Summary
우리는 각막 기증자 기질의 고품질 평가를 위한 방법으로 전체 필드 광학 간섭 현미경의 사용을 설명합니다. 이 프로토콜은 건강 또는 질병을 나타내는 특징을 식별하는 데 사용할 수 있으며 기증자 조직의 스크리닝 및 선택, 따라서 각막 성형술의 결과를 개선하는 것을 목표로 합니다.
Abstract
전체 각막 두께의 약 90%를 차지하는 기증자 각막 기질의 질은 심부 전방 층상 및 관통 각막 성형술의 성공을 위한 주요 제한 요인 중 하나일 가능성이 높습니다. 이것은 병든 각막층의 일부 또는 전부를 최근에 사망한 개인에게서 채취한 기증된 조직인 이식편으로 각각 교체하는 수술 절차입니다. 그러나 안구 은행에서 각막 이식편의 기질 품질을 평가하는 수단은 제한적이며 질병 지표의 고해상도 정량적 평가 기능이 부족합니다. 신선하거나 고정된 생체 외 생물학적 조직 샘플의 고해상도 3D 이미징을 허용하는 FF-OCM(Full-Field Optical Coherence Microscopy)은 기증자 각막 평가에 매우 적합한 비침습적 기술입니다. 여기에서는 FF-OCM을 사용하여 각막 간질의 정성 및 정량 분석 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 정상 기증자 각막과 병리학적 각막 버튼에 성공적으로 적용되었으며 거시적 및 미시적 수준 모두에서 건강하고 병리학적인 특징을 식별하는 데 사용할 수 있으므로 각막 성형술의 결과를 손상시킬 수 있는 간질 장애의 감지를 용이하게 합니다. 이식편 품질 관리를 개선함으로써 이 프로토콜은 기증자 조직의 더 나은 선택(및 거부)을 초래하여 이식 실패를 줄일 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.
Introduction
각막 질환은 전 세계적으로 실명의 주요 원인 중 하나입니다1. 일부 질병은 수술로만 치료할 수 있으며, 종종 최근에 사망한 개인에게서 채취한 기증된 조직인 이식편에 의해 병든 각막의 일부(즉, 층상 각막 성형술) 또는 전체(즉, 관통 각막 성형술)를 교체하는 것을 포함합니다. 내피에 영향을 미치지 않는 각막 질환(예: 원추각막, 감염성 각막염 후 기질 흉터, 외상 및 기질 이영양증)의 경우 심부 전방 층상 각막 성형술(DALK)이 현재 선택 수술 기법으로 간주됩니다 2,3,4,5. 이 기술은 이식 거부 반응의 낮은 발생률, 내피 거부의 부재, 낮은 내피 세포 손실 및 유리한 비용 효율성 비율과 관련된 중심 각막 상피 및 간질만을 대체함으로써 수혜자의 각막 내피의 보존을 가능하게 합니다 6,7,8,9,10,11 . DALK는 또한 최적의 내피 품질이 낮은 각막을 이식편으로 사용할 수 있도록 하는데, 이는 이 손상된 층이 이식되지 않기 때문이다12. 반대로, 기증자 각막 간질의 질은 간질이 남아 있는 유일한 기증자 각막층인 반면 기증자 상피는 수혜자 상피로 대체되기 때문에 이식 성공 및 시력 회복의 주요 제한 요인이 될 수 있습니다. 불행히도 안구 은행에서 기증자 각막 기질을 평가하는 수단은 제한적입니다. 여기에는 일반적으로 적출술에 의한 조직 회수 시 기증자 안구의 세극등 검사와 기증자 기질의 광학 현미경 검사가 포함된다13. 일부 안구 은행은 푸리에 영역 광간섭 단층촬영(FD-OCT)을 사용하여 이러한 표준 절차를 보완하기 시작했습니다14.
초음파 영상(15)에 대한 광학 아날로그인 안과 광간섭 단층촬영(OCT)은 광대역 또는 조정 가능한 광의 간섭을 사용하여 망막(16 ) 및 전안분(17)의 광학 섹션을 생성한다. 초기 임상 시스템의 기초인 시간 영역 OCT에서는 참조 미러의 위치가 변경되어 참조 빔이 다양한 조직 계면에서 반사된 빔과 거의 동일한 시간을 이동할 때마다 간섭 패턴이 나타나고 A-스캔은 시간의 함수로 생성됩니다. 대부분의 현대 임상 시스템의 기초가 되는 FD-OCT(스펙트럼 또는 주파수 영역 OCT라고도 함)에서는 참조 미러가 한 위치에 고정되고 모든 간섭 패턴이 혼합된 개별 A-스캔이 한 번에 획득되고 푸리에 분석을 통해 해부됩니다.
