Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Spredning og differensiering av Murine myelogen forløper 32D/G-CSF-R celler

Published: February 21, 2018 doi: 10.3791/57033
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1,2
1Department of Hemato-Oncology, Institute of Molecular Genetics of the ASCR, 2Childhood Leukaemia Investigation Prague, Department of Paediatric Haematology and Oncology, 2nd Faculty of Medicine, Charles University
* These authors contributed equally

Summary

Her presenteres detaljert protokoller for dyrking murine myelogen forløper 32D/G-CSF-R celle linjen utfører virusinfeksjoner og gjennomføre spredning og differensiering analyser. Denne cellen linjen er egnet for å studere myelogen celle utvikling og rollen av gener av interesse myelogen cellevekst og neutrophilic differensiering.

Abstract

Forståelse av blodkreft stilk og stamfar cellebiologi har viktige implikasjoner for regenerativ medisin og behandling av Hematologisk patologi. Til tross for de mest relevante dataene som kan erverves i vivo modeller eller primære kulturer, begrenser lav overflod av blodkreft stilk og stamfar celler vesentlig utvalget av egnet teknikker for etterforskningen. Bruken av linjer kan derfor tilstrekkelig produksjon av biologisk materiale til visninger eller analyser som krever stor cellen tallene. Her presenterer vi en detaljert beskrivelse, avlesning og tolkning av spredning og differensiering analyser som brukes for etterforskningen av prosesser i myelopoiesis og neutrophilic differensiering. Disse eksperimentene ansette 32D/G-CSF-R cytokin underordnet murine myelogen celle linjen, som besitter evnen til å spre seg i nærvær av IL-3 og differensiere i G-CSF. Vi tilbyr optimalisert protokoller for håndtering 32D/G-CSF-R celler og diskutere store fallgruver og ulemper som kan kompromittere beskrevet analyser og forventede resultater. I tillegg inneholder denne artikkelen protokoller for lentiviral og retroviral titrering og signaltransduksjon 32D/G-CSF-R celler. Vi viser at genetisk manipulasjon av disse cellene kan brukes til å utføre funksjonelle og molekylære studier som kan utfylle resultatene med primære blodkreft stilk og stamfar celler eller i vivo modeller.

Introduction

Blodkreft stilk og stamfar befolkningen leverer organisme med et stort utvalg av modne cellene, inkludert celler fra myelogen linjen (nøytrofile, eosinofile, basofile og monocytter). Prosessen som kjører produksjon av myeloide celler fra blodkreft stamceller er kjent som myelopoiesis, og tilstrekkelig produksjon av modne myeloide celler i svar på endrede krav er en forutsetning for riktig mestring av organismen stress forhold, for eksempel infeksjoner og blodtap. Utilstrekkelig produksjon av modne myeloide celler kan føre til manglende evne til å eliminere patogener, redusert blodpropp og andre livstruende forhold1,2. I tillegg kan endringer i myelogen avstamning utvikling også være knyttet til Hematologisk malignitet, som akutt myelogen leukemi (AML)3. Endringer i myelopoiesis kan skyldes ulike årsaker som mangler i cellen overflate reseptorer4, endret uttrykk for transkripsjon faktorer5, svekket signalnettverk trasé6, mutasjoner som resulterer i dannelsen / aktivering av oncogenes7eller inaktivering av tumor suppressor gener8.

Ulike metoder har blitt utviklet for å studere myelogen utvikling og vurdere effekten av konkrete genetiske endringer i denne prosessen. Felles tilnærminger brukt for å studere myelopoiesis innebære primære celler og transgene mus. Selv om disse modellene at oppkjøpet av biologisk relevante data, har de visse begrensninger. Bruk av primære celler møter et begrenset antall celler og en begrenset periode av kultur, begrense mulighetene for å endre genuttrykk og påfølgende biologiske eller biokjemiske analyse. Transgene mus er kostbare og krever en rimelig grad av biologisk begrunnelse. I tillegg gir arbeider med i vivo modeller en grad av kompleksitet til forståelsen av en genet av interesse i en gitt prosess. Derfor er alternative tilnærminger til å omgå disse begrensningene nødvendig. Linjer har udiskutable fordeler: (1) de har ubegrenset spredning kapasitet som gir genererer nok materiale for biokjemisk og biologiske studier, (2) de er utsatt for genetisk manipulasjon (knockdown, knockout, overuttrykte), (3) er relativt lav, og (4) de tillate en grad av biologiske forenkling kreves i visse eksperimentelle tilnærminger.

Den foreldre IL-3 (Interleukin-3) avhengige 32D celle linje ble etablert i 1983 av Greenberger og kolleger av infeksjon beinmargen celleområde fra C3H/HeJ mus med venn murine leukemi virus9. Flere 32D kloner ble beskrevet i litteraturen: cl-239, cl-310og cl-1011. 32D cl-3 cellene ble vist å spre seg i IL-3 og gjennomgå neutrophilic differensiering på behandling med granulocytt-colony stimulering faktor (G-CSF)10. Tvert imot, var 32D cl-10 celler, samtidig som IL-3 avhengige, opprinnelig ikke skille svar på G-CSF behandling. I 1995 transduced gruppen av Dr. Ivo Touw retrovirally 32D cl-10 celler med wild type og mutant former for G-CSF reseptor (G-CSF-R), for å identifisere funksjonelt viktige regioner i denne reseptoren11. Denne studien resulterte i generasjon av 32D/G-CSF-R celler som er tilsvarende avhengige IL-3, men innen 6 til 10 dager etter utskifting av IL-3 med G-CSF, celler slutte å spre og differensiere irreversibelt til modne nøytrofile. Disse egenskapene gjør 32D cl-3 og 32D/G-CSF-R celler forenklet modeller av murine neutrophilic differensiering som kan være modulert av to veldefinerte vekst og differensiering faktorer - IL-3 og G-CSF. I løpet av de siste tiårene har flere grupper brukt 32D/G-CSF-R celler for å studere rollen til bestemte gener i spredning og differensiering av myeloide celler i kultur12,13,14,15 , 16, og å studere G-CSF signalnettverk17,18. Viktigst, resultatene som oppnås ved å bruke denne cellen: korrelert med data innhentet primære celler og transgene mus16,19,20,21. Derfor tror vi at 32D/G-CSF-R celler, blir mye brukt og veletablerte modell, representerer en verdifull system å studere myelogen differensiering som kan brukes parallelt med andre tilnærminger adressering denne spørsmål.

Her, detaljert protokoller som beskriver håndtering av 32D/G-CSF-R cellen linje, som dekker ekspansjon differensiering og vurdering av spredning og differensiering av disse cellene er presentert. Detaljert informasjon for genetisk modifisering av 32D/G-CSF-R celler, enten ved retroviral eller lentiviral signaltransduksjon, samt protokoller for virus titrering er gitt. I tillegg tilbys flere representant resultater som viser potensielle anvendelser av 32D/G-CSF-R celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Merk: Trinn beskriver ekspansjon, differensiering, og signaltransduksjon 32D/G-CSF-R celler presenteres nedenfor.

