Summary
We beschrijven het gebruik van full-field optische coherentiemicroscopie als een methode voor een hoogwaardige beoordeling van corneadonorstroma. Dit protocol kan worden gebruikt om kenmerken te identificeren die wijzen op gezondheid of ziekte, en is gericht op het verbeteren van de screening en selectie van donorweefsels, en dus de resultaten van keratoplastiek.
Abstract
De kwaliteit van het hoornvliesstroma van de donor, dat ongeveer 90% van de totale hoornvliesdikte uitmaakt, is waarschijnlijk een van de belangrijkste, zo niet de belangrijkste, beperkende factor (en) voor het succes van diepe voorste lamellaire en penetrerende keratoplastiek. Dit zijn chirurgische procedures waarbij een deel of alle zieke hoornvlieslagen worden vervangen door respectievelijk gedoneerd weefsel, het transplantaat, genomen van een onlangs overleden persoon. De middelen om de stromale kwaliteit van hoornvliestransplantaten in oogbanken te evalueren zijn echter beperkt en missen het vermogen van kwantitatieve beoordeling met hoge resolutie van ziekte-indicatoren. Full-field optische coherentiemicroscopie (FF-OCM), die 3D-beeldvorming met hoge resolutie van verse of vaste ex vivo biologische weefselmonsters mogelijk maakt, is een niet-invasieve techniek die zeer geschikt is voor de beoordeling van het donorhoornvlies. Hier beschrijven we een methode voor de kwalitatieve en kwantitatieve analyse van corneastroma met behulp van FF-OCM. Het protocol is met succes toegepast op normale donorhoornvliezen en pathologische hoornvliesknoppen en kan worden gebruikt om gezonde en pathologische kenmerken op zowel macroscopisch als microscopisch niveau te identificeren, waardoor de detectie van stromale stoornissen die de uitkomst van keratoplastiek in gevaar kunnen brengen, wordt vergemakkelijkt. Door de kwaliteitscontrole van het transplantaat te verbeteren, heeft dit protocol het potentieel om te resulteren in een betere selectie (en afstoting) van donorweefsels en dus minder transplantaatfalen.
Introduction
Hoornvliesaandoeningen behoren wereldwijd tot de belangrijkste oorzaken van blindheid1. Sommige ziekten kunnen alleen chirurgisch worden behandeld, vaak met de vervanging van een deel (d.w.z. lamellaire keratoplastiek) of het gehele (d.w.z. doordringende keratoplastiek) zieke hoornvlies, door gedoneerd weefsel, het transplantaat, genomen van een onlangs overleden persoon. Voor hoornvliesaandoeningen die het endotheel niet beïnvloeden (bijv. Keratoconus, stromale littekens na infectieuze keratitis, trauma en stromale dystrofieën), wordt diepe anterieure lamellaire keratoplastiek (DALK) momenteel beschouwd als de chirurgische techniek van keuze 2,3,4,5. Deze techniek maakt het behoud van het cornea-endotheel van de ontvanger mogelijk, door alleen het centrale cornea-epitheel en stroma te vervangen, wat geassocieerd is met een lagere incidentie van transplantaatafstoting, afwezigheid van endotheelafstoting, lager endotheelcelverlies en gunstige kosteneffectiviteitsratio 6,7,8,9,10,11 . DALK maakt het verder mogelijk om hoornvliezen met een minder dan optimale endotheelkwaliteit te gebruiken als grafts, omdat deze aangetaste laag niet zal worden getransplanteerd12. Omgekeerd is de kwaliteit van het donorvliesstroma waarschijnlijk de belangrijkste beperkende factor voor het succes van het transplantaat en het herstel van het gezichtsvermogen, omdat het stroma de enige donorhoornvlieslaag is die overblijft, terwijl het donorepitheel zal worden vervangen door ontvangend epitheel. Helaas zijn de middelen om het hoornvliesstroma van de donor in oogbanken te beoordelen beperkt. Ze omvatten meestal spleetlamponderzoek van de donoroogbol wanneer weefselopvraging wordt uitgevoerd door enucleatie en lichtmicroscooponderzoek van het donorstroma13. Sommige oogbanken zijn begonnen met het aanvullen van dergelijke standaardprocedures met behulp van Fourier-domein optische coherentietomografie (FD-OCT)14.
Oftalmische optische coherentietomografie (OCT), een optisch analoog aan echografie15, maakt gebruik van interferentie van breedband of afstembaar licht om optische secties van het netvlies 16 en het voorste segment17 te genereren. In tijdsdomein OCT, de basis van vroege klinische systemen, wordt de positie van een referentiespiegel gewijzigd, zodat interferentiepatronen verschijnen wanneer de referentiebundel bijna dezelfde hoeveelheid tijd heeft afgelegd als de bundel die wordt gereflecteerd op de verschillende weefselinterfaces, waarbij A-scans worden gegenereerd als functie van de tijd. In FD-OCT (ook wel spectraal- of frequentiedomein OCT genoemd), de basis van de meeste moderne klinische systemen, wordt de referentiespiegel op één positie gefixeerd en wordt een individuele A-scan, met alle interferentiepatronen door elkaar, per keer verkregen en uit elkaar ontleed via Fourier-analyse.
Hoewel klinische (tijd- of spectraal-domein) OCT-systemen dwarsdoorsnedes van het hoornvlies en de detectie van stromale opaciteiten met een hogere axiale resolutie dan spleetlampbiomicroscopie mogelijk maken, is hun laterale resolutie beperkt. Confocale microscopie18 maakt onderzoek van het hoornvlies mogelijk met een laterale resolutie die histologisch detail benadert, maar is axiaal beperkt.
Full-field optische coherentie tomografische microscopie (FF-OCT of FF-OCM)19,20 combineert elementen van zowel confocale microscopie als OCT, waardoor een laterale resolutie wordt bereikt die vergelijkbaar is met de axiale resolutie van ongeveer 1 μm. Meer specifiek maakt FF-OCM gebruik van onsamenhangende breedbandlichtbronnen (bijv. een halogeenlamp) en optica met een hoog numeriek diafragma om 2D-tomografische beelden te verkrijgen zonder laterale scanning. Door in de diepterichting te scannen, maakt FF-OCM niet-invasieve 3D-beeldvorming van verse of vaste ex vivo biologische weefselmonsters mogelijk. Het is gebruikt om het hoornvlies21,22,23 in beeld te brengen. Door zowel hoge resolutie en face als cross-sectionele weergaven te bieden, biedt FF-OCM informatie over zowel de histologische structuur als cellulaire details van het hoornvlies. In feite is aangetoond dat FF-OCM structurele informatie biedt die superieur is aan histologie en was in staat om meer ziekte-indicatoren te identificeren zoals mogelijk was met de combinatie van spectraal-domein OCT en confocale microscopie24,25.
Hier beschrijven we een protocol voor de kwalitatieve en kwantitatieve beoordeling van corneadonorstroma met behulp van FF-OCM. De methode is gebaseerd op de histologie-achtige analyse van macroscopische en microscopische kenmerken die wijzen op stromale toestand, waaronder drie kwantitatieve stromale parameters (d.w.z. Bowman's laagdikte en zijn variabiliteit, en stromale reflectiviteit). Het beschreven protocol wordt daarom toegepast op normale en abnormale hoornvliesweefsels en maakt differentiatie van zieke van normale menselijke hoornvliesweefsels mogelijk.
Protocol
Alle hier beschreven methoden werden uitgevoerd volgens de principes van de Verklaring van Helsinki en volgden de internationale ethische vereisten voor menselijke weefsels. Dit was een prospectieve observationele case control studie. Geïnformeerde toestemming werd verkregen van patiënten. Er werden geen wijzigingen aangebracht in de Franse normen voor behandeling of follow-up. De goedkeuring van de Institutional Review Board (IRB) werd verkregen van het Comité voor patiëntenbescherming, Ile-de-France V (14944).
1. Weefselselectie en -voorbereiding
- Selecteer donorhoornvliezen.
- Breng donorhoornvliezen die zijn opgeslagen in orgaankweekmedium 26 gedurende 3 dagen over naar dextran-aangevuld orgaankweekmedium om deturgescence27 mogelijk te maken voorafgaand aan FF-OCM-beeldvorming28 (zie tabel met materialen).
- Bereid de monsters voor.
- Plaats het hoornvlies, ondergedompeld in opslagmedium, in de monsterhouder met het epitheel naar boven gericht.
- Plaats een schone silica coverslip (meegeleverd met de monsterhouder) bovenop het hoornvlies en sluit de houder door de basis voorzichtig te draaien totdat het monster enigszins is afgeplat en geïmmobiliseerd onder de afdekplaat, waardoor een relatief gelijkmatig beeldoppervlak ontstaat. Neem voorzorgsmaatregelen om luchtbellen te voorkomen.
- Breng een dikke laag oogheelkundige of optische gel aan op de dekplaat als onderdompelingsmedium.
2. FF-OCM initialisatie, setup en image acquisitie
- Initialiseer het apparaat.
- Schakel het apparaat in door de aan/uit-schakelaar aan de achterkant van het apparaat te bedienen; verlichting van een groene LED aan de voorkant van het apparaat geeft aan dat de stroom is ingeschakeld.
- Schakel de speciale computer en halogeenlichtbron in door de aan/uit-schakelaar aan de voorkant te bedienen.
- Start de acquisitiesoftware (zie Materiaaltabel) door te dubbelklikken op de snelkoppeling op het bureaublad.
- Zorg ervoor dat de beeldvormingsfase vrij is, behalve de verplaatsbare lade. Klik vervolgens op "OK" om de motoren bij de prompt te initialiseren.
- Trek de lade uit en plaats de monsterhouder in de speciale container en duw de lade voorzichtig terug.
- Stel het apparaat in.
- Voer een "voorbeeld-ID" in het aangewezen en verplichte veld in; Voer eventueel een "voorbeeldbeschrijving" en/of "onderzoeksbeschrijving" in.
- Klik op "Macro-afbeelding verkrijgen" wanneer u klaar bent, om een momentopname van het voorbeeld te maken die later kan worden gebruikt voor laterale positionering en navigatiedoeleinden; eenmaal voldaan, valideert u de afbeelding bij de prompt door op "Ja" te klikken, waarna het apparaat de monsterlade onder het doel verplaatst en een automatische aanpassing uitvoert.
- Zorg ervoor dat het microscoopobjectief goed is ondergedompeld in de optische gel voordat u verder gaat.
- Verwerf de stapels.
- Selecteer het tabblad "Verkennen" om een acquisitie voor te bereiden.
- Voordat u een stapel afbeeldingen verwerft, navigeert u naar het midden van het hoornvlies, via vertaling van de joystick of handmatige selectie op het scherm (dat wil zeggen door op het rode vierkant op de verkregen macroafbeelding te klikken en naar de gewenste locatie te slepen).
- Varieer de beelddiepte via rotatie van de joystick, aanpassing van de schuifregelaar of handmatige toetsenbordinvoer in de grafische gebruikersinterface (GUI) en pas de gemiddelde waarde aan (een gemiddelde van 40 wordt over het algemeen aanbevolen voor optimale corneabeeldvorming).
OPMERKING: Dit wordt gedaan om de dikte van het hoornvliesmonster te bepalen en het gemiddelde dat nodig is om de volledige hoornvliesdikte in beeld te brengen terwijl de eerste en laatste beeldlocatie in de diepte worden genoteerd. Het onderste oppervlak van de coverslip creëert parallelle interferentieranden die te zien zijn op het tomografische beeld (aan de rechterkant van de GUI), die het lokaliseren van het hoornvliesoppervlak vergemakkelijken. - Voer de waarde van het hoornvliesoppervlak of de eerste afbeeldingslocatie in de diepte in het veld "Diepte" in.
- Selecteer het tabblad "Verwerven" om afbeeldingen te verkrijgen.
- Selecteer de "Slice spacing" (de standaard en aanbevolen instelling is 1 μm, overeenkomend met de axiale resolutie van het apparaat) en voer de corneadiktewaarde dienovereenkomstig in onder "Aantal plakjes".
- Bekijk parameters en acquisitietijd en druk wanneer u tevreden bent op "OK" om de overname te starten.
- Vermijd tijdens de overname elk contact met de tafel waarop het FF-OCM is geplaatst.
- Selecteer het tabblad "Verkennen" om een acquisitie voor te bereiden.
3. Beheer van verworven beelden
- Bekijk en exporteer afbeeldingen.
- Start de FF-OCM-weergavesoftware (zie Materiaaltabel) door te dubbelklikken op de snelkoppeling op het bureaublad; verkregen afbeeldingen (geïdentificeerd door de voorbeeld-ID) verschijnen in de lijst "Lokale studies".
- Selecteer de studie met de bijbehorende voorbeeld-ID, die zowel de macroafbeelding als de verkregen afbeeldingsstapel bevat, en "exporteer" de laatste door met de rechtermuisknop op de reeks afbeeldingen te klikken en het "DICOM" -formaat te selecteren om de onbewerkte pixelgegevens en metagegevens te behouden voor verdere analyse.
- Geef de 3D-beeldstapels weer in en face- en cross-sectionele weergaven met behulp van de multiplanaire reconstructie (MPR) -modus, door te dubbelklikken op de reeks afbeeldingen; Navigeer door de afbeeldingen (bijvoorbeeld via muiswiel scrollen of schuifregelaaraanpassing) en selecteer representatieve En Face - en Cross-Sectional weergaven van elke stapel.
- Exporteer de geselecteerde weergaven door op het pictogram rechtsonder in het venster te klikken met behulp van het "DICOM" -formaat.
- Afbeeldingen importeren.
- Open de beeldverwerkingssoftware (zie Materiaaltabel) door te dubbelklikken op de snelkoppeling op het bureaublad en navigeer naar de "Bio-Formats" "Importer" onder "Plug-ins" om DICOM-afbeeldingen te importeren; zorg ervoor dat "Bestanden met vergelijkbare namen groeperen" is geselecteerd in het venster "Bio-Formats Import Options".
4. Beeldanalyse: kwalitatieve en kwantitatieve beoordeling van stromale morfologie en kenmerken
- Beoordeel de laagdikte van stromal en Bowman.
- Meet afstanden handmatig op corneadoorsneden, bijvoorbeeld op vijf even ver uit elkaar liggende punten over de doorsnede25.
- Trek een lijn tussen twee punten van bekende afstand (zoals van links naar rechts van de hele afbeelding, dat wil zeggen volgens het standaardgezichtsveld, 1.024 pixels of 780 μm), ga naar "Analyseren" en selecteer "Schaal instellen" en voer de "Bekende afstand" en "Lengte-eenheid" in de juiste velden in en klik op "OK".
- Trek een lijn tussen twee punten van onbekende afstand; Lees de lengte of afstand die rechtstreeks vanuit de statusbalk is gemeten.
- Noteer het gemiddelde en de variatiecoëfficiënt (COV). Bowman's laagdikte van minder dan 6,5 μm en een COV van meer dan 18,6% zijn in verband gebracht met abnormaal corneastroma25.
- Meet afstanden handmatig op corneadoorsneden, bijvoorbeeld op vijf even ver uit elkaar liggende punten over de doorsnede25.
- Bepaal de keratocytendichtheid.
- Volgens de conventie van confocale microscopie: som stromale en face beelden in groepen van 7 om plakjes van vergelijkbare dikte te produceren. Ga hiervoor naar het tabblad "Afbeelding" en selecteer "Reslice Z" onder "Stapels".
- Houd rekening met de verschillende (afnemende) celdichtheid bij progressie door het stroma24,25. Hiervoor kan het stroma worden beschouwd als samengesteld uit 4 gebieden volgens diepte: (1) het zeer voorste stroma onder de laag van Bowman, dat is 2% van de gehele stromale dikte; het resterende stroma (dat wil zeggen 98% van de gehele stromale dikte), met drie zones van identieke dikte: (2) voorste stroma, (3) middenstroma en (4) achterste stroma.
- Neem voor verdere analyse alle beschikbare en face slices voor het zeer voorste stroma, 15 beelden voor het voorste stroma, 5 beelden voor het midstroma en 5 afbeeldingen voor het achterste stroma op (waarbij het aantal beelden per regio dat nodig is voor een betrouwbare telling werd bepaald door stapsgewijze analyse29).
- Selecteer op elke afbeelding met het gezicht een interessegebied van 300 μm x 300 μm. Om de kernvisualisatie te verbeteren, keert u de afbeelding om met behulp van "Omkeren" onder het tabblad "Bewerken" en past u het contrast en de helderheid aan. Ga voor dit laatste naar "Afbeelding" en navigeer naar "Helderheid / contrast" onder "Analyseren".
- Tel handmatig celkernen, bijvoorbeeld met behulp van de "celteller"-functie25. Ga hiervoor naar "Plug-ins" en navigeer naar "Celteller" onder "Analyseren". Druk op "initialiseren" en selecteer vervolgens een itemtype. Begin vervolgens met het tellen van de celkernen door op donkere ovale kenmerken in de omgekeerde afbeelding te klikken, rekening houdend met die landen op een afbeeldingsrand alleen voor twee van de vier zijden van de afbeelding25.
- Noteer de celdichtheid in termen van oppervlaktedichtheid, dat wil zeggen in cellen/mm² (deel het aantal getelde cellen door 0,09, om van cellen/90.000 μm² om te zetten in cellen/mm²), volgens confocale microscopieconventie waarbij is aangetoond dat de keratocytendichtheden lager zijn bij patiënten (bijvoorbeeld met keratoconus) dan bij gezonde proefpersonen en gecorreleerd zijn met de ernst van de ziekte25.
OPMERKING: Verdere klinische studies zijn nodig om te bepalen of een minimale drempel van keratocytendichtheid nodig is om een perfect helder hoornvliestransplantaat na transplantatie te verkrijgen.
- Beoordeel de stromale reflectiviteit.
- Genereer gemiddelde intensiteitsdiepteprofielen van stromale beeldstapels, bijvoorbeeld met behulp van de functie "Z-asprofiel" en/of aangepaste software25,30,31.
OPMERKING: Dit zijn in feite amplitudediepteprofielen, aangezien FF-OCM de amplitude meet van licht dat door het monster wordt teruggekaatst in plaats van de intensiteit ervan.- Bereken het gemiddelde grijsniveau voor elke en face stack.
- Trek de minimale grijswaarde af en normaliseer met de maximale grijswaarde.
- Weergave in logschaal als functie van de stromale diepte (% van de stromale dikte).
- Benader het resulterende logaritmische profiel met een lineaire regressielijn, die de som van de kwadratische residuen minimaliseert (minst-kwadraten passen).
- Noteer de R-kwadraatwaarde (R²) als een maat voor lineariteit. Waarden lager dan 0,94 kunnen een indicatie zijn van hoornvliespathologie25.
OPMERKING: Om de ontoereikendheid van een lineair logaritmisch regressiemodel (of een mono-exponentieel vervalmodel) als gevolg van de aanwezigheid van een pathologie te onderscheiden van louter meetruis, kan signaalanalyse door Bayesiaanse inferentie worden uitgevoerd31. Ook in hoornvliezen met lineaire logaritmische (of mono-exponentiële) stromale diepteprofielen (bijvoorbeeld weergegeven door R-kwadraatwaarden30 of Birge-verhoudingen 31 dicht bij 1), kan de berekening van het fotongemiddelde vrije pad van de snelheid van signaalverval worden gebruikt om de mate van transparantie31 verder te kwantificeren.
- Genereer gemiddelde intensiteitsdiepteprofielen van stromale beeldstapels, bijvoorbeeld met behulp van de functie "Z-asprofiel" en/of aangepaste software25,30,31.
- Beoordeel de zichtbaarheid van andere stromale kenmerken en ziekte-indicatoren.
- Controleer op de aanwezigheid van littekens, fibrotisch weefsel, meren of Vogt striae.
- Beoordeel de gemiddelde dikte van zenuwen in het stroma, indien voldoende zichtbaar voor meting24.
- Selecteer een en face afbeelding waar de stromale zenuw het meest zichtbaar is (meestal in het midden-stromale gebied).
- Meet de dikte van de zenuw, bijvoorbeeld op vijf punten24, en bereken vervolgens het gemiddelde en de standaarddeviatie. Zenuwdiktes boven 9 μm kunnen een extra indicator zijn voor pathologie, zoals keratoconus24.
Representative Results
Het FF-OCM-apparaat (zie materiaaltabel)28 en de algemene opstelling die in dit manuscript wordt gebruikt, zijn weergegeven in figuur 1. Figuur 2 toont een opgezwollen menselijk donorhoornvlies na opslag in orgaankweekmedium, wat een pathofysiologisch model van oedemateus hoornvlies geeft en FF-OCM-beeldverwerving door de gehele hoornvliesdikte voorkomt vanwege de beperkte penetratiediepte. Overdracht naar met dextran aangevuld orgaankweekmedium veroorzaakt deswelling en resulteert in donorhoornvliezen van normale dikte, zoals weergegeven in figuur 3. Zieke hoornvliezen zijn te herkennen aan morfologische veranderingen en typische stromale kenmerken, waaronder een verminderde en variabele dikte van het stroma (figuur 4) en/of de laag van Bowman (figuur 5). Beoordeling van de keratocytendichtheid (figuur 6) en stromale reflectiviteit (figuur 7) kan verder helpen bij de histologie-achtige analyse en differentiatie van normale van pathologische corneaweefsels met FF-OCM, buiten de mogelijkheden van klinische OCT-systemen (figuur 8).
Figuur 1: Schema en foto's van de algemene opstelling en het FF-OCM-apparaat dat in dit werk wordt gebruikt. (A) Foto van het FF-OCM-apparaat (zie materiaaltabel)28. (B) Schematische en optische opstelling van het apparaat. C) Foto van een menselijk donorhoornvlies in de monsterhouder. (D) Zoom in op het onderdompelingsdoel en de monsterhouder. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Orgaangekweekt normaal menselijk hoornvlies vóór deturgescence. Doorsnede (A) en en face view (B, snijd door het stroma) van gezwollen ("oedemateus") hoornvlies veroorzaakt door opslag in orgaankweekmedium, waar meren kunnen worden gezien als donkere gebieden (zoals aangegeven door pijlen). De dikte van het hoornvlies is verdubbeld tot meer dan 1.100 μm, waardoor beeldacquisitie over de hele diepte wordt voorkomen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Orgaangekweekt normaal menselijk hoornvlies na deturgescence. Cross-sectioneel zicht door het gehele hoornvlies (A) en en face stromale weergave (B) van het opgezwollen hoornvlies ondergedompeld in dextran-aangevuld medium, met regelmatig verdeelde hyperreflecterende (witte) keratocyten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Algemene beoordeling van stromale morfologie en kenmerken, inclusief stromale dikte. Vergeleken met normale menselijke hoornvliezen (A), hebben hoornvliezen met keratoconus (B) een verminderde en variabele stromale dikte, samen met talrijke, parallelle Vogt-striae die waarneembaar zijn als donkere verticale banden in dwarsdoorsneden, en dikke stromale zenuwen die kunnen worden gevonden in mid-stromale en face slices (C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Beoordeling van Bowman's laagdikte, die anterieur wordt afgebakend door het hyperreflecterende epitheliale keldermembraan en posterieur door de hyperreflecterende keratocyten in het voorste stroma. Vergeleken met een normaal menselijk hoornvlies (A), heeft pathologisch hoornvlies (bijv. keratoconus) (B) een verminderde en variabele laagdikte van Bowman als gevolg van onderbreking en littekens. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Beoordeling van de keratocytendichtheid. (A) Keratocytenkernen worden handmatig geteld op verbeterde en omgekeerde en gezichtsopnamen na selectie van een interessant gebied van 300 μm x 300 μm. (B) Getelde kernen worden aangegeven met pijlen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Beoordeling van stromale reflectiviteit. De hoeveelheid teruggekaatst licht neemt (exponentieel) af met de diepte in het stroma van normale donorhoornvliezen (zie figuur 3 en figuur 4A), wat resulteert in lineaire logaritmische diepteprofielen, weergegeven door R-kwadraatwaarden dicht bij 1 (groen spoor). Dit geldt mogelijk niet voor pathologische hoornvliezen met stromale gebieden met verhoogde lichtterugkaatter (zie figuur 4B). De aanwezigheid van dergelijke macroscopische kenmerken, zoals in het voorbeeld van een hoornvlies met stromaal litteken na infectieuze keratitis (afgebeeld in de inzet), zal dus niet-lineaire logaritmische intensiteitsdiepteprofielen creëren, weergegeven door een R-kwadraatwaarde onder een bepaalde drempel (bijvoorbeeld lager dan 0,9425; rood spoor). Merk op dat logaritmische amplitudediepteprofielen in feite worden weergegeven als FF-OCM meet de amplitude van licht dat door het monster wordt teruggekaatst in plaats van de intensiteit ervan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Demonstratie van de voordelen van FF-OCM ten opzichte van histologie en spectraal-domein OCT. (A) Histologie en (B) corresponderend spectraal-domein-OCT-beeld verkregen op hetzelfde hoornvlies in vivo voorafgaand aan keratoplastiek. (C) Overeenkomstige FF-OCM-doorsnede van de ex vivo corneaknop na keratoplastiek, wat een superieure resolutie illustreert in vergelijking met de klinische spectraal-domein OCT-beelden. De fibrose is ook duidelijker zichtbaar in FF-OCM-beelden dan in de histologie. De hoge dichtheid van keratocyten in het bovenste stroma is duidelijk te zien in zowel de (C) dwarsdoorsnede als (D) en face aanzichten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Het hier beschreven protocol voor de kwalitatieve en kwantitatieve beoordeling van corneadonorstroma met behulp van FF-OCM is gebaseerd op de histologie-achtige analyse van macroscopische en microscopische kenmerken die wijzen op stromale toestand, buiten de mogelijkheden van spectraal-domein OCT en confocale microscopie21,24,25, en maakt differentiatie van zieke van normale menselijke weefsels mogelijk.
Afgezien van een uitstekende endotheelkwaliteitsbeoordeling van menselijke donorhoornvliezen door middel van spiegelmicroscopie, is de beoordeling van stromale kwaliteit een uitdaging in oogbanken, en over het algemeen beperkt tot een grove waarneming met spleetlampbiomicroscopie en / of lichtmicroscopie in de huidige protocollen. Gebrek aan fijne resolutie met bestaande methoden betekent niet alleen dat hoornvliezen met een stromale ziekte kunnen worden geselecteerd die het resultaat van keratoplastiek in gevaar brengen, maar ook dat hoornvliezen kunnen worden afgewezen voor stromale opaciteiten die in feite beperkend zijn voor voorste stroma of epitheelgebieden en nog steeds kunnen worden gebruikt voor endotheelkeratoplastiekprocedures14.
Het huidige oogbankprotocol zou kunnen worden aangevuld met de toevoeging van FF-OCM, dat vanwege zijn superieure resolutie een krachtig en niet-invasief hulpmiddel vormt om de kwaliteitsbeoordeling van het hoornvlies, met name het stroma (inclusief de laag van Bowman), te voltooien. In tegenstelling tot tijdens het onderzoek van de spleetlamp, blijft het transplantaat tijdens de FF-OCM-beeldacquisitie ondergedompeld in een gesloten kamer gevuld met opslagmedium, waardoor het potentiële risico op verontreiniging wordt verminderd.
Voor een succesvolle beeldacquisitie met FF-OCM (zie Materiaaltabel) is het belangrijk dat het microscoopobjectief goed wordt ondergedompeld in de optische gel die bovenop de afdekplaat van de monsterhouder wordt aangebracht (stap 2.2.3). Het wordt verder aanbevolen om de kalibratie van het apparaat regelmatig te controleren, een procedure die ook moet worden uitgevoerd na mislukte automatische aanpassing (stap 2.2.2) en toegankelijk is via "Tools en opties" in de acquisitiesoftware (zie Materiaaltabel). De procedure, waarbij een kalibratiespiegel in de monsterhouder wordt gebruikt, is dezelfde als de gebruikelijke monstervoorbereiding (zie stap 1.2), behalve dat de optische gel op de spiegel moet worden aangebracht voordat de afdekplaat wordt geplaatst.
Een reeks donorhoornvliestransplantaten, die volgens de bestaande oogbankprocedures als normaal stroma worden beschouwd, werden gebruikt om het protocol in dit manuscript te beschrijven en specifiek de geschiktheid van FF-OCM aan te tonen voor een nauwkeurige en betrouwbare beoordeling van de donorstromale kwaliteit. Deze normale donorhoornvliezen werden vergeleken met pathologische hoornvliezen ondergedompeld in opslagmedium, waaruit blijkt dat de histologie-achtige analyse die mogelijk is gemaakt met FF-OCM van verschillende stromale kenmerken (geïllustreerd in figuur 2, figuur 3, figuur 4, figuur 5, figuur 6, figuur 7 en figuur 8) in hoornvliestransplantaten het mogelijk maakt om zieke van normale menselijke hoornvliesweefsels te onderscheiden.
Afgezien van morfologische veranderingen, zoals de aanwezigheid van littekens (figuur 5 en figuur 7), fibrotisch weefsel (figuur 8), meren (figuur 2), Vogt striae (figuur 4) of verhoogde stromale zenuwdiameter (figuur 4), zijn typische stromale kenmerken aanwezig in zieke hoornvliezen. Stromale parameters die met name relevant zijn in de stromale kwaliteitsbeoordeling lijken de laagdikte en de variabiliteit van Bowman en de stromale reflectiviteit te zijn. Kritische stappen binnen het protocol zijn dus stappen 4.1 en 4.3.
Terwijl het wordt uitgescheiden tijdens de ontwikkeling van het menselijk hoornvlies, wordt met name de laag van Bowman onderscheiden door 19 weken zwangerschap en herstelt nooit na de geboorte32. Schade aan de laag van Bowman is dus onomkeerbaar en dient als een ideale indicator van eerdere stromale schade in donorhoornvliesweefsel, inclusief schade veroorzaakt door refractieve chirurgie, infectieuze keratitis, keratoconus. Dergelijke hoornvliesaandoeningen, die contra-indicaties vormen voor het gebruik van het hoornvlies van donoren, zijn geassocieerd met een verminderde en variabele laagdikte van Bowman als gevolg van onderbreking en littekens (figuur 5) en zullen waarschijnlijk worden gemist door de huidige oogbankprotocollen wanneer de donorgeschiedenis niet precies bekend is.
Hoewel de transparantie van het hoornvlies na donorsterfte wordt aangetast als gevolg van post mortem cornea-oedeem, zal de hoeveelheid teruggekaatst licht of stromale reflectiviteit naar verwachting exponentieel afnemen met de diepte in het stroma (zie figuur 3 en figuur 4A); als gevolg hiervan zal de logaritme van genormaliseerde stromale reflectiviteit een lineaire functie zijn van stromale diepte in normale donorhoornvliezen, weergegeven door R-kwadraatwaarden dicht bij 1. Omgekeerd is de aanwezigheid van macroscopische kenmerken geassocieerd met niet-lineaire logaritmische diepteprofielen en indicatief voor stromale ziekte (figuur 4B en figuur 7)25.
Aangezien keratocytendichtheid verantwoordelijk is voor de synthese en vernieuwing van stromale collageenfibril en extracellulaire matrix, lijkt het redelijk om aan te nemen dat keratocytendichtheid een andere relevante parameter is voor het beoordelen van de donorstromale kwaliteit, en dat weefsels met een zeer laag aantal keratocyten niet mogen worden getransplanteerd. Het protocol bevat daarom een nauwkeurige en betrouwbare methode om keratocytendichtheid te meten uit FF-OCM-beelden die gemakkelijk kunnen worden gebruikt in oogbanken25 en volgt de conventie van confocale microscopie. Merk op dat met FF-OCM de keratocytendichtheid ook kan worden bepaald door keratocyten direct in de dwarsdoorsnedete tellen 33, een potentieel voordeel ten opzichte van confocale microscopie, waarbij keratocyten op meerdere en face slices moeten worden geteld. In tegenstelling tot bij levende patiënten, waar is aangetoond dat de keratocytendichtheden lager zijn bij ziektepatiënten dan bij normale controles 34,35,36,37 en correleren met de ernst van de ziekte 34,38, was dit echter niet het geval bij menselijke ex vivo weefselmonsters 25 , en verdere studies zijn nodig om te bepalen of een minimaal aantal keratocyten nodig is in donorhoornvliezen om te resulteren in een goed visueel herstel na transplantatie. Lage keratocytendichtheid in donorweefsel zoals in pathologisch weefsel kan worden verklaard door veroudering, post mortem verlies van cellen geïnduceerd door ischemie en/of opslag van donorweefsel 27,39,40,41. Er moet ook op worden gewezen dat de normale donorhoornvliezen die in dit protocol werden verkregen en afgebeeld, ofwel werden opgeslagen en oedemateus of opgezwollen waren, of vóór transplantatie door de oogbank waren weggegooid vanwege slechte endotheelkwaliteit volgens de normen van de EU Eye Bank Association. Als FF-OCM-beeldvorming samen met het beschreven protocol zou worden opgenomen in de oogbankinstelling, zouden de hoornvliezen meestal in een frissere toestand worden beoordeeld dan hier mogelijk was, wat de keratocytendichtheden kan beïnvloeden.
Het hier beschreven protocol voor de stromale kwaliteitsanalyse zou kunnen worden uitgebreid voor de beoordeling van het membraan van Descemet, wat ook kan worden opgelost met FF-OCM in termen van dikte en structuur21,24. Dit kan nuttig zijn voor de selectie van weefsels voor Descemet's membraan endotheliale keratoplastiek, waar dunne Descemet's membranen moeilijker te scheiden zijn van het stroma.
Kortom, FF-OCM maakt een nauwkeurige en betrouwbare beoordeling van het hoornvliesstroma van de menselijke donor tijdens de opslag mogelijk. Door de kwaliteit van het transplantaat te verbeteren, heeft de toevoeging van dit protocol aan de huidige oogbankprocedures het potentieel om de screening en selectie van donorweefsels, en dus de resultaten van keratoplastiek, te verbeteren. Real-life integratie van het FF-OCM-apparaat in de oogbankroutine moet worden vergemakkelijkt door recente technologische updates, waaronder snellere beeldacquisitie en een groter gezichtsveld dankzij de ontwikkeling van een aangepaste CMOS-camera en het ontwerp van aangepaste steriele wegwerpcassettes voor hoornvliesopslag en -verwerking tijdens beeldvorming.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk is gefinancierd door het Agence Nationale de Recherche (ANR), in het kader van een PRTS-subsidie (Projet de Recherche Translationelle en Santé) nr. ANR-13-PRTS-0009 (V.B.) en uit het Horizon 2020-onderzoeks- en innovatieprogramma van de Europese Unie in het kader van de Marie Skłodowska-Curie-subsidieovereenkomst nr. 709104 (K.I.). De auteurs bedanken Céline de Sousa voor haar hulp bij het tellen van cellen en histologische verwerking.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Light-CT Scanner | LLTech, France | http://www.lltechimaging.com/products-applications/products/ | FF-OCM device used in this manuscript for imaging |
| CorneaJet | EuroBio, France | http://www.eurobio-cornea.com/en/corneamax-10-100-ml-xml-352-822.html | Organ culture medium in which donor corneas are stored |
| CorneaMax | EuroBio, France | http://www.eurobio-cornea.com/en/corneajet-10-50-ml-xml-352-823.html | Dextran-supplemented organ culture medium used for deturgescence |
| Fiji (ImageJ) | National Institute of Health, Bethesda, MD, USA | https://fiji.sc/ | Open source image processing software |
| Matlab | Mathworks, Inc., Natick, MA, USA | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | Mathematical computing software |
References
- Pascolini, D., Mariotti, S. P.
- Shimazaki, J., Shimmura, S., Ishioka, M., Tsubota, K. Randomized clinical trial of deep lamellar keratoplasty vs penetrating keratoplasty. Am J Ophthalmol. 134, 159-165 (2002).
- Tsubota, K., Kaido, M., Monden, Y., Satake, Y., Bissen-Miyajima, H., Shimazaki, J. A new surgical technique for deep lamellar keratoplasty with single running suture adjustment. Am J Ophthalmol. 126, 1-8 (1998).
- Busin, M., Zambianchi, L., Arffa, R. C. Microkeratome-assisted lamellar keratoplasty for the surgical treatment of keratoconus. Ophthalmology. 112, 987-997 (2005).
- Amayem, A. F., Anwar, M.
- Borderie, V. M., Guilbert, E., Touzeau, O., Laroche, L. Graft rejection and graft failure after anterior lamellar versus penetrating keratoplasty. Am J Ophthalmol. 151, 1024-1029 (2011).
- Borderie, V. M., Sandali, O., Bullet, J., Gaujoux, T., Touzeau, O., Laroche, L. Long-term results of deep anterior lamellar versus penetrating keratoplasty. Ophthalmology. 119, 249-255 (2012).
- Koo, T. S., Finkelstein, E., Tan, D., Mehta, J. S. Incremental cost-utility analysis of deep anterior lamellar keratoplasty compared with penetrating keratoplasty for the treatment of keratoconus. Am J Ophthalmol. 152, 40-47 (2011).
- Bahar, I., Kaiserman, I., Srinivasan, S., Ya-Ping, J., Slomovic, A. R., Rootman, D. S. Comparison of three different techniques of corneal transplantation for keratoconus. Am J Ophthalmol. 146, 905-912 (2008).
- Bahar, I., Kaiserman, I., Srinivasan, S., Ya-Ping, J., Slomovic, A. R., Rootman, D. S. Longterm results of deep anterior lamellar keratoplasty for the treatment of keratoconus. Am J Ophthalmol. 151, 760-767 (2011).
- Cheng, Y. Y., et al. Endothelial cell loss and visual outcome of deep anterior lamellar keratoplasty versus penetrating keratoplasty: a randomized multicenter clinical trial. Ophthalmology. 118, 302-309 (2011).
- Borderie, V. M., Sandali, O., Bullet, J., Guilbert, E., Goldschmidt, P., Laroche, L. Donor tissue selection for anterior lamellar keratoplasty. Cornea. 32, 1105-1109 (2013).
- Borderie, V., Martinache, C., Sabolic, V., Touzeau, O., Laroche, L. Light microscopic evaluation of human donor corneal stroma during organ culture. Acta Ophthalmol Scand. 76, 154-157 (1998).
- Bald, M. R., Stoeger, C., Galloway, J., Tang, M., Holiman, J., Huang, D. Use of fourier-domain optical coherence tomography to evaluate anterior stromal opacities in donor corneas. J Ophthalmol. 2013. 397680, (2013).
- Huang, D., et al.
- Swanson, E. A., et al. In vivo retinal imaging by optical coherence tomography. Opt Lett. 18, 1864-1866 (1993).
- Izatt, J. A., et al. Micrometer-scale resolution imaging of the anterior eye in vivo with optical coherence tomography. Arch Ophthalmol. 112, 1584-1589 (1994).
- Stave, J., Zinser, G., Grummer, G., Guthoff, R. Modified Heidelberg retinal tomograph HRT. Initial results of in vivo presentation of corneal structures. Ophthalmologe. 99, 276-280 (2002).
- Beaurepaire, E., Boccara, A. C., Lebec, M., Blanchot, L., Saint-Jalmes, H.
- Dubois, A., Vabre, L., Boccara, A. C., Beaurepaire, E. High-resolution full-field optical coherence tomography with a Linnik microscope. Appl Opt. 41, 805-812 (2002).
- Ghouali, W., et al. Full-field optical coherence tomography of human donor and pathological corneas. Curr Eye Res. 24, 1-9 (2014).
- Akiba, M., et al. Ultrahigh-resolution imaging of human donor cornea using full-field optical coherence tomography. J Biomed Opt. 12, 041202 (2007).
- Latour, G., Georges, G., Lamoine, L. S., Deumie, C., Conrath, J., Hoffart, L. Human graft cornea and laser incisions imaging with micrometer scale resolution full-field optical coherence tomography. J Biomed Opt. 15, 056006 (2010).
- Grieve, K., Georgeon, C., Andreiuolo, F., Borderie, M., Ghoubay, D., Rault, J., Borderie, V. M. Imaging microscopic features of keratoconic corneal morphology. Cornea. 35, 1621-1630 (2016).
- Borderie, M., et al. New parameters in assessment of human donor corneal stroma. Acta Ophthalmol. 95. 297, e297-e306 (2017).
- Borderie, V. M., Scheer, S., Touzeau, O., Vedie, F., Carvajal-Gonzalez, S., Laroche, L. Donor organ cultured corneal tissue selection before penetrating keratoplasty. Br J Ophthalmol. 82, 382-388 (1998).
- Borderie, V. M., Baudrimont, M., Lopez, M., Carvajal, S., Laroche, L. Evaluation of the deswelling period in dextran-containing medium after corneal organ culture. Cornea. 16, 215-223 (1997).
- Tech, L. L. , Light-CT Scanner. http://www.lltechimaging.com/products-applications/products (2017).
- Doughty, M. J., Müller, A., Zaman, M. L. Assessment of the reliability of human corneal endothelial cell-density estimates using a noncontact specular microscope. Cornea. 19, 148-158 (2000).
- Irsch, K., Borderie, M., Grieve, K., Plamann, K., Laroche, L., Borderie, V. M. Objective analysis of stromal light backscattering with full-field optical coherence tomographic microscopy shows potential to quantify corneal transparency. Frontiers in Optics. OSA Technical Digest (online), paper FW6A.6. , (2015).
- Bocheux, R., Pernot, P., Borderie, V., Plamann, K., Irsch, K. Quantitative measures of corneal transparency, derived from objective analysis of depth-resolved corneal images, demonstrated with full-field optical coherence tomographic microscopy. PLoS ONE. e0221707. 14, (2019).
- Karimi, A. H., Wong, A., Bizheva, K. Automated detection and cell density assessment of keratocytes in the human corneal stroma from ultrahigh resolution optical coherence tomograms. Biomed Opt Express. 2, 2905-2916 (2011).
- Ku, J. Y., Niederer, R. L., Patel, D. V., Sherwin, T., McGhee, C. N. Laser scanning in vivo confocal analysis of keratocyte density in keratoconus. Ophthalmology. 115, 845-850 (2008).
- Ozgurhan, E. B., Kara, N., Yildirim, A., Bozkurt, E., Uslu, H., Demirok, A. Evaluation of corneal microstructure in keratoconus: a confocal microscopy study. Am J Ophthalmol. 156, 885-893 (2013).
- Erie, J. C., Patel, S. V., McLaren, J. W., Nau, C. B., Hodge, D. O., Bourne, W. M. Keratocyte density in keratoconus. A confocal microscopy study. Am J Ophthalmol. 134, 689-695 (2002).
- Imre, L., Resch, M., Nagymihaly, A.
- Niederer, R. L., Perumal, D., Sherwin, T., McGhee, C. N. Laser scanning in vivo confocal microscopy reveals reduced innervation and reduction in cell density in all layers of the keratoconic cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 2964-2970 (2008).
- Patel, S., McLaren, J., Hodge, D., Bourne, W. Normal human keratocyte density and corneal thickness measurement by using confocal microscopy in vivo. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42, 333-339 (2001).
- Komuro, A., Hodge, D. O., Gores, G. J., Bourne, W. M. Cell death during corneal storage at 4 degrees. C. Invest Ophthalmol Vis Sci. 40, 2827-2832 (1999).
- Gambato, C., Longhin, E., Catania, A. G., Lazzarini, D., Parrozzani, R., Midena, E. Aging and corneal layers: an in vivo corneal confocal microscopy study. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 253, 267-275 (2015).