임상(시간 또는 스펙트럼 영역) OCT 시스템은 각막의 단면도를 허용하고 세극등 생체현미경보다 더 높은 축 분해능에서 기질 혼탁을 감지할 수 있지만 측면 분해능은 제한적입니다. 공초점 현미경(18 )은 조직학적 세부사항에 접근하는 측면 해상도에서 각막의 검사를 허용하지만, 축으로 제한된다.
전장 광간섭 단층 촬영 현미경(FF-OCT 또는 FF-OCM)19,20은 컨포칼 현미경과 OCT의 요소를 결합하여 약 1μm의 축 분해능에 필적하는 측면 분해능을 달성합니다. 보다 구체적으로, FF-OCM은 비간섭성 광대역 광원(예: 할로겐 램프)과 높은 개구 광학을 사용하여 측면 스캐닝 없이 얼굴 2D 단층 촬영 이미지를 획득합니다. 깊이 방향으로 스캔함으로써 FF-OCM은 신선하거나 고정된 생체 외 생물학적 조직 샘플의 비침습적 3D 이미징을 가능하게 합니다. 각막21,22,23을 이미지화하는 데 사용되었습니다. 고해상도 en 얼굴 및 단면도를 모두 제공함으로써 FF-OCM은 각막의 조직학적 구조와 세포 세부 사항에 대한 정보를 제공합니다. 사실, FF-OCM은 조직학보다 우수한 구조 정보를 제공하는 것으로 나타났으며 스펙트럼 도메인 OCT와 공초점 현미경의 조합으로 가능한 한 더 많은 질병 지표를 식별할 수 있었습니다24,25.
여기에서는 FF-OCM을 사용하여 각막 기증자 기질의 정성적 및 정량적 평가를 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 세 가지 정량적 기질 매개변수(즉, Bowman의 층 두께 및 가변성, 기질 반사율)를 포함하여 기질 상태를 나타내는 거시적 및 현미경적 특징의 조직학과 유사한 분석을 기반으로 합니다. 따라서 설명된 프로토콜은 정상 및 비정상 각막 조직에 적용되며 병에 걸린 인간 각막 조직과 정상 인간 각막 조직의 분화를 허용합니다.
Protocol
여기에 설명 된 모든 방법은 헬싱키 선언의 교리에 따라 수행되었으며 인체 조직에 대한 국제 윤리 요구 사항을 따랐습니다. 이것은 전향적 관찰 사례 대조 연구였습니다. 환자로부터 정보에 입각한 동의를 얻었습니다. 프랑스의 치료 또는 후속 조치에 대한 수정은 이루어지지 않았다. IRB(Institutional Review Board) 승인은 Ile-de-France V (14944)의 환자 보호 위원회로부터 얻었다.
1. 조직 선택 및 준비
- 기증자 각막을 선택하십시오.
- FF-OCM 이미징28 전에 퇴출(27)을 허용하기 위해 장기 배양 배지(26)에 저장된 기증자 각막을 덱스트란이 보충된 장기 배양 배지로 3일 동안 옮깁니다(재료 표 참조).
- 샘플을 준비합니다.
- 저장 매체에 담근 각막을 상피가 위를 향하도록 샘플 홀더에 놓습니다.
- 깨끗한 실리카 커버슬립(샘플 홀더와 함께 제공됨)을 각막 위에 놓고 샘플이 약간 평평해지고 커버슬립 아래에 고정되어 비교적 균일한 이미징 표면을 제공할 때까지 베이스를 부드럽게 돌려 홀더를 닫습니다. 기포가 발생하지 않도록 주의하십시오.
- 침지 매체로 커버슬립에 안과용 또는 광학 젤을 두껍게 바릅니다.
2. FF-OCM 초기화, 설정 및 이미지 획득
- 장치를 초기화합니다.
- 장치 뒷면의 전원 스위치를 조작하여 장치를 켭니다. 장치 전면에 녹색 LED가 켜지면 전원이 켜져 있음을 나타냅니다.
- 전면의 전원 스위치를 조작하여 전용 컴퓨터와 할로겐 광원을 켭니다.
- 바탕 화면 바로 가기를 두 번 클릭하여 수집 소프트웨어( 재료 표 참조)를 시작합니다.
- 이미징 단계가 이동식 트레이를 제외하고 깨끗한지 확인하십시오. 그런 다음 "확인"을 클릭하여 프롬프트에서 모터를 초기화합니다.
- 트레이를 당겨 빼내고 샘플 홀더를 전용 용기에 넣은 다음 트레이를 부드럽게 뒤로 밉니다.
- 장치를 설정합니다.
- 지정 및 필수 필드에 "샘플 식별자"를 입력합니다. 선택적으로 "샘플 설명" 및/또는 "연구 설명"을 입력합니다.
- 준비가 되면 "Acquire macro image"를 클릭하여 나중에 측면 위치 지정 및 탐색 목적으로 사용할 수 있는 샘플의 스냅샷을 만듭니다. 만족스러우면 프롬프트에서 "예"를 클릭하여 이미지를 검증한 후 장치가 대물렌즈 아래의 샘플 트레이를 이동하고 자동 조정을 수행합니다.
- 계속 진행하기 전에 현미경 대물렌즈가 광학 젤에 잘 잠겨 있는지 확인하십시오.
- 스택을 획득합니다.
- "탐색" 탭을 선택하여 인수를 준비합니다.
- 이미지 스택을 획득하기 전에 조이스틱의 번역 또는 화면의 수동 선택을 통해 각막 중앙으로 이동하십시오 (즉, 획득 한 매크로 이미지의 빨간색 사각형을 클릭하여 원하는 위치로 드래그).
- 조이스틱 회전, 슬라이더 조정 또는 그래픽 사용자 인터페이스(GUI)의 수동 키보드 입력을 통해 이미징 깊이를 변경하고 평균값을 조정합니다(최적의 각막 이미징을 위해 일반적으로 평균 40이 권장됨).
참고: 이것은 각막 샘플의 두께와 첫 번째 및 마지막 이미지 위치를 깊이 기록하면서 전체 각막 두께를 이미지화하는 데 필요한 평균을 결정하기 위해 수행됩니다. 커버슬립의 바닥면은 단층 촬영 이미지(GUI의 오른쪽)에서 볼 수 있는 평행 간섭 무늬를 생성하여 각막 표면을 쉽게 찾을 수 있습니다. - 각막 표면 값 또는 첫 번째 이미지 위치를 "깊이" 필드에 깊이 입력합니다.
- "획득 탭"을 선택하여 이미지를 획득합니다.
- "슬라이스 간격"(기본 및 권장 설정은 장치의 축 해상도와 일치하는 1μm)을 선택하고 "슬라이스 수" 아래에 그에 따라 각막 두께 값을 입력합니다.
- 매개변수 및 획득 시간을 검토하고 만족스러우면 "확인"을 눌러 획득을 시작합니다.
- 획득하는 동안 FF-OCM이 배치된 테이블과의 접촉을 피하십시오.
- "탐색" 탭을 선택하여 인수를 준비합니다.
3. 취득한 이미지의 관리
- 이미지를 보고 내보냅니다.
- FF-OCM을 실행합니다. view바탕 화면 바로 가기를 두 번 클릭하여 소프트웨어( 재료 표 참조)를 클릭합니다. 획득한 이미지(샘플 ID로 식별됨)는 "지역 연구" 목록에 나타납니다.
- 매크로 이미지와 획득한 이미지 스택을 모두 포함하는 해당 샘플 ID가 있는 스터디를 선택하고, 일련의 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 추가 분석을 위해 원시 픽셀 데이터와 메타데이터를 유지하기 위해 "DICOM" 형식을 선택하여 후자를 "내보내기"합니다.
- 일련의 이미지를 두 번 클릭하여 MPR(Multiplanar Reconstruction) 모드를 사용하여 3D 이미지 스택을 en 얼굴 및 단면 보기로 표시합니다. 이미지를 탐색하고(예: 마우스 휠 스크롤 또는 슬라이더 조정을 통해) 각 스택의 대표 en 면 및 단면 보기를 선택합니다.
- "DICOM" 형식을 사용하여 창의 오른쪽 하단에 있는 아이콘을 클릭하여 선택한 보기를 내보냅니다.
- 이미지를 가져옵니다.
- 바탕 화면 바로 가기를 두 번 클릭하여 이미지 처리 소프트웨어( 재료 표 참조)를 열고 "플러그인" 아래의 "Bio-Formats" "Importer"로 이동하여 DICOM 이미지를 가져옵니다. "Bio-Formats 가져오기 옵션" 창에서 "이름이 유사한 파일 그룹"이 선택되어 있는지 확인합니다.
4. 이미지 분석: 기질 형태 및 특징의 정성적 및 정량적 평가
- 기질 및 Bowman의 층 두께를 평가합니다.
- 각막 단면에서 수동으로 거리를 측정합니다(예: 단면25)에 걸쳐 동일한 간격의 5개 지점에서 측정합니다.
- 알려진 거리의 두 지점 사이에 선을 그리고(예: 전체 이미지의 왼쪽에서 오른쪽으로, 즉 기본 시야, 1,024픽셀 또는 780μm에 따름) "분석"으로 이동하여 "배율 설정"을 선택하고 해당 필드에 "알려진 거리" 및 "길이 단위"를 입력하고 "확인"을 클릭합니다.
- 거리를 알 수 없는 두 점 사이에 선을 그립니다. 상태 표시줄에서 직접 측정된 길이 또는 거리를 읽습니다.
- 평균과 변동 계수(COV)를 기록합니다. Bowman의 층 두께가 6.5μm 미만이고 COV가 18.6% 이상인 것은 비정상적인 각막 기질과 관련이 있습니다25.
- 각막 단면에서 수동으로 거리를 측정합니다(예: 단면25)에 걸쳐 동일한 간격의 5개 지점에서 측정합니다.
- 각질 세포 밀도를 결정하십시오.
- 컨포칼 현미경의 규칙에 따라: 7개의 그룹으로 얼굴 이미지를 합산하여 비슷한 두께의 슬라이스를 생성합니다. 이를 위해 "이미지" 탭으로 이동하여 "스택"에서 "Z 다시 슬라이스"를 선택합니다.
- 간질24,25를 통한 진행에 따라 상이한(감소하는) 세포 밀도를 고려하십시오. 이를 위해, 간질은 깊이에 따라 4개의 영역으로 구성되는 것으로 간주될 수 있다: (1) Bowman's layer 아래의 매우 전방 간질, 즉 전체 간질 두께의 2%; 동일한 두께의 세 영역: (2) 전방 간질, (3) 중간 간질 및 (4) 후방 간질의 세 영역을 갖는 나머지 간질(즉, 전체 기질 두께의 98%).
- 추가 분석을 위해 극전방 기질에 대해 사용 가능한 모든 안면 슬라이스, 전방 기질에 대한 15개 이미지, 중간 기질에 대한 5개 이미지 및 후방 기질에 대한 5개 이미지를 포함합니다(여기서 신뢰할 수 있는 카운트에 필요한 영역당 이미지 수는 단계적 분석29에 의해 결정됨).
- 각 얼굴 이미지에서 300μm x 300μm의 관심 영역을 선택합니다. 핵 시각화를 향상시키려면 "편집" 탭에서 "반전"을 사용하여 이미지를 반전하고 대비와 밝기를 조정합니다. 후자의 경우 "Image"로 이동하여 "Analyze"에서 "Brightness/Contrast"로 이동합니다.
- 예를 들어 "세포 계수기" 기능25를 사용하여 수동으로 세포핵을 계수합니다. 이를 위해 "플러그인"으로 이동하여 "분석"에서 "셀 카운터"로 이동합니다. "초기화"를 누른 다음 카운터 유형을 선택합니다. 그런 다음 반전된 이미지에서 어두운 타원형 특징을 클릭하여 세포핵을 계수하기 시작하고, 이미지(25)의 4면 중 2개에 대해서만 이미지 테두리에 착륙하는 것을 고려합니다.
- 원추세포 밀도가 건강한 피험자보다 환자(예: 원추각막이 있는 경우)에서 더 낮고 질병 중증도와 상관관계가 있는 것으로 나타났던 공초점 현미경 규칙에 따라 면적 밀도, 즉 cells/mm²(셀 수를 0.09로 나누어 cells/90,000 μm²에서 cells/mm²로 변환)로 세포 밀도를기록합니다.
참고: 이식 후 완벽하게 투명한 각막 이식편을 얻기 위해 각질세포 밀도의 최소 임계값이 필요한지 여부를 결정하기 위해서는 추가 임상 연구가 필요합니다.
- 기질 반사율을 평가합니다.
- 예를 들어 "Z축 프로파일" 기능 및/또는 사용자 정의 소프트웨어25,30,31을 사용하여 스트로마 이미지 스택의 평균 강도 깊이 프로파일을 생성합니다.
참고: FF-OCM은 샘플의 강도가 아닌 샘플에 의해 후방 산란되는 빛의 진폭을 측정하기 때문에 실제로 진폭 깊이 프로파일입니다.- 각 면 스택에 대한 평균 회색 수준을 계산합니다.
- 최소 회색 값을 빼고 최대 회색 값으로 정규화합니다.
- 스트로마 깊이(스트로마 두께의 %)의 함수로 로그 스케일로 표시합니다.
- 선형 회귀선으로 결과 로그 프로파일을 근사하면 잔차의 제곱합(최소제곱 피팅)이 최소화됩니다.
- R-제곱 값(R²)을 선형성의 측도로 기록합니다. 0.94 미만의 값은 각막 병리를 나타내는 것일 수있다 25.
참고: 병리의 존재로 인한 선형 로그 회귀 모델(또는 모노-지수 붕괴 모델)의 부적절성을 단순한 측정 노이즈와 구별하기 위해, 베이지안 추론에 의한 신호 분석이 수행될 수 있다31. 또한, 선형 로그(또는 모노-지수) 기질 깊이 프로파일(예를 들어, R-제곱값(30) 또는 1에 가까운 버지 비(31)으로 표시됨)을 갖는 각막에서, 신호 감쇠 속도로부터 광자 평균-없는 경로의 계산은 투명도(31)의 정도를 추가로 정량화하기 위해 사용될 수 있다.
- 예를 들어 "Z축 프로파일" 기능 및/또는 사용자 정의 소프트웨어25,30,31을 사용하여 스트로마 이미지 스택의 평균 강도 깊이 프로파일을 생성합니다.
- 다른 기질 특징 및 질병 지표의 가시성을 평가합니다.
- 흉터, 섬유 조직, 호수 또는 Vogt 줄무늬가 있는지 확인하십시오.
- 측정을 위해 충분히 보이는 경우 간질의 신경의 평균 두께를 평가한다24.
- 하나를 선택하십시오 en 간 질 신경이 가장 잘 보이는 얼굴 이미지(일반적으로 중간 기질 영역).
- 예를 들어 5 점24에서 신경의 두께를 측정 한 다음 평균과 표준 편차를 계산하십시오. 9 μm 이상의 신경 두께는 원추 각막과 같은 병리에 대한 추가 지표가 될 수 있습니다24.
Representative Results
이 원고에 사용된 FF-OCM 장치(재료 표 참조)28 및 일반 설정은 그림 1에 나와 있습니다. 도 2는 기관 배양 배지에 보관한 후 팽윤된 인간 기증자 각막을 보여주며, 부종성 각막의 병태생리학적 모델을 제공하고 제한된 침투 깊이로 인해 전체 각막 두께를 통한 FF-OCM 이미지 획득을 방지한다. 덱스트란이 보충된 장기 배양 배지로 옮기면 부종이 줄어들고 그림 3과 같이 정상 두께의 기증자 각막이 생성됩니다. 병든 각막은 기질의 감소하고 가변적인 두께(그림 4) 및/또는 Bowman's layer(그림 5)를 포함하여 형태학적 변화와 전형적인 기질 특징으로 인식할 수 있습니다. 각질세포 밀도(그림 6) 및 기질 반사율(그림 7)의 평가는 임상 OCT 시스템의 기능을 넘어 FF-OCM을 사용하여 조직학과 유사한 분석 및 병리학적 각막 조직과 정상의 분화에 추가로 도움이 될 수 있습니다(그림 8).
그림 1: 이 작업에 사용된 일반 설정 및 FF-OCM 장치의 개략도 및 사진. (A) FF-OCM 장치의 사진( 재료 표 참조)28. (B) 장치의 개략도 및 광학 설정. (C) 샘플 홀더에 있는 인간 기증자 각막의 사진. (D) 침지 대물렌즈와 샘플 홀더를 확대합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 퇴기 전의 장기 배양된 정상 인간 각막. 장기 배양 배지에 보관하여 발생하는 부풀어 오른("부종성") 각막의 단면(A) 및 en 얼굴 보기(B, 간질을 통한 슬라이스), 호수는 어두운 영역(화살표로 표시됨)으로 볼 수 있습니다. 각막 두께가 1,100μm 이상으로 두 배 증가하여 전체 깊이에서 이미지 획득을 방해합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 퇴화 후 장기 배양된 정상 인간 각막. 전체 각막을 통한 단면도(A) 및 덱스트란 보충 배지에 담근 부풀어 오른 각막의 얼굴 기질 보기(B)는 규칙적으로 분포된 과반사(흰색) 각질 세포를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 기질 두께를 포함한 기질 형태 및 특징의 전반적인 평가. 정상적인 인간 각막(A)과 비교하여 원추각막이 있는 각막(B)은 단면도에서 어두운 수직 띠로 관찰할 수 있는 수많은 평행한 Vogt 줄무늬와 함께 감소하고 다양한 기질 두께를 특징으로 하며, 중간 기질 en 얼굴 조각(C). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 전방으로는 과반사 상피 기저막에 의해 묘사되고 후방으로는 초반사 간질의 과반사 각질세포에 의해 묘사되는 Bowman의 층 두께 평가. 정상적인 인간 각막(A)과 비교하여 병리학적 각막(예: 원추각막)(B)은 중단 및 흉터로 인해 Bowman's layer 두께가 감소하고 가변적인 특징이 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 각질세포 밀도 평가. (A) 각세포 핵은 300μm x 300μm 관심 영역을 선택한 후 강화 및 반전된 얼굴 이미지에서 수동으로 계산됩니다. (B) 계수된 핵은 화살표로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 기질 반사율 평가. 후방 산란광의 양은 정상 기증자 각막의 간질 깊이에 따라 (기하 급수적으로) 감소하여 (그림 3 및 그림 4A 참조) 1에 가까운 R- 제곱 값 (녹색 트레이스)으로 표시되는 선형 로그 깊이 프로파일이 생성됩니다. 이것은 증가된 광 후방 산란의 기질 영역을 특징으로 하는 병리학적 각막에는 해당되지 않을 수 있습니다( 그림 4B 참조). 감염성 각막염 후 기질 흉터가 있는 각막의 예에서와 같이 이러한 거시적 특징의 존재(삽입에 묘사됨)는 특정 임계값 미만의 R-제곱 값으로 표시되는 비선형 로그 강도 깊이 프로파일을 생성합니다(예: 0.94미만 25; 빨간색 추적). 로그 진폭 깊이 프로파일은 실제로 FF-OCM이 샘플의 강도가 아닌 샘플에 의해 후방 산란되는 빛의 진폭을 측정하기 때문에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 조직학 및 스펙트럼 도메인 OCT에 대한 FF-OCM의 이점 입증. (A) 조직학 및 (B) 각막 성형술 전에 생체 내에서 동일한 각막에서 획득한 해당 스펙트럼 도메인-OCT 이미지. (C) 각막 성형술 후 생체 외 각막 버튼의 해당 FF-OCM 단면으로, 임상 스펙트럼 도메인 OCT 이미지와 비교하여 우수한 해상도를 보여줍니다. 섬유증은 또한 조직학보다 FF-OCM 이미지에서 더 명확하게 볼 수 있습니다. 상부 간질의 각질 세포의 고밀도는 (C) 단면도와 (D) 안면 모두에서 명확하게 볼 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
FF-OCM을 사용한 각막 기증자 기질의 정성적 및 정량적 평가를 위해 여기에 설명된 프로토콜은 스펙트럼 영역 OCT 및 공초점 현미경21,24,25의 기능을 넘어 기질 상태를 나타내는 거시적 및 현미경적 특징의 조직학과 유사한 분석을 기반으로 하며 질병에 걸린 사람을 정상 인간 조직과 구별할 수 있습니다.
정반사 현미경을 통한 인간 기증자 각막의 우수한 내피 품질 평가 외에도 안구 은행에서 기질 품질 평가는 어려운 일이며 일반적으로 현재 프로토콜에서 세극등 생체현미경 및/또는 광학 현미경을 사용한 전체 관찰로 제한됩니다. 기존 방법으로는 미세한 해상도가 없다는 것은 각막 성형술의 결과를 손상시키는 일부 기질 질환이 있는 각막이 선택될 수 있다는 것을 의미할 뿐만 아니라, 전방 기질 또는 상피 부위에 실제로 제약이 되는 기질 혼탁으로 인해 각막이 거부될 수 있으며 내피 각막 성형술에 여전히 사용될 수 있음을 의미한다14.
현재의 안구 은행 프로토콜은 FF-OCM의 추가로 보완될 수 있으며, 이는 우수한 해상도로 인해 각막, 특히 간질(Bowman's layer 포함)의 품질 평가를 완료하는 강력하고 비침습적인 도구를 구성합니다. 세극등 검사와 달리 이식편은 FF-OCM 이미지 획득 전반에 걸쳐 저장 매체로 채워진 밀폐된 챔버에 잠겨 있어 잠재적인 오염 위험을 줄입니다.
FF-OCM을 사용한 성공적인 이미지 획득( 재료 표 참조)을 위해서는 현미경 대물렌즈가 샘플 홀더의 커버슬립 위에 도포된 광학 젤에 잘 잠겨 있어야 합니다(2.2.3단계). 또한 장치의 교정을 정기적으로 점검하는 것이 좋으며, 자동 조정에 실패한 후(2.2.2단계) 수집 소프트웨어의 "도구 및 옵션"을 통해 액세스할 수 있는 절차입니다( 재료 표 참조). 샘플 홀더에 교정 미러를 사용하는 절차는 커버슬립을 배치하기 전에 광학 젤을 미러에 도포해야 한다는 점을 제외하면 일반적인 샘플 준비(1.2단계 참조)와 동일합니다.
기존 안구 은행 절차에 따라 정상 간질을 갖는 것으로 간주되는 일련의 기증자 각막 이식편을 사용하여 이 원고의 프로토콜을 설명하고 기증자 기질 품질의 정확하고 신뢰할 수 있는 평가를 위한 FF-OCM의 적합성을 구체적으로 입증했습니다. 이러한 정상 기증자 각막은 저장 배지에 담근 병리학적 각막과 비교되었으며, 이는 각막 이식편에서 여러 기질 특징(그림 2, 그림 3, 그림 4, 그림 5, 그림 6, 그림 7 및 그림 8)의 FF-OCM으로 조직학적 유사 분석이 가능함을 보여줍니다.
흉터(그림 5 및 그림 7), 섬유성 조직(그림 8), 호수(그림 2), Vogt striae(그림 4) 또는 증가된 기질 신경 직경(그림 4)의 존재와 같은 형태학적 변화를 제외하고, 병든 각막에는 전형적인 기질 특징이 존재합니다. 기질 품질 평가와 특히 관련된 기질 매개변수는 Bowman의 층 두께와 그 가변성, 기질 반사율인 것으로 보입니다. 따라서 프로토콜 내의 중요한 단계는 4.1 및 4.3 단계입니다.
인간의 각막 발달 중에 분비되는 반면, 특히 Bowman의 층은 임신 19 주까지 뚜렷 해지고 출생 후에는 결코 회복되지 않습니다32. 따라서 Bowman 층의 손상은 돌이킬 수 없으며 굴절 수술, 감염성 각막염, 원추 각막으로 인한 손상을 포함하여 기증자 각막 조직의 이전 간질 손상의 이상적인 지표 역할을 합니다. 기증자 각막 사용에 대한 금기 사항을 구성하는 이러한 각막 질환은 중단 및 흉터로 인한 Bowman's layer 두께 감소 및 가변적인 것과 관련이 있으며(그림 5), 기증자 이력이 정확히 알려지지 않은 경우 현재 안구 은행 프로토콜에서 놓칠 가능성이 있습니다.
사후 각막 부종으로 인해 기증자 사망 후 각막 투명도가 손상되지만, 후방 산란광의 양 또는 기질 반사율은 기질의 깊이에 따라 기하급수적으로 감소할 것으로 예상됩니다(그림 3 및 그림 4A 참조). 결과적으로, 정규화된 기질 반사율의 로그는 1에 가까운 R-제곱 값으로 표시되는 정상 기증자 각막의 기질 깊이의 선형 함수가 될 것입니다. 반대로, 거시적 특징의 존재는 비선형 로그 깊이 프로파일과 관련이 있으며 기질 질환을 나타냅니다(그림 4B 및 그림 7)25.
각질세포 밀도는 기질 콜라겐 원섬유와 세포외 기질 합성 및 재생을 담당하기 때문에 각질세포 밀도가 기증자 기질 품질을 평가하기 위한 또 다른 관련 매개변수이며 매우 낮은 각질세포 수를 나타내는 조직은 이식해서는 안 된다고 가정하는 것이 합리적으로 보입니다. 따라서 이 프로토콜은 안구 은행(25)에서 쉽게 사용할 수 있는 FF-OCM 이미지로부터 각질세포 밀도를 측정하는 정확하고 신뢰할 수 있는 방법을 포함하며 공초점 현미경의 관례를 따릅니다. FF-OCM을 이용하여, 각질세포 밀도는 또한 단면도(33)에서 직접 각질세포를 계수함으로써 결정될 수 있으며, 이는 다수의 en 면 슬라이스 상에서 각질세포를 계수해야 하는 공초점 현미경에 비해 잠재적인 이점이다. 그러나, 각질세포 밀도가 정상 대조군 34,35,36,37에서보다 질환 환자에서 더 낮고 질환 중 증도(34,38)와 상관관계가 있는 것으로 입증된 살아있는 환자와 달리, 이는 인간 생체외 조직 샘플(25)에서는 그렇지 않았다 , 이식 후 좋은 시력 회복을 위해 기증자 각막에 최소한의 각질 세포가 필요한지 여부를 결정하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다. 병리학적 조직에서와 같이 기증자 조직의 낮은 각질세포 밀도는 노화, 허혈에 의해 유도된 세포의 사후 손실 및/또는 기증자 조직의 저장으로 설명될 수 있습니다 27,39,40,41. 또한 이 프로토콜에서 획득하고 이미지화한 정상적인 기증자 각막은 저장되고 부종성이거나 부종이 제거되었거나 EU 안구 은행 협회의 표준에 따라 내피 품질이 좋지 않아 이식 전에 안구 은행에 의해 폐기되었다는 점도 지적해야 합니다. 설명된 프로토콜과 함께 FF-OCM 이미징이 안구 은행 설정에 포함된다면 각막은 일반적으로 여기에서 가능한 것보다 더 신선한 상태로 평가될 것이며, 이는 각질세포 밀도에 영향을 미칠 수 있습니다.
기질 품질 분석을 위해 여기에 설명된 프로토콜은 Descemet의 멤브레인 평가를 위해 확장될 수 있으며, 이는 두께 및 구조 측면에서 FF-OCM으로도 해결할 수 있습니다(21,24). 이것은 얇은 Descemet의 막이 간질에서 분리하기가 더 어려울 수 있는 Descemet의 막 내피 각막 성형술을 위한 조직 선택에 유용할 수 있습니다.
결론적으로, FF-OCM은 보관 중 인간 기증자 각막 기질의 정확하고 신뢰할 수 있는 평가를 가능하게 합니다. 이식편의 품질을 개선함으로써 현재 안구 은행 절차에 이 프로토콜을 추가하면 기증자 조직의 선별 및 선택과 각막 성형술의 결과를 개선할 수 있는 잠재력이 있습니다. FF-OCM 장치를 안구 은행 루틴에 실제로 통합하는 것은 맞춤형 CMOS 카메라의 개발로 인한 더 빠른 이미지 획득 및 더 넓은 시야, 이미징 중 각막 보관 및 취급을 위한 맞춤형 멸균 일회용 카세트 설계를 포함한 최근 기술 업데이트를 통해 촉진되어야 합니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 PRTS(Projet de Recherche Translationelle en Santé) 보조금 No ANR-13-PRTS-0009(VB)에 따라 ANR(Agence Nationale de Recherche)과 Marie Skłodowska-Curie 보조금 계약 No 709104(K.I.)에 따라 유럽 연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램으로부터 자금을 받았습니다. 저자는 세포 계수 및 조직 학적 처리에 도움을 준 Céline de Sousa에게 감사를 표합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Light-CT Scanner | LLTech, France | http://www.lltechimaging.com/products-applications/products/ | FF-OCM device used in this manuscript for imaging |
| CorneaJet | EuroBio, France | http://www.eurobio-cornea.com/en/corneamax-10-100-ml-xml-352-822.html | Organ culture medium in which donor corneas are stored |
| CorneaMax | EuroBio, France | http://www.eurobio-cornea.com/en/corneajet-10-50-ml-xml-352-823.html | Dextran-supplemented organ culture medium used for deturgescence |
| Fiji (ImageJ) | National Institute of Health, Bethesda, MD, USA | https://fiji.sc/ | Open source image processing software |
| Matlab | Mathworks, Inc., Natick, MA, USA | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | Mathematical computing software |
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