1. forberedelse

  1. Media forberedelse
    1. Forberede 250 mL kultur medium: RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 medium med 10% varme inaktivert FBS (fosterets bovin serum) og murine IL-3 (10 ng/mL).
      1. Alternativt bruke hjemmelaget IL-3. Å lage hjemmelaget IL-3, transduce HEK293 celler med IL-3 uttrykke vektor og samle IL-3 inneholder supernatant22.
        Merk: Antibiotika, som penicillin G (100 IU/mL), streptomycin (100 µg/mL) og gentamicin (40 µg/mL), kan brukes for cellen dyrking på alle trinn av protokollen annet er oppgitt.
    2. Forberede 50 mL av differensiering medium: RPMI 1640 medium supplert med 10% FBS og menneskelige G-CSF (100 ng/mL).
      Merk: (Viktig) ikke alle serum bunker støtte differensiering av 32D/G-CSF-R celler. Før eksperiment kan du teste ulike grupper av serum. Det anbefales å teste minst 4 forskjellige bunker og velge den optimale basert på evnen til 32D/G-CSF-R cellene å differensiere. Se 32D/G-CSF-R differensiering protokollen nedenfor.
    3. Forberede 10 mL av frysing medium: RPMI 1640 medium supplert med 40% FBS, og 10% DMSO (dimethyl sulfoxide).
  2. Produksjon av retrovirus
    1. Plate en enkeltcelle suspensjon av Bosc23 celler (6 × 106) i en 16 cm Petriskål og dyrke i 18 mL av DMEM (Dulbeccos endret Eagle's Medium) som inneholder 10% FBS til confluency kultur når 80% (24 timer).
      Merk: Cellene skal vokse i en monolayer og ikke danner klumper i kultur. Cellen teller kan utføres med ulike metoder (gyldig for resten av protokollene presenteres her). I tilfelle av lavt antall eksempler anbefales manuelle telle under mikroskopet med Bürker kammeret. I dette tilfellet, bruk Trypan blå for utelukkelse av døde celler. Bland celler 1:1 med 0,4% Trypan blå i PBS. For å utføre telling av mange eksempler, kan en automatisk celle teller anvendes.
    2. Kombinere 40 µg av retroviral konstruere (for eksempel MSCV), 20 µg pCL-Eco (emballasje vektor)23, 80 µl Pei (polyethylenimine), og 2 mL redusert Serum medium (f.eks Opti-MEM) medium (uten antibiotika). Inkuber denne blandingen for 20 min ved romtemperatur (RT).
    3. Nøye erstatte Bosc23 celler medium med 16 mL DMEM med 2% FBS. Forvarm mellomlang til 37 ° C før bruk.
      Merk: Ikke bruk antibiotika under transfection, siden det kan redusere transfection effektivitet.
    4. Legg blandingen i 1.2.2. dropwise og forsiktig til Bosc23 kultur og ruge 4 h på 37 ° C. Begrense inkubasjon til mindre enn 6 h på grunn av PEI toksisitet.
    5. Etter inkubasjon endre Bosc23 medium til 18 mL pre varmet DMEM inneholder 10% FBS, og dyrke celler for 48 timer på 37 ° C. Plasser retter i et biosikkerhet nivå 2 laboratorium, holde her fra dette trinnet på, og følger standard prosedyrer.
    6. Samle Bosc23 mediet (som inneholder ecotropic retroviral partikler) bruker en 25-mL serologisk pipette til en 50-mL konisk rør, og lagre på 4 ° C.
      Merk: (Viktig) Transfection effektivitet skal nå 90% for å produsere høy titer virus.
    7. Legge til 18 mL pre varmet DMEM 10% FBS til Bosc23 celler og dyrke 24 h.
    8. Gjenta trinn 1.2.6.
      Merk: Retroviral supernatants fra 1.2.6 og 1.2.8 kan samordnes når de når samme temperatur (4 ° C) for å beholde viral integritet.
    9. For å unngå Bosc23 forurensning i viral supernatants, spin samlet virus 1500 × g i 10 min på 4 ° C. Aliquot virus, fest fryse med tørris eller flytende nitrogen, og lagre på-80 ° C. Merk imidlertid at nylagde virus er av høyere kvalitet av infeksjon effektivitet enn frosne aksjer.
      Merk: (Viktig) unngå repeterende fryser/tining av viruset, siden det fører til viral degradering.
  3. Produksjon av lentivirus
    1. Plate en enkeltcelle suspensjon av HEK293T (menneskelige embryonale 293T) nyreceller (6 × 106) i en 16 cm Petriskål og dyrke i 18 mL av DMEM som inneholder 10% FBS til confluency kultur når 80% (24 timer).
      Merk: Cellene skal vokse i en monolayer og ikke danner klumper i kultur.
    2. Kombinere 15 µg av lentiviral konstruere (for eksempel pGhU6), emballasje plasmider pCMVdR8.74 (koding for gag/pol, 12 µg) og pMD2.VSVG (koding for VSV-G, 1,4 µg), 85.2 µL PEI og 2 mL redusert serum medium (uten antibiotika). Inkuber denne blandingen for 20 min på RT.
    3. Nøye erstatte HEK293T medium med 16 mL DMEM med 2% FBS. Forvarm mellomlang til 37 ° C før bruk. Ikke bruk antibiotika under transfection, siden det kan redusere transfection effektivitet.
    4. Nøye slippe blandingen i 1.3.2 til HEK293T cellekultur og ruge 4 h på 37 ° C. Begrense inkubasjon varighet innen 6 timer å hindre PEI toksisitet.
    5. Endre middels til 18 mL pre varmet DMEM 10% FBS og dyrke celler for 48 timer på 37 ° C. Plasser retter i et biosikkerhet nivå 2 laboratorium, holde her fra dette trinnet på, og følger standard prosedyrer.
    6. Samle HEK293T mediet (som inneholder amphotropic lentiviral partikler) bruker en 25-mL serologisk pipette inn i et 50 mL konisk rør og lagre det på 4 ° C.
      Merk: (Viktig) Transfection effektivitet skal nå 90% for å produsere høy titer virus.
    7. Forsiktig legge 18 mL forvarmes DMEM 10% FBS til HEK293T cellene. Dyrke 24 h på 37 ° C.
    8. Gjenta trinn 1.3.6.
      Merk: Lentiviral supernatants 1.3.6 og 1.3.8 kan samordnes når de når samme temperatur (4 ° C) for å beholde viral integritet.
    9. For å unngå forurensning av viral nedbryting med HEK293T celler, spin samlet virus 1500 × g i 10 min på 4 ° C. Aliquot virus, fest fryse med tørris eller flytende nitrogen, og lagre den på-80 ° C. Legg imidlertid merke til at nylagde virus er av høyere kvalitet av infeksjon effektivitet enn frosne aksjer.
      Merk: (Viktig) unngå repeterende fryser/tining av viruset, siden det fører til viral degradering.
  4. Titrering virus som inneholder en GFP reporter
    1. Frø 1 × 105 NIH/3T3 celler i 300 µL av DMEM 10% FBS per brønn i en 24-vel plate. 7 brønner vil bli ansatt titer en virus.
    2. Tine virus på 37 ° C og Legg til 1, 5, 10, 50, 100 og 500 µL virus NIH/3T3 kulturer. Ikke Legg noen virus i negativ kontroll godt. Dyrke celler i nærvær av viruset 48 h på 37 ° C.
    3. Høste NIH/3T3 celler med 30 µL av trypsin/EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) (0,25% Trypsin, 0,01% EDTA i PBS) og plasserer cellene i 250 µL PBS i et FACS (fluorescens aktivert celle sortering) rør.
    4. Bestemme frekvensen av GFP+ celler av flowcytometri i hvert eksempel24. Utelate døde celler ved tillegg av en levedyktighet fargestoff, som Hoechst 33258.
    5. Beregne det totale antallet GFP+ celler (basert på antall belagt celler og prosentandel av GFP+ celler), og tegne dem mot volumet av virus brukes for infeksjon.
      Merk: (Viktig) effektiviteten av smitte når et platå når store viral doser brukes. Derfor er det viktig å estimere titer basert på viral konsentrasjoner som infeksjon effektivitet oppstår i en lineær område (eksempel vist i tabell 1). Antall GFP+ celler indikerer antall funksjonelle virus partikler (TU - transformere enheter) i et gitt virus volum. Beregne antall TU per mL.
  5. Titrering virus som inneholder en puromycin reporter
    1. Frø 5 × 104 NIH/3T3 celler i 3 mL DMEM 10% FBS per brønn i en 6-vel plate; ansette 6 brønner titer en virus. Kultur overnatting på 37 ° C.
    2. Neste dag fortynne virus som vist i tabell 2. For å fortynne virus, bruke forvarmes DMEM 10% FBS. Gjør ikke vortex.
    3. Fjerne kultur mediet fra NIH/3T3 celler og legge 1 mL av utvannet virus.
    4. Ruge over natten på 37 ° C.
    5. Forsiktig erstatte virus som inneholder mediet med 2 mL forvarmes DMEM 10% FBS, og ruge over natten på 37 ° C.
    6. Forsiktig erstatte NIH/3T3 medium med 2 mL forvarmes DMEM 10% FBS inneholder puromycin (2 µg/mL).
    7. Kultur på 37 ° C og nøye Oppdater medium med puromycin hver 3 dager eller når mediet blir gul.
    8. På 10-12 dager etter smitte, Sug opp medium fra hver brønn og vaskes forsiktig med PBS.
    9. Flekker med 1 mL crystal violet (0,5% crystal violet i 20% etanol og dH2O), 2 minutter til RT og vaskes forsiktig med PBS to ganger.
    10. Telle blå kolonier i hver brønn under et mikroskop (forstørrelse X4). Ingen kolonier praktiseres i kontrollen negative godt.
    11. Beregne det totale antallet TU/mL vurderer fortynningsfaktoren.

2. ekspansjon og vedlikehold av 32D/G-CSF-R cellene

  1. Hvis 32D/G-CSF-R celler er frosset, ta en aliquot og tine celler i et 37 ° C vannbad for 1 min og hell celler fra ampullen direkte inn 10 mL av forvarmes RPMI 1640 medium med 10% FBS i en 15-mL tube. Inverter røret 3 ganger og Nedspinning cellene på 400 × g. Fjern nedbryting og resuspend celler i IL-3 inneholder kultur medium i en konsentrasjon av 0,3 × 106 celler/mL.
  2. Optimal celle vekst konsentrasjonen er 0,25-0,5 × 106 celler/mL. Del celler hver 2 dager bringe dem til en konsentrasjon av 0.1-0.2 × 106 celler/mL.
    Merk: (Viktig) 32D/G-CSF-R celler kan delvis mister evnen til å skille hvis vokst til konsentrasjoner høyere enn 1 × 106 celler/mL. Derfor er det svært viktig å dele 32D/G-CSF-R celler i tide.
  3. Nødvendig fryse og lagre celle dele for lengre tid på-80 ° C eller i flytende nitrogen. Nedspinning 3 × 106 celler, fjerne nedbryting og resuspend i 1 mL av frysing medium. Sett røret i en fryser beholder på-80 ° C. For langtidslagring, flytte celler til flytende nitrogen.

3. signaltransduksjon 32D/G-CSF-R celler

  1. Platen 32D/G-CSF-R celler inn 6-vel plate i en konsentrasjon av 0,3 × 106 celler/mL.
  2. Legge til riktig mengde virus å nå en MOI (mangfold av infeksjon) mellom 10 og 40.
    Merk: Høyere MOI vil resultere i økt andel av GFP+ celler, i tillegg til høyere nivåer av uttrykket av genet av interesse. Eksempel: Å infisere 0,3 × 106 celler med en MOI 10; 3 × 106 TU må legges til 32D/G-CSF-R cellene.
  3. Legg polybrene til siste konsentrasjon 8 µg/mL og ruge 6 h på 37 ° C. Eventuelt utføre en spin-vaksinasjon prosedyre: sentrifuge 1200 × g for 90 min på 30 ° C i en culturing plate med en swing-bøtte rotor og ruge for 3t på 37 ° C.
  4. Samle celler, overføre til en 15-mL tube og spinne på 450 × g i 5 min (4 ° C).
  5. Forkaste nedbryting, resuspend pelleted celler i 6 mL av kultur medium, sett i en T25 celle kultur kolbe, og kultur på 37 ° C.
  6. 48 timer senere, høste celler og spinne dem 450 × g i 5 min (4 ° C). Kast nedbryting.
  7. Ved en GFP reporter: plassere cellene i 500 µL av PBS og sortere GFP+ celler med flyt cytometri sortering. Ved en puromycin reporter som inneholder vector: plassere cellene i kultur medium med 2 µg/mL av puromycin.
  8. Utvid celler etter behov for videre analyse og eksperimenter.
    Merk: (Valgfritt) Transduced celler kan være frosset i iskaldt medier i en fryser beholder-80 ° c, og ytterligere lagres i flytende nitrogen.

4. 32D/G-CSF-R celle spredning analysen

  1. Å vurdere spredning rate sted 0,2 × 106 celler i 1 mL av kultur medium og ruge over natten på 37 ° C.
  2. Neste dag teller antall celler og fortynne dem tilbake til en konsentrasjon av 0,2 × 106 celler/mL bruker kultur medium. Ruge over natten på 37 ° C. Holde oversikt over cellen konsentrasjoner og fortynninger brukes daglig kulturer bruke tabell 3.
  3. Gjenta trinn 4.2 for så mange dager som spredning må vurderes.
    Merk: Lengden på spredning analyser avhenger på effekten av genet av interesse. Ved en sterk fenotype, kan 8-9 dagene være tilstrekkelig til å observere en betydelig effekt (se figur 3A). Men i en mild fenotype, kan lengre perioder være nødvendig.
  4. Vurdere cellevekst ved å gjøre en spredning kurve som vist i tabell 3.

5. 32D/G-CSF-R celle differensiering analysen

  1. Vask 0,2 × 106 32D/G-CSF-R celler to ganger med RPMI medium uten cytokiner.
    Merk: Punktene vask før addisjon av G-CSF i kulturen er viktig, siden tilstedeværelsen av gjenværende IL-3 kan hemme differensiering.
  2. Plasser celler i 1 mL differensiering medium (som inneholder 100 ng/mL G-CSF) i en 24 godt/plate, noe som resulterer i en celle konsentrasjon av 0,2 × 106 celler/mL (dag 0). Kultur overnatting på 37 ° C.
  3. Teller antall celler/mL som angitt ovenfor (trinn 1.2.1).
  4. Cytospin 2-5 × 104 celler på et glass lysbilde (76 mm X 26 mm) ved hjelp av en sentrifuge med nødvendige adaptere på 20 × g.
  5. Oppdater differensiering medium og plate celler i en konsentrasjon av 0,2 × 105 celler/mL på en 24 godt/plate (dag 1). Forkaste gamle platen og fortsette neste dag med trinn 5.6 med den nye platen.
  6. På dager 2 til 7, gjentar du trinn 5.3 til 5,5. Vurdere celle spredning i nærvær av G-CSF som beskrevet i trinn 4.
    Merk: (Viktig) under differensiering, celle spredning bremser ned, derfor etter 3-4 dager i nærvær av G-CSF er det tilstrekkelig å kultur cellene på høyere konsentrasjoner.
  7. Vurdere differensiering delstaten 32D/G-CSF-R cellene basert på celle morfologi.
    1. Fastsette celler fra trinn 5.4 i metanol i 5 min på RT og la lysbildene air-dry.
      Merk: Lysbilder fra dag 0 til 7 kan være lagret på RT og fast samtidig. På samme måte kan de også holdes på RT for lengre perioder etter fiksering.
    2. Stain celler ved hjelp av mai-Grünwald Giemsa flekker følgende produsentens protokollen.
    3. Visualisere farget celler ved hjelp av et mikroskop og forstørrelse X40.
    4. Kvantifisere eksplosjonene, intermediately differensierte celler og modne granulocytter bruke illustrasjon bilder på figur 1 og beskrivelsen i Tabell 4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Spredning og differensiering av 32D/G-CSF-R celler

For å vurdere spredning av 32D/G-CSF-R celler under pro-proliferativ og Pro differensiering, ble 32D/G-CSF-R celler kultivert i mediet som inneholder IL-3 og G-CSF, henholdsvis. Det ble observert at cellene kultivert i IL-3 inneholder medium (10 ng/mL) deler ca hver 24 h (figur 2A). Ved utskifting av IL-3 med G-CSF (100 ng/mL) spredning gradvis bremset ned og stoppet etter 4 dager (figur 2A). Videre ble differensiering delstaten celler kultivert i nærvær av G-CSF bruke mai-Grünwald Giemsa-farget cytospun celler vurdert. Det ble vist at på dag 0 (før starten av G-CSF behandling), celler presentere en umoden myeloblast-lignende morfologi, preget av en stor kjerne og en mørk cytoplasma (figur 2B). I løpet av behandlingen, reduseres kjernefysiske størrelsen og formen på kjernen endringer i en måne-formet eller bolle-figur. Videre cytoplasma forstørres og mister mørk fiolett farge. Etter 6 dager behandling med G-CSF presentere celler tegn på full neutrophilic differensiering, preget av en lobulated kjerne og en lys fiolett cytoplasma (figur 2B). Differensiering av 32D/G-CSF-R celler er en gradvis prosess, der ikke alle cellene utvikle seg mot eldre nøytrofile med nøyaktig samme hastighet. Kvantifisering av celler på ulike stadier i løpet av differensiering (nemlig blast intermediately differensiert cellen og nøytrofile) vises i figur 2B.

Murine Evi2b knockdown blokkerer neutrophilic differensiering i 32D/G-CSF-R celler

For downregulation av EVI2B (Ecotropic Viral integrering området 2B) i 32D/G-CSF-R celler, 3 Evi2b-målretting (Sh2, Sh3, Sh4) og 1 ikke målretting ikke stanse kontroll (NSC1) shRNAs ble utformet; Dette ble klonet i en lentiviral vektor bærer en GFP reporter16. 32D/G-CSF-R celler var transduced med kontroll og Evi2b-stanse shRNAs bruker en MOI 10. To dager etter transduction, ble GFP+ (transduced) celler sortert, og utvidet for videre studier. I tilfelle av Sh3 og Sh4, nådde EVI2B uttømming 80%, men Sh2 kan ikke effektivt downregulate EVI2B protein nivå, og derfor ble brukt som en ekstra kontroll omtalt her som ikke stanse kontroll 2 (NSC2). Fire dager etter transduction, differensiering og spredning analyser ble utført i nærvær av G-CSF, og effekten av Evi2b downregulation i disse prosessene ble evaluert. Det ble observert at Evi2b-utarmet celler (Sh2, Sh3) vedvarende celle spredning i nærvær av GCSF, mens kontroll cellene (NSC1 og NSC2) redusert spredning rundt dag 4 (figur 3A). Videre, Evi2b-forstummet 32D/G-CSF-R celler produsert mindre middels og modne nøytrofile sammenlignet kontroll celler (figur 3B). Bemerkelsesverdig, viste celler transduced med NSC2, som viste dårlig Evi2b knockdown effektivitet, liten reduksjon i antall eldre nøytrofile (figur 3B). Disse dataene ble nylig publisert16.

BCR-ABL fusion protein svekker neutrophilic differensiering i 32D/G-CSF-R celler

Det har vist at BCR-ABL fusion protein svekker myelogen differensiering, forårsaker en omfattende utvidelse av myelogen progenitors som resulterer i blodkreft svikt i akutte fasen av Kronisk myelogen leukemi25,26. Tidligere studier viste at håndheves uttrykk for BCR-ABL i 32D cl-3 celler resulterte i en blokk med nøytrofile differensiering27,28. Derfor undersøkt vi om lignende resultater kan oppnås med 32D/G-CSF-R cellen linje. 32D/G-CSF-R celler var transduced med BCR-ABL eller kontroll MSCV retroviral vektor bærer en GFP reporter (MOI = 20). 2 dager etter transduction, var GFP+ celler sortert og utvidet i 2 uker i IL-3 inneholder medium. Deretter ble differensiering analyser utført i nærvær av G-CSF. Vi observert på dag 0 (før du overfører cellene til G-CSF inneholder middels) MSCV styre og BCR-ABL uttrykke 32D/G-CSF-R celler presentert lignende morfologi, hovedsakelig representerer umodne myelogen blast celler (Figur 4). Vi viste imidlertid at mens tom vektor transduced kontroll celler ikke igjennom neutrophilic differensiering etter 6 dager for G-CSF behandling (produsere 11.5% av modne nøytrofile og 56,4% av intermediately differensierte celler), modne nøytrofile ble generert fra BCR-ABL-transduced 32D/G-CSF-R celler (Figur 4). Konsekvent, forble prosentandelen av umodne eksplosjon i BCR-ABL uttrykke celler i G-CSF lik andelen eksplosjon i IL-3 forhold.

Figure 1
Figur 1. Representant bilder av forskjellige 32D/G-CSF-R celle morfologi. 32D/G-CSF-R celler kan klassifiseres morphologically som blast, intermediately differensierte celler og modne nøytrofile. Se Tabell 4 beskrivelse.

Figure 2
Figur 2. Spredning og differensiering av 32D/G-CSF-R celler. (A) spredning av 32D/GCSFR celler i 10 ng/mL IL-3 (svart linje) eller 100 ng/mL G-CSF (blå linje) som inneholder mediet. X-aksen representerer dagers behandling. Y-aksen vises i logaritmisk skala (Logg2) og angir antall celler × 105. Resultatene representerer gjennomsnittet av 3 uavhengige eksperimenter. Feilfelt viser standardavviket. (B) differensiering av 32D/G-CSF-R celler i G-CSF-inneholder medium (100 ng/mL). I øvre panelet pie-tomter viser prosentandelen av støt (svart), intermediately differensierte celler (rosa), og nøytrofile (rød) i kultur etter 0, 2, 4 og 6 dager for G-CSF behandling. Nedre panel inneholder representant bilder av cytospun celler fra de respektive tid poeng med mai-Grünwald Giemsa. Minimum 100 celler ble vurdert for hvert punkt.

Figure 3
Figur 3. Evi2b stanse blokkerer neutrophilic differensiering i 32D-G-CSF-R celler. (A) spredning av Evi2b-silenced (oransje linje) og kontroll (svart linje) 32D/G-CSF-R celler i 100 ng/mL G-CSF inneholder medium. X-aksen representerer dagers behandling. Y-aksen vises i logaritmisk skala (Logg2) og angir antall celler × 105. Resultatene viser en representant resultat av 3 uavhengige eksperimenter. (B) vurdering av 32D/G-CSF-R celler transduced med Evi2b-demping og kontroll shRNAs i G-CSF-inneholder medium (100 ng/mL) bruker mai-Grünwald Giemsa farging av cytospun celler. I øvre panel, pai-tomter viser prosentandelen av støt (svart), intermediately differensierte celler (rosa) og nøytrofile (rød) i kultur. Den nedre paneler inneholde representant bilder av cytospun celler. Differensiering ble vurdert på dag 7 av differensiering. Minst 100 celler ble vurdert for hvert vilkår.

Figure 4
Figur 4. Overuttrykte BCR-ABL fusion protein svekker differensiering av 32D/G-CSF-R celler. Vurdering av 32D/G-CSF-R celler transduced enten med MSCV eller BCR-ABL fusion genet i G-CSF-inneholder medium (100 ng/mL). Øvre pie-tomter viser andelen eksplosjonene (svart), intermediately differensierte celler (rosa) og nøytrofile (rød) på dag 6 av differensiering. Den nedre paneler vise representant bilder av cytospun celler med mai-Grünwald Giemsa. Minst 100 celler ble vurdert for hvert punkt.

Virus V [µL] Antall belagt celler % GFP+ GFP+ celletall Lineær? TU/mL Gjennomsnitt (TU/mL)
1 100 000 1.83 1 830 ja 1 830 000 2 350 000
5 100 000 12,9 12 900 ja 2 580 000
10 100 000 26,4 26 400 ja 2 640 000
50 100 000 71.4 71 400 nei
100 100 000 85.1 85 100 nei
500 100 000 85.6 85 600 nei

Tabell 1. Viral titer bestemmelse for GFP reporter som inneholder vektorer. Eksempel på data innhentet med MSCV retrovirus og beregningen utføres for å anslå den viral titer. Viral titer ble beregnet basert på antall GFP+ celler ervervet når viss virus ble brukt. Mengden av virus ansatt for infeksjon bør være i en lineær sammenheng der GFP+ celler målt. TU: transformere enheter.

Rør Rør beskrivelse DMEM + 10% FBS Virus Totalt volum Fortynningsfaktoren
(ΜL) (ΜL) (ΜL)
1 fortynning 1 1485 15 µL viral lager 1500 1 x 102
2 fortynning 2 1350 150 µL tube 1 1500 1 x 103
3 fortynning 3 1350 150 µL rør 2 1500 1 x 104
4 fortynning 4 1350 150 µL tube 3 1500 1 x 105
5 fortynning 5 1350 150 µL tube 4 1500 1 x 106

Tabell 2. Viral titer bestemmelse for puromycin reporter som inneholder vektorer. Viral fortynning strategi å avgjøre det viral titer i puromycin som inneholder vektorer. Tabellen viser deg 5 rør (1-5) som inneholder en føljetong fortynning av viral aksjen. Tuben 1 inneholder 1485 µL DMEM + 10% FBS og 15 µL av produsert viruset, gir en 1 × 102 utvannet virus. Rør 2 inneholder 1350 µL DMEM + 10% FBS og 150 µL av 1 × 102 utvannet virus (Tube 1), gir 1 × 103 utvannet virus. Tuben 3 inneholder 1350 µL DMEM + 10% FBS og 150 µL av 1 × 103 utvannet virus (rør 2), gir 1 × 104 utvannet virus. Tube 4 inneholder 1350 µL DMEM + 10% FBS og 150 µL av 1 × 104 utvannet virus (Tube 3), gir 1 × 105 utvannet virus. Tuben 5 inneholder 1350 µL DMEM + 10% FBS og 150 µL av 1 × 105 utvannet virus (Tube 4), gir 1 × 106 utvannet virus. 1 ml fra rør 1-5 brukes til titer viruset.

Cellen teller (x = antall celler per ml)
dag 0 dag 1 dag 2 dag 3 dag 4 dag 5 dag 6
Eksempel 1 x0 x1 x2 x3 x4 x5 x6
Fortynning (d) (y = antall celler brukes for replating [mL]; z = siste volum [mL])
dag 0 dag 1 dag 2 dag 3 dag 4 dag 5 dag 6
Eksempel 1 d0= 1 d1= y1/z1 d2= y2/z2 d3= y3/z3 d4= y4/z4 d5= y5/z5
Totalt celletall
dag 0 dag 1 dag 2 dag 3 dag 4 dag 5 dag 6
Eksempel 1 x0 x1 /d0 x2/d1 x3/d2/d1 x4/d3/d2/d1 x5/d4/d3/d2/d1 x6/d5/d4/d3/d2/d1

Tabell 3. Vekst kurve generasjon. Tabellen beskriver ligninger nødvendig for vurdering av spredning av 32D/G-CSF-R celler.

Kjernen Cytoplasma
Eksplosjonene Mørke, runde Mørk, nesten utvisket fra kjernen
Intermediately atskilte celler Uttales endringer i kjernefysiske form, ofte bolle-lignende eller månen som formet Lettere, skilles cytoplasma
Eldre nøytrofile Lobulated kjernen; nesten ingen forbindelser mellom lobules former Lys cytoplasma

Tabell 4. 32D/G-CSF-R celle morfologi under neutrophilic differensiering. Tabellen oppsummerer store morfologiske funksjoner som muliggjør æren av umodne eksplosjonene, intermediately differensierte celler og modne nøytrofile. Kjernefysiske og cytoplasmatiske egenskaper er beskrevet. Se figur 1 for representant bilder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Valg av en eksperimentell modell er en av de viktigste spørsmålene i forskning. Om primære dyr og menneskelige celler antas å produsere biologisk relevante data, disse modellene kan innebære Etiske bekymringene og er ofte forbundet med dyr og/eller sofistikert isolasjon/dyrking prosedyrer. Primær celler er begrenset i antall og det er vanskelig å genetisk manipulere dem. I tillegg representerer primære cellene en heterogen befolkning består av ulike celletyper som kan komplisere data tolkning29. Derimot cellelinjer gi en nesten ubegrenset kilde til biologisk materiale, er kostnadseffektive, og tillater for å omkjøringsvei etiske problemstillinger. Det er imidlertid viktig å ta hensyn til cellen linjer anses å være en kunstig eksperimentelle system, hvilke kanskje genetisk og svært forskjellig fra deres vev av opprinnelse. Likevel cellelinjer kombinert med andre eksperimentelle tilnærminger, gi en verdifull modell for generering av reproduserbar og biologisk relevante data.

32D/G-CSF-R celle linje, i tillegg til 32D cl-3 celler, er godt etablert og brukte celle kultur modeller av murine neutrophilic differensiering14,15,24,30. Flere forskningsgrupper har brukt disse cellene til å vurdere rollen til bestemte gener i myelopoiesis, og fikk resultatene som korrelert med data innhentet med i vivo modeller og primære celler16,31. Her gir vi en protokoll for håndtering 32D/G-CSF-R celle linjen, men lignende fremgangsmåter som kan brukes for dyrking og manipulere 32D cl-3 celler. Det er viktig å påpeke at forskjellige bunker 32D cl-3 cellene brukt i ulike laboratorier finnes forskjeller i karyotype, noe som tyder på at ulike grupper kan arbeide med sine egne subclones32. Basert på denne observasjonen, hypothesize vi at genetisk variasjon kan tilsvarende finnes i 32D/G-CSF-R celler, og dette må tas i betraktning når sammenligne resultatene innhentet av forskjellige forskningsgrupper. Alternative celle kultur modellene 32D/G-CSF-R celler er udødeliggjort blodkreft stamfar linjene22,33,34,35,36. Denne tilnærmingen er nyttig når store stamfar ekspansjon kreves, for eksempel for å studere protein interaksjoner22. En fordel å 32D/G-CSF-R celler er at udødeliggjort progenitors kan genereres fra alle genmodifiserte mus, men tid til å etablere linjen er betydelig lang37. I tillegg krever håndtering og manipulering av bein margtransplantasjon udødeliggjort progenitors mer kompetanse enn 32D/G-CSF-R celler.

For å gjøre kjent leseren med 32D/G-CSF-R-modellen, i den første delen av representant resultatene viste vi spredning og differensiering kinetics 32D/G-CSF-R celler i nærvær av IL-3 og G-CSF. Representant bilder demonstrere morfologi av cellene i IL-3 voksende forhold og på ulike tidspunkt av GCSF-indusert differensiering ble presentert. Vi vurdert neutrophilic differensiering av morfologisk analyse, men det har blitt rapportert at 32D cl-3 celledifferensiering kan bestemmes ved flyt cytometric analyse ved hjelp av den CD11b cellen overflaten markør27,31, 38,39. Til vår kunnskap og ekspertise er CD11b ikke upregulated ved neutrophilic differensiering av 32D/G-CSF-R celler. For standardisering, i 32D/G-CSF-R spredning analyser ansatt vi kommersielt tilgjengelig IL-3. Men, observerte vi at sprer celler i hjemmelaget IL-3, produsert som beskrevet av Drobek og kolleger22. For å få en god grad av G-CSF-indusert neutrophilic differensiering, er det viktig å huske at differensiering evne til 32D/G-CSF-R celler kan bli svekket hvis cellene er kultivert over en konsentrasjon av 1 × 106 celler/mL. I tillegg kan den grad og hastigheten av differensiering påvirkes av serum sammensetningen. Det anbefales derfor å teste differensiering evne til 32D/G-CSF-R celler i flere FBS bunker, og velg den som bedre støtter utviklingen av modne nøytrofile på 6 til 9 dager kultur i nærvær av G-CSF.

Vi gitt to representant eksperimenter som viser mulige måter å studere rollen til bestemte proteiner myelogen atskilling (Figur 3 og Figur 4). Først vi viste at downregulation av EVI2B, en transmembrane protein i blodkreft cellene, fører til en blokk med myelogen differensiering i 32D/G-CSF-R celler. Disse dataene ble nylig utgitt av vår gruppe, i kombinasjon med analyser utført ved hjelp av primære celler og Evi2b knockout mus16. Andre undersøkt vi effekten av BCR-ABL, en fusion protein som følge av genetiske translokasjon t(9,22) (SP34, S11), på neutrophilic differensiering av 32D/G-CSF-R celler. Denne translokasjon ble opprinnelig identifisert i pasienter som lider av Kronisk myelogen leukemi40,41. Det ble tidligere vist at uttrykk for BCR-ABL fusion oncoprotein i 32D cl-3 celler fører til en myelogen differensiering arrestasjonen27,28. Her har vi vist at BCR-ABL overuttrykte har liknende effekter på 32D/G-CSF-R celler. I settene eksperimenter presenteres her (med Evi2b downregulation og BCR-ABL overexpression), genetisk modifisering av 32D/G-CSF-R celler ble utført gjennom viral transduction, som resulterer i stabil genuttrykk. Valg av retroviral versus lentiviral levering påvirker ikke spredning eller differensiering av 32D/G-CSF-R celler. Men er lentiviral infeksjon mer effektiv enn retroviral signaltransduksjon på grunn av tilstedeværelsen av endogene retrovirus i 32D/G-CSF-R celler. Vår erfaring er hva til disse cellene ved å bruke standard lipofile reagenser ikke effektiv. Men hvis forbigående konstruere uttrykket er nødvendig, er hva av electroporation en levedyktig tilnærming42,43,44. Her vi presentert genetisk manipulering av 32D/G-CSF-R celler etterfulgt av GFP sortering og bulk analyse av infiserte celler. Men eventuelt kan enkeltcelle sortering brukes til å generere enkeltcelle kloner som tidligere rapportert12,45.

I tillegg til spredning og differensiering analyser, har 32D/G-CSF-R celler vært ansatt å lykkes i å fastslå rollen av visse proteiner i celle migrasjon og apoptose13,46,47,48 . Videre har 32D/G-CSF-R linjen blitt brukt til å bestemme cytokin uavhengig vekst formidlet av oncoproteins19,20. En annen linje brukte å studere cytokin independency er Ba/F3 celler21,49. Ba/F3 er en IL-3 underordnede murine cellen linje avledet fra C3H musen belastning, tilsvarende til 32D/G-CSF-R celler. Selv om begge systemene kan brukes til å studere cytokin uavhengig spredning, skille Ba/F3 cellene dårlig i nærvær av G-CSF.

Helt, foreslår vi at 32D/G-CSF-R celler, men blir lavere prioritet enn primære celler, tilbyr flere fordeler som ubegrenset spredning kapasitet og enkel håndtering. Vi tror at for generering av pålitelige data, bør eksperimenter utført i 32D/G-CSF-R celler suppleres med data ervervet bruke alternative eksperimentelle tilnærminger som murine modeller og primære kulturer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker Prof Ruud Delwel og Prof Ivo Touw for å gi oss med 32D/G-CSF-R cellen linje og Prof Daniel G. Tenen for å gi oss med Bosc23 cellen linje. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd av Grant byrået i Tsjekkia (GACR 15-03796S og GACR 17-02177S) til MA-J, støtte fra Institutt for molekylær genetikk av tsjekkiske Academy of Sciences (RVO 68378050) til MA-J, et GA UK fellesskap (prosjekt nr. 341015) fra Charles University i Praha MK, og et GA UK fellesskap (prosjekt nr. 1278217) fra Charles University i Praha til PD.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 powder medium Merck, Kenilworth, NJ, USA T 121-10 without NaHCO3, with L-glutamine
DMEM Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 15028
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 31985-047 L-Glutamine, Phenol Red
Fetal bovine serum (FBS) PAA Laboratories (GE Healthcare,Chicago, IL, USA) MT35011CV For differentiation of 32D/G-CSF-R cells
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 10270 Used for culturing HEK293T, NIH3T3, BOSC23 cells
Penicillin Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) P3032
Streptomycin Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) S9137 Streptomycin sulfate salt powder
Gentamicin Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) G1914
murine IL-3 PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA 213-13
human G-CSF PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA 300-23
Polyethylenimine Polyscience, Warrington, PA, USA 23966 Linear, MW 25,000 (PEI 25000)
Polybrene Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) H9268
Trypsin VWR Chemicals, Radnor, PA, USA 0458
EDTA Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) E5134
Crystal violet Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) C0775
Trypan blue Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) T6146
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) D2650
May-Grünwald Giemsa DiaPath, Martinengo, BG, Italy 10802

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bonilla, M. A., et al. Effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor on neutropenia in patients with congenital agranulocytosis. N Engl J Med. 320 (24), 1574-1580 (1989).
  2. Bennett, C. L., Djulbegovic, B., Norris, L. B., Armitage, J. O. Colony-stimulating factors for febrile neutropenia during cancer therapy. N Engl J Med. 368 (12), 1131-1139 (2013).
  3. Lowenberg, B., Downing, J. R., Burnett, A. Acute myeloid leukemia. N Engl J Med. 341 (14), 1051-1062 (1999).
  4. Dong, F., et al. Identification of a nonsense mutation in the granulocyte-colony-stimulating factor receptor in severe congenital neutropenia. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (10), 4480-4484 (1994).
  5. Rosenbauer, F., Tenen, D. G. Transcription factors in myeloid development: balancing differentiation with transformation. Nat Rev Immunol. 7 (2), 105-117 (2007).
  6. Kota, J., Caceres, N., Constantinescu, S. N. Aberrant signal transduction pathways in myeloproliferative neoplasms. Leukemia. 22 (10), 1828-1840 (2008).
  7. Kvinlaug, B. T., et al. Common and overlapping oncogenic pathways contribute to the evolution of acute myeloid leukemias. Cancer Res. 71 (12), 4117-4129 (2011).
  8. Krug, U., Ganser, A., Koeffler, H. P. Tumor suppressor genes in normal and malignant hematopoiesis. Oncogene. 21 (21), 3475-3495 (2002).
  9. Greenberger, J. S., Sakakeeny, M. A., Humphries, R. K., Eaves, C. J., Eckner, R. J. Demonstration of permanent factor-dependent multipotential (erythroid/neutrophil/basophil) hematopoietic progenitor cell lines. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (10), 2931-2935 (1983).
  10. Valtieri, M., et al. Cytokine-dependent granulocytic differentiation. Regulation of proliferative and differentiative responses in a murine progenitor cell line. J Immunol. 138 (11), 3829-3835 (1987).
  11. Dong, F., et al. Mutations in the gene for the granulocyte colony-stimulating-factor receptor in patients with acute myeloid leukemia preceded by severe congenital neutropenia. N Engl J Med. 333 (8), 487-493 (1995).
  12. Jorda, M. A., Lowenberg, B., Delwel, R. The peripheral cannabinoid receptor Cb2, a novel oncoprotein, induces a reversible block in neutrophilic differentiation. Blood. 101 (4), 1336-1343 (2003).
  13. Jorda, M. A., et al. Hematopoietic cells expressing the peripheral cannabinoid receptor migrate in response to the endocannabinoid 2-arachidonoylglycerol. Blood. 99 (8), 2786-2793 (2002).
  14. Abbas, S., et al. Integrated genome-wide genotyping and gene expression profiling reveals BCL11B as a putative oncogene in acute myeloid leukemia with 14q32 aberrations. Haematologica. 99 (5), 848-857 (2014).
  15. Zhuang, D., Qiu, Y., Kogan, S. C., Dong, F. Increased CCAAT enhancer-binding protein epsilon (C/EBPepsilon) expression and premature apoptosis in myeloid cells expressing Gfi-1 N382S mutant associated with severe congenital neutropenia. J Biol Chem. 281 (16), 10745-10751 (2006).
  16. Zjablovskaja, P., et al. EVI2B is a C/EBPalpha target gene required for granulocytic differentiation and functionality of hematopoietic progenitors. Cell Death Differ. 24 (4), 705-716 (2017).
  17. Santini, V., et al. The carboxy-terminal region of the granulocyte colony-stimulating factor receptor transduces a phagocytic signal. Blood. 101 (11), 4615-4622 (2003).
  18. Liu, H., Qiu, Y., Xiao, L., Dong, F. Involvement of protein kinase Cepsilon in the negative regulation of Akt activation stimulated by granulocyte colony-stimulating factor. J Immunol. 176 (4), 2407-2413 (2006).
  19. Kelly, L. M., et al. FLT3 internal tandem duplication mutations associated with human acute myeloid leukemias induce myeloproliferative disease in a murine bone marrow transplant model. Blood. 99 (1), 310-318 (2002).
  20. Pikman, Y., et al. MPLW515L is a novel somatic activating mutation in myelofibrosis with myeloid metaplasia. PLoS Med. 3 (7), e270 (2006).
  21. Schwaller, J., et al. Transformation of hematopoietic cell lines to growth-factor independence and induction of a fatal myelo- and lymphoproliferative disease in mice by retrovirally transduced TEL/JAK2 fusion genes. EMBO J. 17 (18), 5321-5333 (1998).
  22. Drobek, A., et al. PSTPIP2, a Protein Associated with Autoinflammatory Disease, Interacts with Inhibitory Enzymes SHIP1 and Csk. J Immunol. 195 (7), 3416-3426 (2015).
  23. Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. J Virol. 70 (8), 5701-5705 (1996).
  24. Alberich-Jorda, M., et al. C/EBPgamma deregulation results in differentiation arrest in acute myeloid leukemia. J Clin Invest. 122 (12), 4490-4504 (2012).
  25. Calabretta, B., Perrotti, D. The biology of CML blast crisis. Blood. 103 (11), 4010-4022 (2004).
  26. Ren, R. Mechanisms of BCR-ABL in the pathogenesis of chronic myelogenous leukaemia. Nat Rev Cancer. 5 (3), 172-183 (2005).
  27. Schuster, C., et al. The effects of Bcr-Abl on C/EBP transcription-factor regulation and neutrophilic differentiation are reversed by the Abl kinase inhibitor imatinib mesylate. Blood. 101 (2), 655-663 (2003).
  28. Chang, J. S., et al. High levels of the BCR/ABL oncoprotein are required for the MAPK-hnRNP-E2 dependent suppression of C/EBPalpha-driven myeloid differentiation. Blood. 110 (3), 994-1003 (2007).
  29. Velten, L., et al. Human haematopoietic stem cell lineage commitment is a continuous process. Nat Cell Biol. 19 (4), 271-281 (2017).
  30. Jorda, M. A., Rayman, N., Valk, P., De Wee, E., Delwel, R. Identification, characterization, and function of a novel oncogene: the peripheral cannabinoid receptor Cb2. Ann N Y Acad Sci. 996, 10-16 (2003).
  31. Wurm, A. A., et al. Disruption of the C/EBPalpha-miR-182 balance impairs granulocytic differentiation. Nat Commun. 8 (1), 46 (2017).
  32. Agliano, A. M., et al. On chromosomal instability: what is the karyotype of your 32D CI3 cell line. Blood. 95 (11), 3636-3637 (2000).
  33. Wang, G. G., et al. Quantitative production of macrophages or neutrophils ex vivo using conditional Hoxb8. Nat Methods. 3 (4), 287-293 (2006).
  34. Houston, I. B., Huang, K. J., Jennings, S. R., DeKoter, R. P. PU.1 immortalizes hematopoietic progenitors in a GM-CSF-dependent manner. Exp Hematol. 35 (3), 374-384 (2007).
  35. Calvo, K. R., Sykes, D. B., Pasillas, M., Kamps, M. P. Hoxa9 immortalizes a granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-dependent promyelocyte capable of biphenotypic differentiation to neutrophils or macrophages, independent of enforced meis expression. Mol Cell Biol. 20 (9), 3274-3285 (2000).
  36. Calvo, K. R., Sykes, D. B., Pasillas, M. P., Kamps, M. P. Nup98-HoxA9 immortalizes myeloid progenitors, enforces expression of Hoxa9, Hoxa7 and Meis1, and alters cytokine-specific responses in a manner similar to that induced by retroviral co-expression of Hoxa9 and Meis1. Oncogene. 21 (27), 4247-4256 (2002).
  37. Fossati-Jimack, L., et al. Phagocytosis is the main CR3-mediated function affected by the lupus-associated variant of CD11b in human myeloid cells. PLoS One. 8 (2), e57082 (2013).
  38. Schwable, J., et al. RGS2 is an important target gene of Flt3-ITD mutations in AML and functions in myeloid differentiation and leukemic transformation. Blood. 105 (5), 2107-2114 (2005).
  39. Worch, J., et al. The serine-threonine kinase MNK1 is post-translationally stabilized by PML-RARalpha and regulates differentiation of hematopoietic cells. Oncogene. 23 (57), 9162-9172 (2004).
  40. Rowley, J. D. Letter: A new consistent chromosomal abnormality in chronic myelogenous leukaemia identified by quinacrine fluorescence and Giemsa staining. Nature. 243 (5405), 290-293 (1973).
  41. Stam, K., et al. Evidence of a new chimeric bcr/c-abl mRNA in patients with chronic myelocytic leukemia and the Philadelphia chromosome. N Engl J Med. 313 (23), 1429-1433 (1985).
  42. Holly, S. P., Larson, M. K., Parise, L. V. The unique N-terminus of R-ras is required for Rac activation and precise regulation of cell migration. Mol Biol Cell. 16 (5), 2458-2469 (2005).
  43. Pierce, J. H., et al. Macrophage-colony-stimulating factor (CSF-1) induces proliferation, chemotaxis, and reversible monocytic differentiation in myeloid progenitor cells transfected with the human c-fms/CSF-1 receptor cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (15), 5613-5617 (1990).
  44. Pierce, J. H., et al. Signal transduction through the EGF receptor transfected in IL-3-dependent hematopoietic cells. Science. 239 (4840), 628-631 (1988).
  45. Oomen, S. P., et al. Somatostatin modulates G-CSF-induced but not interleukin-3-induced proliferative responses in myeloid 32D cells via activation of somatostatin receptor subtype 2. Hematol J. 2 (5), 322-329 (2001).
  46. Oomen, S. P., et al. Somatostatin is a selective chemoattractant for primitive (CD34(+)) hematopoietic progenitor cells. Exp Hematol. 30 (2), 116-125 (2002).
  47. Nogami, A., et al. FLT3-ITD confers resistance to the PI3K/Akt pathway inhibitors by protecting the mTOR/4EBP1/Mcl-1 pathway through STAT5 activation in acute myeloid leukemia. Oncotarget. 6 (11), 9189-9205 (2015).
  48. Rodel, J. E., Link, D. C. Suppression of apoptosis during cytokine deprivation of 32D cells is not sufficient to induce complete granulocytic differentiation. Blood. 87 (3), 858-864 (1996).
  49. Daley, G. Q., Baltimore, D. Transformation of an interleukin 3-dependent hematopoietic cell line by the chronic myelogenous leukemia-specific P210bcr/abl protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 85 (23), 9312-9316 (1988).

Tags

Utviklingspsykologi biologi problemet 132 32D/G-CSF-R celler murine myelogen forløper celler flytende kultur differensiering nøytrofile spredning cytokiner IL-3 G-CSF
Spredning og differensiering av Murine myelogen forløper 32D/G-CSF-R celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zjablovskaja, P., Danek, P.,… More

Zjablovskaja, P., Danek, P., Kardosova, M., Alberich-Jorda, M. Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells. J. Vis. Exp. (132), e57033, doi:10.3791/57033 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter