Summary
Vi beskriver anvendelse af fuldfelts optisk kohærensmikroskopi som en metode til vurdering af høj kvalitet af hornhindedonorstroma. Denne protokol kan bruges til at identificere træk, der tyder på sundhed eller sygdom, og har til formål at forbedre screening og udvælgelse af donorvæv og dermed resultaterne af keratoplastik.
Abstract
Kvaliteten af donorhornhindestroma, som udgør ca. 90 % af den samlede hornhindetykkelse, er sandsynligvis en af de vigtigste, hvis ikke den vigtigste, begrænsende faktor (er) for succes med dyb anterior lamellær og gennemtrængende keratoplastik. Disse er kirurgiske procedurer, der involverer udskiftning af henholdsvis en del af eller alle de syge hornhindelaget med doneret væv, transplantatet, taget fra en nyligt afdød person. Midlerne til at evaluere stromalkvaliteten af hornhindetransplantater i øjenbanker er imidlertid begrænsede og mangler evnen til kvantitativ vurdering af sygdomsindikatorer i høj opløsning. Full-field optical coherence microscopy (FF-OCM), der muliggør 3D-billeddannelse i høj opløsning af friske eller faste ex vivo biologiske vævsprøver, er en ikke-invasiv teknik, der er velegnet til vurdering af donorhornhinden. Her beskriver vi en metode til kvalitativ og kvantitativ analyse af hornhindestroma ved anvendelse af FF-OCM. Protokollen er med succes blevet anvendt på normale donorhornhinder og patologiske hornhindeknapper og kan bruges til at identificere sunde og patologiske træk på både makroskopisk og mikroskopisk niveau og derved lette påvisning af stromale lidelser, der kan kompromittere resultatet af keratoplastik. Ved at forbedre graftkvalitetskontrol har denne protokol potentialet til at resultere i bedre udvælgelse (og afvisning) af donorvæv og dermed nedsat transplantatfejl.
Introduction
Hornhindesygdomme er blandt de vigtigste årsager til blindhed på verdensplan1. Nogle sygdomme kan kun behandles kirurgisk, ofte involverer udskiftning af en del (dvs. lamellær keratoplastik) eller hele (dvs. penetrerende keratoplastik) syge hornhinde, ved doneret væv, transplantatet, taget fra en nyligt afdød person. For hornhindesygdomme, der ikke påvirker endotelet (f.eks. Keratoconus, stromale ar efter infektiøs keratitis, traumer og stromale dystrofier), betragtes dyb anterior lamellær keratoplastik (DALK) i øjeblikket som den valgte kirurgiske teknik 2,3,4,5. Denne teknik muliggør bevarelsen af modtagerens hornhindeendotel ved kun at erstatte det centrale hornhindepitel og stroma, som er forbundet med en lavere forekomst af transplantatafstødning, fravær af endotelafstødning, lavere endotelcelletab og gunstigt omkostningseffektivitetsforhold 6,7,8,9,10,11 . DALK tillader endvidere, at hornhinder med mindre end optimal endotelkvalitet anvendes som transplantater, da dette kompromitterede lag ikke vil blive transplanteret12. Omvendt vil kvaliteten af donorhornhindestroma sandsynligvis være den største begrænsende faktor for transplantatsucces og synsgendannelse, fordi stroma er det eneste donorhornhindelaget, der er tilbage, mens donorepitelet erstattes af modtagerepitel. Desværre er midlerne til at vurdere donorhornhindestroma i øjenbanker begrænsede. De omfatter normalt spaltelampeundersøgelse af donorøjeæblet, når vævsudtagning foretages ved enukleation og lysmikroskopundersøgelse af donorstroma13. Nogle øjenbanker er begyndt at supplere sådanne standardprocedurer ved hjælp af Fourier-domæne optisk kohærenstomografi (FD-OCT)14.
Oftalmisk optisk kohærenstomografi (OCT), en optisk analog til ultralydsbilleddannelse15, bruger interferens fra bredbånd eller justerbart lys til at generere optiske sektioner af nethinden 16 og det forreste segment17. I tidsdomæne OCT, grundlaget for tidlige kliniske systemer, ændres placeringen af et referencespejl, således at interferensmønstre dukker op, når referencestrålen har rejst næsten samme tid som strålen reflekteret ved de forskellige vævsgrænseflader, hvor A-scanninger genereres som en funktion af tiden. I FD-OCT (også kaldet spektral- eller frekvensdomæne-OCT), grundlaget for de fleste moderne kliniske systemer, er referencespejlet fastgjort i en position, og en individuel A-scanning, med alle interferensmønstre blandet sammen, erhverves ad gangen og dissekeres fra hinanden via Fourier-analyse.
Mens kliniske (tids- eller spektraldomæne) OCT-systemer tillader tværsnitsbilleder af hornhinden og påvisning af stromale opaciteter ved en højere aksial opløsning end spaltelampebiomikroskopi, er deres laterale opløsning begrænset. Konfokal mikroskopi18 tillader undersøgelse af hornhinden ved en lateral opløsning, der nærmer sig histologisk detalje, men er begrænset aksialt.
Tomografisk mikroskopi med fuld felt af optisk kohærens (FF-OCT eller FF-OCM)19,20 kombinerer elementer fra både konfokalmikroskopi og OLT og opnår en lateral opløsning, der kan sammenlignes med den aksiale opløsning på ca. 1 μm. Mere specifikt bruger FF-OCM usammenhængende bredbåndslyskilder (f.eks. En halogenlampe) og optik med høj numerisk blænde til at erhverve 2D-tomografiske billeder uden lateral scanning. Ved at scanne i dybderetningen muliggør FF-OCM ikke-invasiv 3D-billeddannelse af friske eller faste ex vivo biologiske vævsprøver. Det er blevet brugt til at afbilde hornhinden21,22,23. Ved at give både høj opløsning en face og tværsnitsvisninger giver FF-OCM information om både hornhindens histologiske struktur og cellulære detaljer. Faktisk har FF-OCM vist sig at give strukturel information, der er bedre end histologi, og var i stand til at identificere flere sygdomsindikatorer, som det var muligt med kombinationen af spektraldomæne OCT og konfokal mikroskopi24,25.
Her beskriver vi en protokol for kvalitativ og kvantitativ vurdering af hornhindedonorstroma ved anvendelse af FF-OCM. Metoden er baseret på histologilignende analyse af makroskopiske og mikroskopiske træk, der indikerer stromal tilstand, herunder tre kvantitative stromale parametre (dvs. Bowmans lagtykkelse og dens variabilitet og stromal reflektionsevne). Den beskrevne protokol anvendes derfor på normale og abnorme hornhindevæv og tillader differentiering af syge fra normalt humant hornhindevæv.
Protocol
Alle metoder, der er beskrevet her, blev udført i overensstemmelse med principperne i Helsingfors-erklæringen og fulgte internationale etiske krav til humant væv. Dette var en prospektiv observationsundersøgelse af case-kontrol. Der blev indhentet informeret samtykke fra patienterne. Der blev ikke foretaget ændringer i franske standarder for behandling eller opfølgning. Institutional Review Board (IRB) godkendelse blev opnået fra patientbeskyttelsesudvalget, Ile-de-France V (14944).
1. Valg og forberedelse af væv
- Vælg donorhornhinder.
- Overfør donorhornhinder, der opbevares i organkulturmedium 26, til dextran-suppleret organkulturmedium i 3 dage for at tillade deturgescens27 før FF-OCM-billeddannelse28 (se materialetabel).
- Forbered prøverne.
- Hornhinden, nedsænket i opbevaringsmediet, anbringes i prøveholderen med epitelet opad.
- Anbring en ren silicadæksel (forsynet med prøveholderen) oven på hornhinden, og luk holderen ved forsigtigt at dreje dens base, indtil prøven er let fladtrykt og immobiliseret under dæksedlen, hvilket giver en relativt jævn billedoverflade. Tag forholdsregler for at undgå luftbobler.
- Påfør et tykt lag oftalmisk eller optisk gel på dækselen som nedsænkningsmedium.
2. FF-OCM initialisering, opsætning og billedoptagelse
- Initialiser enheden.
- Tænd for enheden ved at betjene afbryderen på bagsiden af enheden; belysning af en grøn LED på forsiden af enheden indikerer, at strømmen er tændt.
- Tænd for den dedikerede computer og halogenlyskilde ved at betjene afbryderen på forsiden.
- Start anskaffelsessoftwaren (se materialetabellen) ved at dobbeltklikke på skrivebordsgenvejen.
- Sørg for, at billeddannelsestrinnet er klart bortset fra den bevægelige bakke. Klik derefter på "OK" for at initialisere motorerne ved prompten.
- Træk bakken ud, sæt prøveholderen i den dedikerede beholder, og skub derefter forsigtigt bakken tilbage.
- Konfigurer enheden.
- Indtast en "prøveidentifikator" i det udpegede og obligatoriske felt; Du kan også angive en "Prøvebeskrivelse" og/eller "Undersøgelsesbeskrivelse".
- Klik på "Hent makrobillede", når du er klar, for at oprette et øjebliksbillede af prøven, der kan bruges til lateral positionering og navigationsformål senere; Når du er tilfreds, skal du validere billedet ved prompten ved at klikke på "Ja", hvorefter enheden flytter prøvebakken under målet og udfører en automatisk justering.
- Sørg for, at mikroskopmålet er godt nedsænket i den optiske gel, før du fortsætter.
- Anskaf stakkene.
- Vælg fanen "Udforsk" for at forberede en erhvervelse.
- Før du køber en stak billeder, skal du navigere til midten af hornhinden via oversættelse af joysticket eller manuelt valg på skærmen (det vil sige ved at klikke og trække den røde firkant på det erhvervede makrobillede til det ønskede sted).
- Varier billeddybden via rotation af joysticket, justering af skyderen eller manuel tastaturindtastning i den grafiske brugergrænseflade (GUI), og juster gennemsnitsværdien (et gennemsnit på 40 anbefales generelt for optimal hornhindebilleddannelse).
BEMÆRK: Dette gøres for at bestemme tykkelsen af hornhindeprøven og det gennemsnit, der er nødvendigt for at afbilde gennem hele hornhindetykkelsen, mens den første og sidste billedplacering noteres i dybden. Den nederste overflade af dæksedlen skaber parallelle interferensfrynser, der ses på det tomografiske billede (på højre side af GUI), hvilket letter lokaliseringen af hornhindeoverfladen. - Indtast hornhindeoverfladeværdien eller den første billedplacering i dybden i feltet "Dybde".
- Vælg fanen "Anskkaffe" for at hente billeder.
- Vælg "Udsnitsafstand" (standard og anbefalet indstilling er 1 μm, der matcher enhedens aksiale opløsning), og indtast hornhindetykkelsesværdien i overensstemmelse hermed under "Antal skiver".
- Gennemgå parametre og anskaffelsestid, og tryk på "OK", når du er tilfreds, for at starte overtagelsen.
- Undgå enhver kontakt med bordet, hvor FF-OCM er placeret under overtagelsen.
- Vælg fanen "Udforsk" for at forberede en erhvervelse.
3. Styring af erhvervede billeder
- Se og eksporter billeder.
- Start FF-OCM-visningssoftwaren (se materialetabel) ved at dobbeltklikke på skrivebordsgenvejen; erhvervede billeder (identificeret ved eksempel-id'et) vises på listen "Lokale undersøgelser".
- Vælg undersøgelsen med tilsvarende prøve-id, som indeholder både makrobilledet og den erhvervede billedstak, og "eksporter" sidstnævnte ved at højreklikke på billedserien og vælge formatet "DICOM" for at bevare de rå pixeldata og metadata til yderligere analyse.
- Vis 3D-billedstablerne i ansigts - og tværsnitsvisninger ved hjælp af MPR-tilstanden (multiplanar rekonstruktion) ved at dobbeltklikke på billedserien; Naviger gennem billederne (f.eks. via musehjulsrulning eller skyderjustering), og vælg repræsentative ansigts - og tværsnitsvisninger af hver stak.
- Eksporter de valgte visninger ved at klikke på ikonet nederst til højre i vinduet ved hjælp af "DICOM" -formatet.
- Importer billeder.
- Åbn billedbehandlingssoftwaren (se materialetabellen) ved at dobbeltklikke på skrivebordsgenvejen, og naviger til "Bioformater" "Importør" under "Plugins" for at importere DICOM-billeder; Sørg for, at "Gruppér filer med lignende navne" er valgt i vinduet "Indstillinger for import af bioformater".
4. Billedanalyse: kvalitativt og kvantitativt vurdering af stromalmorfologi og funktioner
- Vurder stromal og Bowmans lagtykkelse.
- Mål afstande manuelt på hornhindetværsnit, for eksempel på fem lige store punkter på tværs af tværsnittet25.
- Tegn en linje mellem to punkter med kendt afstand (såsom fra venstre mod højre for hele billedet, det vil sige i henhold til standardsynsfeltet, 1.024 pixels eller 780 μm), gå til "Analyser" og vælg "Indstil skala", og indtast "Kendt afstand" og "Længdeenhed" i de relevante felter og klik på "OK".
- Tegn en linje mellem to punkter med ukendt afstand; Aflæs længden eller afstanden målt direkte fra statuslinjen.
- Gennemsnit og variationskoefficient (COV) registreres. Bowmans lagtykkelse mindre end 6,5 μm og en COV større end 18,6% har været forbundet med unormal hornhindestrama25.
- Mål afstande manuelt på hornhindetværsnit, for eksempel på fem lige store punkter på tværs af tværsnittet25.
- Bestem keratocytdensiteten.
- Efter konvention om konfokal mikroskopi: sum stromale en ansigtsbilleder i grupper på 7 for at producere skiver af sammenlignelig tykkelse. For dette skal du gå til fanen "Billede" og vælge "Reslice Z" under "Stacks".
- Tag højde for den forskellige (faldende) celletæthed ved progression gennem stroma24,25. Til dette kan stroma betragtes som sammensat af 4 regioner i henhold til dybde: (1) den meget forreste stroma under Bowmans lag, det vil sige 2% af hele stromaltykkelsen; den resterende stroma (det vil sige 98% af hele stromaltykkelsen) med tre zoner af samme tykkelse: (2) forreste stroma, (3) midterste stroma, og (4) bageste stroma.
- For yderligere analyse medtages alle tilgængelige fladeskiver for det meget forreste stroma, 15 billeder for det forreste stroma, 5 billeder for det midterste stroma, samt 5 billeder for det bageste stroma (hvor antallet af billeder pr. region, der kræves til en pålidelig optælling, blev bestemt ved trinvis analyse29).
- På hvert ansigtsbillede skal du vælge et interesseområde på 300 μm x 300 μm. For at forbedre kernevisualiseringen skal du invertere billedet ved hjælp af "Inverter" under fanen "Rediger" og justere kontrast og lysstyrke. For sidstnævnte skal du gå til "Billede" og navigere til "Lysstyrke / kontrast" under "Analyser".
- Manuel tæl cellekerner ved hjælp af for eksempel funktionen "celletæller"25. For dette skal du gå til "Plugins" og navigere til "Cell Counter" under "Analyser". Tryk på "initialiser", og vælg derefter en tællertype. Start derefter med at tælle cellekernerne ved at klikke på mørke ovale træk i det omvendte billede, idet du overvejer dem, der lander på en billedkant, kun for to af de fire sider af billedet25.
- Registrer celletætheden med hensyn til arealtæthed, det vil sige i celler / mm² (divider antallet af celler talt med 0,09 for at konvertere fra celler / 90.000 μm² til celler / mm²) efter konfokalmikroskopikonvention, hvor keratocyttætheder har vist sig at være lavere hos patienter (f.eks. Med keratoconus) end hos raske forsøgspersoner og at være korreleret med sygdommens sværhedsgrad25.
BEMÆRK: Yderligere kliniske undersøgelser er nødvendige for at afgøre, om der kræves en minimal tærskel for keratocytdensitet for at opnå et helt klart hornhindetransplantat efter transplantation.
- Vurder stromal reflektionsevne.
- Generer dybdeprofiler med gennemsnitlig intensitet af stromale billedstakke, f.eks. ved hjælp af funktionen "Z-akseprofil" og/eller brugerdefineret software25,30,31.
BEMÆRK: Disse er faktisk amplitudedybdeprofiler, da FF-OCM måler amplituden af lys, der er tilbagespredt af prøven snarere end dens intensitet.- Beregn det gennemsnitlige grå niveau for hver stak en flade .
- Træk den mindste grå værdi fra, og normaliser med den maksimale grå værdi.
- Vis i logskala som funktion af stromal dybde (% af stromaltykkelsen).
- Tilnærm den resulterende logaritmiske profil med en lineær regressionslinje, som minimerer summen af de kvadrerede residualer (mindste kvadraters pasform).
- Optag R-kvadratværdien (R²) som et mål for linearitet. Værdier under 0,94 kan være en indikation af hornhindepatologi25.
BEMÆRK: For at differentiere utilstrækkeligheden af en lineær logaritmisk regressionsmodel (eller en monoeksponentiel henfaldsmodel) på grund af tilstedeværelsen af en patologi fra ren målestøj kan signalanalyse ved Bayesiansk inferens udføres31. I hornhinder med lineære logaritmiske (eller monoeksponentielle) stromale dybdeprofiler (f.eks. repræsenteret ved R-kvadratværdier30 eller Birge-forhold 31 tæt på 1) kan beregningen af fotonmiddelfri vej fra signalhenfaldshastigheden anvendes til yderligere at kvantificere graden af gennemsigtighed31.
- Generer dybdeprofiler med gennemsnitlig intensitet af stromale billedstakke, f.eks. ved hjælp af funktionen "Z-akseprofil" og/eller brugerdefineret software25,30,31.
- Vurder synligheden af andre stromale træk og sygdomsindikatorer.
- Kontroller for tilstedeværelse af ar, fibrotisk væv, søer eller Vogt striae.
- Vurder den gennemsnitlige tykkelse af nerverne i stroma, hvis de er tilstrækkeligt synlige til måling24.
- Vælg et ansigtsbillede , hvor stromalnerven er mest synlig (generelt i det midterste stromale område).
- Mål tykkelsen af nerven, for eksempel ved fem punkter24, og beregn derefter middelværdien og standardafvigelsen. Nervetykkelser over 9 μm kan være en yderligere indikator for patologi, såsom keratoconus24.
Representative Results
FF-OCM-enheden (se materialetabellen)28 og den generelle opsætning, der anvendes i dette manuskript, er vist i figur 1. Figur 2 viser en opsvulmet human donorhornhinde efter opbevaring i organkulturmedium, hvilket giver en patofysiologisk model af edematøs hornhinde og forhindrer FF-OCM billedoptagelse gennem hele hornhindetykkelsen på grund af begrænset penetrationsdybde. Overførsel til dextran-suppleret organkulturmedium forårsager hævelse og resulterer i donorhornhinder af normal tykkelse, som vist i figur 3. Syge hornhinder kan genkendes ved morfologiske ændringer og typiske stromale træk, herunder en nedsat og variabel tykkelse af stroma (figur 4) og / eller Bowmans lag (figur 5). Vurdering af keratocytdensiteten (figur 6) og stromal reflektionsevne (figur 7) kan yderligere hjælpe med histologilignende analyse og differentiering af normalt fra patologisk hornhindevæv med FF-OCM, ud over kapaciteten i kliniske OCT-systemer (figur 8).
Figur 1: Skematisk og fotografi af den generelle opsætning og FF-OCM-enhed, der anvendes i dette arbejde. A) Fotografi af FF-OCM-anordningen (se materialefortegnelsen)28. (B) Skematisk og optisk opsætning af enheden. C) Fotografi af en human donorhornhinde i prøveholderen. (D) Zoom på nedsænkningsmålet og prøveholderen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Organdyrket normal human hornhinde før deturgescens. Tværsnit (A) og et ansigtsbillede (B, skive gennem stroma) af opsvulmet ("edematøs") hornhinde forårsaget af opbevaring i organkulturmedium, hvor søer kan ses som mørke områder (som angivet med pile). Hornhindetykkelsen er fordoblet til over 1.100 μm, hvilket forhindrer billedoptagelse gennem hele dybden. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Organdyrket normal human hornhinde efter deturgescens. Tværsnitsbillede gennem hele hornhinden (A) og stromal udsigt (B) af afsvulmet hornhinde nedsænket i dextran-suppleret medium, der viser regelmæssigt fordelte hyperreflekterende (hvide) keratocytter. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Samlet vurdering af stromalmorfologi og træk, herunder stromaltykkelse. Sammenlignet med normal human hornhinde (A) har hornhinder med keratoconus (B) nedsat og variabel stromaltykkelse sammen med talrige, parallelle Vogt striae, der kan observeres som mørke lodrette bånd i tværsnitsbilleder og tykke stromale nerver, der kan findes i midtstromale ansigtsskiver (C). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Vurdering af Bowmans lagtykkelse, som afgrænses anteriort af den hyperreflekterende epitelkældermembran og posteriort af de hyperreflekterende keratocytter i den meget forreste stroma. Sammenlignet med en normal human hornhinde (A) har patologisk hornhinde (f.eks. keratoconus) (B) nedsat og variabel Bowmans lagtykkelse på grund af afbrydelse og ardannelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Vurdering af keratocytdensitet. (A) Keratocytkerner tælles manuelt på forbedrede og inverterede ansigtsbilleder efter valg af et område på 300 μm x 300 μm af interesse. (B) Optalte kerner er angivet med pile. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Vurdering af stromal reflektionsevne. Mængden af tilbagespredt lys falder (eksponentielt) med dybden i stroma af normale donorhornhinder (se figur 3 og figur 4A), hvilket resulterer i lineære logaritmiske dybdeprofiler, repræsenteret af R-kvadratværdier tæt på 1 (grønt spor). Dette gælder muligvis ikke for patologiske hornhinder med stromale områder med øget lysspredning (se figur 4B). Tilstedeværelsen af sådanne makroskopiske træk, som i eksemplet med en hornhinde med stromal ar efter infektiøs keratitis (afbildet i indsatsen), vil således skabe ikke-lineære logaritmiske intensitetsdybdeprofiler, repræsenteret af en R-kvadratværdi under en bestemt tærskel (f.eks. lavere end 0,9425; rødt spor). Bemærk, at logaritmiske amplitudedybdeprofiler faktisk vises, da FF-OCM måler amplituden af lys, der tilbagespredes af prøven snarere end dens intensitet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Påvisning af fordelene ved FF-OCM i forhold til histologi og spektraldomæne OLT. (A) Histologi og (B) tilsvarende spektraldomæne-OLT-billede erhvervet på samme hornhinde in vivo før keratoplastik. C) Tilsvarende FF-OCM-tværsnit af ex vivo-hornhindeknappen efter keratoplastik, der illustrerer bedre opløsning sammenlignet med de kliniske OCT-billeder med spektraldomænet. Fibrosen er også tydeligere synlig i FF-OCM-billeder end i histologien. Den høje tæthed af keratocytter i det øvre stroma kan tydeligt ses i både (C) tværsnit og (D) en ansigtsvisning . Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Protokollen beskrevet her til kvalitativ og kvantitativ vurdering af hornhindedonorstroma ved anvendelse af FF-OCM er baseret på histologilignende analyse af makroskopiske og mikroskopiske træk, der indikerer stromal tilstand, ud over kapaciteten af spektraldomæne OCT og konfokalmikroskopi21,24,25, og muliggør differentiering af syge fra normale humane væv.
Bortset fra en fremragende endotelkvalitetsvurdering af humane donorhornhinder ved hjælp af spejlmikroskopi, er vurdering af stromal kvalitet udfordrende i øjenbanker og generelt begrænset til en grov observation med spaltelampebiomikroskopi og / eller lysmikroskopi i nuværende protokoller. Mangel på fin opløsning med eksisterende metoder betyder ikke kun, at hornhinder med en vis stromal sygdom kan vælges, der kompromitterer resultatet af keratoplastik, men også at hornhinder kan afvises for stromale opaciteter, der faktisk er begrænsende for forreste stroma- eller epitelregioner og stadig kan bruges til endotelkeratoplastikprocedurer14.
Den nuværende øjenbankprotokol kunne suppleres med tilføjelsen af FF-OCM, som på grund af sin overlegne opløsning udgør et kraftfuldt og ikke-invasivt værktøj til at fuldføre kvalitetsvurderingen af hornhinden, især stroma (inklusive Bowmans lag). I modsætning til under undersøgelse af spaltelamper forbliver transplantatet nedsænket i et lukket kammer fyldt med lagringsmedium under hele FF-OCM-billedoptagelsen, hvilket reducerer enhver potentiel risiko for kontaminering.
For at opnå et vellykket billedbillede med FF-OCM (se materialetabellen) er det vigtigt, at mikroskopmålet er godt nedsænket i den optiske gel, der påføres oven på prøveholderens dæksel (trin 2.2.3). Det anbefales endvidere regelmæssigt at kontrollere kalibreringen af enheden, en procedure, der også skal udføres efter mislykket automatisk justering (trin 2.2.2) og åbnes via "Værktøjer og indstillinger" i anskaffelsessoftwaren (se materialetabel). Proceduren, som indebærer anvendelse af et kalibreringsspejl i prøveholderen, er den samme som den sædvanlige prøveforberedelse (se trin 1.2), bortset fra at den optiske gel skal påføres spejlet, før dækslet placeres.
En række donorhornhindetransplantater, der anses for at have normal stroma i henhold til eksisterende øjenbankprocedurer, blev brugt til at beskrive protokollen i dette manuskript og specifikt demonstrere FF-OCM's egnethed til præcis og pålidelig vurdering af donorstromal kvalitet. Disse normale donorhornhinder blev sammenlignet med patologiske hornhinder nedsænket i opbevaringsmedium, hvilket viser, at den histologilignende analyse, der blev muliggjort med FF-OCM af flere stromale træk (illustreret i figur 2, figur 3, figur 4, figur 5, figur 6, figur 7 og figur 8) i hornhindetransplantater, gør det muligt at skelne syge fra normalt humant hornhindevæv.
Bortset fra morfologiske ændringer, såsom tilstedeværelsen af ar (figur 5 og figur 7), fibrotisk væv (figur 8), søer (figur 2), Vogt striae (figur 4) eller øget stromal nervediameter (figur 4), er typiske stromale træk til stede i syge hornhinder. Stromaparametre, der er særligt relevante i stromalkvalitetsvurderingen, synes at være Bowmans lagtykkelse og dens variabilitet samt stromal reflektionsevne. Kritiske trin i protokollen er således trin 4.1 og 4.3.
Mens det udskilles under menneskelig hornhindeudvikling, bliver især Bowmans lag tydeligt ved 19 ugers svangerskab og repareres aldrig efter fødslen32. Skader på Bowmans lag er således irreversible og tjener som en ideel indikator for tidligere stromal skade i donorhornhindevæv, herunder skader forårsaget af brydningskirurgi, infektiøs keratitis, keratoconus. Sådanne hornhindesygdomme, som udgør kontraindikationer for donorhornhindebrug, er forbundet med nedsat og variabel lagtykkelse på grund af afbrydelse og ardannelse (figur 5) og vil sandsynligvis blive savnet af nuværende øjenbankprotokoller, når donorhistorien ikke er præcist kendt.
Selvom hornhindens gennemsigtighed er svækket efter donordød på grund af post mortem hornhindeødem, forventes mængden af tilbagespredt lys eller stromal reflektionsevne at falde eksponentielt med dybden i stroma (se figur 3 og figur 4A); som et resultat vil logaritmen til normaliseret stromal reflektivitet være en lineær funktion af stromal dybde i normale donorhornhinder, repræsenteret af R-kvadratværdier tæt på 1. Omvendt er tilstedeværelsen af makroskopiske træk forbundet med ikke-lineære logaritmiske dybdeprofiler og indikerer stromal sygdom (figur 4B og figur 7)25.
Da keratocytdensitet er ansvarlig for stromal kollagenfibril og ekstracellulær matrixsyntese og fornyelse, synes det rimeligt at antage, at keratocytdensitet er en anden relevant parameter til vurdering af donorstromal kvalitet, og at væv med meget lave keratocyttal ikke bør transplanteres. Protokollen indeholder derfor en præcis og pålidelig metode til måling af keratocytdensitet fra FF-OCM-billeder, der let kan bruges i øjenbanker25 og følger konventionen om konfokal mikroskopi. Bemærk, at med FF-OCM kan keratocytdensitet også bestemmes ved at tælle keratocytter direkte i tværsnitsbilledet33, en potentiel fordel i forhold til konfokal mikroskopi, som kræver, at keratocytter tælles på flere ansigtsskiver. I modsætning til hos levende patienter, hvor keratocyttætheden har vist sig at være lavere hos sygdomspatienter end hos normale kontroller 34,35,36,37 og at korrelere med sygdommens sværhedsgrad 34,38, var dette imidlertid ikke tilfældet i humane ex vivo-vævsprøver 25 , og yderligere undersøgelser er nødvendige for at afgøre, om der kræves et minimalt antal keratocytter i donorhornhinden for at resultere i god visuel genopretning efter transplantation. Lav keratocyttæthed i donorvæv som i patologisk væv kan forklares ved aldring, post mortem tab af celler induceret af iskæmi og/eller opbevaring af donorvæv 27,39,40,41. Det skal også påpeges, at de normale donorhornhinder, der blev opnået og afbildet i denne protokol, enten blev opbevaret og edematøse eller svulmet op eller var blevet kasseret af øjenbanken før transplantation på grund af dårlig endotelkvalitet i henhold til standarderne fra EU Eye Bank Association. Hvis FF-OCM-billeddannelse sammen med den beskrevne protokol skulle inkluderes i øjenbankindstillingen, ville hornhinderne typisk blive vurderet i en friskere tilstand, end det var muligt her, hvilket kan påvirke keratocyttæthederne.
Den her beskrevne protokol for stromalkvalitetsanalysen kunne udvides til vurdering af Descemets membran, som også kan løses med FF-OCM med hensyn til tykkelse og struktur21,24. Dette kan vise sig nyttigt til udvælgelse af væv til Descemets membranendotelkeratoplastik, hvor tynde Descemets membraner kan være vanskeligere at adskille fra stroma.
Afslutningsvis muliggør FF-OCM præcis og pålidelig vurdering af humant donorhornhindestroma under opbevaring. Ved at forbedre transplantatkvaliteten har tilføjelsen af denne protokol til de nuværende øjenbankprocedurer potentialet til at forbedre screening og udvælgelse af donorvæv og dermed resultaterne af keratoplastik. Reel integration af FF-OCM-enheden i øjenbankrutinen bør lettes af nylige teknologiske opdateringer, herunder hurtigere billedoptagelse og større synsfelt takket være udviklingen af et brugerdefineret CMOS-kamera og design af brugerdefinerede sterile engangskassetter til hornhindeopbevaring og håndtering under billeddannelse.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde har modtaget støtte fra Agence Nationale de Recherche (ANR), under et PRTS-tilskud (Projet de Recherche Translationelle en Santé) nr. ANR-13-PRTS-0009 (V.B.) og fra EU's forsknings- og innovationsprogram Horisont 2020 under Marie Skłodowska-Curie-tilskudsaftale nr. 709104 (K.I.). Forfatterne takker Céline de Sousa for hjælp med celletælling og histologisk behandling.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Light-CT Scanner | LLTech, France | http://www.lltechimaging.com/products-applications/products/ | FF-OCM device used in this manuscript for imaging |
| CorneaJet | EuroBio, France | http://www.eurobio-cornea.com/en/corneamax-10-100-ml-xml-352-822.html | Organ culture medium in which donor corneas are stored |
| CorneaMax | EuroBio, France | http://www.eurobio-cornea.com/en/corneajet-10-50-ml-xml-352-823.html | Dextran-supplemented organ culture medium used for deturgescence |
| Fiji (ImageJ) | National Institute of Health, Bethesda, MD, USA | https://fiji.sc/ | Open source image processing software |
| Matlab | Mathworks, Inc., Natick, MA, USA | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | Mathematical computing software |
References
- Pascolini, D., Mariotti, S. P.
- Shimazaki, J., Shimmura, S., Ishioka, M., Tsubota, K. Randomized clinical trial of deep lamellar keratoplasty vs penetrating keratoplasty. Am J Ophthalmol. 134, 159-165 (2002).
- Tsubota, K., Kaido, M., Monden, Y., Satake, Y., Bissen-Miyajima, H., Shimazaki, J. A new surgical technique for deep lamellar keratoplasty with single running suture adjustment. Am J Ophthalmol. 126, 1-8 (1998).
- Busin, M., Zambianchi, L., Arffa, R. C. Microkeratome-assisted lamellar keratoplasty for the surgical treatment of keratoconus. Ophthalmology. 112, 987-997 (2005).
- Amayem, A. F., Anwar, M.
- Borderie, V. M., Guilbert, E., Touzeau, O., Laroche, L. Graft rejection and graft failure after anterior lamellar versus penetrating keratoplasty. Am J Ophthalmol. 151, 1024-1029 (2011).
- Borderie, V. M., Sandali, O., Bullet, J., Gaujoux, T., Touzeau, O., Laroche, L. Long-term results of deep anterior lamellar versus penetrating keratoplasty. Ophthalmology. 119, 249-255 (2012).
- Koo, T. S., Finkelstein, E., Tan, D., Mehta, J. S. Incremental cost-utility analysis of deep anterior lamellar keratoplasty compared with penetrating keratoplasty for the treatment of keratoconus. Am J Ophthalmol. 152, 40-47 (2011).
- Bahar, I., Kaiserman, I., Srinivasan, S., Ya-Ping, J., Slomovic, A. R., Rootman, D. S. Comparison of three different techniques of corneal transplantation for keratoconus. Am J Ophthalmol. 146, 905-912 (2008).
- Bahar, I., Kaiserman, I., Srinivasan, S., Ya-Ping, J., Slomovic, A. R., Rootman, D. S. Longterm results of deep anterior lamellar keratoplasty for the treatment of keratoconus. Am J Ophthalmol. 151, 760-767 (2011).
- Cheng, Y. Y., et al. Endothelial cell loss and visual outcome of deep anterior lamellar keratoplasty versus penetrating keratoplasty: a randomized multicenter clinical trial. Ophthalmology. 118, 302-309 (2011).
- Borderie, V. M., Sandali, O., Bullet, J., Guilbert, E., Goldschmidt, P., Laroche, L. Donor tissue selection for anterior lamellar keratoplasty. Cornea. 32, 1105-1109 (2013).
- Borderie, V., Martinache, C., Sabolic, V., Touzeau, O., Laroche, L. Light microscopic evaluation of human donor corneal stroma during organ culture. Acta Ophthalmol Scand. 76, 154-157 (1998).
- Bald, M. R., Stoeger, C., Galloway, J., Tang, M., Holiman, J., Huang, D. Use of fourier-domain optical coherence tomography to evaluate anterior stromal opacities in donor corneas. J Ophthalmol. 2013. 397680, (2013).
- Huang, D., et al.
- Swanson, E. A., et al. In vivo retinal imaging by optical coherence tomography. Opt Lett. 18, 1864-1866 (1993).
- Izatt, J. A., et al. Micrometer-scale resolution imaging of the anterior eye in vivo with optical coherence tomography. Arch Ophthalmol. 112, 1584-1589 (1994).
- Stave, J., Zinser, G., Grummer, G., Guthoff, R. Modified Heidelberg retinal tomograph HRT. Initial results of in vivo presentation of corneal structures. Ophthalmologe. 99, 276-280 (2002).
- Beaurepaire, E., Boccara, A. C., Lebec, M., Blanchot, L., Saint-Jalmes, H.
- Dubois, A., Vabre, L., Boccara, A. C., Beaurepaire, E. High-resolution full-field optical coherence tomography with a Linnik microscope. Appl Opt. 41, 805-812 (2002).
- Ghouali, W., et al. Full-field optical coherence tomography of human donor and pathological corneas. Curr Eye Res. 24, 1-9 (2014).
- Akiba, M., et al. Ultrahigh-resolution imaging of human donor cornea using full-field optical coherence tomography. J Biomed Opt. 12, 041202 (2007).
- Latour, G., Georges, G., Lamoine, L. S., Deumie, C., Conrath, J., Hoffart, L. Human graft cornea and laser incisions imaging with micrometer scale resolution full-field optical coherence tomography. J Biomed Opt. 15, 056006 (2010).
- Grieve, K., Georgeon, C., Andreiuolo, F., Borderie, M., Ghoubay, D., Rault, J., Borderie, V. M. Imaging microscopic features of keratoconic corneal morphology. Cornea. 35, 1621-1630 (2016).
- Borderie, M., et al. New parameters in assessment of human donor corneal stroma. Acta Ophthalmol. 95. 297, e297-e306 (2017).
- Borderie, V. M., Scheer, S., Touzeau, O., Vedie, F., Carvajal-Gonzalez, S., Laroche, L. Donor organ cultured corneal tissue selection before penetrating keratoplasty. Br J Ophthalmol. 82, 382-388 (1998).
- Borderie, V. M., Baudrimont, M., Lopez, M., Carvajal, S., Laroche, L. Evaluation of the deswelling period in dextran-containing medium after corneal organ culture. Cornea. 16, 215-223 (1997).
- Tech, L. L. , Light-CT Scanner. http://www.lltechimaging.com/products-applications/products (2017).
- Doughty, M. J., Müller, A., Zaman, M. L. Assessment of the reliability of human corneal endothelial cell-density estimates using a noncontact specular microscope. Cornea. 19, 148-158 (2000).
- Irsch, K., Borderie, M., Grieve, K., Plamann, K., Laroche, L., Borderie, V. M. Objective analysis of stromal light backscattering with full-field optical coherence tomographic microscopy shows potential to quantify corneal transparency. Frontiers in Optics. OSA Technical Digest (online), paper FW6A.6. , (2015).
- Bocheux, R., Pernot, P., Borderie, V., Plamann, K., Irsch, K. Quantitative measures of corneal transparency, derived from objective analysis of depth-resolved corneal images, demonstrated with full-field optical coherence tomographic microscopy. PLoS ONE. e0221707. 14, (2019).
- Karimi, A. H., Wong, A., Bizheva, K. Automated detection and cell density assessment of keratocytes in the human corneal stroma from ultrahigh resolution optical coherence tomograms. Biomed Opt Express. 2, 2905-2916 (2011).
- Ku, J. Y., Niederer, R. L., Patel, D. V., Sherwin, T., McGhee, C. N. Laser scanning in vivo confocal analysis of keratocyte density in keratoconus. Ophthalmology. 115, 845-850 (2008).
- Ozgurhan, E. B., Kara, N., Yildirim, A., Bozkurt, E., Uslu, H., Demirok, A. Evaluation of corneal microstructure in keratoconus: a confocal microscopy study. Am J Ophthalmol. 156, 885-893 (2013).
- Erie, J. C., Patel, S. V., McLaren, J. W., Nau, C. B., Hodge, D. O., Bourne, W. M. Keratocyte density in keratoconus. A confocal microscopy study. Am J Ophthalmol. 134, 689-695 (2002).
- Imre, L., Resch, M., Nagymihaly, A.
- Niederer, R. L., Perumal, D., Sherwin, T., McGhee, C. N. Laser scanning in vivo confocal microscopy reveals reduced innervation and reduction in cell density in all layers of the keratoconic cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 2964-2970 (2008).
- Patel, S., McLaren, J., Hodge, D., Bourne, W. Normal human keratocyte density and corneal thickness measurement by using confocal microscopy in vivo. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42, 333-339 (2001).
- Komuro, A., Hodge, D. O., Gores, G. J., Bourne, W. M. Cell death during corneal storage at 4 degrees. C. Invest Ophthalmol Vis Sci. 40, 2827-2832 (1999).
- Gambato, C., Longhin, E., Catania, A. G., Lazzarini, D., Parrozzani, R., Midena, E. Aging and corneal layers: an in vivo corneal confocal microscopy study. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 253, 267-275 (2015).
