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Immunology and Infection

कॉर्नियल ग्राफ्ट में स्ट्रोमल विशेषताओं के हिस्टोलॉजी-जैसे विश्लेषण के लिए पूर्ण-क्षेत्र ऑप्टिकल सुसंगतता माइक्रोस्कोपी

Published: October 21, 2022 doi: 10.3791/57104
Automatic Translation
1,2,3, 1,2, 2, 1,2,4, 4,5, 1,2, 2, 1,2
1Vision Institute, Sorbonne University, UM 80 / INSERM, UMR_S 968 / CNRS, UMR_7210, 2Quinze Vingts National Ophthalmology Hospital, 3Laboratory of Ophthalmic Instrument Development, The Wilmer Eye Institute, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Laboratory for Optics and Biosciences (LOB), École polytechnique, 5LOA - ENSTA Paris, École polytechnique

Summary

हम कॉर्नियल दाता स्ट्रोमा के उच्च गुणवत्ता मूल्यांकन के लिए एक विधि के रूप में पूर्ण-क्षेत्र ऑप्टिकल सुसंगतता माइक्रोस्कोपी के उपयोग का वर्णन करते हैं। इस प्रोटोकॉल का उपयोग स्वास्थ्य या बीमारी के संकेत देने वाली विशेषताओं की पहचान करने के लिए किया जा सकता है, और इसका उद्देश्य दाता ऊतकों की स्क्रीनिंग और चयन में सुधार करना है, और इसलिए केराटोप्लास्टी के परिणाम।

Abstract

दाता कॉर्नियल स्ट्रोमा की गुणवत्ता, जो कुल कॉर्नियल मोटाई का लगभग 90% बनाती है, गहरे पूर्ववर्ती लैमेलर और मर्मज्ञ केराटोप्लास्टी की सफलता के लिए मुख्य, यदि प्रमुख नहीं, सीमित कारकों में से एक होने की संभावना है। ये सर्जिकल प्रक्रियाएं हैं जिनमें हाल ही में मृत व्यक्ति से लिए गए दान किए गए ऊतक, ग्राफ्ट द्वारा क्रमशः रोगग्रस्त कॉर्नियल परतों के हिस्से या सभी को बदलना शामिल है। हालांकि, नेत्र बैंकों में कॉर्नियल ग्राफ्ट की स्ट्रोमल गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के साधन सीमित हैं और रोग संकेतकों के उच्च-रिज़ॉल्यूशन मात्रात्मक मूल्यांकन की क्षमता की कमी है। फुल-फील्ड ऑप्टिकल सुसंगतता माइक्रोस्कोपी (एफएफ-ओसीएम), ताजा या निश्चित पूर्व विवो जैविक ऊतक नमूनों के उच्च-रिज़ॉल्यूशन 3 डी इमेजिंग की अनुमति देता है, एक गैर-इनवेसिव तकनीक है जो दाता कॉर्निया मूल्यांकन के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है। यहां हम एफएफ-ओसीएम का उपयोग करके कॉर्नियल स्ट्रोमा के गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं। प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक सामान्य दाता कॉर्निया और पैथोलॉजिकल कॉर्नियल बटन पर लागू किया गया है, और इसका उपयोग मैक्रोस्कोपिक और माइक्रोस्कोपिक दोनों स्तरों पर स्वस्थ और पैथोलॉजिकल विशेषताओं की पहचान करने के लिए किया जा सकता है, जिससे स्ट्रोमल विकारों का पता लगाने की सुविधा मिलती है जो केराटोप्लास्टी के परिणाम से समझौता कर सकते हैं। ग्राफ्ट गुणवत्ता नियंत्रण में सुधार करके, इस प्रोटोकॉल में दाता ऊतकों के बेहतर चयन (और अस्वीकृति) के परिणामस्वरूप होने की क्षमता है और इसलिए ग्राफ्ट विफलता में कमी आई है।

Introduction

कॉर्नियल रोग दुनिया भर में अंधापन के प्रमुख कारणों में से हैं। कुछ बीमारियों का इलाज केवल शल्य चिकित्सा द्वारा किया जा सकता है, जिसमें अक्सर हाल ही में मृत व्यक्ति से लिए गए दान किए गए ऊतक, ग्राफ्ट द्वारा भाग (यानी, लैमेलर केराटोप्लास्टी) या पूरे (यानी, केराटोप्लास्टी को भेदने वाले) रोगग्रस्त कॉर्निया के प्रतिस्थापन को शामिल किया जाता है। कॉर्नियल रोगों के लिए जो एंडोथेलियम (जैसे, केराटोकोनस, संक्रामक केराटाइटिस, आघात और स्ट्रोमल डिस्ट्रोफी के बाद स्ट्रोमल निशान) को प्रभावित नहीं करते हैं, वर्तमान में डीप एंटीरियर लैमेलर केराटोप्लास्टी (डीएएलके) को पसंद 2,3,4,5 की सर्जिकल तकनीक के रूप में माना जाता है। यह तकनीक केवल केंद्रीय कॉर्नियल एपिथेलियम और स्ट्रोमा को प्रतिस्थापित करके प्राप्तकर्ता के कॉर्नियल एंडोथेलियम के संरक्षण को संभव बनाती है, जो ग्राफ्ट अस्वीकृति की कम घटनाओं, एंडोथेलियल अस्वीकृति की अनुपस्थिति, कम एंडोथेलियल सेल हानि और अनुकूल लागत-प्रभावशीलता अनुपात 6,7,8,9,10,11 से जुड़ी है। . डीएएलके आगे इष्टतम एंडोथेलियम गुणवत्ता से कम वाले कॉर्निया को ग्राफ्ट के रूप में उपयोग करने की अनुमति देता है, क्योंकि इस समझौता परत कोप्रत्यारोपित नहीं किया जाएगा। इसके विपरीत, दाता कॉर्नियल स्ट्रोमा की गुणवत्ता ग्राफ्ट सफलता और दृष्टि वसूली के लिए प्रमुख सीमित कारक होने की संभावना है क्योंकि स्ट्रोमा एकमात्र दाता कॉर्नियल परत है, जबकि दाता उपकला को प्राप्तकर्ता उपकला द्वारा प्रतिस्थापित किया जाएगा। दुर्भाग्य से, आंखों के बैंकों में दाता कॉर्नियल स्ट्रोमा का आकलन करने के साधन सीमित हैं। वे आमतौर पर दाता नेत्रगोलक की स्लिट-लैंप परीक्षा शामिल करते हैं जब ऊतक पुनर्प्राप्ति दाता स्ट्रोमा13 के न्यूक्लियेशन और प्रकाश माइक्रोस्कोप परीक्षा द्वारा की जाती है। कुछ नेत्र बैंकों ने फूरियर-डोमेन ऑप्टिकल समेकन टोमोग्राफी (एफडी-ओसीटी) 14 का उपयोग करके ऐसी मानक प्रक्रियाओं को पूरक करना शुरू कर दिया है।

नेत्र ऑप्टिकल सुसंगतता टोमोग्राफी (ओसीटी), अल्ट्रासाउंड इमेजिंग15 के लिए एक ऑप्टिकल एनालॉग, रेटिना16 और पूर्ववर्ती खंड17 के ऑप्टिकल वर्गों को उत्पन्न करने के लिए ब्रॉडबैंड या असमर्थ प्रकाश के हस्तक्षेप का उपयोग करता है। टाइम-डोमेन ओसीटी में, प्रारंभिक नैदानिक प्रणालियों का आधार, एक संदर्भ दर्पण की स्थिति बदल दी जाती है, ताकि हस्तक्षेप पैटर्न तब दिखाई दें जब भी संदर्भ बीम ने विभिन्न ऊतक इंटरफेस पर प्रतिबिंबित बीम के रूप में लगभग समान समय की यात्रा की हो, जिसमें ए-स्कैन समय के कार्य के रूप में उत्पन्न होते हैं। एफडी-ओसीटी (जिसे वर्णक्रमीय- या आवृत्ति-डोमेन ओसीटी भी कहा जाता है) में, अधिकांश आधुनिक नैदानिक प्रणालियों का आधार, संदर्भ दर्पण एक स्थिति में तय किया जाता है और एक व्यक्तिगत ए-स्कैन, जिसमें सभी हस्तक्षेप पैटर्न एक साथ मिश्रित होते हैं, एक समय में अधिग्रहित किए जाते हैं, और फूरियर विश्लेषण के माध्यम से अलग-अलग विच्छेदित होते हैं।

जबकि नैदानिक (समय या वर्णक्रमीय-डोमेन) ओसीटी सिस्टम कॉर्निया के क्रॉस-अनुभागीय दृश्यों और स्लिट-लैंप बायोमाइक्रोस्कोपी की तुलना में उच्च अक्षीय रिज़ॉल्यूशन पर स्ट्रोमल ओपेसिटी का पता लगाने की अनुमति देते हैं, उनका पार्श्व संकल्प सीमित है। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी18 हिस्टोलॉजिकल विवरण के करीब एक पार्श्व रिज़ॉल्यूशन पर कॉर्निया की परीक्षा की अनुमति देता है, लेकिन अक्षीय रूप से सीमित है।

पूर्ण-क्षेत्र ऑप्टिकल सुसंगतता टोमोग्राफिक माइक्रोस्कोपी (एफएफ-ओसीटी या एफएफ-ओसीएम) 19,20 कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी और ओसीटी दोनों के तत्वों को जोड़ती है, जो लगभग 1 μm के अक्षीय रिज़ॉल्यूशन के बराबर पार्श्व संकल्प प्राप्त करती है। अधिक विशेष रूप से, एफएफ-ओसीएम पार्श्व स्कैनिंग के बिना फेस 2 डी टोमोग्राफिक छवियों को प्राप्त करने के लिए असंगत ब्रॉडबैंड प्रकाश स्रोतों (जैसे, एक हलोजन लैंप) और उच्च संख्यात्मक एपर्चर ऑप्टिक्स का उपयोग करता है। गहराई की दिशा में स्कैन करके, एफएफ-ओसीएम ताजा या निश्चित पूर्व विवो जैविक ऊतक नमूनों के गैर-इनवेसिव 3 डी इमेजिंग को सक्षम बनाता है। इसका उपयोग कॉर्निया21,22,23 की छवि बनाने के लिए किया गया है। चेहरे और क्रॉस-अनुभागीय दृश्यों दोनों को उच्च-रिज़ॉल्यूशन प्रदान करके, एफएफ-ओसीएम कॉर्निया की हिस्टोलॉजिकल संरचना और सेलुलर विवरण दोनों पर जानकारी प्रदान करता है। वास्तव में, एफएफ-ओसीएम को हिस्टोलॉजी से बेहतर संरचनात्मक जानकारी प्रदान करने के लिए दिखाया गया है और वर्णक्रमीय-डोमेन ओसीटी और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी24,25 के संयोजन के साथ संभव रूप से अधिक रोग संकेतकों की पहचान करने में सक्षम था।

यहां हम एफएफ-ओसीएम का उपयोग करके कॉर्नियल दाता स्ट्रोमा के गुणात्मक और मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। यह विधि स्ट्रोमल स्थिति के संकेत देने वाले मैक्रोस्कोपिक और सूक्ष्म विशेषताओं के हिस्टोलॉजी जैसे विश्लेषण पर आधारित है, जिसमें तीन मात्रात्मक स्ट्रोमल पैरामीटर (यानी, बोमन की परत मोटाई और इसकी परिवर्तनशीलता, और स्ट्रोमल परावर्तकता) शामिल हैं। इसलिए वर्णित प्रोटोकॉल सामान्य और असामान्य कॉर्निया ऊतकों पर लागू होता है और सामान्य मानव कॉर्नियल ऊतकों से रोगग्रस्त के भेदभाव की अनुमति देता है।

Protocol

यहां वर्णित सभी विधियों को हेलसिंकी की घोषणा के सिद्धांतों के अनुसार किया गया था और मानव ऊतकों के लिए अंतर्राष्ट्रीय नैतिक आवश्यकताओं का पालन किया गया था। यह एक संभावित अवलोकन मामला नियंत्रण अध्ययन था। रोगियों से सूचित सहमति प्राप्त की गई थी। उपचार या अनुवर्ती के फ्रांसीसी मानकों में कोई संशोधन नहीं किया गया था। संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) की मंजूरी रोगी संरक्षण समिति, इले-डी-फ्रांस वी (14944) से प्राप्त की गई थी।

1. ऊतक चयन और तैयारी

  1. दाता कॉर्निया का चयन करें।
    1. अंग संवर्धन माध्यम26 में संग्रहीत दाता कॉर्निया को 3 दिनों के लिए डेक्सट्रान-पूरक अंग संवर्धन माध्यम में स्थानांतरित करें ताकि एफएफ-ओसीएम इमेजिंग28 से पहले27 को हटाने की अनुमति मिल सके ( सामग्री की तालिका देखें)।
  2. नमूने तैयार करें।
    1. भंडारण माध्यम में डूबे कॉर्निया को नमूना धारक में एपिथेलियम के साथ रखें।
    2. कॉर्निया के शीर्ष पर एक साफ सिलिका कवरस्लिप (नमूना धारक के साथ प्रदान किया गया) रखें और अपने आधार को धीरे से मोड़कर धारक को बंद करें जब तक कि नमूना थोड़ा चपटा न हो जाए और कवरस्लिप के नीचे स्थिर न हो जाए जो अपेक्षाकृत समान इमेजिंग सतह प्रदान करता है। किसी भी हवा के बुलबुले से बचने के लिए सावधानी बरतें।
    3. विसर्जन माध्यम के रूप में कवरस्लिप पर नेत्र या ऑप्टिकल जेल की एक मोटी परत लागू करें।

2. एफएफ-ओसीएम आरंभ, सेटअप और छवि अधिग्रहण

  1. डिवाइस प्रारंभ करें.
    1. डिवाइस के पीछे पावर स्विच संचालित करके डिवाइस चालू करें; डिवाइस के सामने एक हरे रंग के एलईडी की रोशनी इंगित करती है कि शक्ति चालू है।
    2. सामने की ओर पावर स्विच संचालित करके समर्पित कंप्यूटर और हैलोजन प्रकाश स्रोत चालू करें।
    3. डेस्कटॉप शॉर्टकट पर डबल-क्लिक करके अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर लॉन्च करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    4. सुनिश्चित करें कि चल ट्रे को छोड़कर इमेजिंग चरण स्पष्ट है। फिर प्रॉम्प्ट पर मोटर्स को शुरू करने के लिए "ओके" पर क्लिक करें।
    5. ट्रे को बाहर निकालें और नमूना धारक को समर्पित कंटेनर में डालें, फिर धीरे से ट्रे को पीछे धकेलें।
  2. डिवाइस सेटअप करें।
    1. निर्दिष्ट और अनिवार्य फ़ील्ड में "नमूना पहचानकर्ता" दर्ज करें; वैकल्पिक रूप से "नमूना विवरण" और / या "अध्ययन विवरण" दर्ज करें।
    2. तैयार होने पर "मैक्रो छवि प्राप्त करें" पर क्लिक करें, नमूने का एक स्नैपशॉट बनाने के लिए जिसका उपयोग बाद में पार्श्व स्थिति और नेविगेशन उद्देश्यों के लिए किया जा सकता है; एक बार संतुष्ट होने के बाद, "हां" पर क्लिक करके संकेत पर छवि को मान्य करें, जिसके बाद डिवाइस उद्देश्य के नीचे नमूना ट्रे को स्थानांतरित करता है और एक ऑटो-समायोजन करता है।
    3. सुनिश्चित करें कि माइक्रोस्कोप उद्देश्य आगे बढ़ने से पहले ऑप्टिकल जेल में अच्छी तरह से डूबा हुआ है।
  3. ढेर प्राप्त करें।
    1. अधिग्रहण तैयार करने के लिए "एक्सप्लोर" टैब का चयन करें।
      1. छवियों का ढेर प्राप्त करने से पहले, स्क्रीन पर जॉयस्टिक या मैनुअल चयन के अनुवाद के माध्यम से कॉर्निया के केंद्र में नेविगेट करें (यानी, अधिग्रहित मैक्रो छवि पर लाल वर्ग को वांछित स्थान पर क्लिक करके और खींचकर)।
      2. जॉयस्टिक के रोटेशन, स्लाइडर के समायोजन, या ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (जीयूआई) में मैनुअल कीबोर्ड इनपुट के माध्यम से इमेजिंग गहराई को अलग-अलग करें, और औसत मूल्य को समायोजित करें (आमतौर पर इष्टतम कॉर्नियल इमेजिंग के लिए 40 का औसत अनुशंसित है)।
        नोट: यह कॉर्नियल नमूने की मोटाई और गहराई में पहले और अंतिम छवि स्थान को नोट करते हुए पूरे कॉर्नियल मोटाई के माध्यम से छवि बनाने के लिए आवश्यक औसत निर्धारित करने के लिए किया जाता है। कवरस्लिप की निचली सतह समानांतर हस्तक्षेप फ्रिंज बनाती है जो टोमोग्राफिक छवि (जीयूआई के दाईं ओर) पर देखी जाती है, जो कॉर्नियल सतह का पता लगाने की सुविधा प्रदान करती है।
      3. "गहराई" क्षेत्र में गहराई में कॉर्नियल सतह मान या पहला छवि स्थान दर्ज करें।
    2. छवियों को प्राप्त करने के लिए "अधिग्रहण टैब" का चयन करें।
      1. "स्लाइस स्पेसिंग" का चयन करें (डिफ़ॉल्ट और अनुशंसित सेटिंग डिवाइस के अक्षीय रिज़ॉल्यूशन से मेल खाती 1 μm है) और "स्लाइस की संख्या" के तहत तदनुसार कॉर्नियल मोटाई मान दर्ज करें।
      2. पैरामीटर और अधिग्रहण समय की समीक्षा करें, और जब संतुष्ट हों तो अधिग्रहण शुरू करने के लिए "ओके" दबाएं।
      3. अधिग्रहण के दौरान, उस तालिका के साथ किसी भी संपर्क से बचें जिस पर एफएफ-ओसीएम स्थित है।

3. अधिग्रहित छवियों का प्रबंधन

  1. छवियों को देखें और निर्यात करें.
    1. डेस्कटॉप शॉर्टकट पर डबल-क्लिक करके एफएफ-ओसीएम देखने वाले सॉफ़्टवेयर ( सामग्री की तालिका देखें) लॉन्च करें; अधिग्रहित छवियां (नमूना आईडी द्वारा पहचानी गई) "स्थानीय अध्ययन" सूची में दिखाई देती हैं।
    2. संबंधित नमूना आईडी के साथ अध्ययन का चयन करें, जिसमें मैक्रो छवि और अधिग्रहित छवि स्टैक दोनों शामिल हैं, और छवियों की श्रृंखला पर राइट-क्लिक करके और आगे के विश्लेषण के लिए कच्चे पिक्सेल डेटा और मेटाडेटा को बनाए रखने के लिए "DICOM" प्रारूप का चयन करके उत्तरार्द्ध को "निर्यात" करें।
    3. छवियों की श्रृंखला पर डबल-क्लिक करके, मल्टीप्लानर पुनर्निर्माण (एमपीआर) मोड का उपयोग करके चेहरे और क्रॉस-अनुभागीय दृश्यों में 3 डी छवि स्टैक प्रदर्शित करें; छवियों के माध्यम से नेविगेट करें (उदाहरण के लिए, माउस-व्हील स्क्रॉल या स्लाइडर समायोजन के माध्यम से) और प्रत्येक स्टैक के चेहरे और क्रॉस-अनुभागीय दृश्यों में प्रतिनिधि का चयन करें।
    4. "DICOM" प्रारूप का उपयोग करके विंडो के निचले दाईं ओर आइकन पर क्लिक करके चयनित दृश्यों को निर्यात करें।
  2. छवियों का आयात करें.
    1. डेस्कटॉप शॉर्टकट पर डबल-क्लिक करके छवि प्रसंस्करण सॉफ़्टवेयर खोलें ( सामग्री की तालिका देखें), और DICOM छवियों को आयात करने के लिए "प्लगइन्स" के तहत "बायो-फॉर्मेट" "आयातक" पर नेविगेट करें; सुनिश्चित करें कि "समान नामों वाली फ़ाइलें समूह" "जैव-स्वरूप आयात विकल्प" विंडो में चयनित है।

4. छवि विश्लेषण: स्ट्रोमल आकृति विज्ञान और विशेषताओं का गुणात्मक और मात्रात्मक मूल्यांकन

  1. स्ट्रोमल और बोमन की परत मोटाई का आकलन करें।
    1. कॉर्नियल क्रॉस-सेक्शन पर मैन्युअल रूप से दूरी मापें, उदाहरण के लिए क्रॉस-सेक्शन25 में पांच समान रूप से स्पेस किए गए बिंदुओं पर।
      1. ज्ञात दूरी के दो बिंदुओं (जैसे, पूरी छवि के बाएं से दाईं ओर, जो डिफ़ॉल्ट फ़ील्ड-ऑफ-व्यू के अनुसार है, 1,024 पिक्सेल या 780 μm) के बीच एक रेखा खींचें, "विश्लेषण करें" पर जाएं और "स्केल सेट करें" चुनें, और उपयुक्त फ़ील्ड में "ज्ञात दूरी" और "लंबाई की इकाई" दर्ज करें और "ओके" पर क्लिक करें।
      2. अज्ञात दूरी के दो बिंदुओं के बीच एक रेखा खींचें; स्थिति पट्टी से सीधे मापी गई लंबाई या दूरी पढ़ें.
    2. भिन्नता (सीओवी) के माध्य और गुणांक को रिकॉर्ड करें। बोमन की परत की मोटाई 6.5 μm से कम और 18.6% से अधिक COV असामान्य कॉर्नियल स्ट्रोमा25 से जुड़ी हुई है।
  2. केराटोसाइट घनत्व निर्धारित करें।
    1. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के निम्नलिखित सम्मेलन: तुलनीय मोटाई के स्लाइस का उत्पादन करने के लिए 7 के समूहों में चेहरे की छवियों का योग। इसके लिए, "छवि" टैब पर जाएं और "स्टैक्स" के तहत "रेस्लीस जेड" चुनें।
    2. स्ट्रोमा24,25 के माध्यम से प्रगति पर अलग-अलग (घटते) सेल घनत्व को ध्यान में रखें। इसके लिए, स्ट्रोमा को गहराई के अनुसार 4 क्षेत्रों से बना माना जा सकता है: (1) बोमन की परत के नीचे बहुत पूर्ववर्ती स्ट्रोमा, जो पूरे स्ट्रोमल मोटाई का 2% है; शेष स्ट्रोमा (यानी, पूरे स्ट्रोमल मोटाई का 98%), समान मोटाई के तीन क्षेत्रों के साथ: (2) पूर्ववर्ती स्ट्रोमा, (3) मध्य स्ट्रोमा, और (4) पश्चवर्ती स्ट्रोमा।
    3. आगे के विश्लेषण के लिए, बहुत पूर्वकाल स्ट्रोमा के लिए सभी उपलब्ध फेस स्लाइस, पूर्ववर्ती स्ट्रोमा के लिए 15 छवियां, मध्य स्ट्रोमा के लिए 5 छवियां, साथ ही पीछे के स्ट्रोमा के लिए 5 छवियां शामिल करें (जहां विश्वसनीय गणना के लिए आवश्यक प्रति क्षेत्र छवियों की संख्या चरणबद्ध विश्लेषण29 द्वारा निर्धारित की गई थी)।
    4. प्रत्येक चेहरे की छवि पर, रुचि के 300 μm x 300 μm क्षेत्र का चयन करें। न्यूक्लियस विज़ुअलाइज़ेशन को बढ़ाने के लिए, "संपादित करें" टैब के तहत "इनवर्ट" का उपयोग करके छवि को उलटा करें, और कंट्रास्ट और चमक को समायोजित करें। उत्तरार्द्ध के लिए, "छवि" पर जाएं और "विश्लेषण" के तहत "ब्राइटनेस / कंट्रास्ट" पर नेविगेट करें।
    5. मैन्युअल रूप से सेल नाभिक की गणना करें, उदाहरण के लिए "सेल काउंटर" फ़ंक्शन25 का उपयोग करके। इसके लिए, "प्लगइन्स" पर जाएं और "विश्लेषण" के तहत "सेल काउंटर" पर नेविगेट करें। "प्रारंभ करें" दबाएँ और तब किसी काउंटर प्रकार का चयन करें. फिर उल्टे छवि में अंधेरे अंडाकार विशेषताओं पर क्लिक करके सेल नाभिक की गिनती शुरू करें, छवि25 के चार पक्षों में से केवल दो के लिए छवि सीमा पर उतरने वालों पर विचार करें।
    6. क्षेत्र घनत्व के संदर्भ में सेल घनत्व को रिकॉर्ड करें, जो कोशिकाओं / मिमी² में है (कोशिकाओं / 90,000 μm² से कोशिकाओं / mm² में परिवर्तित करने के लिए 0.09 द्वारा गिनी गई कोशिकाओं की संख्या को विभाजित करें), कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी कन्वेंशन के बाद, जहां केराटोसाइट घनत्व को स्वस्थ विषयों की तुलना में रोगियों (जैसे, केराटोकोनस के साथ) में कम दिखाया गया है और रोग की गंभीरता25 के साथ सहसंबद्ध किया गया है।
      नोट: प्रत्यारोपण के बाद पूरी तरह से स्पष्ट कॉर्नियल ग्राफ्ट प्राप्त करने के लिए केराटोसाइट घनत्व की न्यूनतम सीमा की आवश्यकता है या नहीं, यह निर्धारित करने के लिए आगे नैदानिक अध्ययन आवश्यक हैं।
  3. स्ट्रोमल परावर्तकता का आकलन करें।
    1. उदाहरण के लिए "जेड-अक्ष प्रोफ़ाइल" फ़ंक्शन और / या कस्टम सॉफ़्टवेयर25,30,31 का उपयोग करके स्ट्रोमल छवि स्टैक की औसत तीव्रता गहराई प्रोफाइल उत्पन्न करें।
      नोट: ये वास्तव में आयाम गहराई प्रोफाइल हैं क्योंकि एफएफ-ओसीएम इसकी तीव्रता के बजाय नमूने द्वारा पीछे बिखरे हुए प्रकाश के आयाम को मापता है।
      1. प्रत्येक चेहरे के ढेर के लिए औसत ग्रे स्तर की गणना करें।
      2. न्यूनतम ग्रे मान घटाएं और अधिकतम ग्रे मान से सामान्य करें।
      3. स्ट्रोमल गहराई (स्ट्रोमल मोटाई का%) के कार्य के रूप में लॉग स्केल में प्रदर्शित करें।
      4. एक रैखिक प्रतिगमन रेखा द्वारा परिणामी लघुगणकीय प्रोफ़ाइल का अनुमान लगाएं, जो वर्ग अवशिष्ट (कम से कम वर्ग फिट) के योग को कम करता है।
      5. रैखिकता के माप के रूप में आर-वर्ग मान (आर²) रिकॉर्ड करें। 0.94 से नीचे का मान कॉर्नियल पैथोलॉजी25 का संकेत हो सकता है।
        नोट: केवल माप शोर से पैथोलॉजी की उपस्थिति के कारण रैखिक लघुगणकीय प्रतिगमन मॉडल (या एक मोनो-घातीय क्षय मॉडल) की अपर्याप्तता को अलग करने के लिए, बायेसियन अनुमान द्वारा संकेत विश्लेषण किया जा सकताहै। इसके अलावा, रैखिक लघुगणकीय (या मोनो-घातीय) स्ट्रोमल गहराई प्रोफाइल (उदाहरण के लिए, आर-वर्ग मान30 या बिर्गे अनुपात31 द्वारा 1 के करीब दर्शाया गया) वाले कॉर्निया में, सिग्नल क्षय की दर से फोटॉन माध्य-मुक्त पथ की गणना का उपयोग पारदर्शिता31 की डिग्री को और अधिक निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है।
  4. अन्य स्ट्रोमल विशेषताओं और रोग संकेतकों की दृश्यता का आकलन करें।
    1. निशान, फाइब्रोटिक ऊतक, झीलों, या वोग्ट स्ट्रिया की उपस्थिति की जांच करें।
    2. स्ट्रोमा में नसों की औसत मोटाई का आकलन करें, यदि माप24 के लिए पर्याप्त रूप से दिखाई देता है।
      1. एक चेहरे की छवि का चयन करें जहां स्ट्रोमल तंत्रिका सबसे अधिक दिखाई देती है (आमतौर पर मध्य-स्ट्रोमल क्षेत्र में)।
      2. तंत्रिका की मोटाई को मापें, उदाहरण के लिए पांच बिंदु24 पर, फिर माध्य और मानक विचलन की गणना करें। 9 μm से ऊपर तंत्रिका मोटाई पैथोलॉजी के लिए एक अतिरिक्त संकेतक हो सकता है, जैसे कि केराटोकोनस24।

Representative Results

एफएफ-ओसीएम डिवाइस ( सामग्री की तालिका देखें) 28 और इस पांडुलिपि में उपयोग किए जाने वाले सामान्य सेटअप को चित्र 1 में दिखाया गया है। चित्र 2 अंग संवर्धन माध्यम में भंडारण के बाद एक सूजे हुए मानव दाता कॉर्निया को दर्शाता है, जो एडेमेटस कॉर्निया का एक पैथोफिजियोलॉजिकल मॉडल देता है और सीमित प्रवेश गहराई के कारण पूरे कॉर्नियल मोटाई के माध्यम से एफएफ-ओसीएम छवि अधिग्रहण को रोकता है। डेक्सट्रान-पूरक अंग संस्कृति माध्यम में स्थानांतरण से सूजन होती है और परिणामस्वरूप सामान्य मोटाई के दाता कॉर्निया होते हैं, जैसा कि चित्र 3 में दर्शाया गया है। रोगग्रस्त कॉर्निया को रूपात्मक परिवर्तनों और विशिष्ट स्ट्रोमल विशेषताओं द्वारा पहचाना जा सकता है, जिसमें स्ट्रोमा (चित्रा 4) और / या बोमन की परत (चित्रा 5) की कम और परिवर्तनशील मोटाई शामिल है। केराटोसाइट घनत्व (चित्रा 6) और स्ट्रोमल परावर्तकता (चित्रा 7) का आकलन नैदानिक ओसीटी प्रणालियों की क्षमताओं से परे, एफएफ-ओसीएम के साथ पैथोलॉजिकल कॉर्नियल ऊतकों से सामान्य के हिस्टोलॉजी जैसे विश्लेषण और भेदभाव में सहायता कर सकता है (चित्रा 8)।

Figure 1
चित्रा 1: इस काम में उपयोग किए जाने वाले सामान्य सेटअप और एफएफ-ओसीएम डिवाइस की योजनाबद्ध और तस्वीरें। (ए) एफएफ-ओसीएम डिवाइस की तस्वीर ( सामग्री की तालिका देखें) 28. (बी) डिवाइस का योजनाबद्ध और ऑप्टिकल सेटअप। (सी) नमूना धारक में मानव दाता कॉर्निया की तस्वीर। (डी) विसर्जन उद्देश्य और नमूना धारक पर जूम करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: विघटन से पहले अंग-सुसंस्कृत सामान्य मानव कॉर्निया। अंग संवर्धन माध्यम में भंडारण के कारण सूजे हुए ("एडेमेटस") कॉर्निया के क्रॉस-सेक्शनल (ए) और एन फेस व्यू (बी, स्ट्रोमा के माध्यम से टुकड़ा) जहां झीलों को अंधेरे क्षेत्रों के रूप में देखा जा सकता है (जैसा कि तीर द्वारा इंगित किया गया है)। कॉर्नियल मोटाई 1,100 μm से दोगुनी हो गई है, जिससे पूरी गहराई के माध्यम से छवि अधिग्रहण को रोका जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: विकृति के बाद अंग-सुसंस्कृत सामान्य मानव कॉर्निया। पूरे कॉर्निया (ए) के माध्यम से क्रॉस-अनुभागीय दृश्य और डी-सूजे हुए कॉर्निया के चेहरे के स्ट्रोमल दृश्य (बी) को डेक्सट्रान-पूरक माध्यम में डुबोया जाता है, जो नियमित रूप से वितरित हाइपर-रिफ्लेक्टिव (सफेद) केराटोसाइट्स दिखाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: स्ट्रोमल मोटाई सहित स्ट्रोमल आकृति विज्ञान और विशेषताओं का समग्र मूल्यांकन। सामान्य मानव कॉर्निया (ए) की तुलना में, केराटोकोनस (बी) सुविधा वाले कॉर्निया में कमी आई है और परिवर्तनीय स्ट्रोमल मोटाई के साथ-साथ कई, समानांतर वोग्ट स्ट्रिया हैं जो क्रॉस-अनुभागीय दृश्यों में अंधेरे ऊर्ध्वाधर बैंड के रूप में देखे जा सकते हैं, और मोटी स्ट्रोमल तंत्रिकाएं जो मध्य-स्ट्रोमल एन फेस स्लाइस (सी) में पाई जा सकती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्र 5: बोमन की परत मोटाई का आकलन, जो हाइपर-रिफ्लेक्टिव एपिथेलियल बेसमेंट झिल्ली द्वारा और बहुत पूर्ववर्ती स्ट्रोमा में हाइपर-रिफ्लेक्टिव केराटोसाइट्स द्वारा पूर्ववर्ती रूप से चित्रित किया गया है। एक सामान्य मानव कॉर्निया (ए) की तुलना में, पैथोलॉजिक कॉर्निया (जैसे, केराटोकोनस) (बी) विशेषताओं में कमी आई और रुकावट और निशान के कारण बोमन की परत की मोटाई बढ़ गई। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: केराटोसाइट घनत्व का आकलन। (ए) केराटोसाइट नाभिक को 300 μm x 300 μm रुचि के क्षेत्र के चयन के बाद चेहरे की छवियों में बढ़ाया और उलटा किया जाता है। (बी) गणना किए गए नाभिक तीरों द्वारा इंगित किए जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्रा 7: स्ट्रोमल परावर्तकता का आकलन। सामान्य दाता कॉर्निया के स्ट्रोमा में गहराई के साथ बैकस्प्रेटेड प्रकाश की मात्रा (तेजी से) कम हो जाती है ( चित्रा 3 और चित्रा 4 ए देखें), जिसके परिणामस्वरूप रैखिक लघुगणकीय गहराई प्रोफाइल होते हैं, जो 1 (हरे ट्रेस) के करीब आर-स्क्वायर मानों द्वारा दर्शाया जाता है। यह पैथोलॉजिकल कॉर्निया के लिए सच नहीं हो सकता है जिसमें बढ़े हुए प्रकाश बैकस्कैटर के स्ट्रोमल क्षेत्र होते हैं ( चित्रा 4 बी देखें)। इस तरह की मैक्रोस्कोपिक विशेषताओं की उपस्थिति, जैसा कि संक्रामक केराटाइटिस (इनसेट में दर्शाया गया है) के बाद स्ट्रोमल निशान वाले कॉर्निया के उदाहरण में, इस प्रकार गैर-रैखिक लघुगणकीय तीव्रता गहराई प्रोफाइल बनाएगा, जिसे एक निश्चित सीमा से नीचे आर-वर्ग मान द्वारा दर्शाया गया है (उदाहरण के लिए, 0.9425 से कम; लाल ट्रेस)। ध्यान दें कि लघुगणकीय आयाम गहराई प्रोफाइल वास्तव में दिखाए गए हैं क्योंकि एफएफ-ओसीएम इसकी तीव्रता के बजाय नमूने द्वारा पीछे बिखरे हुए प्रकाश के आयाम को मापता है।  कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 8
चित्रा 8: हिस्टोलॉजी और स्पेक्ट्रल-डोमेन ओसीटी पर एफएफ-ओसीएम के लाभों का प्रदर्शन। (ए) हिस्टोलॉजी और (बी) संबंधित वर्णक्रमीय-डोमेन-ओसीटी छवि केराटोप्लास्टी से पहले विवो में एक ही कॉर्निया पर प्राप्त की गई। (सी) एक्स विवो कॉर्नियल बटन पोस्ट-केराटोप्लास्टी के संबंधित एफएफ-ओसीएम क्रॉस सेक्शन, नैदानिक वर्णक्रमीय-डोमेन ओसीटी छवियों की तुलना में बेहतर रिज़ॉल्यूशन को दर्शाता है। फाइब्रोसिस हिस्टोलॉजी की तुलना में एफएफ-ओसीएम छवियों में भी अधिक स्पष्ट रूप से दिखाई देता है। ऊपरी स्ट्रोमा में केराटोसाइट्स का उच्च घनत्व स्पष्ट रूप से (सी) क्रॉस-सेक्शनल और (डी) दोनों में देखा जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

एफएफ-ओसीएम का उपयोग करके कॉर्नियल डोनर स्ट्रोमा के गुणात्मक और मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए यहां वर्णित प्रोटोकॉल स्पेक्ट्रल-डोमेन ओसीटी और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी21,24,25 की क्षमताओं से परे, स्ट्रोमल स्थिति के संकेत वाले मैक्रोस्कोपिक और माइक्रोस्कोपिक विशेषताओं के हिस्टोलॉजी जैसे विश्लेषण पर आधारित है, और सामान्य मानव ऊतकों से रोगग्रस्त के भेदभाव को सक्षम बनाता है।

स्पेकुलर माइक्रोस्कोपी के माध्यम से मानव दाता कॉर्निया के उत्कृष्ट एंडोथेलियल गुणवत्ता मूल्यांकन के अलावा, स्ट्रोमल गुणवत्ता का आकलन आंखों के बैंकों में चुनौतीपूर्ण है, और आम तौर पर वर्तमान प्रोटोकॉल में स्लिट-लैंप बायोमाइक्रोस्कोपी और / या प्रकाश माइक्रोस्कोपी के साथ सकल अवलोकन तक सीमित है। मौजूदा तरीकों के साथ ठीक समाधान की कमी का मतलब न केवल यह है कि कुछ स्ट्रोमल रोग वाले कॉर्निया का चयन किया जा सकता है जो केराटोप्लास्टी के परिणाम से समझौता करते हैं, बल्कि यह भी कि कॉर्निया को स्ट्रोमल ओपेसिटी के लिए अस्वीकार कर दिया जा सकता है जो वास्तव में पूर्ववर्ती स्ट्रोमा या उपकला क्षेत्रों के लिए बाधा हैं और अभी भी एंडोथेलियल केराटोप्लास्टी प्रक्रियाओंके लिए उपयोग किया जा सकता है।

वर्तमान आई-बैंक प्रोटोकॉल को एफएफ-ओसीएम के अलावा पूरक किया जा सकता है, जो अपने बेहतर रिज़ॉल्यूशन के कारण, कॉर्निया, विशेष रूप से स्ट्रोमा (बोमन की परत सहित) के गुणवत्ता मूल्यांकन को पूरा करने के लिए एक शक्तिशाली और गैर-इनवेसिव उपकरण का गठन करता है। स्लिट-लैंप परीक्षा के विपरीत, ग्राफ्ट एफएफ-ओसीएम छवि अधिग्रहण के दौरान भंडारण माध्यम से भरे एक बंद कक्ष में डूबा रहता है, जिससे संदूषण का कोई संभावित जोखिम कम हो जाता है।

एफएफ-ओसीएम के साथ सफल छवि अधिग्रहण के लिए ( सामग्री की तालिका देखें), माइक्रोस्कोप उद्देश्य के लिए ऑप्टिकल जेल में अच्छी तरह से डूबा होना महत्वपूर्ण है जो नमूना धारक (चरण 2.2.3) के कवरस्लिप के शीर्ष पर लागू होता है। आगे डिवाइस के अंशांकन की नियमित रूप से जांच करने की सिफारिश की जाती है, एक प्रक्रिया जिसे असफल ऑटो-समायोजन (चरण 2.2.2) के बाद भी किया जाना चाहिए और अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में "उपकरण और विकल्प" के माध्यम से एक्सेस किया जाता है ( सामग्री की तालिका देखें)। प्रक्रिया, जिसमें नमूना धारक में अंशांकन दर्पण का उपयोग शामिल है, सामान्य नमूना तैयारी के समान है (चरण 1.2 देखें) सिवाय इसके कि ऑप्टिकल जेल को कवरस्लिप की स्थिति से पहले दर्पण पर लागू किया जाना चाहिए।

दाता कॉर्नियल ग्राफ्ट की एक श्रृंखला, जिसे मौजूदा आई-बैंक प्रक्रियाओं के अनुसार सामान्य स्ट्रोमा माना जाता है, का उपयोग इस पांडुलिपि में प्रोटोकॉल का वर्णन करने और विशेष रूप से दाता स्ट्रोमल गुणवत्ता के सटीक और विश्वसनीय मूल्यांकन के लिए एफएफ-ओसीएम की उपयुक्तता को प्रदर्शित करने के लिए किया गया था। इन सामान्य दाता कॉर्निया की तुलना भंडारण माध्यम में डूबे पैथोलॉजिकल कॉर्निया के साथ की गई थी, जिसमें दिखाया गया था कि हिस्टोलॉजी जैसे विश्लेषण ने कॉर्नियल ग्राफ्ट में कई स्ट्रोमल विशेषताओं (चित्रा 2, चित्रा 3, चित्रा 4, चित्रा 5, चित्रा 6, चित्रा 7, और चित्रा 8 में चित्रित) के एफएफ-ओसीएम के साथ संभव बनाया।

रूपात्मक परिवर्तनों के अलावा, जैसे निशान (चित्रा 5 और चित्रा 7), फाइब्रोटिक ऊतक (चित्रा 8), झीलें (चित्रा 2), वोग्ट स्ट्रिया (चित्रा 4), या बढ़े हुए स्ट्रोमल तंत्रिका व्यास (चित्रा 4), रोगग्रस्त कॉर्निया में विशिष्ट स्ट्रोमल विशेषताएं मौजूद हैं। स्ट्रोमल गुणवत्ता मूल्यांकन में विशेष रूप से प्रासंगिक स्ट्रोमल पैरामीटर बोमन की परत की मोटाई और इसकी परिवर्तनशीलता, और स्ट्रोमल परावर्तकता प्रतीत होते हैं। प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम इस प्रकार चरण 4.1 और 4.3 हैं।

मानव कॉर्नियल विकास के दौरान स्रावित होने के दौरान, बोमन की परत, विशेष रूप से, 19 सप्ताह के गर्भ से अलग हो जाती है और जन्म32 के बाद कभी भी मरम्मत नहीं करती है। बोमन की परत को नुकसान इस प्रकार अपरिवर्तनीय है और दाता कॉर्नियल ऊतक में पिछले स्ट्रोमल क्षति के आदर्श संकेतक के रूप में कार्य करता है, जिसमें अपवर्तक सर्जरी, संक्रामक केराटाइटिस, केराटोकोनस के कारण होने वाली क्षति शामिल है। इस तरह के कॉर्नियल रोग, जो दाता कॉर्नियल उपयोग के लिए मतभेद ों का गठन करते हैं, रुकावट और निशान के कारण बोमन की परत की मोटाई में कमी और चर के साथ जुड़े होते हैं (चित्रा 5), और वर्तमान आंख-बैंक प्रोटोकॉल द्वारा याद किए जाने की संभावना है जब दाता इतिहास ठीक से ज्ञात नहीं होता है।

यद्यपि पोस्ट मॉर्टम कॉर्नियल एडिमा के कारण दाता की मृत्यु के बाद कॉर्नियल पारदर्शिता बिगड़ जाती है, लेकिन बैकस्प्रेटेड प्रकाश, या स्ट्रोमल परावर्तकता की मात्रा स्ट्रोमा में गहराई के साथ तेजी से कम होने की उम्मीद है ( चित्रा 3 और चित्रा 4 ए देखें); नतीजतन, सामान्यीकृत स्ट्रोमल परावर्तकता का लघुगणक सामान्य दाता कॉर्निया में स्ट्रोमल गहराई का एक रैखिक कार्य होगा, जिसे 1 के करीब आर-स्क्वायर मानों द्वारा दर्शाया जाएगा। इसके विपरीत, मैक्रोस्कोपिक विशेषताओं की उपस्थिति गैर-रैखिक लघुगणकीय गहराई प्रोफाइल और स्ट्रोमल रोग (चित्रा 4 बी और चित्रा 7)25 के संकेत से जुड़ी है।

चूंकि केराटोसाइट घनत्व स्ट्रोमल कोलेजन फाइब्रिल और बाह्य मैट्रिक्स संश्लेषण और नवीकरण के लिए जिम्मेदार है, इसलिए यह मानना उचित प्रतीत होता है कि दाता स्ट्रोमल गुणवत्ता का आकलन करने के लिए केराटोसाइट घनत्व एक और प्रासंगिक पैरामीटर है, और यह कि बहुत कम केराटोसाइट गिनती का प्रदर्शन करने वाले ऊतकों को प्रत्यारोपित नहीं किया जाना चाहिए। इसलिए प्रोटोकॉल में एफएफ-ओसीएम छवियों से केराटोसाइट घनत्व को मापने के लिए एक सटीक और विश्वसनीय विधि शामिल है जिसे आसानी से आंखों के बैंक25 में उपयोग किया जा सकता है और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के सम्मेलन का पालन करता है। ध्यान दें कि एफएफ-ओसीएम के साथ, केराटोसाइट घनत्व को क्रॉस-सेक्शनल व्यू33 में सीधे केराटोसाइट्स की गिनती करके भी निर्धारित किया जा सकता है, जो कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी पर एक संभावित लाभ है, जिसके लिए केराटोसाइट्स को कई एन फेस स्लाइस पर गिना जाना आवश्यक है। हालांकि, जीवित रोगियों के विपरीत, जहां केराटोसाइट घनत्व सामान्य नियंत्रण34,35,36,37 की तुलना में रोग रोगियों में कम दिखाया गया है और रोग की गंभीरता34,38 के साथ सहसंबंधित है, मानव पूर्व विवो ऊतक नमूने25 में ऐसा नहीं था। , और यह निर्धारित करने के लिए आगे के अध्ययन आवश्यक हैं कि प्रत्यारोपण के बाद अच्छी दृश्य वसूली के परिणामस्वरूप दाता कॉर्निया में केराटोसाइट्स की न्यूनतम संख्या की आवश्यकता होती है या नहीं। पैथोलॉजिकल ऊतक के रूप में दाता ऊतक में कम केराटोसाइट घनत्व को उम्र बढ़ने, इस्केमिया से प्रेरित कोशिकाओं के पोस्टमार्टम नुकसान और / या दाता ऊतक 27,39,40,41 के भंडारण से समझाया जा सकता है। यह भी बताया जाना चाहिए कि इस प्रोटोकॉल में प्राप्त और चित्रित किए गए सामान्य दाता कॉर्निया को या तो संग्रहीत और एडेमेटस या डी-बूस्ट किया गया था, या यूरोपीय संघ के आई बैंक एसोसिएशन के मानकों के अनुसार खराब एंडोथेलियल गुणवत्ता के कारण प्रत्यारोपण से पहले नेत्र बैंक द्वारा छोड़ दिया गया था। यदि एफएफ-ओसीएम इमेजिंग को आंखों के बैंक सेटिंग में शामिल करने के लिए वर्णित प्रोटोकॉल के साथ किया जाता है, तो कॉर्निया का मूल्यांकन आमतौर पर यहां संभव होने की तुलना में एक ताजा स्थिति में किया जाएगा, जो केराटोसाइट घनत्व को प्रभावित कर सकता है।

स्ट्रोमल गुणवत्ता विश्लेषण के लिए यहां वर्णित प्रोटोकॉल को डेसेमेट की झिल्ली के मूल्यांकन के लिए बढ़ाया जा सकता है, जिसे मोटाई और संरचना21,24 के संदर्भ में एफएफ-ओसीएम के साथ भी हल किया जा सकता है। यह डेसेमेट की झिल्ली एंडोथेलियल केराटोप्लास्टी के लिए ऊतकों के चयन के लिए उपयोगी साबित हो सकता है, जहां पतली डेसेमेट की झिल्ली को स्ट्रोमा से अलग करना अधिक कठिन हो सकता है।

अंत में, एफएफ-ओसीएम भंडारण के दौरान मानव दाता कॉर्नियल स्ट्रोमा के सटीक और विश्वसनीय मूल्यांकन को सक्षम बनाता है। ग्राफ्ट गुणवत्ता में सुधार करके, वर्तमान नेत्र-बैंकिंग प्रक्रियाओं में इस प्रोटोकॉल के अतिरिक्त दाता ऊतकों की स्क्रीनिंग और चयन में सुधार करने की क्षमता है, और इसलिए केराटोप्लास्टी के परिणाम हैं। आई-बैंक रूटीन में एफएफ-ओसीएम डिवाइस के वास्तविक जीवन एकीकरण को हाल के तकनीकी अपडेट द्वारा सुविधाजनक बनाया जाना चाहिए, जिसमें कस्टम सीएमओएस कैमरे के विकास के लिए तेजी से छवि अधिग्रहण और बड़े क्षेत्र और इमेजिंग के दौरान कॉर्निया भंडारण और हैंडलिंग के लिए कस्टम बाँझ डिस्पोजेबल कैसेट का डिजाइन शामिल है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को एजेंस नेशनल डी रेचरचे (एएनआर), एक पीआरटीएस (प्रोजेट डी रेचरचे ट्रांसलेशने एन सैंटे) अनुदान संख्या एएनआर -13-पीआरटीएस -0009 (वीबी) के तहत और यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम से मैरी स्कोडोव्स्का-क्यूरी अनुदान समझौते नंबर 709104 (केआई) के तहत धन प्राप्त हुआ है। लेखक सेल गिनती और हिस्टोलॉजिकल प्रोसेसिंग में मदद के लिए सेलिन डी सूसा को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Light-CT Scanner LLTech, France http://www.lltechimaging.com/products-applications/products/ FF-OCM device used in this manuscript for imaging
CorneaJet EuroBio, France http://www.eurobio-cornea.com/en/corneamax-10-100-ml-xml-352-822.html Organ culture medium in which donor corneas are stored
CorneaMax EuroBio, France http://www.eurobio-cornea.com/en/corneajet-10-50-ml-xml-352-823.html Dextran-supplemented organ culture medium used for deturgescence 
Fiji (ImageJ) National Institute of Health, Bethesda, MD, USA https://fiji.sc/ Open source image processing software
Matlab Mathworks, Inc., Natick, MA, USA https://www.mathworks.com/products/matlab.html Mathematical computing software

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Irsch, K., Grieve, K., Borderie, M., Vilbert, M., Plamann, K., Ghoubay, D., Georgeon, C., Borderie, V. Full-Field Optical Coherence Microscopy for Histology-Like Analysis of Stromal Features in Corneal Grafts. J. Vis. Exp. (188), e57104, doi:10.3791/57104 (2022).

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