tussen de 0,3 × 106 cellen/mL.
  2. Optimale cel groei concentratie is 0,25-0,5 × 106 cellen/mL. Cellen splitsen om de 2 dagen brengen ze naar een concentratie van 0,1-0,2 × 106 cellen/mL.
    Opmerking: (Belangrijk) 32 quinquies/G-CSF-R cellen kunnen gedeeltelijk verliezen hun vermogen om te onderscheiden als uitgegroeid tot concentraties hoger dan 1 × 106 cellen/mL. Het is daarom heel belangrijk om 32 quinquies/G-CSF-R cellen splitsen op tijd.
  3. Indien nodig, bevriezen en opslaan van cel aliquots voor langere tijd bij-80 ° C of in vloeibare stikstof. Spin down 3 × 10-6 cellen verwijderen supernatant en resuspendeer in 1 mL van bevriezing medium. Plaats de buis in een bevriezing container bij-80 ° C. Verplaatsen voor lange termijn opslag, cellen met vloeibare stikstof.

3. signaaltransductie van cellen van de 32 quinquies/G-CSF-R

  1. Plaat 32 quinquies/G-CSF-R cellen in 6-well plaat in een concentratie tussen de 0,3 × 106 cellen/mL.
  2. Voeg de juiste hoeveelheid virus te bereiken een MOI (multipliciteit van infectie) tussen 10 en 40.
    Opmerking: Hogere MOI zal leiden tot verhoogd percentage van GFP+ cellen, alsmede hogere niveaus van expressie van het gen van belang. Voorbeeld: Te infecteren 0,3 × 10-6 cellen met een MOI van 10; 3 × 10-6 TU zal moeten worden toegevoegd aan de cellen 32 quinquies/G-CSF-R.
  3. Voeg polybrene toe aan eindconcentratie 8 µg/mL en incubeer gedurende 6 uur bij 37 ° C. U kunt ook een spin-inoculatie-procedure uitvoeren: centrifugeren op 1200 × g gedurende 90 minuten bij 30 ° C in een kweken plaat met behulp van een swing-emmer rotor en incubeer gedurende 3 uur bij 37 ° C.
  4. De cellen van het verzamelen, overbrengen in een buis 15 mL, en spin bij 450 × g gedurende 5 min (4 ° C).
  5. Verwijder het supernatant, resuspendeer Ingehuld cellen in 6 mL gestolde voedingsbodem, breng in een maatkolf van T25 cel-cultuur, en cultuur bij 37 ° C.
  6. 48 uur later, oogsten van cellen en draaien ze bij 450 × g gedurende 5 min (4 ° C). Verwijder het supernatant.
  7. In het geval van een GFP-verslaggever: cellen in 500 µL van PBS en sorteren GFP+ cellen met behulp van een stroom cytometry sorter plaatsen. In het geval van een verslaggever van de puromycin met vector: plaatsen van cellen in kweekmedium dat 2 µg/mL puromycin.
  8. Vouw cellen zo nodig voor verdere analyse en experimenten.
    Opmerking: (Optioneel) Transduced cellen kunnen worden bevroren in de bevriezing van de media in een bevriezing container bij-80 ° C, en verder opgeslagen in vloeibare stikstof.

4. 32 quinquies/G-CSF-R cel proliferatie assay

  1. Om te beoordelen van proliferatie tarief plaats 0.2 × 106 cellen in 1 mL gestolde voedingsbodem en na een nacht bebroeden bij 37 ° C.
  2. Volgende dag tellen aantal cellen en hen terug naar een concentratie van 0,2 × 106 cellen/mL gestolde voedingsbodem met verdund. Na een nacht bebroeden bij 37 ° C. Een register bijhouden van cel concentraties en verdunningen toegepast op de dagelijkse culturen met behulp van tabel 3.
  3. Herhaal stap 4.2 voor zoveel dagen zoals proliferatie dient te worden beoordeeld.
    Opmerking: De lengte van de proliferatie tests zal afhangen van het effect van het gen van belang. In geval van een sterke fenotype, zou kunnen 8-9 dagen volstaan om te kijken wat een significant effect (Zie figuur 3A). Nochtans, in geval van een milde fenotype, langere tijd kunnen zijn vereist.
  4. Beoordelen celgroei doordat een proliferatie curve zoals aangegeven in tabel 3.

5. 32 quinquies/G-CSF-R cel differentiatie assay

  1. Wassen 0.2 × 106 32 quinquies/G-CSF-R cellen tweemaal met RPMI medium zonder cytokines.
    Opmerking: De stappen wassen vóór toevoeging van G-CSF in de cultuur zijn belangrijk, omdat de aanwezigheid van residuele IL-3 differentiatie kan remmen.
  2. Cellen in 1 mL differentiatie opslagmedium (met 100 ng/mL G-CSF) in een 24 goed/plaat, wat resulteert in een cel concentratie van 0,2 × 10-6 cellen/mL (dag 0) plaatsen. Cultuur 's nachts bij 37 ° C.
  3. Aantal cellen/mL zoals hierboven (stap 1.2.1) aangegeven.
  4. Cytospin 2-5 × 104 cellen op een glasplaatje (76 X 26 mm) met behulp van een centrifuge met nodige adapters op 20 × g.
  5. Vernieuwen differentiatie medium en plaat cellen bij een concentratie van 0,2 × 105 cellen/mL op een 24 goed/plaat (dag 1). Gooi de oude plaat, en gaan de volgende dag met stap 5.6 met de nieuwe plaat.
  6. Herhaal stap 5.3 naar 5.5 op 2 tot 7 dagen. Beoordelen celproliferatie in aanwezigheid van G-CSF zoals beschreven in stap 4.
    Opmerking: (Belangrijk) tijdens de differentiatie, celproliferatie vertraagt, daarom na 3 tot 4 dagen in het bijzijn van G-CSF is het voldoende om de cellen van de cultuur bij hogere concentraties.
  7. Beoordelen van differentiatie staat van 32 quinquies/G-CSF-R cellen op basis van morfologie van de cel.
    1. Cellen uit stap 5.4 in methanol gedurende 5 minuten op RT vast en laat dia's om te drogen.
      Opmerking: Dia's uit dag 0 tot en met 7 kunnen worden opgeslagen op RT en tegelijkertijd vast. Ook kunnen ze ook worden bewaard op RT voor langere periodes na fixatie.
    2. Vlek cellen met behulp van mei-Grünwald-Giemsa kleuring van volgende fabrikant protocol.
    3. Gekleurde cellen met behulp van een microscoop en vergroting X40 visualiseren.
    4. Kwantificeren aantal ontploffingen, gearchiveerd gedifferentieerde cellen en volwassen granulocyten met behulp van de illustratieve afbeeldingen op Figuur 1 en beschrijving in tabel 4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Proliferatie en differentiatie van cellen van de 32 quinquies/G-CSF-R

Om te beoordelen van proliferatie van 32 quinquies/G-CSF-R cellen onder de voorwaarden van pro-proliferatieve en Pro-differentiatie, werden 32 quinquies/G-CSF-R cellen gekweekt in medium met IL-3 en G-CSF, respectievelijk. Het werd waargenomen dat cellen gekweekt in IL-3 met medium (10 ng/mL) ongeveer elke 24 h (figuur 2A verdelen). Bij vervanging van IL-3 G-CSF (100 ng/mL) proliferatie geleidelijk vertraagd en gestopt na 4 dagen (figuur 2A). Verder is de staat van de differentiatie van cellen gekweekt in het bijzijn van G-CSF cytospun mei-Grünwald-Giemsa gekleurd cuvetten evalueerden. Het bleek dat op dag 0 (vóór het begin van de behandeling van de G-CSF), cellen een onrijpe myeloblast-achtige morfologie legt, gekenmerkt door een grote kern en een donkere cytoplasma (figuur 2B). In de loop van de behandeling, het nucleaire wordt verkleind en de vorm van de nucleus wijzigingen aan een maan-vormige of donut-vorm. Verder is het cytoplasma wordt vergroot en verliest de donkere, violette kleur. Na 6 dagen van de behandeling met G-CSF presenteren cellen tekenen van volledige neutrofiele differentiatie, gekenmerkt door de kern van een lobulated en een licht violet cytoplasma (figuur 2B). De differentiatie van cellen van de 32 quinquies/G-CSF-R is een geleidelijk proces, waar niet alle cellen naar volwassen neutrofielen op exact dezelfde snelheid evolueren. Kwantificering van cellen in de verschillende stadia in de loop van differentiatie (namelijk blast, gearchiveerd gedifferentieerde cel en neutrofiele) wordt weergegeven in figuur 2B.

Lymfkliertest Evi2b knockdown blokkeert neutrofiele differentiatie in 32 quinquies/G-CSF-R cellen

Voor Downregulatie van EVI2B (Ecotropic virale integratie Site 2B) in 32 quinquies/G-CSF-R cellen, 3 Evi2b-targeting (Sh2, Sh3, Sh4) en 1 niet-targeting non-zwijgen controle (NSC1) shRNAs werden ontworpen; Deze werden gekloond in een lentivirale vector uitvoering een GFP verslaggever16. Getransduceerde 32 quinquies/G-CSF-R cellen werden met controle- en Evi2b-zwijgen shRNAs met behulp van een MOI van 10. Twee dagen na de signaaltransductie, werden GFP+ (getransduceerde) cellen gesorteerd en uitgebreid voor verdere experimenten. In het geval van Sh3 en Sh4, EVI2B uitputting bereikt 80%, maar Sh2 efficiënt downregulate EVI2B eiwitniveaus kon, en daarom werd gebruikt als een extra controle hier bedoelde als non-zwijgen controle 2 (NSC2). Vier dagen na de signaaltransductie, differentiatie en proliferatie tests werden uitgevoerd in het bijzijn van G-CSF, en de effecten van Evi2b Downregulatie in deze processen werden geëvalueerd. Er werd opgemerkt dat Evi2b-uitgeputte cellen (Sh2, Sh3) opgelopen celproliferatie in aanwezigheid van GCSF, overwegende dat de controle cellen (NSC1 en NSC2) proliferatie rond dag 4 (figuur 3A verminderde). Verder, Evi2b-zwijgen 32 quinquies/G-CSF-R cellen geproduceerd minder tussenliggende en volwassen neutrofielen in vergelijking met cellen (figuur 3B). Opmerkelijk, cellen getransduceerde met NSC2, die arme Evi2b vechtpartij efficiëntie aangetoond, bleek ook lichte daling in het aantal volwassen neutrofiele granulocyten (figuur 3B). Deze gegevens werden onlangs gepubliceerde16.

BCR-ABL fusieproteïne schaadt neutrofiele differentiatie in 32 quinquies/G-CSF-R cellen

Het is aangetoond dat het BCR-ABL fusieproteïne myeloïde differentiatie, waardoor een uitgebreide uitbreiding van myeloïde voorlopercellen, wat in hematopoietische falen tijdens de acute fase van chronische myeloïde leukemie25,26 resulteertschaadt. Vorige studies aangetoond dat gedwongen uitdrukking van het BCR-ABL in 32ste cl-3 cellen in een blok van neutrofiele differentiatie27,28 resulteerde. We onderzochten daarom of vergelijkbare resultaten kunnen worden verkregen met de cellijn van 32 quinquies/G-CSF-R. Getransduceerde 32 quinquies/G-CSF-R cellen werden met BCR-ABL of besturingselement MSCV retrovirale vector uitvoering een GFP-verslaggever (MOI = 20). 2 dagen na signaaltransductie, werden GFP+ cellen gesorteerd en uitgebreid voor 2 weken in IL-3 met medium. Vervolgens werden differentiatie tests uitgevoerd in het bijzijn van G-CSF. We hebben vastgesteld dat op dag 0 (vóór de overbrenging van de cellen op met gemiddeld G-CSF), MSCV controle en BCR-ABL uiten 32 quinquies/G-CSF-R-cellen gepresenteerd soortgelijke morfologie, voornamelijk vertegenwoordigen onvolwassen myeloïde cellen van de hoogoven (Figuur 4). We lieten echter zien dat tijdens lege vector getransduceerde cellen onderging neutrofiele differentiatie na 6 dagen van G-CSF behandeling (productie van 11,5% van de volwassen neutrofielen en 56,4% van gearchiveerd gedifferentieerde cellen), geen oudere neutrofiele granulocyten werden gegenereerd vanuit het BCR-ABL-getransduceerde 32 quinquies/G-CSF-R cellen (Figuur 4). Het percentage voor onrijpe blast in het BCR-ABL waarin cellen in G-CSF bleef consequent, vergelijkbaar met het percentage voor blast in IL-3 voorwaarden.

Figure 1
Figuur 1. Representatieve beelden van verschillende 32 quinquies/G-CSF-R cel morfologie. 32 quinquies/G-CSF-R cellen morfologisch kan worden geclassificeerd als blast, gearchiveerd gedifferentieerde cellen en volwassen neutrofiele granulocyten. Zie tabel 4 voor beschrijving.

Figure 2
Figuur 2. Proliferatie en differentiatie van 32 quinquies/G-CSF-R cellen. (A) proliferatie van cellen van de 32 quinquies/GCSFR in 10 ng/mL IL-3 (zwarte lijn) of 100 ng/mL G-CSF (blauwe lijn) met medium. De X-as vertegenwoordigt dagen van behandeling. De Y-as wordt weergegeven in een logaritmische schaal (log2) en geeft het aantal cellen × 105. Resultaten vertegenwoordigen gemiddelde van 3 onafhankelijke experimenten. Foutbalken geven standaarddeviatie. (B) differentiatie van 32 quinquies/G-CSF-R cellen in G-CSF-bevattende medium (100 ng/mL). In het bovenste deelvenster de taart-Staanplaatsen tonen percentage van ontploffingen (zwart), gearchiveerd gedifferentieerde cellen (p! NK), en neutrofielen (rood) in cultuur na 0, 2, 4 en 6 dagen van G-CSF behandeling. Het onderste deelvenster bevat representatieve beelden van cytospun cellen uit de respectieve tijd punten met mei-Grünwald-Giemsa gekleurd. Minimaal 100 cellen werden geëvalueerd voor elk punt van de tijd.

Figure 3
Figuur 3. Evi2b silencing blokkeert neutrofiele differentiatie in 32 quinquies-G-CSF-R cellen. (A) proliferatie van Evi2b-zwijgen (oranje lijn) en control (zwarte lijnen) 32 quinquies/G-CSF-R cellen in 100 ng/mL G-CSF met medium. De X-as vertegenwoordigt dagen van behandeling. De Y-as wordt weergegeven in een logaritmische schaal (log2) en geeft het aantal cellen × 105. Resultaten tonen een representatief resultaat van 3 onafhankelijke experimenten. (B) beoordeling van differentiatie van 32 quinquies/G-CSF-R cellen getransduceerde met Evi2b-zwijgen en controle shRNAs in G-CSF-bevattende medium (100 ng/mL) met behulp van mei-Grünwald-Giemsa-kleuring van cytospun cellen. In het bovenste deelvenster de taart-Staanplaatsen tonen percentage van ontploffingen (zwart), gearchiveerd gedifferentieerde cellen (roze) en neutrofielen (rood) in cultuur. De lagere panelen bevatten representatieve foto's van cytospun cellen. Differentiatie evalueerden op dag 7 van differentiatie. Ten minste 100 cellen werden geëvalueerd voor elke voorwaarde.

Figure 4
Figuur 4. Overexpressie van het BCR-ABL fusieproteïne schaadt differentiatie van 32 quinquies/G-CSF-R cellen. Beoordeling van differentiatie van cellen van de 32 quinquies/G-CSF-R getransduceerde met controle MSCV of BCR-ABL gen van de fusie in G-CSF-bevattende medium (100 ng/mL). Bovenste taart-Staanplaatsen tonen percentage van ontploffingen (zwart), gearchiveerd gedifferentieerde cellen (roze) en neutrofielen (rood) op dag 6 van differentiatie. De lagere panelen tonen representatieve foto's van cytospun cellen met mei-Grünwald-Giemsa gekleurd. Ten minste 100 cellen werden geëvalueerd voor elk punt van de tijd.

Virus V [µL] Aantal vergulde cellen % GFP+ GFP+ cel tellen Lineaire? TU/mL Gemiddelde (TU/mL)
1 100 000 1,83 1 830 Ja 1 830 000 2 350 000
5 100 000 12.9 12 900 Ja 2 580 000
10 100 000 26.4 26 400 Ja 2 640 000
50 100 000 71,4 71 400 No
100 100 000 85,1 85 100 No
500 100 000 85,6 85 600 No

Tabel 1. De bepaling van de virale titer voor GFP reporter met vectoren. Voorbeeld van gegevens die zijn verkregen met de MSCV retrovirus en berekening uitgevoerd om de schatten van de virale titer. Virale titer was berekend op basis van aantal GFP+ cellen verworven wanneer bepaalde hoeveelheid virus werd toegepast. De hoeveelheid virus werkzaam voor infectie moet in een lineaire correlatie met het percentage GFP+ cellen gemeten. TU: transformeren eenheden.

Buis Beschrijving van de buis DMEM + 10% FBS Virus Totaal volume Verdunningsfactor
(ΜL) (ΜL) (ΜL)
1 verdunning 1 1485 15 µL virale voorraad 1500 1 x 102
2 verdunning 2 1350 150 µL buis 1 1500 1 x 103
3 verdunning 3 1350 150 µL buis 2 1500 1 x 104
4 verdunning 4 1350 150 µL buis 3 1500 1 x 105
5 verdunning 5 1350 150 µL buis 4 1500 1 x 106

Tabel 2. Virale titer bepaling over puromycin verslaggever met vectoren. Virale verdunning strategie om te bepalen van de virale titer in puromycin met vectoren. Tabel geeft aan hoe voor te bereiden 5 buizen (1-5) waarin een seriële verdunning van de virale voorraad. Buis 1 bevat 1485 µL DMEM + 10% FBS en 15 µL van het geproduceerde virus, die een 1 × 10-2 bieden: verdund virus. Buis 2 bevat 1350 µL DMEM + 10% FBS en 150 µL van de 1 × 10-2 verdund virus (buis 1), bieden een 1 × 103 verdunde virus. Buis 3 bevat 1350 µL DMEM + 10% FBS en 150 µL van de 1 × 10-3 verdund virus (Tube 2), bieden een 1 × 10-4 verdunde virus. Buis 4 bevat 1350 µL DMEM + 10% FBS en 150 µL van de 1 × 10-4 verdund virus (buis 3), bieden een 1 × 105 verdunde virus. Buis 5 bevat 1350 µL DMEM + 10% FBS en 150 µL van de 1 × 10-5 verdund virus (buis 4), bieden een 1 × 10-6 verdunde virus. 1 ml van buizen 1-5 wordt gebruikt om de titer van het virus.

Cel telt (x = aantal cellen per ml)
dag 0 dag 1 dag 2 dag 3 dag 4 dag 5 dag 6
Voorbeeld 1 x0 x1 x2 x3 x4 x5 x6
Verdunning (d) (y = volume van cellen die gebruikt worden voor replating [mL]; z = eindvolume [mL])
dag 0 dag 1 dag 2 dag 3 dag 4 dag 5 dag 6
Voorbeeld 1 d0= 1 d1= y1/z1 d2= y2/z2 d3= y3/z3 d4= y4/z4 d5= y5/z5
Cel totaal tellen
dag 0 dag 1 dag 2 dag 3 dag 4 dag 5 dag 6
Voorbeeld 1 x0 x1 /d0 x2/d1 x3/d2/d1 x4/d3/d2/d1 x5/d4/d3/d2/d1 x6/d5/d4/d3/d2/d1

Tabel 3. Groei curve generatie. De tabel bevat een beschrijving van vergelijkingen nodig zijn voor de beoordeling van proliferatie tarief van 32 quinquies/G-CSF-R cellen.

Nucleus Cytoplasma
Ontploffing Donkere, afgeronde Donker, bijna niet te onderscheiden van nucleus
Gearchiveerd gedifferentieerde cellen Wijzigingen in nucleaire vorm, vaak donut-achtige uitgesproken of maan-achtige vorm Lichter, te onderscheiden cytoplasma
Volwassen neutrofiele granulocyten De kern van het lobulated; bijna geen verbindingen tussen de melkklieren Lichte cytoplasma

Tabel 4. 32 quinquies/G-CSF-R cel morfologie tijdens neutrofiele differentiatie. De tabel wordt een overzicht gegeven van grote morfologische kenmerken waarmee onderscheid van onrijpe ontploffing, gearchiveerd gedifferentieerde cellen en volwassen neutrofiele granulocyten. Nucleaire en cytoplasmatische karakteristieken worden beschreven. Zie afbeelding 1 voor representatieve beelden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De keuze van een experimenteel model is een van de belangrijkste kwesties in onderzoek. Hoewel primaire dierlijke en menselijke cellen worden verondersteld om de meest biologisch relevante gegevens te produceren, wordt deze modellen ethische bezwaren kunnen betrekken en worden vaak geassocieerd met dure en/of geavanceerde isolatie/kweken van procedures. Primaire cellen in aantallen zijn beperkt en het is moeilijk om genetisch te manipuleren hen. Bovendien, vertegenwoordigen primaire cellen een heterogene populatie bestaat uit verschillende soorten cellen die gegevens interpretatie29kunnen bemoeilijken. Daarentegen bieden een vrijwel onbeperkte bron van biologisch materiaal cellijnen, kosteneffectief zijn, en ondersteuning voor rondweg de ethische vraagstukken. Het is echter belangrijk om rekening te houden met die cel lijnen worden beschouwd als een kunstmatige experimenteel systeem, die kunnen genetisch en fenotypische afwijken van hun weefsel van oorsprong. Niettemin, cellijnen wanneer deze wordt gecombineerd met andere experimentele benaderingen, bieden een waardevol model voor de generatie van reproduceerbaar zijn en biologisch relevante gegevens.

De 32 quinquies/G-CSF-R cellijn, evenals de 32ste cl-3 cellen, zijn reeds lang gevestigde en gebruikte cel cultuur modellen van lymfkliertest neutrofiele differentiatie14,15,24,30. Verschillende onderzoeksgroepen hebben deze cellen gebruikt ter beoordeling van de rol van bepaalde genen in myelopoiesis en verkregen resultaten die gecorreleerd met gegevens die zijn verkregen met behulp van in vivo modellen en primaire cellen16,31. Hier bieden wij een protocol voor de behandeling van de 32 quinquies/G-CSF-R cellijn, echter soortgelijke procedures kunnen worden toegepast voor het kweken en manipuleren van de 32ste cl-3 cellen. Het is belangrijk erop te wijzen dat de verschillende batches instellen van de 32ste cl-3 cellen in verschillende laboratoria aanwezig verschillen in karyotype gebruikt, suggereren dat verschillende groepen gebruikers kunnen met hun eigen subklonen32werken. Op basis van deze constatering, veronderstellen we dat genetische variabiliteit misschien ook wel in 32 quinquies/G-CSF-R cellen aanwezig, en dit rekening worden gehouden moet bij het vergelijken van de resultaten verkregen door verschillende onderzoeksgroepen. Alternatieve cel cultuur modellen naar 32 quinquies/G-CSF-R cellen zijn vereeuwigd hematopoïetische voorlopercellen lijnen22,33,34,35,,36. Deze benadering is handig als grootschalige voorlopercellen uitbreiding is vereist, bijvoorbeeld met het oog op studie eiwit interacties22. Een voordeel van 32 quinquies/G-CSF-R cellen is dat vereeuwigd progenitoren kunnen worden gegenereerd vanuit de normale genetisch gemodificeerde muizen, hoewel de tijd om de lijn aanzienlijk lange37 is. Daarnaast vereist hanteren en manipulatie van het beenmerg vereeuwigd progenitoren meer expertise dan 32 quinquies/G-CSF-R cellen.

We toonden om de lezer vertrouwd met het 32 quinquies/G-CSF-R-model, in het eerste deel van de representatieve resultaten te kinetiek van de proliferatie en differentiatie van 32 quinquies/G-CSF-R cellen in aanwezigheid van IL-3 en G-CSF. Representatieve beelden te tonen van de morfologie van de cellen in de delende voorwaarden IL-3 alsmede op verschillende tijdstippen van de GCSF-geïnduceerde differentiatie werden gepresenteerd. We beoordeeld neutrofiele differentiatie door morfologische analyse, maar er werd gemeld dat de 32ste cl-3 celdifferentiatie kan worden bepaald door stroom cytometrische analyse met behulp van de CD11b cel oppervlakte marker27,31, 38,39. Onze kennis en expertise is CD11b niet upregulated tijdens neutrofiele differentiatie van 32 quinquies/G-CSF-R cellen. Voor normalisatie werkzaam de 32 quinquies/G-CSF-R proliferatie testen wij verkrijgbare IL-3. Wij merkte echter op dat de cellen goed in zelfgemaakte IL-3 vermenigvuldigen, zoals beschreven door Drobek en collega's22geproduceerd. Voor het verkrijgen van een goede mate van G-CSF-geïnduceerde neutrofiele differentiatie, is het belangrijk te onthouden dat het vermogen van de differentiatie van 32 quinquies/G-CSF-R cellen geschaad worden kan als de cellen worden gekweekt boven een concentratie van 1 × 10-6 cellen/mL. Bovendien, kunnen de mate en snelheid van differentiatie worden beïnvloed door de samenstelling van het serum. Daarom is het aanbevolen om test van het vermogen van de differentiatie van 32 quinquies/G-CSF-R cellen in meerdere FBS batches en selecteer degene die beter de ontwikkeling van volwassen neutrofielen bij 6 tot en met 9 dagen van cultuur in het bijzijn van G-CSF ondersteunt.

We voorzien twee representatieve experimenten aantonen van mogelijke manieren om te studeren van de rol van bepaalde eiwitten bij myeloïde differentiatie (Figuur 3 en Figuur 4). Ten eerste, we toonden dat Downregulatie van EVI2B, een transmembraan eiwit uitgedrukt in hematopoietische cellen, leidt tot een blok van myeloïde differentiatie in 32 quinquies/G-CSF-R cellen. Deze gegevens werden onlangs gepubliceerd door onze fractie, in combinatie met testen uitgevoerd met behulp van primaire cellen en Evi2b knock-out muizen16. Ten tweede, we onderzochten het effect van de BCR-ABL, een fusieproteïne die voortvloeien uit de genetische translocatie-t(9,22) (q34; q11), op neutrofiele differentiatie van 32 quinquies/G-CSF-R cellen. Deze translocatie werd oorspronkelijk geïdentificeerd bij patiënten met chronische myeloïde leukemie40,41. Het bleek eerder dat expressie van het BCR-ABL fusion oncoprotein in 32ste cl-3 cellen leidt tot een myeloïde differentiatie arrestatie27,28. Hier toonden we aan dat BCR-ABL overexpressie soortgelijke effecten op 32 quinquies/G-CSF-R cellen heeft. In beide sets van experimenten hier gepresenteerd (waarbij Evi2b Downregulatie en overexpressie van het BCR-ABL), genetische modificatie van 32 quinquies/G-CSF-R cellen werd uitgevoerd via virale signaaltransductie, wat in stabiele genexpressie resulteert. De keuze van retrovirale versus lentivirale levering heeft geen invloed op de proliferatie of differentiatie van 32 quinquies/G-CSF-R cellen. Lentivirale infectie is echter efficiënter dan retrovirale signaaltransductie als gevolg van de aanwezigheid van endogene retrovirus in 32 quinquies/G-CSF-R cellen. Volgens onze ervaring is de transfectie van deze cellen met behulp van standaard lipofiele reagentia niet efficiënt. Echter, als voorbijgaande construct expressie nodig is, transfectie door electroporation is een haalbare aanpak42,43,44. Hier, presenteerden we de genetische manipulatie van 32 quinquies/G-CSF-R cellen gevolgd door GFP sorteren en bulk analyse van de geïnfecteerde cellen. Echter, indien nodig, eencellige sorteren kan worden ingezet voor het genereren van eencellige klonen als eerder gemeld12,45.

Naast de proliferatie en differentiatie testen, zijn met succes het bepalen van de rol van bepaalde eiwitten in cel migratie en apoptosis13,46,47,48 32 quinquies/G-CSF-R cellen tewerkgesteld . Verder, de lijn 32 quinquies/G-CSF-R is gebruikt om te bepalen van onafhankelijke groei cytokine gemedieerde door oncoproteins19,20. Een andere regel vaak gebruikt bij het bestuderen van cytokine onafhankelijkheid is Ba/F3 cellen21,49. BA/F3 is een IL-3 afhankelijke lymfkliertest cellijn afkomstig van C3H muis stam, ook naar 32 quinquies/G-CSF-R cellen. Hoewel beide systemen kunnen worden ingezet om te studeren van cytokine onafhankelijke proliferatie, Ba/F3 cellen slecht onderscheid worden gemaakt in het bijzijn van G-CSF.

Over het geheel genomen is het raadzaam dat 32 quinquies/G-CSF-R paneeltechnologie, hoewel minder voorkeur dan primaire cellen, verschillende voordelen bieden, met inbegrip van de proliferatie van de onbeperkte capaciteit en eenvoudige bediening. Wij zijn van mening dat voor de generatie van betrouwbare gegevens, experimenten uitgevoerd in 32 quinquies/G-CSF-R cellen dienen te worden aangevuld met gegevens die zijn verkregen met behulp van alternatieve experimentele benaderingen zoals lymfkliertest modellen en primaire culturen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs bedanken Prof. Ruud Delwel en Prof. Ivo Touw voor het verstrekken van ons met de 32 quinquies/G-CSF-R cellijn en Prof. Daniel G. Tenen voor het verstrekken van ons met de cellijn van Bosc23. Dit werk werd ondersteund door subsidies van het subsidie-Agentschap van de Tsjechische Republiek (GACR 15-03796S en GACR 17-02177S) bij MA-J, ondersteuning van het Instituut voor moleculaire genetica van de Tsjechische Academie van Wetenschappen (RVO 68378050) MA-J, een GA UK fellowship (project nr. 341015) van de Karelsuniversiteit in Praag MK, en een fellowship GA UK (project nr. 1278217) van de Karelsuniversiteit in Praag te PD.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 powder medium Merck, Kenilworth, NJ, USA T 121-10 without NaHCO3, with L-glutamine
DMEM Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 15028
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 31985-047 L-Glutamine, Phenol Red
Fetal bovine serum (FBS) PAA Laboratories (GE Healthcare,Chicago, IL, USA) MT35011CV For differentiation of 32D/G-CSF-R cells
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 10270 Used for culturing HEK293T, NIH3T3, BOSC23 cells
Penicillin Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) P3032
Streptomycin Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) S9137 Streptomycin sulfate salt powder
Gentamicin Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) G1914
murine IL-3 PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA 213-13
human G-CSF PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA 300-23
Polyethylenimine Polyscience, Warrington, PA, USA 23966 Linear, MW 25,000 (PEI 25000)
Polybrene Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) H9268
Trypsin VWR Chemicals, Radnor, PA, USA 0458
EDTA Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) E5134
Crystal violet Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) C0775
Trypan blue Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) T6146
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) D2650
May-Grünwald Giemsa DiaPath, Martinengo, BG, Italy 10802

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bonilla, M. A., et al. Effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor on neutropenia in patients with congenital agranulocytosis. N Engl J Med. 320 (24), 1574-1580 (1989).
  2. Bennett, C. L., Djulbegovic, B., Norris, L. B., Armitage, J. O. Colony-stimulating factors for febrile neutropenia during cancer therapy. N Engl J Med. 368 (12), 1131-1139 (2013).
  3. Lowenberg, B., Downing, J. R., Burnett, A. Acute myeloid leukemia. N Engl J Med. 341 (14), 1051-1062 (1999).
  4. Dong, F., et al. Identification of a nonsense mutation in the granulocyte-colony-stimulating factor receptor in severe congenital neutropenia. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (10), 4480-4484 (1994).
  5. Rosenbauer, F., Tenen, D. G. Transcription factors in myeloid development: balancing differentiation with transformation. Nat Rev Immunol. 7 (2), 105-117 (2007).
  6. Kota, J., Caceres, N., Constantinescu, S. N. Aberrant signal transduction pathways in myeloproliferative neoplasms. Leukemia. 22 (10), 1828-1840 (2008).
  7. Kvinlaug, B. T., et al. Common and overlapping oncogenic pathways contribute to the evolution of acute myeloid leukemias. Cancer Res. 71 (12), 4117-4129 (2011).
  8. Krug, U., Ganser, A., Koeffler, H. P. Tumor suppressor genes in normal and malignant hematopoiesis. Oncogene. 21 (21), 3475-3495 (2002).
  9. Greenberger, J. S., Sakakeeny, M. A., Humphries, R. K., Eaves, C. J., Eckner, R. J. Demonstration of permanent factor-dependent multipotential (erythroid/neutrophil/basophil) hematopoietic progenitor cell lines. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (10), 2931-2935 (1983).
  10. Valtieri, M., et al. Cytokine-dependent granulocytic differentiation. Regulation of proliferative and differentiative responses in a murine progenitor cell line. J Immunol. 138 (11), 3829-3835 (1987).
  11. Dong, F., et al. Mutations in the gene for the granulocyte colony-stimulating-factor receptor in patients with acute myeloid leukemia preceded by severe congenital neutropenia. N Engl J Med. 333 (8), 487-493 (1995).
  12. Jorda, M. A., Lowenberg, B., Delwel, R. The peripheral cannabinoid receptor Cb2, a novel oncoprotein, induces a reversible block in neutrophilic differentiation. Blood. 101 (4), 1336-1343 (2003).
  13. Jorda, M. A., et al. Hematopoietic cells expressing the peripheral cannabinoid receptor migrate in response to the endocannabinoid 2-arachidonoylglycerol. Blood. 99 (8), 2786-2793 (2002).
  14. Abbas, S., et al. Integrated genome-wide genotyping and gene expression profiling reveals BCL11B as a putative oncogene in acute myeloid leukemia with 14q32 aberrations. Haematologica. 99 (5), 848-857 (2014).
  15. Zhuang, D., Qiu, Y., Kogan, S. C., Dong, F. Increased CCAAT enhancer-binding protein epsilon (C/EBPepsilon) expression and premature apoptosis in myeloid cells expressing Gfi-1 N382S mutant associated with severe congenital neutropenia. J Biol Chem. 281 (16), 10745-10751 (2006).
  16. Zjablovskaja, P., et al. EVI2B is a C/EBPalpha target gene required for granulocytic differentiation and functionality of hematopoietic progenitors. Cell Death Differ. 24 (4), 705-716 (2017).
  17. Santini, V., et al. The carboxy-terminal region of the granulocyte colony-stimulating factor receptor transduces a phagocytic signal. Blood. 101 (11), 4615-4622 (2003).
  18. Liu, H., Qiu, Y., Xiao, L., Dong, F. Involvement of protein kinase Cepsilon in the negative regulation of Akt activation stimulated by granulocyte colony-stimulating factor. J Immunol. 176 (4), 2407-2413 (2006).
  19. Kelly, L. M., et al. FLT3 internal tandem duplication mutations associated with human acute myeloid leukemias induce myeloproliferative disease in a murine bone marrow transplant model. Blood. 99 (1), 310-318 (2002).
  20. Pikman, Y., et al. MPLW515L is a novel somatic activating mutation in myelofibrosis with myeloid metaplasia. PLoS Med. 3 (7), e270 (2006).
  21. Schwaller, J., et al. Transformation of hematopoietic cell lines to growth-factor independence and induction of a fatal myelo- and lymphoproliferative disease in mice by retrovirally transduced TEL/JAK2 fusion genes. EMBO J. 17 (18), 5321-5333 (1998).
  22. Drobek, A., et al. PSTPIP2, a Protein Associated with Autoinflammatory Disease, Interacts with Inhibitory Enzymes SHIP1 and Csk. J Immunol. 195 (7), 3416-3426 (2015).
  23. Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. J Virol. 70 (8), 5701-5705 (1996).
  24. Alberich-Jorda, M., et al. C/EBPgamma deregulation results in differentiation arrest in acute myeloid leukemia. J Clin Invest. 122 (12), 4490-4504 (2012).
  25. Calabretta, B., Perrotti, D. The biology of CML blast crisis. Blood. 103 (11), 4010-4022 (2004).
  26. Ren, R. Mechanisms of BCR-ABL in the pathogenesis of chronic myelogenous leukaemia. Nat Rev Cancer. 5 (3), 172-183 (2005).
  27. Schuster, C., et al. The effects of Bcr-Abl on C/EBP transcription-factor regulation and neutrophilic differentiation are reversed by the Abl kinase inhibitor imatinib mesylate. Blood. 101 (2), 655-663 (2003).
  28. Chang, J. S., et al. High levels of the BCR/ABL oncoprotein are required for the MAPK-hnRNP-E2 dependent suppression of C/EBPalpha-driven myeloid differentiation. Blood. 110 (3), 994-1003 (2007).
  29. Velten, L., et al. Human haematopoietic stem cell lineage commitment is a continuous process. Nat Cell Biol. 19 (4), 271-281 (2017).
  30. Jorda, M. A., Rayman, N., Valk, P., De Wee, E., Delwel, R. Identification, characterization, and function of a novel oncogene: the peripheral cannabinoid receptor Cb2. Ann N Y Acad Sci. 996, 10-16 (2003).
  31. Wurm, A. A., et al. Disruption of the C/EBPalpha-miR-182 balance impairs granulocytic differentiation. Nat Commun. 8 (1), 46 (2017).
  32. Agliano, A. M., et al. On chromosomal instability: what is the karyotype of your 32D CI3 cell line. Blood. 95 (11), 3636-3637 (2000).
  33. Wang, G. G., et al. Quantitative production of macrophages or neutrophils ex vivo using conditional Hoxb8. Nat Methods. 3 (4), 287-293 (2006).
  34. Houston, I. B., Huang, K. J., Jennings, S. R., DeKoter, R. P. PU.1 immortalizes hematopoietic progenitors in a GM-CSF-dependent manner. Exp Hematol. 35 (3), 374-384 (2007).
  35. Calvo, K. R., Sykes, D. B., Pasillas, M., Kamps, M. P. Hoxa9 immortalizes a granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-dependent promyelocyte capable of biphenotypic differentiation to neutrophils or macrophages, independent of enforced meis expression. Mol Cell Biol. 20 (9), 3274-3285 (2000).
  36. Calvo, K. R., Sykes, D. B., Pasillas, M. P., Kamps, M. P. Nup98-HoxA9 immortalizes myeloid progenitors, enforces expression of Hoxa9, Hoxa7 and Meis1, and alters cytokine-specific responses in a manner similar to that induced by retroviral co-expression of Hoxa9 and Meis1. Oncogene. 21 (27), 4247-4256 (2002).
  37. Fossati-Jimack, L., et al. Phagocytosis is the main CR3-mediated function affected by the lupus-associated variant of CD11b in human myeloid cells. PLoS One. 8 (2), e57082 (2013).
  38. Schwable, J., et al. RGS2 is an important target gene of Flt3-ITD mutations in AML and functions in myeloid differentiation and leukemic transformation. Blood. 105 (5), 2107-2114 (2005).
  39. Worch, J., et al. The serine-threonine kinase MNK1 is post-translationally stabilized by PML-RARalpha and regulates differentiation of hematopoietic cells. Oncogene. 23 (57), 9162-9172 (2004).
  40. Rowley, J. D. Letter: A new consistent chromosomal abnormality in chronic myelogenous leukaemia identified by quinacrine fluorescence and Giemsa staining. Nature. 243 (5405), 290-293 (1973).
  41. Stam, K., et al. Evidence of a new chimeric bcr/c-abl mRNA in patients with chronic myelocytic leukemia and the Philadelphia chromosome. N Engl J Med. 313 (23), 1429-1433 (1985).
  42. Holly, S. P., Larson, M. K., Parise, L. V. The unique N-terminus of R-ras is required for Rac activation and precise regulation of cell migration. Mol Biol Cell. 16 (5), 2458-2469 (2005).
  43. Pierce, J. H., et al. Macrophage-colony-stimulating factor (CSF-1) induces proliferation, chemotaxis, and reversible monocytic differentiation in myeloid progenitor cells transfected with the human c-fms/CSF-1 receptor cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (15), 5613-5617 (1990).
  44. Pierce, J. H., et al. Signal transduction through the EGF receptor transfected in IL-3-dependent hematopoietic cells. Science. 239 (4840), 628-631 (1988).
  45. Oomen, S. P., et al. Somatostatin modulates G-CSF-induced but not interleukin-3-induced proliferative responses in myeloid 32D cells via activation of somatostatin receptor subtype 2. Hematol J. 2 (5), 322-329 (2001).
  46. Oomen, S. P., et al. Somatostatin is a selective chemoattractant for primitive (CD34(+)) hematopoietic progenitor cells. Exp Hematol. 30 (2), 116-125 (2002).
  47. Nogami, A., et al. FLT3-ITD confers resistance to the PI3K/Akt pathway inhibitors by protecting the mTOR/4EBP1/Mcl-1 pathway through STAT5 activation in acute myeloid leukemia. Oncotarget. 6 (11), 9189-9205 (2015).
  48. Rodel, J. E., Link, D. C. Suppression of apoptosis during cytokine deprivation of 32D cells is not sufficient to induce complete granulocytic differentiation. Blood. 87 (3), 858-864 (1996).
  49. Daley, G. Q., Baltimore, D. Transformation of an interleukin 3-dependent hematopoietic cell line by the chronic myelogenous leukemia-specific P210bcr/abl protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 85 (23), 9312-9316 (1988).

Tags

Ontwikkelingsbiologie kwestie 132 32 quinquies/G-CSF-R cellen lymfkliertest myeloïde voorlopercellen vloeibare cultuur differentiatie neutrofielen proliferatie cytokines IL-3 G-CSF
Proliferatie en differentiatie van lymfkliertest myeloïde voorloper 32 quinquies/G-CSF-R cellen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zjablovskaja, P., Danek, P.,… More

Zjablovskaja, P., Danek, P., Kardosova, M., Alberich-Jorda, M. Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells. J. Vis. Exp. (132), e57033, doi:10.3791/57033 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter